用於靶向樹突細胞的組合物的製作方法

2023-08-08 17:11:56 1

專利名稱：用於靶向樹突細胞的組合物的製作方法
用於靶向樹突細胞的組合物本發明涉及用於靶向樹突細胞的組合物。特別地，本發明涉及用於疫苗接種的組合物，其包括包含抗原和樹突細胞靶向分子的膜囊泡(membrane vesicles).適當地，樹突細胞靶向分子是與DC-SIGN結合的分子。本發明進一步涉及包含此類抗DC-SIGN分子的用途、製劑、組合物和裝置。
背景技術：
惡性黑素瘤是造成79%的皮膚癌相關死亡的原因，儘管事實是它僅佔所有皮膚癌的 4% [1]。澳大利亞和紐西蘭具有黑素瘤的最高發病率和死亡率，並且據報導它的發生日趨嚴重[2]。惡性黑素瘤起因於黑色素產生細胞(黑素細胞)中的突變。因為黑素細胞主要在皮膚的表皮層中發現，所以它因此是原發性黑素瘤病變的最常見場所[3]。原發性病變還可以在其中發現黑素細胞的非皮膚部位出現，例如口腔黏膜、鼻咽、鼻旁竇、氣管支氣管樹、女陰、陰道、肛門、泌尿道、中樞神經系統和眼W]。分期系統用於測量疾病的程度和嚴重性，其基於原發性腫瘤的檢查和傳播程度。因為仍未鑑定出用於篩選目的的可靠血液標記，所以診斷依賴於通過體格檢查和放射學技術獲得的測量。這些測量用於確定總體分期(第0期到第IV期)和患者預後。較早期(0、1和II)顯示無原發性腫瘤的傳播，並且具有非常良好的預後。這些較早期主要基於侵入性腫瘤的深度進行區分。當原發性腫瘤已轉移至淋巴腺或周圍組織但未轉移至遠側淋巴結或其他器官時，患者診斷為第III期。當黑素瘤已傳播至一個或多個遠側器官或一個或多個遠側淋巴腺時，診斷為疾病的第IV期[5]。因為較早期的黑素瘤一般是無症狀的，所以到患者診斷時，癌症一般處於晚期(第III或IV期)，並且因此預後不良。皮膚黑素瘤的早期檢測以及隨後的合適幹預對患有黑素瘤的患者的預後具有極大影響。當在第O-II期檢測出時，推薦治療是通過手術去除原發性腫瘤、原發性腫瘤周圍的皮膚和肉(flesh)。當狀況在其過程中早期被識別並且原發性治療用手術去除時，97%的患者顯示無該問題的復發。因為不完全切除的腫瘤具有高復發率，並且因為具有復發病變的患者具有較低的長期治癒率，所以重要的是去除整個腫瘤W]。在診斷時腫瘤的侵入深度最精確地預測患有黑素瘤的存活與黑素瘤相關的存活率與其在診斷時的深度反相關。當原發性黑素瘤已更深入地侵入時，執行信號結(sentinel node)活組織檢查用於疾病的更精確分期，並且有助於測定關於另外治療的需要。當診斷為較後期(第III和IV期)時，對於惡性黑素瘤存在的治療選項並不令人滿意，並且轉移性黑素瘤患者的長期存活是相對罕見事件[7]。對於第III期患者，一般去除測試為黑素瘤陽性的結周圍的淋巴結。當患者在醫學上不適合於手術或具有因為太廣泛而不能切除的疾病時，放射性療法可以用作手術的替代方案。在手術後具有陽性或閉合邊緣或其中至淋巴結的轉移增加區域發生的危險的患者中也考慮手術後放射性治療[8]。對於第IV期黑素瘤，標準治療是使用達卡巴嗪(DTIC)的化學療法[9]。其他化學治療藥物例如羅莫司汀和福莫司汀也批准用於第IV期黑素瘤[10]。2種生物療法已得到FAD批准用於在高危黑素瘤患者的治療中使用幹擾素α -2b和IL-2。幹擾素α _2b開處方為輔助療法以改變疾病的自然史，並且在某些研究中顯示減少具有完全切除的高危惡性黑素瘤的患者的復發率[11]。然而，治療需要經過52周時間段的反覆施用，這與顯著毒性和相當大的成本相關[12]。IL-2是用於患有轉移的黑素瘤的患者的免疫治療劑，並且與 13-17%的低但持續的總體應答率相關(7-9%部分應答和6-8% 完全應答)[13，14]。黑素瘤是免疫原性癌症。大量腫瘤浸潤淋巴細胞通常在黑素瘤患者中天然發現， 並且許多研究已報導黑素瘤細胞表達可以誘導黑素瘤特異性T細胞和抗體應答的抗原 [15]。這已導致各種黑素瘤疫苗策略的設計，其中一些由全細胞、細胞裂解物、蛋白質和其他特異性肽組成。也已測試了使用先體外後體內(a ^ra)抗原負載的DC的基於樹突細胞的疫苗，目的是增強患者對腫瘤的免疫應答。然而，儘管經過15年的研究，但無一已被批准用於在臨床試驗外使用[16]。因此，仍需要有效的黑素瘤治療。發明概述
在一個方面，本發明提供了包含下述的組合物
a)一種或多種抗原；
b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域；和
c)攜帶a)和b)的載體。在一個實施方案中，組合物進一步包含d)免疫調節因子。合適的免疫調節因子例如在WO 2005/018610中描述。合適的免疫調節因子也可以描述為「危險信號」。 在一個實施方案中，一種或多種抗原衍生自膜囊泡(MV)。適當地，膜囊泡包含一種或多種膜相關抗原，適當地是腫瘤抗原，包含黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-1， 或癌症睪丸抗原 MAGE-A3、MAGE A-10、BAGE, GAGE 和 XAGE。在另一個實施方案中，一種或多種抗原可以衍生自其在樹突細胞上的呈遞可能是需要的任何多肽。在一個實施方案中，膜囊泡衍生自腫瘤細胞，優選黑素瘤細胞。許多黑素瘤細胞系是可獲得的。在一個實施方案中，使用衍生自黑素瘤細胞系MM200的黑素瘤細胞。在另一個實施方案中，黑素瘤細胞可以得自患者。在一個實施方案中，患者是具有惡性黑素瘤的患者。在另一個實施方案中，腫瘤細胞可以是衍生自任何形式的癌症的細胞系或患者細胞，包括例如膀胱、乳腺、肺(包括NSCLC)、肝臟、精原細胞瘤和/或頭頸癌。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是單一結構域抗體 (dAb)，適當地是重鏈dAb片段例如￥11 dAb片段。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是輕鏈dAb片段例如\ dAb片段。在一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域包含特異性單一結構域抗體，本文鑑定為DMS5000，包含如

圖12 的SEQ ID NO :1中所示的胺基酸序列。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是具有如圖12的SEQ ID NO 1中所示的胺基酸序列的DMS5000。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO :3中所示的胺基酸。在一個進一步的實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是具有與具有如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3中所示胺基酸序列的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域相同的結合特異性的那種結構域。
在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是具有與SEQ ID NO :1或3中所示胺基酸序列相同的CDR序列的那種結構域。抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域可以進一步包含多組氨酸C末端尾。例如， 抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域可以包含如圖12的SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列。這個多組氨酸C末端尾使得抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域能夠使用螯合劑脂質3NTA-DTDA經由尾與膜囊泡栓系(tethered)。合適載體包括任何合適的遞送方法，例如生物可降解的微膠囊或免疫刺激複合物 (150)10、(0(^1盼切8、脂質體、遺傳改造的減毒活載體例如病毒或細菌、和重組(嵌合)病毒樣顆粒例如藍舌病。在人中的其他載體系統可以包括保護抗原不受胃的酸性環境的腸釋放膠囊和聚丙交酯-乙交酯微球體。合適稀釋劑是0. 2 N NaHC03和/或鹽水。在一個實施方案中，載體是脂質體。適當地，脂質體包含脂質體組成成分。此類脂質體組成成分使得能夠形成脂質體。合適的脂質體組成成分例如在WO 2005/018610中描述。因此，在另一個實施方案中，脂質體組成成分包含螯合劑脂質3 (氮川三乙酸)-雙十四胺(3NTA-DTDA)。在一個進一步的實施方案中，脂質體組成成分還包含鎳，優選以硫酸鎳(NiSO4)的形式。NiSO4促進多組氨酸C末端尾與螯合劑脂質3NTA-DTDA的相互作用。在另一個實施方案中，脂質體組成成分包含脂質α -棕櫚醯-β -油醯-磷脂醯膽 M(POPO)0在一個實施方案中，脂質體組成成分(liposomal constituent)可以摻入親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以便延長脂質體在體內循環中的存在。在另一個實施方案中，免疫調節因子是刺激樹突細胞(DC)的細胞因子。適當地，免疫調節因子是細胞因子幹擾素Y(IFN-Y)。其他免疫調節因子包括白介素_2、白介素-4、 白介素-10、白介素-12和轉化生長因子-β。在一個實施方案中，組合物是疫苗組合物。在一個實施方案中，疫苗組合物是如本文描述的 「Lipovaxin-MM」。在另一個實施方案中，組合物進一步包含藥學上可接受的載體。適當地，組合物製備用於靜脈內施用。在另一個方面，本發明提供了用於製備依照本發明的組合物的方法，其包含
i)製備膜囊泡；
ii)製備脂質體組成成分；
iii)使膜囊泡和脂質體組成成分與免疫調節因子組合；
iv)加入抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域。在一個實施方案中，關於方法的此類步驟可以以任何次序執行。在一個實施方案中，膜囊泡的製備通過使腫瘤細胞繁殖，超聲處理且經由離心和重懸浮於PBS中製備膜團塊來進行。在另一個實施方案中，脂質體組成成分通過使POPC和 Ni-3NTA-DTDA混合進行製備。在一個進一步的實施方案中，該方法進一步包含補充有鎳。在另一個方面，提供了用作藥物使用的依照本發明的組合物。在一個方面，依照本發明的組合物是用於癌症治療。適當地，癌症是黑素瘤。在另一個實施方案中，組合物是用於靜脈內施用。在另一個方面，提供了用於治療受試者中的腫瘤的方法，其包含施用依照本發明的組合物。附圖簡述
圖1 :Lip0Vaxin-MM的圖解表示，其顯示衍生自MM200膜部分、POPC和各種癌抗原的脂質是可見的。還描述了樹突細胞靶向結構域抗體(dAb)DMS5000。幹擾素γ描述為主要與疫苗的外表面結合。圖2 增加脂質體中的3NTA-DTDA量和dAb的相應摩爾比不增加Lipovaxin-MM 的靶向效應。表達人DC-SIGN的THP-I細胞與抗人DC-SIGN單克隆抗體或包含不同量 3NTA-DTDA和嫁接的(engrafted) dAb的Lipovaxin-MM —起孵育。圖2通過FACS分析顯示增加Lipovaxin-MM表面上的靶向分子數目不增加疫苗的靶向。圖3 通過與Lipovaxin-MM—起孵育的人單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)的Z切片。疫苗由摻入B0DIPY-500-510-C螢光染料(綠色)的P0PC、3NTA_DTDA和MM200膜囊泡製備，且嫁接dAb DMS5000。moDC用BODIPY紅色琥珀醯亞胺酯(紅色)染色，並且在顯微鏡檢查前與疫苗一起孵育5小時。在共聚焦顯微鏡下觀察前立即將細胞置於蓋玻片上。Z切片顯示疫苗與moDC表面結合(第一個和第四個圖像)並且它在細胞內發生(第二個和第三個圖像)。圖4 嫁接測定。脂質體/MV融合和Lipovaxin-MM(具有嫁接的dAb)與A蛋白-生物素一起孵育，隨後為與螢光染料AleXaFlUOr488綴合的鏈黴抗生物素蛋白。通過流式細胞術的分析證實僅具有嫁接的dAb (右手側)的顆粒能夠結合螢光染料。圖5 螢光標記(fluorescinated)的Lipovaxin-MM與人細胞和轉染細胞系的結合。就DC-SIGN表達和結合螢光標記的Lipovaxin-MM的能力，對THP-I細胞、表達人 DC-SIGN的轉染的THP-I細胞(THP-1/DC-SIGN)、人外周血單核細胞(PBMC)和人單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)進行評估。僅THP-1/DC-SIGN細胞和moDC表達DC-SIGN，並且能夠結合 Lipovaxin-MM。圖 6 與 Lipovaxin-MM 相關的 IFN- γ 活性的定量。Lipovaxin-MM 的 IFN- γ 活性基於在THP-1/DC-SIGN細胞上的⑶64表達進行測量。細胞在37 °C與不同濃度的新鮮的Lipovaxin-MM或其中通過離心去除未摻入IFN-Y的Lipovaxin-MM (膜結合的 Lipovaxin-MM)孵育48小時。通過流式細胞術使用抗⑶64 mAb測量⑶64上調。結果顯示為平均值士標準誤。圖7 :MM200膜囊泡的蛋白質印跡分析。細胞裂解物通過超聲處理進行處理；MV如本文描述的根據標準操作程序進行製備。測量樣品的蛋白質含量，隨後使樣品與樣品緩衝液一起煮沸，加樣到預製(precast)的NuS印凝膠(4-20% )上且實施SDS-PAGE。將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上且封閉過夜。膜用一級抗體進行探測，洗滌且與鹼性磷酸酶綴合的二級抗體孵育。使用!Iomega的蛋白質藍色穩定化底物顯現條帶。在由MM200細胞製備的細胞裂解物(左)和MV (右)中顯現廣譜鈣粘蛋白(pan cadherin)、Melan A和gplOO。圖 8 貯存於 4°C 的 Lipovaxin 的穩定性對體外 Lipovaxin-MM(LV-MM)與 DC-SIGN 結合的作用。LV-MM貯存於4°C，且對在各個時間點獲得的等分試樣執行使用THP-I/ DC-SIGN細胞的結合測定。LV-MM用B0DIPY-500-5IO-C染料進行螢光標記。在4°C貯存4 周后，就與THP-1/DCSIGN細胞上的DC-SIGN結合而言，LV-MM是穩定的。圖9 貯存於4°C的Lipovaxin (LV-MM)的穩定性對IFN- γ活性的作用。基於在THP-1/DCSIGN細胞上的CD64表達，測量在新鮮LV-MM和貯存於4°C的LV-MM中的IFN- γ 活性。在左側的曲線圖代表完整LV-MM，而在右側的曲線圖代表具有通過離心去除的非膜結合的IFN- γ的LV-MM。細胞在37°C與不同濃度的LV-MM孵育48小時。通過流式細胞術使用抗⑶64 mAb測量⑶64上調。結果表示為平均值士標準誤。在4°C貯存後，LV-MM中的IFN-Y穩定最多4周。然而，在LV-MM中膜結合的IFN-γ中的減少指出隨著時間過去 IFN-Y變得與膜解離。圖10 來自用Lipovaxin-MM接種疫苗的獼猴的培養的PBMC對IFN- γ和TNF- α 的分泌。4隻獼猴的2個組(Α和B)根據下文概述的時間表用Lipovaxin-MM接種疫苗。在疫苗接種時間表過程中的各個時間獲得血液，並且分離外周血單核細胞(PBMC)且與『假的 (dummy)，Lipovaxin-MM (缺乏 IFN-γ )(含々ΖΚ)、抗 CD3 mAb (OW)、或無刺激(無々ZK)培養48 小時。收集培養物上清液，且使用 BD CBA Non-Human Primate Thl/Th2 Cytokine Kit 分析IFN-γ和TNF-α產生。SN =上清液。圖11 在用Lipovaxin-MM接種疫苗的獼猴中的抗體生產。4隻獼猴的2個組(A 和B)根據下文概述的時間表用Lipovaxin-MM接種疫苗。在疫苗接種時間表過程中的各個時間獲得血液，並且執行酶聯免疫吸附測定，以測量對於完整Lipovaxin-MM (Lipovaxin), Lipovaxin-MM的MM200膜囊泡組分(MV)和結構域抗體DMS5000 (dAb)特異的抗體的產生。發明詳述
在本說明書內，本發明已參考實施方案，以使得能夠書寫明確和簡明說明書的方式進行描述。預期且應當理解實施方案可以被不同組合或分開而不背離本發明。除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與由本領域普通技術人員通常理解相同的含義(例如，在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學中)。標準技術用於分子、遺傳和生物化學方法(一般參見，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版，John Wiley & Sons, Inc.，其引入本文作為參考)和化學方法。用於在本發明的組合物中使用的抗原包括腫瘤抗原。適當地，此類抗原可以包括與衍生自相同組織的非腫瘤細胞比較，在腫瘤細胞上差異表達的任何抗原。差異表達可以包括例如上調，可變剪接形式等等。腫瘤抗原包括所謂的癌/睪丸抗原。這些是在除睪丸外的正常細胞/細胞中一般不表達的抗原/蛋白質。然而，這些抗原被認為在特定癌症/ 腫瘤中特異性表達，例如膀胱、乳腺、肺特別是非小細胞肺癌(NSCLC)、肝臟、精原細胞瘤、黑素瘤和/或頭頸癌，並且有利地能夠由細胞毒性T細胞識別。今為止已描述了超過50種癌 /睪丸抗原迄，並且對於其中許多，已鑑定了由T淋巴細胞識別的特異性表位。在本發明的一個實施方案中，所述一種或多種抗原可以是任何癌/睪丸抗原。充分表徵的癌/睪丸抗原家族是MAGE家族，這包括位於染色體X上並且在其編碼序列中彼此共享64 - 85%同源性的12種緊密相關的基因，MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、 MAGE 4,MAGE 5,MAGE 6,MAGE 7 ,MAGE 8,MAGE 9,MAGE 10,MAGE IUMAGE 12 (De Plaen, Immunogenetics 1994,40 5 (360-369))。這些有時稱為 MAGE Al.MAGE A2、MAGE A3,MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A 10,MAGE Al UMAGE A 12 (MAGE A家族)。其他2組蛋白質也是MAGE家族的部分，儘管更遙遠相關。這些是MAGE B和MAGEC 組。MAGE B 家族包括 MAGE Bl (也稱為 MAGE XpI 禾口 DAM 10),MAGE B2 (也稱為 MAGE Xp2 禾口 DAM 6) MAGE B3 禾口 MAGE B4 _ Mage C 家族目前包括 MAGE C IfPMAGE C2。在一個實施方案中，用於在本發明的組合物中使用的抗原是黑素瘤抗原。合適的黑素瘤抗原是由T細胞識別的那些抗原，包括癌/睪丸抗原例如MAGE-I和MAGE-3。這些抗原也在其他腫瘤中產生。例如，MAGE-3在小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(非SCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、結腸癌和乳腺癌中發現。MAGE-I也在乳腺癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、SCLC和甲狀腺的髓質瘤中產生。其他黑素瘤抗原包括黑素細胞譜系特異性分化抗原，包括MART-1/Melan-A、酪氨酸酶、GP75和GP100。其他合適的抗原包括酪氨酸酶、 BAGE, GAGE-U2, GnT-V, pl5。此外，包括腫瘤特異性突變抗原例如b_連環蛋白、MUM-1和 CDK4。樹突細胞特異性ICAM-3結合的(grabbing)非整合素(DC-SIGN或CD209)是II型膜蛋白，其是甘露糖特異性鈣依賴性(C型)凝集素。DC-SIGN介導樹突細胞(DC)和T細胞之間的相互作用，並且例如由Soilleux，Clinical Science (2003)，104，437-446描述，具有在NM_021155 (mRNA)和NP_066978 (蛋白質)中給出的序列數據。適當地，本發明的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域可以以任何抗體形式呈現。如本文使用的，抗體指IgG, IgM, IgA, IgD或IgE或片段(例如Fab、F (ab，) 2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙抗體)，無論是衍生自天然產生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術產生的；無論是從血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母還是細菌中分離的。如本文使用的，「抗體形式」指任何合適的多肽結構，其中一個或多個抗體可變結構域可以如此摻入，以便在結構上賦予對於抗原的結合特異性。各種合適的抗體形式是本領域已知的，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任何的抗原結合片段(例如Fv片段 (例如單鏈Fv (scFv)、二硫鍵結合的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F (ab，)2片段)、單一抗體可變結構域(例如dAb、VH、VHH、\)和前述任何的修飾形式(例如通過聚乙二醇或其他合適聚合物或人源化Vhh的共價連接修飾的)。短語「免疫球蛋白單一可變結構域」指抗體可變結構域(VinVfflA),其不依賴於其他V區或結構域特異性結合抗原或表位。免疫球蛋白單一可變結構域可以以具有其他可變區或可變結構域的形式(例如，同或異多聚體)呈現，其中所述其他區域或結構域不是通過單一免疫球蛋白可變結構域的抗原結合所需的(即其中免疫球蛋白單一可變結構域不依賴於另外可變結構域而結合抗原)。「結構域抗體」或「dAb」與「免疫球蛋白單一可變結構域」 相同，如該術語在本文中使用的。「單一免疫球蛋白可變結構域」與「免疫球蛋白單一可變結構域」相同，如該術語在本文中使用的。「單一抗體可變結構域」或「抗體單一可變結構域」 與「免疫球蛋白單一可變結構域」相同，如該術語在本文中使用的。免疫球蛋白單一可變結構域在一個實施方案中是人抗體可變結構域，但還包括來自其他物種的單一抗體可變結構域，例如嚙齒類(例如如WO 00/29004中公開的，其內容整體引入本文作為參考)、護士鯊和駱駝科dAb。駱駝科Vhh是免疫球蛋白單一可變結構域多肽，其衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種，其產生天然地缺乏輕鏈的重鏈抗體。Vhh可以是人源化的。「結構域」是摺疊的蛋白質結構，其具有不依賴於蛋白質其餘部分的三級結構。一般地，結構域負責蛋白質的不連續功能性質，並且在許多情況下可以加入、去除或轉移至其他蛋白質，而無蛋白質和/或結構域其餘部分的功能喪失。「單一抗體可變結構域」是包含具有抗體可變結構域特徵的序列的摺疊多肽結構域。它因此包括完全抗體可變結構域和修飾可變結構域，例如其中一個或多個環已由並非抗體可變結構域特徵的序列替換，或已截短或包含N或C末端延長的抗體可變結構域，以及可變結構域的摺疊片段，其保留全長結構域的至少結合活性和特異性。抗原結合蛋白質(結合特異性)例如dAb與抗原或表位的特異性結合可以通過任何合適測定進行測定，包括例如katchard分析和/或競爭結合測定，例如放射性免疫測定 (RIA)、酶免疫測定例如ELISA和夾心競爭測定及其不同變體。互補決定區(⑶R)和構架區是免疫球蛋白可變結構域的那些區域。特別地，存在展示特定變異性的單一抗體可變結構域的序列區域，即CDR (互補決定區)序列。CDR在抗體可變結構域的序列內的限定位置上。用於限定序列的CDR區的許多系統是本領域技術人員熟悉的。在一個實施方案中，本發明的CDR序列如具有免疫學重要性的蛋白質序列Kabat資料庫(Kabat database of Sequences of Proteins of Immunological Interest)中定義的(Kabat Ε. Α. , Wu, Τ. Τ. , Perry, H. , Gottesman, K.禾口 Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological hterest，第 5 版.NIH公開號 91-3242)，其給出用於以一致方式編號抗體中的殘基的標準編號方案。本文描述的免疫球蛋白單一可變結構域(dAb)包含互補決定區(⑶Rl、⑶R2和⑶R3)。基於眾所周知的Kabat胺基酸編號系統和CDR的定義，本文描述的Vh (CDRHl等) 和Vl (⑶RLl等)(Vk)的⑶Rs (⑶R1、⑶R2、⑶R3)的胺基酸序列對於本領域技術人員將是顯而易見的。根據Kabat編號系統，基於序列變異性的最常用的方法，重鏈CDR-H3具有可變長度，插入片段以直到K的字母在殘基HlOO和HlOl之間編號(即H100、H100A ... H100K、 HlOD0⑶R可替代地如下使用Chothia的系統進行測定(基於結構環區域的位置XChothia ^Α (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342 (6252)，第877-883頁)，根據AbM(在Kabat和Chothia之間妥協)或根據接觸法(基於與抗原的接觸殘基的晶體結構和預測)。關於用於測定⑶R的合適方法參見http://WWW. bioinf. org. uk/abs/o一旦每個殘基已編號，隨後就可以應用下述⑶R定義 Kabat
CDR Hl :31-35/35A/35B CDR H2 :50-65 CDR H3 :95-102 CDR Ll :24-34 CDR L2 :50-56 CDR L3 :89-97 Chothia CDR Hl 26-32CDR H2 :52-56
CDR H3 :95-102
CDR Ll :24-34
CDR L2 :50-56
CDR L3 :89-97 AbM
(使用Kabat編號) (使用Chothia編號)
CDR Hl :26-35/35A/35B 26-35
CDR H2 :50-58-
CDR H3 :95-102-
CDR Ll :24-34-
CDR L2 :50-56-
CDR L3 :89-97-
接觸
(使用Kabat編號) (使用Chothia編號)
CDR Hl :30-35/35A/35B 30-35
CDR H2 :47-58-
CDR H3 :93-101-
CDR Ll:30-36-
CDR L2 :46-55-
CDR L3 :89-96-
(「_」意指與Kabat相同的編號)。本發明提供了疫苗或藥物組合物，其任選進一歩包括藥學上可接受的載體。—般地，本發明的組合物將以純化形式連同藥理學上合適的載體一起利用。一般 地，這些載體包括水或醇/水溶液、乳狀液或懸浮液、任何包括鹽水和/或緩衝介質。腸胃 外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸林格。如果是維持懸浮液中 的多肽複合物所需的，那麼合適的生理學上可接受的佐劑可以選自增稠劑，例如羧甲基纖 維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。靜脈內載體包括液體和營養補充劑和電解質補充劑，例如基於林格氏葡萄糖的那 些。也可以存在防腐劑和其他添加剤，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack (.19^2) Remington's Pharmaceutical Scieaces，第 16 版)。可以使用各種合適的製劑，包 括延長釋放製劑。本發明的組合物可以作為分開施用的組合物或與其他試劑結合使用。藥物組合物 可以包括與本發明的組合物結合的各種細胞毒性或其他試劑的「混合物(cocktails)」，或 甚至具有不同特異性的組合物的組合，例如包含使用不同靶抗原或表位選擇的配體的組合 物，或包含不同免疫調節因子的組合物，無論它們在施用前是否合井。根據本發明的藥物組合物的施用途徑可以是本領域普通技術人員通常已知的那 些中的任何。對於治療，包括但不限於免疫治療，本發明選擇的組合物可以依照標準技術施 用於任何患者。
施用可以通過任何合適方式，包括腸胃外、靜脈內、肌肉內、腹膜內、經皮、經由肺途徑、或還適當地通過用導管直接輸注。施用劑量和頻率將依賴於患者的年齡、性別和狀況，其他藥物的同時施用、對抗適應症(counter indication)和待由臨床醫生考慮的其他參數。施用可以是如指示的局部的(例如通過肺施用例如鼻內施用局部遞送至肺)或全身的。用於在本發明的組合物中使用的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域可以凍幹用於貯存，並且在使用前在合適載體中重構。這種技術已顯示對於常規免疫球蛋白是有效的，並且可以採用領域已知的凍幹和重構技術。本領域技術人員應當理解凍幹和重構可以導致各種程度的抗體活性喪失(例如，對於常規免疫球蛋白，IgM抗體趨於具有比IgG抗體更大的活性喪失)，並且使用水平可以向上調整以補償。本發明的組合物或其混合物可以施用用於預防和/或治療性處理。在特定治療應用中，達到所選擇細胞群體的至少部分抑制、壓制、調節、殺死或某些其他可測量參數的足夠量定義為「治療有效劑量」。達到這個劑量所需的量將依賴於疾病的嚴重性和患者的自身免疫系統的一般狀態。對於預防應用，包含呈現組合物或其混合物的組合物還可以以相似或略微更低的劑量施用，以預防、抑制或延遲疾病的發作(例如，以支持緩解或靜止，或預防急性期)。技術人員將能夠確定治療、壓制或預防疾病的合適給藥間隔。如果相對於在治療前存在的此類症狀、或相對於在未用此類組合物治療的個體 (人或模型動物)中的此類症狀或其他合適對照，一種或多種症狀減少(例如，至少10%或在臨床評估量表上的至少一個點)，那麼使用本文描述的組合物執行的處理或治療被視為「有效的」。症狀將依賴於靶向的疾病或病症明顯不同，但可以通過普通臨床醫生或技術人員進行測量。此類症狀可以例如通過下述進行測量監控疾病或病症的一種或多種生物化學指示劑水平(例如與疾病相關的酶或代謝產物的水平，受累細胞數目等)，監控物理表現(例如，炎症、腫瘤大小等)，或公認的臨床評估量表。疾病或病症症狀中至少10%或在給定臨床量表上的一個或多個點的持續(例如一天或更多時間，或更久)減少指示「有效」治療。類似地，如果相對於未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)中的此類症狀，一種或多種症狀的發作或嚴重性延遲、減少或取消，那麼使用如本文描述的組合物執行的預防是「有效的」。根據本發明的組合物可以在預防和治療背景中使用，以幫助改變、滅活、殺死或去除哺乳動物中的選擇靶細胞群體。組合物可以連同一種或多種另外治療或活性劑一起施用或配製。當組合物與另外治療劑一起施用時，組合物可以在另外試劑施用之前、同時或之後施用。一般地，組合物和另外試劑以提供療效重疊的方式施用。如本文使用的，術語「劑量」指一次(單位劑量)或以經過限定時間間隔的2次或更多次施用全部施用於受試者的組合物數量。例如，劑量可以指經過一天( 小時)(日劑量)、兩天、一周、兩周、三周或一個或多個月(例如通過單次施用，或通過2次或更多次施用) 過程施用於受試者的組合物數量。劑量之間的間隔可以是任何所需時間量。適當地，組合物用於施用於患有癌症且特別是黑素瘤的患者，並且用於那個患者的治療。如本文使用的，使用「治療」或「處理」指預防疾病或疾病症狀的發作，抑制疾病或疾病症狀的進展，或逆轉疾病或疾病症狀。有效黑素瘤疫苗/免疫療法的尋找基於免疫系統可以通過治療疫苗接種從頭操縱的原則，以便加強針對癌症的內源免疫功能，以破壞對癌症的免疫耐受，且刺激腫瘤細胞的破壞[17]。目前認識到DC在T細胞介導的適應性免疫應答起始中起關鍵作用，這對於腫瘤破壞是重要的[18]。DC在其使免疫應答成形的能力中是獨特的。一方面它們能夠起始適應性免疫應答，而另一方面它們負責維持針對自身抗原的耐受。2類免疫應答中的哪一類起始在很大程度上依賴於在抗原攝取時由DC接受到的信號。用於癌症免疫療法一一包括黑素瘤一一的疫苗策略因此集中於癌抗原對抗原呈遞細胞的這個特異性亞群的遞送一一在體內和先體外後體內。在一個實施方案中，本發明提供了用於惡性黑素瘤的Lipovaxinaipovaxin-MM)， 其是針對惡性黑素瘤的多價、樹突細胞(DC)靶向的脂質體疫苗/免疫療法。在這個實施方案中且如本文描述的，疫苗由6種組分製備由匪200黑素瘤細胞製備的膜囊泡 (MV), DC-SIGN特異性結構域抗體(dAb)DMS5000、螯合劑脂質3 (氮川三乙酸)-雙十四胺 (3NTA-DTDA)、硫酸鎳(NiS04)、細胞因子幹擾素γ (IFN-γ)和脂質α-棕櫚醯-β-油醯-磷脂醯膽鹼(POPC)。ΜΜ200黑素瘤細胞的膜部分構成攜帶膜相關抗原包括黑素瘤相關腫瘤抗原的MV。 DMS-5000, 一種Vh dAb片段，識別人DC標記DC-SIGN，並且使得疫苗能夠特異性遞送至DC。 DMS5000使用螯合劑脂質3NTA-DTDA經由多組氨酸C末端尾與膜囊泡栓系，並且這種相互作用依賴於NiSO4的存在。3NTA-DTDA插入囊泡的膜內通過載體脂質POPC的包含得到增強。 細胞因子IFN-Y提供了裝備(arm) DC執行其必需效應子功能所需的刺激信號。Lipovaxin-MM是用於惡性黑素瘤的脂質體疫苗/免疫療法，這通過將其抗原負荷在體內特異性靶向人DC表面上的DC-SIGN受體起作用。DC-SIGN是胞吞受體，並且疫苗與 DC-SIGN的結合導致疫苗-DC-SIGN複合物通過DC的內在化。疫苗還攜帶細胞因子IFN-γ， 這刺激DC成熟。Lipovaxin-MM因此已設計為使得細胞因子能夠在DC接受且加工抗原材料的同時對DC提供刺激信號，從而為DC提供起始合適的疫苗特異性刺激T細胞應答的更佳機會。不需要患者DC的先體外後體內操作，這是超過迄今為止試驗的現有DC靶向黑素瘤疫苗的顯著優點。人DC與Lipovaxin-MM在體外共培養導致疫苗的內在化和DC成熟標記數目的上調，包括CD64、CD40、CD86、CD80和HLA-ABC，和程度較少的HLA-DR。Lipovaxin-MM靶向衍生自黑素瘤細胞衍生的膜部分的黑素瘤抗原庫至DC與此同時遞送合適的刺激信號，以確保靶向的DC的最佳成熟。在本文描述的製劑中， Lipovaxin-MM攜帶一般的質膜標記例如廣譜鈣粘蛋白，以及黑素瘤相關蛋白質。在疫苗中已證實了這些蛋白質中的至少3種的存在一一 gp 100、酪氨酸酶和MART-I。眾多未表徵的MM200膜相關黑素瘤抗原也可能存在於構成疫苗的膜囊泡中，因此允許複雜抗原庫遞送至DC，且從而不使疫苗抗原的選擇限制於特定黑素瘤分化或癌症睪丸(CT)抗原。來自在 Lipovaxin-MM中使用的MM200黑素瘤細胞的膜部分的雙向SDS-PAGE分析已揭示>700種分離蛋白質組分的存在。DC成熟是克服T細胞無反應性必需的，據報導與腫瘤進展相關的現象[19，20]。為了達到這點，調節多重DC效應子功能[21]的IFN-γ已包括在製劑中。因為這種細胞因子與疫苗在物理上結合，所以DC在抗原負荷達到其的同時接受合適的刺激信號。
整合至Lipovaxin-MM的膜囊泡在其表面上攜帶His標記的重組Vh dAb(DMS5000) 的眾多拷貝，這就其特異性靶向人DC表面標記DC-SIGN (DC特異性細胞內粘附分子3-結合非整合素)，C型凝集素的能力而被選擇。DC-SIGN由人DC特異性表達[22]。它在DC分化過程中被誘導，在DC成熟後適度下調[23]，並且牽涉病原體的捕獲和攝取，所述病原體大小範圍從極小的病原體例如病毒(HIV、C型肝炎病毒(HCV)、伊波拉病毒、登革病毒)到大得多的細菌、真菌和寄生蟲[24]。DC-SIGN在配體結合後快速內在化[25]，其中體外研究顯示靶向人DC上的DC-SIGN的抗原被快速胞吞，轉運至溶酶體且在MHC I類和II類背景中呈遞給T細胞[26]。Lipovaxin-MM策略利用通用螯合劑脂質，這允許His標記的分子(例如抗體或抗體片段)與脂質體或膜囊泡表面結合，而無需嫁接分子的另外化學修飾。在體外，DMS5000使得DMS5000嫁接的脂質體能夠靶向遞送至人DC-SIGN表達細胞，包括單核細胞衍生的DC。遞送是DMS5000依賴性的且對於人DC-SIGN特異性的。通過共聚焦顯微鏡檢查的螢光標記的Lipovaxin-MM研究已證實，在體外疫苗與人DC的結合隨後為疫苗的內在化。預期隨後為由Lipovaxin-MM攜帶的抗原的加工。使用移植的小鼠模型(用人免疫細胞移植的小鼠)，近期已報導抗原通過DC-SIGN在體內靶向人DC，引發刺激性免疫應答且抑制嫁接腫瘤的生長，從而支持這種受體是用於遞送癌抗原的有效靶的觀念[27]。儘管本文給出了黑素瘤疫苗的具體描述，但應當理解本發明的組合物和方法可以適合於治療其他腫瘤特別是抗原腫瘤中的適合性，包括例如膀胱、乳腺、肺特別是小細胞肺細胞癌(SCLC)或非小細胞肺細胞癌(非SCLC)、肝臟、精原細胞瘤、黑素瘤和/或頭頸癌頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、結腸癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤和甲狀腺的髓質瘤。本發明在下述實施例中進一步描述，僅用於舉例說明的目的。
實施例1)物理、化學和藥學性質和配製 A)藥物物質-背景
Lipovaxin-MM由6種成分製備，這構成4種起始『配製前組分』。Lipovaxin-MM配製前組分的組成和特徵在表1中展示。膜囊泡
疫苗的眾多抗原衍生自裂解的匪200黑素瘤細胞的膜部分。匪200細胞系是從43歲女性中最初去除的原發性黑素瘤中分離的黑素瘤細胞系。細胞系的HLA分型(Al，3 ;B7，35 ； DR2，4)、染色體分析和核型分析已得到描述[28]。MM200細胞系據報導表達黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-1，以及癌症睪丸抗原MAGE-A3、MAGE A_10、BAGE、GAGE和XAGE， 但不表達MAGE-Al、CT-7、NA17-1或NY-ES0-1 [29]。診斷有黑素瘤的患者已顯示在其血清中具有高頻率的MM200特異性抗體[30]。無關臨床研究也已報導這種細胞系用於惡性黑素瘤疫苗研究的用途[29、31、32]。這種細胞系已由其他人在痘苗(vaccinia)裂解物MM200黑素瘤疫苗的臨床前研究中使用，並且超過400個患者已接受基於匪200的痘苗裂解物疫苗，沒有明顯不良反應 [29、31、32]。在Lipovaxin-MM臨床前研究中使用的MM200細胞源於在那些研究中使用的才目同S3lfi_，H 自 Peter Hersey 1! (University of Newcastle, Oncology and Immunology Unit，Newcastle，澳大利亞)的單個安瓿(日期為觀/01/1994)。接受的文件指出『28/01/1994』細胞從1986年原始培養物的二次培養物收穫，並且那些細胞已進行測試且證實不含汙染性外來試劑。外來試劑測試也已對在Lipovaxin-MM臨床前研究中使用的細胞進行。MM200 MV單個批次由用於產生研究產物的本體MM200細胞製備物產生。MV產生基於通過超聲處理的匪200細胞裂解，隨後為2輪離心，低速隨後為高速。用於產生MV的超聲處理和離心在多個ImL加工批次中進行。短暫超聲處理幫助形成多層囊泡，其在大小中不同且構成疫苗的抗原組分。囊泡攜帶眾多蛋白質包括黑素瘤抗原。MV隨後通過使膜團塊重懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進行製備。所得到的膜部分隨後合併以生成本體MV材料。整個過程無菌進行以預防MV材料的汙染。終末滅菌是不可能的。本體MV隨後無菌分配，從而使得每個小瓶包含用於產生2mL Lipovaxin-MM的足夠材料。隨機等分試樣就外來試劑的存在及其黑素瘤抗原概況進行測試。3NTA-DTDA
N-氮川三乙酸(NTA)/His標記系統廣泛用於重組蛋白質的一步分離和純化。四齒狀配體NTA與二價金屬離子例如M2+構成六角形複合物，這佔據複合物中的6個結合位點中的4個。來自連續組氨酸殘基串(也稱為His標記)的2個組氨酸的咪唑環與金屬離子-NTA 複合物的未佔據位點結合。結合是協同作用的，並且2:1 (組氨酸金屬離子-NTA)比值造成His標記分子的穩定固定。如WO 00/64471和WO 2005/018610中描述的，3NTA-DTDA通過使NTA頭部基團的每個COOH基團與另一個NTA基團偶聯通過6步合成來合成。所得到的3NTA部分達到NTA 頭部基團的更高局部密度，這允許His標記蛋白質的更穩定錨定。3NTA頭部基團隨後與2 條14碳烴鏈連接，以產生包含與DTDA (雙十四胺)共價連接的3NTA頭部基團的螯合劑脂質。鎳離子佔據NTA基團各自中的6個結合位點中的4個。2條14碳烴鏈構成可以插入脂質體的脂質雙層內的脂質部分[33]。POPC
POPC ( α -棕櫚醯-β -油醯-sn-甘油_3_磷酸膽鹼)是具有2條不對稱烴鏈的磷脂 完全飽和的16碳鏈和具有在第9和10碳之間的一個雙鍵(18:1，9)的單-順式-不飽和 18碳鏈。關於POPC從凝膠態到液晶態的轉換溫度是約-4°C。其為細胞膜的正常脂質組成成分的POPC廣泛用於脂質體的製備中。Esperion Therapeutics, Inc (Ann Arbor, ΜΑ) 報導關於每4天14-16 mg含POPC脂質體的反覆施用的令人滿意的安全概況，共7個周期 (http://www. pharmaquality. com/mag/08092005/pfq_08092005_F02. html)。產生由POPC與NTA-DTDA[34-36]或3NTA_DTDA[37，38]的混合物組成的合成脂質體，且與膜囊泡融合。這有效允許任一螯合劑脂質摻入膜囊泡的脂質雙層內。His標記的蛋白質(例如DMS5000)嫁接到所得到的修飾膜囊泡的表面上，從而用配體有效包被囊泡，所述配體允許囊泡特異性靶向所選擇的細胞表面受體。修飾為包含NTA-DTDA或3NTA-DTDA的膜囊泡已用於在小鼠模型中在體內靶向DC [37]。硫酸鎳
以其最終製劑的Lipovaxin-MM包含約10 μ g/mL硫酸鎳(硫酸鎳與NTA-頭部基團 1:1的摩爾比值)，所有這些預期與螯合劑脂質3NTA-DTDA結合。鎳以高親和力(K/10_"M) 結合NTA。因為它以與3NTA-DTDA頭部基團上的NTA部分相同的摩爾比值存在，所以Lipovaxin-MM製劑中的游離鎳濃度預期極低。儘管鎳及其鹽已報導在高水平是有毒和致癌的[39]，但在Lipovaxin-MM內的鎳含量完全在可接受水平內。一般群體通過食物接受大多數鎳，其中西方國家的平均日飲食鎳攝取為69 - 162Pg。因此，即使包含100 μ g鎳的最高劑量的IOmL Lipovaxin-MM也代表不超過鎳的每日飲食攝取W0]。全身性吸收的鎳的排洩主要通過尿；半衰期值是約觀小時，並且在4天內100%的全身性鎳劑量在尿中或作為糞便中的未吸收鎳回收[39]。對於維持透析療法的具有慢性腎疾病的患者可以畫出有趣的平行線，所述患者可以吸收最多100 口8鎳/透析Wl]。研究產物以其最高建議劑量預期遞送與那類治療可比較的鎳數量。為了製備脂質體，在PBS中製備2種脂質的混合物，並且補充有鎳並且所得到的製劑是凍幹的。脂質體作為凍乾粉末貯存，這在配製過程期間在水中重構。DMS5000
DMS5000是具有圖12中所示的胺基酸序列的結構域抗體(dAb)(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID N0:3)，並且對於人DC細胞表面受體DC-SIGN(DC特異性細胞內粘附分子3-結合非整合素) 高度特異。結構域抗體是抗體的最小功能結合單位，並且由人抗體的重(Vh)或輕(VJ鏈的可變區組成。DMS5000是基於其當嫁接到脂質體上時促進含3NTA-DTDA脂質體與人DC-SIGN 表達細胞結合的能力選擇的14，386kDa Vh dAb。SEQ ID NO 1中所示的dAb序列在kr_Thr 殘基後，所述義！·-!!!!·殘基存在於表達載體多接頭中，以容納5 //克隆位點用於表達。無 ST殘基的dAb序列在SEQ ID NO 3中展示。DMS5000使用過程作為分泌蛋白質產生，所述過程涉及蛋白質在大腸桿菌中的產生，隨後為使用流線(Streamline) A蛋白從條件培養基中捕獲蛋白質。進一步的汙染物通過陰離子交換層析去除，並且其餘內毒素通過經過Mustang E濾器去除。透析到最終製劑內隨後進行無菌過濾。最終對所得到的本體蛋白質(bulk protein)實施無菌填充和完成，以產生瓶裝材料用於臨床試驗。DMS5000-螢光脂質體混合物能夠結合DC-SIGN表達細胞一一 DC或任何其他細胞類型，其已進行遺傳修飾，以表達內源人DC-SIGN (例如THP-1/DC-SIGN細胞)一一僅當螯合劑脂質3NTA-DTDA加入脂質體混合物中時(圖2)，從而證實DMS5000與脂質體的結合依賴於 Ni-3NTA-DTDA。共聚焦顯微鏡檢查已使得能夠顯現Lipovaxin-MM和DC-SIGN表達細胞包括人DC之間的相互作用，從而證實它不僅與靶細胞結合，而且它由DC內在化。這證實 Lipovaxin-MM對人DC表面上的DC-SIGN受體的遞送隨後為負荷的胞吞作用和內在化(圖 3)。B)製備
每種成分依照優良實驗室規範(Good Laboratory Practice) (GLP)進行製造，並且當可能時通過適當地被認可的機構，歡分依照優良生產規範(Good Manufacturing Practice) (GMP)進行製備。研究產物通過使膜囊泡與脂質體組成成分和IFN- Y組合且通過超聲處理融合進行配製。DMS5000在最後步驟中在研究產物施用於患者前加入。C)性質 i)藥理學在最高劑量時，患者接受總共7. 449mg P0PC、0. 297mg 3NTA_DTDA、0. 103mg硫酸鎳和 3. 8mg DMS5000。在這些數量時，它們預期具有很少的藥理學後果。ii)分析和表徵
Lipovaxin-MM表徵涉及至少4個參數的分析，所有這些預期直接影響疫苗的效力。首先，測定通過其His標記與Ni-3NTA-DTDA結合的DMS5000嫁接(圖4)。其次，在體外證實疫苗靶向且結合DC-SIGN表達細胞的能力(圖5)。第三，分析疫苗製劑以證實細胞因子IFN-Y與疫苗的物理結合。因為 Lipovaxin-MM的作用方式高度依賴於IFN-γ對靶細胞的遞送，所以細胞因子與疫苗的結合對於其活性是重要的(圖6)。最後，通過蛋白質印跡分析證實黑素瘤相關抗原在疫苗製劑的存在(圖7)。iii)穩定性
下述3個標準用於測量Lipovaxin-MM的穩定性，包括其在貯存後的穩定性(i)疫苗製劑結合人DC-SIGN表達細胞的能力，(ii)保持與囊泡物理結合的IFN- γ的比例，和(iii) 疫苗結合的IFN-Y的生物活性。因為Lipovaxin-MM是脂質體疫苗，所以通過在不存在合適冷凍保護劑的情況下冷凍，構成疫苗的膜雙層對損害敏感。研究產物的貯存因此僅在它不冷凍的溫度是可能的。在4°C，Lipovaxin-MM與DC-SIGN表達細胞的結合保持不變最多 4周時間段(圖8)。總IFN-Y活性穩定最多4周，但它看起來隨著在4°C的貯存時間增加與疫苗進行性解離(圖9)。D )研究產物 i)配製
每個劑量的Lipovaxin-MM在其施用於患者前不超過6小時由醫院藥劑師配製。研究產物由4種混合前組分配製MM200膜囊泡、凍幹的P0PC/Ni-3NTA-DTDA脂質體、IFN- γ和 DMS5000。對於0. ImL和ImL劑量，製備2mL研究產物；對於IOmL劑量，製備6 χ 2mL研究產物，並且在施用於患者前合併。具有SEQ ID NO :1中所示序列的DMS5000作為分泌蛋白質在包含載體 PET30-GAS-DMS5000 的大腸桿菌 BL21 (DE3)中產生。pET30-GAS_DMS5000 是 pET30 (Invitrogen)的衍生物，其在DMS5000的N末端上摻入通用GAS前導信號肽(例如在WO 2005/093074中描述)。蛋白質通過一系列層析步驟從發酵分批的培養上清液純化，包括流線PrA (以捕獲正確摺疊的dAb分子)、SP瓊脂糖(陽離子交換純化)和Mustang E (去除內毒素汙染物)。純度通過等電聚焦顯示為>95%，通過尺寸排阻層析>95%，並且通過反相高壓液相層析>80%。內毒素水平是89%純度。GMP 級另U 的 POPC 購自 Avanti Polar Lipids (目錄號 770557，批次 # GN160181PC-23)。PuratroniC 級另Ij 的 NiSO4 (99. 9985%)已購自 Alfa Aesar, Johnson MattheyGmbH & Co. KG (Zeppelinstrasse 7 - D-76185 Karlsruhe，德國);原料編號 10820 批次編號22818 ；CAS# 15244-37-8。使材料過濾滅菌，並且通過基於Canberra的公司RadPharm Scientific通過無菌填充和完成以在無菌水中的0. 6mg/L以2mL/小瓶(1. 2mg NiSO4硫酸鹽/小瓶)分配。凍幹脂質體如下製備在PBS中配製3NTA-DTDA，並且在乙醇中配製P0PC。使每種溶液過濾滅菌且隨後混合。將無菌NiSO4W入混合物中，所述混合物在混合完成後以足以產生2mL研究產物的數量無菌分配到個別小瓶內。使材料最後冷凍乾燥且就無菌性、純度和活性進行測試。貯存材料的穩定性以常規間隔進行測試，直至最後一個患者已完成他/她的疫苗接種時間表。本體抗原如下製備生產使得匪200細胞在無血清AIM-V培養基(目錄號 0870112DK)中的繁殖成為必需，那些細胞在PBS中的收穫和最終膜囊泡的產生也在PBS中。 在囊泡生產前，收穫細胞就外來試劑和純度進行測試。膜囊泡製劑的隨機等分試樣也就外來試劑和黑素瘤抗原存在進行測試。ii)最後劑型和呈遞
研究產物在PBS中配製。當施用IOmL研究產物時，製備6 (六)批Lipovaxin-MM，並且在研究產物施用於患者前，分批在配製後在單個小瓶中組合。配製和分批合併由醫院藥劑師使用無菌技術在II類層流櫥中執行。研究產物在外觀中是混濁的，並且當靜置時具有沉降趨勢(研究產物的粒狀外觀與DMS5000在囊泡表面上的成功嫁接相關)。iii)貯存和處理
Lipovaxin-MM配製前組分應存在於-20 °C，除如由製造商推薦的應貯存於4 °C的 IFN-y (Imukin, Boehringer hgelheim，德國)外。在醫院藥房配製後，研究產物應貯存於4°C不超過6小時。研究產物必須通過小瓶的反覆倒轉進行混合，但在其施用於受試者前不應進行渦旋。iv)施用
組合物通過直接緩慢靜脈內施用進行施用。2)體外研究Lipovaxin-MM對DC標記的作用
在體外生成的單核細胞衍生的樹突細胞可以用於測試Lipovaxin-MM對DC成熟的特異性作用。為了達到這點，由外周血單核細胞製備單核細胞祖細胞，所述外周血單核細胞在體外在IL-4和GM-CSF混合物的存在下培養5-6天，在這個階段結束時這些細胞表達標記 DC-SIGN。當Lipovaxin-MM與人單核細胞衍生的DC在體外共培養時，許多DC成熟標記包括CD64、CD40、CD86、CD80和HLA-ABC以及程度較少的HLA-DR上調，並且在條件培養基中檢測出細胞因子IL-12。標記的上調僅在疫苗攜帶IFN-Y時發生，證實在體外抗原單獨的遞送可以刺激足夠的成熟，並且當經由DC-SIGN靶向特異性遞送至DC時是最高的。來自非臨床研究的證據暗示在體外Lipovaxin-MM能夠特異性靶向人DC標記DC-SIGN，用於將其抗原負荷遞送至DC，最可能經由由這種受體觸發的胞吞途徑。 Lipovaxin-MM至DC-SIGN的靶向也伴隨DC成熟細胞表面標記以及IL-12產生中的特異性增加，所述IL-12是在未致敏T細胞分化成Thl細胞中重要的細胞因子。
3)非臨床研究
在體內，研究已局限於已知表達DC-SIGN同系物的那些動物物種，具有與在人中可見的那些一致的模式。已使用2個物種，普通狨猴和獼猴，但最終發現僅獼猴對於免疫原性研究相關。在獼猴中，Lipovaxin-MM顯示在測試的2個劑量誘導細胞介導的和體液免疫應答， 儘管在體外其結合/靶向獼猴DC-SIGN的能力顯示顯著低於其結合/靶向人DC-SIGN的能力的事實。即使在最高劑量也未見顯著不良反應，除僅在2隻不同動物中的第二次劑量後 7天可見的一個AST水平中的暫時增加和一個ALT水平中的暫時增加外。與疫苗接種前的水平比較，膽固醇、甘油三酯和LDL水平在所有4隻動物中在研究結束時一致地更低，而HDL 水平在所有4隻動物中在4次疫苗接種系列後一致地更高。i )在小鼠模型中的概念證明(PROOF OF CONCEPT)研究
概述在小鼠中進行用於Lipovaxin平臺的概念證明研究。因為DC-SIGN不由小鼠樹突細胞表達，所以這個研究調查疫苗至DEC-205受體一一由小鼠DC表達的C型凝集素的靶向。研究顯示來自高轉移性鼠類黑素瘤(B16-0VA)的膜囊泡的粗製劑可以在體內靶向DC， 以引發功能效應。當在同基因小鼠中使用時，B16-0VA疫苗刺激脾臟T細胞中的強CTL應答，並且誘導針對腫瘤生長的顯著保護。保護依賴於抗原和DC成熟信號的同時遞送。給用 B16-0VA細胞攻擊的小鼠施用B16-0VA-DC靶向疫苗誘導顯著的免疫治療效應和延長的無疾病存活。詳細地進行動物研究以在鼠類B16-0VA黑素瘤癌症模型中測試Lipovaxin平臺技術[37]。在這個研究中使用的疫苗配製不同於Lipovaxin-MM，並且對於這種動物模型特異。鼠類B16-0VA黑素瘤癌症模型是高轉移性腫瘤，其當靜脈內接種到小鼠內時，通過其最初轉移至肺並且隨後至其他器官的能力，引起動物中的癌症和死亡。Lipovaxin平臺用於構建由培養B16-0VA細胞製備或以修飾為摻入OVA或SIINFEKL肽的脂質體形式的疫苗。在所有情況下，使用對於標記DEC-205特異性的kFv確保對於DC的靶向，並且包括免疫調節細胞因子幹擾素Y作為『危險信號』。用1.5 χ IO5 B16-0VA黑素瘤細胞接種6隻C57B1/6 小鼠的組，並且隨後在腫瘤接種後第3、6和9天時，將PBS或疫苗(包含kFv嫁接B16-0VA 衍生MV的2 χ IO5細胞等價物)靜脈內施用於小鼠。對照動物發展大量腫瘤負載，到第16 天時在肺中具有250士37腫瘤病灶的平均值(動物在第22天時實施安樂死)。與之鮮明對比，接種疫苗的小鼠直到腫瘤攻擊後8個月未顯示腫瘤發展的任何體徵。修飾的MV在這個系統中也誘導針對腫瘤的保護性免疫。用疫苗(包含^Fv嫁接B16-0VA衍生MV的2 χ IO5 細胞等價物)免疫接種的小鼠就其抵抗用B16-0VA細胞的i.v.攻擊的能力進行檢查。在腫瘤攻擊後16天定量肺轉移灶時，與對照小鼠比較，接種疫苗的小鼠顯示低得多的轉移灶數目，但僅在「危險信號」 IFN-Y或LPS摻入疫苗內時。研究成功證實從用修飾MV接種疫苗的小鼠中分離的脾細胞顯示最大限度CTL活性，當MV靶向DC (經由DEC205或⑶lie)且包括相關危險信號(IFN-γ或LPS)時。研究因此證實使用Lipovaxin技術產生的疫苗在這個動物模型中在抑制B16-0VA腫瘤生長和轉移方面是有效的，並且這種方法可以極大地簡化在人中用於基於DC的癌症疫苗生產和免疫療法的目前策略。ii) Lipovaxin-MM 狨猴研究
概述在普通狨猴(狨猴(feBiiArix jacchus)) 一一在生物醫學研究中使用的最小非人靈長類中進行Lipovaxin-MM的起始研究。在狨猴中，通過免疫組織化學(使用抗人DC-SIGN mAb)在脾臟和淋巴結中檢測出DC-SIGN表達。當狨猴研究起始時，預期在DMS5000 和狨猴DC-SIGN之間一定程度的交叉反應性，但無法證實。動物以每周間隔接受0. 06mL疫苗的5個劑量(等價於基於狨猴中的重量標定的IOmL人劑量的劑量)。處理是完全耐受的但未觀察到免疫原性的顯著證據。隨後發現當用於刺激狨猴外周血單核細胞時，在製劑中包括的『危險信號』(人)IFN-Y在體外具有減少的生物活性。這鑑定為Lipovaxin-MM在這些動物中明顯缺乏免疫原性的可能原因。自從那個研究完成後，狨猴DC-SIGN基因的克隆已促進了使用細胞的更廣泛結合研究，所述細胞已修飾為表達狨猴DC-SIGN。這些研究目前指出Lipovaxin-MM與狨猴DC-SIGN的結合至少在體外是最低限度的。Lipovaxin-MM 對於狨猴DC-SIGN明顯減少的親和力與那些動物中減少的IFN-Y活性組合應明顯損害 Lipovaxin-MM在那些動物中誘導可檢測的免疫應答的能力。詳細地普通狨猴(狨猴)是在生物醫學研究中使用的最小非人靈長類。在狨猴中， 通過免疫組織化學(使用抗人DC-SIGN mAb)在脾臟和淋巴結中檢測出DC-SIGN表達。當狨猴研究起始時，預期在DMS5000和狨猴DC-SIGN之間一定程度的交叉反應性。2組動物(每個組中3隻動物)以每周間隔接受0. 06mL疫苗的5個劑量。2個組在用於嫁接到疫苗表面上的dAb中不同一一一個組接受用DMS5000嫁接的疫苗，並且第二個用『假的dAb』 (無特異性靶的dAb)嫁接。在等價於IOmL人劑量的劑量時(基於狨猴中的重量標定)，不存在與反覆施用相關的嚴重不良反應。動物重量是相對穩定的。未觀察到血液學參數中的顯著改變。 白細胞亞組分析鑑定在所有6隻動物中循環髓樣DC中的增加。已接受靶向疫苗的動物顯示循環類漿細胞DC中的降低。在劑量1後報導皮疹，這在已接受非靶向Lipovaxin-MM的動物腹部上最明顯。僅在劑量5後皮疹在非靶向疫苗組的動物中復發。動物無一看起來處於任何不適。未觀察到免疫原性的顯著證據。隨後發現當用於刺激狨猴外周血單核細胞時，在製劑中包括的『危險信號』(人)IFN-y在體外具有減少的生物活性。這鑑定為明顯缺乏免疫原性的可能原因。自從那個研究完成後，狨猴DC-SIGN基因的克隆已促進了使用細胞的更廣泛結合研究，所述細胞已修飾為表達狨猴DC-SIGN。這些研究目前指出Lipovaxin-MM 與狨猴DC-SIGN的結合至少在體外是最低限度的。iii)在豬尾獼猴中的Lipovaxin-MM免疫原性
概述在非人靈長類豚尾猴(ifecaca(豬尾獼猴)中進行Lipovaxin-MM的
最後測試。選擇這個動物物種是因為與其人配對物比較，獼猴DC-SIGN受體在胺基酸水平上是高度保守的，並且執行作為胞吞受體的類似功能。DC-SIGN表達細胞在獼猴中的組織分布也一般對應於在人組織中可見的那種，僅具有一些較小差異。在研究中測試2組動物， 其在施用於動物的疫苗劑量中不同。4隻動物施用Lipovaxin-MM的3個0. 6mL劑量(這等價於基於體重按比例減少的IOmL人劑量)，並且4隻動物以4周間隔施用Lipovaxin-MM的 5mL劑量(50%最高提議的人劑量，未就動物重量調整)。疫苗在鎮靜狀態下靜脈內施用到隱靜脈內。儘管Lipovaxin-MM與獼猴DC-SIGN的體外結合研究已確定dAb以比它與其人配對物低得多的親和力與獼猴DC-SIGN受體結合，但研究證實疫苗能夠誘導在較高劑量組的動物中最明顯的可檢測水平的疫苗特異性抗體，和在較低組的動物中最明顯的細胞介導的應答(基於通過在疫苗接種後收集的PBMC的細胞因子生產檢測的)。詳細地在豬尾獼猴(豚尾猴)中進行Lipovaxin-MM的研究。通過豬尾獼猴外周血單核細胞(PBMC)的體外刺激測定證實人IFN-Y是生物學活性的。因此不存在關於疫苗的危險信號的生物活性的懷疑。獼猴DC-SIGN胺基酸序列是可容易獲得的，且已知在凝集素結合區一一用於生成DMS5000的相同區域中與人DC-SIGN的胺基酸序列 93%等同。因為針對人DC-SIGN產生的許多單克隆抗體已知與獼猴DC-SIGN交叉反應W2，43]，所以已預料 DMS5000與獼猴DC-SIGN —定程度的交叉反應性。然而，使用單核細胞衍生的獼猴DC和已修飾為表達外源獼猴DC-SIGN的THP-I細胞的Lipovaxin-MM體外研究鑑定，DMS5000對於豬尾獼猴DC-SIGN具有比人DC-SIGN更低的親和力。設計在8隻豬尾獼猴中的Lipovaxin-MM 研究，以提供支持用於首次在人中(first-in-human)的I期臨床試驗的應用的安全和免疫原性信息。已知Lipovaxin-MM顯示以比人DC-SIGN更低的親和力靶向獼猴DC-SIGN，應當理解研究可能低估了疫苗在這種動物模型中的潛在免疫原性。在研究中測試了 2個劑量 (0. 6mL和5mL)。較低劑量等價於基於70kg的平均人重量和4kg的動物重量按比例減少的 IOmL人劑量。較高劑量等價於最高提議人劑量的50%絕對體積，這也是在動物機構的指導下可以施用於動物的最大限度體積。這等價於最高人劑量的約8倍，如果它基於獼猴體重標定。將獼猴分成4隻動物的2個組。第一個組接受以4周間隔的0.6mL Lipovaxin-MM的 3個劑量，並且第二個組接受5mL Lipovaxin-MM的3個劑量。如由WHO指導推薦的，在劑量 3後7天，第二個組中的動物也接受Lipovaxin-MM的另外劑量。所有4隻動物在這個第四個劑量後7天處死，作為安全研究的部分。2個Lipovaxin-MM劑量都導致早在第一個劑量後 7天通過PBMC的細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6產生(圖9)，但Lipovaxin-MM特異性抗體僅在接受較高劑量的Lipovaxin-MM的動物中檢測出。這指出在獼猴中由Lipovaxin-MM 誘導的免疫應答類型受施用的疫苗劑量影響，並且較低劑量的疫苗看起來在刺激細胞介導的免疫應答方面(這對於抗腫瘤應答是關鍵的)是有效的，而較高劑量能夠誘導體液免疫。 因此，儘管DMS5000對於獼猴DC-SIGN的較低親和力，Lipovaxin-MM在已接種疫苗的動物中仍能夠刺激可檢測的疫苗特異性免疫應答。a)概述
在上文概述的豬尾獼猴研究中，4隻動物施用5mL Lipovaxin-MM的4個劑量(50%的實際最高提議人劑量)。當以那個劑量施用時，疫苗是完全耐受和安全的。在第35天在2隻動物中觀察到氨基轉移酶水平中的增加(2隻不同動物中的2種不同酶)時，觀察到唯一異常讀數。增加是暫時的，因為它對於那2隻動物在劑量3或4後或在研究中的任何其他動物未觀察到。在屍檢時，在脾臟和淋巴結中觀察到多病灶濾泡增生。這個觀察暗示Lipovaxin-MM 已由DC加工。對於所有動物，還在肺、腸和肝臟中鑑定出淋巴樣組織的增生。對於人和獼猴中的所有3個器官中的DC已報導DC-SIGN的表達。因此，儘管DMS-5000對於獼猴DC-SIGN 的較低親和力，疫苗在已報導表達DC-SIGN的這些免疫器官中仍成功誘導反應。淋巴樣器官明顯增加的反應性表明活躍免疫應答。b)血液學
在每次抽血時，進行常規血液學測試實驗對象組(panel)，這包括白細胞計數、紅細胞計數和血小板計數。還評估了血紅蛋白、血細胞比容、MCV和MCHC水平。測試結果與對於獼猴公開的『正常』值比較。白細胞總數對於每個個體在各個時間點時不同，但未顯示一致趨勢。紅細胞總數在研究期間保持相對不變。所有值看起來都在『正常』範圍內。應當指出除一隻動物外，在研究結束時在外周血中的淋巴細胞百分比一般高於在研究開始時。相反地，與起始值比較，嗜中性粒細胞百分比在研究結束時一般更低。C)血液生物化學
基於關於天冬氨酸氨基轉移酶(AST或SG0T)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT或SGPT)的血液氨基轉移酶水平，在Lipovaxin-MM施用後監控動物肝功能。2種酶的水平在各個時間點時在每隻動物之間顯著不同，但一般在公開的『正常』水平內，除在研究的第35天時的2個讀數外。在第35天時，在一隻動物中觀察到高AST水平，並且在第二隻中鑑定出高ALT水平。2個值在研究的第35天時都升高超過正常值，但在第42天時或在任何後續時間點時則不是；這些在表2中列出。表1毒理學研究自始至終的獼猴肝臟AST和ALT水平。在研究的第35天時觀察到的2個異常讀數是有下劃線的。AST =天冬氨酸氨基轉移酶，ALT =丙氨酸氨基轉移酶， 酶活性以單位/升測量。d)屍檢
組織病理學檢查揭示所有淋巴樣組織的多病灶濾泡增生，這與細胞免疫應答一致。在所有動物的脾臟、肺和腸中觀察到多病灶濾泡增生(表3)。來自4隻動物中的2隻的肝臟樣品顯示輕度多病灶血管周單核細胞浸潤的證據。相同2隻動物在研究的第35天時已回到高AST和ALT結果。表2作為毒理學研究的部分進行的組織病理學檢查概述。NSL 無特異性損害
權利要求
1.一種組合物，其包含a)一種或多種抗原；b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域；和c)攜帶a)和b)的載體。
2.根據權利要求1的組合物，其進一步包含d)免疫調節因子。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中a)—種或多種抗原衍生自膜囊泡(MV)。
4.根據權利要求3的組合物，其中所述膜囊泡包含膜相關抗原。
5.根據權利要求4的組合物，其中所述膜相關抗原是腫瘤抗原。
6.根據權利要求5的組合物，其中所述膜相關抗原包含選自黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-I以及癌症睪丸抗原MAGE-A3、MAGE A_10、BAGE, GAGE和XAGE的腫瘤抗原。
7.根據權利要求1-6中任一項的組合物，其中所述膜囊泡衍生自腫瘤細胞、黑素瘤細胞或MM200黑素瘤細胞。
8.根據權利要求1-7中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是重鏈dAb片段。
9.根據權利要求8的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是Vh dAb片段。
10.根據權利要求1-9中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 3 (DMS5000)。
11.根據權利要求1-10中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域進一步包含多組氨酸C末端尾。
12.根據權利要求1-11中任一項的組合物，其中所述載體是脂質體。
13.根據權利要求12的組合物，其中所述脂質體包含脂質體組成成分。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述脂質體組成成分包含螯合劑脂質3(氮川三乙酸)-雙十四胺(3NTA-DTDA )。
15.根據權利要求13或14中任一項的組合物，其中所述脂質體組成成分包含硫酸鎳 (NiSO4)0
16.根據權利要求13-15中任一項的組合物，其中所述脂質體組成成分包含脂質α-棕櫚醯-β -油醯-磷脂醯膽鹼(P0PC)。
17.根據權利要求2-16中任一項的組合物，其中所述免疫調節因子是細胞因子幹擾素 Y (IFNi)。
18.根據權利要求1-17中任一項的組合物，其中所述組合物是疫苗組合物。
19.一種用於製備根據權利要求1-18中任一項的組合物的方法，其包含i)製備膜囊泡；ii)製備脂質體組成成分；iii)使所述膜囊泡和所述脂質體組成成分與免疫調節因子組合；iv)加入抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域。
20.根據權利要求19的方法，其中所述膜囊泡的製備通過使腫瘤細胞繁殖，超聲處理且經由離心和重懸浮於PBS中製備膜團塊來進行。
21.根據權利要求19或20的方法，其中所述脂質體組成成分通過使POPC和 N1-3NTA-DTDA混合進行製備。
22.根據權利要求19-21中任一項的方法，其進一步包含補充有鎳。
23.根據權利要求1-18中任一項的組合物，其用作藥物。
24.根據權利要求1-18中任一項的組合物，其用於癌症治療。
25.根據權利要求M的組合物，其中所述癌症是黑素瘤。
26.根據權利要求23-25中任一項的組合物，其用於靜脈內施用。
27.一種用於治療受試者中的腫瘤的方法，其包含施用如權利要求1-18中任一項要求保護的組合物。
28.如前述權利要求中任一項要求保護的組合物或方法，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是具有與具有如SEQ ID NO :1或3中所示胺基酸序列的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域相同的結合特異性的那種結構域。
29.如前述權利要求中任一項要求保護的組合物或方法，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域是具有與SEQ ID NO :1或3中所示胺基酸序列相同的CDR序列的那種結構域。
全文摘要
本發明涉及用於靶向樹突細胞的組合物。特別地，本發明涉及組合物，其包含a)一種或多種抗原；b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結構域；和c)攜帶a)和b)的載體。本發明進一步涉及包含此類DC-SIGN分子的製劑、組合物和裝置，及其作為藥物和在癌症治療適當地是黑素瘤治療中的用途。
文檔編號A61K39/00GK102281867SQ200980151699
公開日2011年12月14日 申請日期2009年10月19日 優先權日2008年10月21日
發明者帕裡什 C., 阿特莫蘇卡託 I., 奧爾丁 J., 普賴斯 J., M. 德 維爾德特 R. 申請人:利珀特克股份有限公司, 杜門蒂斯有限公司