抗愛滋病分泌型重組bcg疫苗的製作方法

2024-04-05 03:33:05

專利名稱：抗愛滋病分泌型重組bcg疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有分泌 融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG菌(Mycobacterium bovis BCG以下簡稱「BCG」)的疫苗，所述融合蛋白質是由外來抗原肽插入含有信號肽的載體蛋白質分子表面得到的。作為具體實施例，可以舉出作為載體的含有信號肽的分泌蛋白質是來自抗酸菌的α抗原、外來抗原肽是愛滋病毒表面抗原的抗原肽的疫苗，此疫苗可用於愛滋病的治療和預防。
背景技術：
自1988年建立BCG的轉化體系開始，已嘗試用重組DNA技術改良BCG，並將其用作抗各種病原體的疫苗[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，6987(1988)]。
BCG是牛型結核菌的弱毒株，是用於人體的唯一被認可的活菌苗。其特徵有毒性弱、安全，具有較高的佐劑活性，效果持續，廉價，耐熱性好，可經口服用。因此人們期望如果改良BCG使之表達抗原，即抗各種病原性細菌和病毒的抗原，這將是極有效疫苗的研製中的先鋒。
其後建立了分泌和表達目的外來抗原的BCG體系[Infect.Immun.，58，4049(1990)]，並期待將其用於疫苗。實際上，已開發了能夠表達和分泌通過將來自堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)的α抗原作為載體與愛滋病毒HIV-1的gag p17的抗原部位(9個胺基酸)融合得到的融合蛋白質的抗酸菌[Infect.Immun.，58，4049(1990)]。另外，據稱為HIV-1的感染防禦抗原之一的表面抗原中存在的第三可變區域(以下簡稱為V3區域或V3抗原決定基)中的15個胺基酸殘基構成的肽的表達和分泌也獲得成功[Vaccine 12，153(1994)]。該V3區域的15個胺基酸殘基構成的肽含有殺傷T細胞抗原決定基和B細胞抗原決定基兩者。它們均以來自抗酸菌的α抗原作載體，在α抗原的C末端附近的位置融合外來抗原肽。也就是說，抗酸菌分泌融合蛋白質。
然而，即使給小鼠接種能分泌V3區域的15個胺基酸殘基構成的肽和來自抗酸菌的α抗原的融合蛋白質的BCG，雖然顯著誘導了殺傷T細胞，但抗體產生的水平不如期待的那樣高。
除BCG外，最近在利用病毒載體的疫苗的開發研究方面取得了進展。例如將以流感病毒的表面蛋白質血細胞凝集素[J.Virol.67，6659(1993)]和脊髓灰質炎病毒的表面蛋白質VP-1[J.Virol.66，3161(1992)]為代表的載體蛋白分別與V3抗原決定基融合產生融合蛋白質，利用重組DNA改良這些病毒使得能夠表達融合蛋白質。用如此得到的嵌合體病毒免疫動物的例子已有報導。已知用這些嵌合體病毒免疫的動物可有效地產生抗V3抗原決定基的抗體。
來自上述病毒的載體蛋白的高級結構已被闡明。在上述融合蛋白質中，外來抗原肽插入存在於載體蛋白的分子表面且易成為B細胞抗原決定基的環部位插入的。發明的公開本發明的目的是開發含有分泌融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG的疫苗，所述融合蛋白質是將外來抗原插入含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面得到的。本發明的進一步的目的是使BCG可用作疫苗。具體地說，是將含有信號肽的載體分泌蛋白質與外來抗原肽融合得到融合蛋白質，以此製備能表達並分泌融合蛋白質的BCG疫苗，並且修飾該融合蛋白質使之可作為抗原決定基被殺傷T細胞識別，作為抗原決定基被B細胞識別，因此它可以有效地誘導殺傷T細胞，顯著提高抗體產生的水平。
當給小鼠接種能分泌由V3區域中15個胺基酸殘基組成的肽和來自抗酸菌的α抗原的融合蛋白質的BCG菌時，雖然可顯著誘導殺傷T細胞，但不象所想的那樣顯著提高產生抗體的水平。
另外，目前已明確V3區域抗體用於黑猩猩後可抵禦HIV-1的感染[Nature 345，622(1990)]。因此目前研究愛滋病疫苗的主攻方向是開發作為疫苗有效成分的能夠誘導產生抗V3區域的抗體的蛋白質。具體地說，可使用含有V3區域的表面抗原gp120作為疫苗，所述抗原是通過基因重組的方法改變動物細胞及昆蟲細胞產生的。可是該疫苗的效果並不理想。
在任何情況下抗原都可以顯著誘導產生V3區域的抗體，這個抗體能抑制愛滋病毒的增殖，而且有預防感染的作用，但至今為止，效果還不很明顯。因此，若製造能夠顯著地誘導產生具有抑制愛滋病毒的增殖、並且能預防感染活性的抗體的抗原並以此作為疫苗使用，這種疫苗將會成為極有希望的疫苗。
本發明人考慮到，即使在來自抗酸菌的α抗原的C末端的位置融合由V3區域的15個胺基酸殘基組成的肽，V3抗原決定基也很難呈現出在愛滋病毒表面抗原中其本來的構象，因此，該抗原決定基很難被B細胞識別。鑑於此，本發明人考慮製備能分泌融合蛋白質的BCG並以此作為疫苗。所述融合蛋白質是通過在含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面插入外來抗原肽得到的。
因此，來自抗酸菌的及高級結構已知的載體蛋白是必要的，但是，對以本發明中使用的α抗原為代表的來自抗酸菌的蛋白質的高級結構未作過解析。
本發明人已明確，當以來自抗酸菌的α抗原作為載體表達並分泌外來抗原肽時，使其在來自抗酸菌的α抗原的何種位置融合，從而可以達到最高的抗原性，並成功地開發了能顯著誘導產生抗所述外來抗原的抗體的疫苗，以此完成了本發明。更詳細地說，通過對位於來自抗酸菌的α抗原的胺基酸序列預測為親水性的區域中的成為α抗原自身的B細胞抗原決定基的區域進行預測和確定，在其附近插入外來抗原肽，可以成功地使BCG分泌具有高抗原性的融合蛋白質，因而成功地開發了能夠誘導產生具有防治該病原體感染的抗體的疫苗。
也就是說，本發明提供了含有分泌融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白質是在含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面插入外來抗原肽得到的。
作為含有信號肽的載體分泌蛋白質，可舉出來自抗酸菌的α抗原。本發明優選的疫苗是含有分泌融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白質是在該α抗原的第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基之間插入外來抗原肽得到的。
作為外來抗原肽，可以舉出愛滋病毒表面抗原的抗原肽，特別是愛滋病毒的第三可變區域的抗原肽。
本發明最理想的疫苗是含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是由Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile GlyPro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列號1)19個胺基酸殘基構成的第三可變區域的抗原肽，特別是用於治療及預防愛滋病的疫苗。
本發明其他理想的疫苗是含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是由Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu GluLeu Asp Lys Trp Ala(序列號13)13個胺基酸構成的來自gp41的抗原肽，特別是用於治療及預防愛滋病的疫苗。
本發明的其他理想疫苗是含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是以下的由19或18個胺基酸殘基構成的第三可變區域的抗原肽，特別是用於治療及預防愛滋病的疫苗。Asn Thr Arg Lys Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe TyrAla Thr Gly Asp(序列號14)(亞型A西、中非)Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe TyrThr Thr Gly Glu(序列號15)(亞型B南北美洲、歐洲、亞洲)Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe TyrAla Thr Gly Glu(序列號16)(亞型C南、中非)Asn Thr Arg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu TyrThr Thr Arg(序列號17)(亞型D中非)Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe TyrArg Thr Gly Asp(序列號18)(亞型E泰國、中非)附圖的簡要說明

圖1是為了確定α抗原自身的B細胞抗原決定基而進行的Western blotting解析圖。左邊的圖(例1、2、3)是使用抗來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原的多克隆抗體的結果。右邊的圖(例4、5、6)是使用抗來自BCG的α抗原的多克隆抗體的結果。
例1、4是大腸桿菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289)的菌體提取物的電泳圖，所述菌株攜帶表達β-半乳糖苷酶的質粒pUR 289。例2、5是大腸桿菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289+α-Leu 38-Ala57)的菌體提取物的電泳圖，所述菌株攜帶表達β-半乳糖苷酶和具有α抗原的第38位的Leu殘基至第57位的Ala殘基的序列的肽融合而成的蛋白質的質粒pUR 289+α-Leu 38-Ala 57。
例3、6是大腸桿菌EQ 192株(EQ 192/pUR 289+α-Ser184-Asn 203)的菌體提出物的電泳圖，所述菌株攜帶表達β-半乳糖苷酶和具有α抗原的第184位的Ser殘基至第203位的Asn殘基的序列的肽融合而成的蛋白質的質粒pUR 289+α-Ser 184-Asn 203。
箭頭表示分子量約為12萬的β-半乳糖苷酶融合蛋白質的位置。
圖2是表示分泌和表達α抗原和HIV-1V3抗原決定基的融合蛋白質的載體的構建的策略圖。斜線的區域表示含有來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原(圖中用α-K表示)的DNA片段，白色區域表示含有抗酸菌質粒的複製開始區域的DNA片段，深色點的區域表示HTLVIIIB株的V3抗原決定基的15個胺基酸的合成基因，淺色點的區域表示HIV日本株V3抗原決定基的19個胺基酸的合成基因。Amp、Km、Cm則分別表示氨比西林、卡那黴素和氯黴素的耐性基因。pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)、pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)分別表示來自HTLVIIIB株的V 3抗原決定基基因導入PstI和XhoI位點的質粒，pIJK-V3(HIV日本株-XhoI)表示HIV日本株共有序列的V3抗原決定基導入XhoI位點的質粒。
圖3表示對攜帶重組分泌載體的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)及BCG的培養上清液中的蛋白質的western blotting解析結果。
例1是攜帶pIJK-1的恥垢分枝桿菌的對照培養上清液的電泳結果。
例2是攜帶pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自HTLVIIIB株的15個胺基酸構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合而成的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
例3是攜帶pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自HTLVIIIB株的15個胺基酸構成的肽在α抗原的第280位的Gln殘基的位置融合而成的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
例4與例1相同。
例5是攜帶pIJK-V3(日本株-XhoI)的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自日本株的19個胺基酸構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合而成的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
例6是攜帶pIJK-1的牛分枝桿菌BCG的對照培養上清液的電泳結果。
例7是攜帶pIJK-V3(日本株-XhoI)的牛分枝桿菌BCG的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自日本株的19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合而成的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
為標記例1、2、3，使用了能識別HIV-1 HTLVIIIB株的V3抗原決定基的中和單克隆抗體gp120N。
為了標記例4、5、6，使用了能識別HIV-1日本株的共有序列的V3抗原決定基的中和單克隆抗體μ5.5。
在分子量約32000的位置可以確認融合蛋白質的帶。
圖4表示小鼠中CTL誘導的結果。橫軸表示效應細胞與靶細胞的比率，縱軸表示受到特異性溶胞的靶細胞的比率。BCG-α是僅表達α抗原的BCG的免疫結果，BCG-V3是表達V3抗原決定基的BCG的免疫結果。H2d/BCG-V3表示使用P815細胞作為靶細胞的結果，H2k/BCG-V3表示使用SW147細胞作為靶細胞的結果。
圖5表示豚鼠中產生的抗體的臨床分離病毒的中和測定的結果。A表示從2個日本人的HIV載體分離的用於測定的病毒的V3區域的胺基酸序列。框圍起來的陰影部分表示中和抗原決定基的區域。B是用抑制率表示的體外中和測定的結果。GP-1及GP-2分別表示使用各有20隻豚鼠的第一組、第二組的血清免疫球蛋白的結果，黑條、帶斜線條及帶點線條分別表示以50、10、1μg/ml的濃度將免疫球蛋白加入測定體系的結果。縱軸表示以不加抗體時的培養上清液中的p24抗原量為對照加入抗體時的p24抗原的減少率(感染抑制率)。
圖6表示用ELISA法測定的泰國A和B型V3肽的交叉反應性的結果。黑點是使用BCG-V3免疫的豚鼠血清的情況，白點是使用沒有進行BCG免疫的正常豚鼠的血清的情況。縱軸表示ELISA的發色劑對硝基苯酚在414nm處的吸光強度。
圖7表示2隻BCG-V3免疫獼猴的抗V3抗體隨時間的變化情況，白點表示#2797猴，黑點表示#2799猴，縱軸是用與V3肽的結合滴定度表示的。10*8表示108。
圖8表示使用BCG-V3免疫4周後的獼猴血清抗體進行的HIV-1MN株中和測定結果。#2796、#2797表示接種30mg BCG-V3的猴，#2798、#2799表示接種5mg BCG-V3的猴，黑條、帶深點條、帶淺點條分別表示在測定體系中加入濃度為10、3、1μg/ml的免疫球蛋白時的情況。μ5.5是作為正極對照物的中和單克隆抗體。縱軸同圖5一樣，表示HIV-1p24抗原產生的抑制率。
圖9表示具有日本株型V3序列的HIV-1-SIV嵌合體病毒NM-3rNJ1的構建的概略圖。白條表示SIVmac(獼猴屬的猴產生的SIV)產生的DNA，黑條表示HIV-1(HTLVIIIB)產生的DNA，帶淺色點條表示含有日本型V3區域的DNA。
圖10是以病毒免疫攻擊後第4周的病毒負荷表示的嵌合體病毒感染防禦試驗的結果。橫軸表示與M8166細胞共培養所用的猴末梢血單核細胞的數目，縱軸用p27抗原濃度表示共培養一周後的培養上清液中的嵌合體病毒量。白色方塊表示沒有進行BCG免疫的正常猴，黑點、白點分別表示使用#2797、#2799的末梢血單核細胞的情況。
圖11表示gp41中和抗原決定基(6個胺基酸及13個胺基酸)由BCG分泌表達的結果。例1、2、3分別是對BCG-α、BCG-gp41-X6、BCG-gp41-X13的培養上清液的蛋白質進行15％SDS-PAGE分離後的western blotting分析結果。為了標記，使用識別HIV-1gp41的中和單克隆抗體2F5。
實施此發明的最佳方式下面，詳細說明本發明。
構成本發明的含有信號肽的載體分泌蛋白質是由BCG分泌的蛋白質。
作為具體實施例，可以舉出來自抗酸菌的α抗原。特別理想的是在後面實施例中所用的來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原，這種α抗原是廣泛地存在於其他抗酸菌種中的交叉反應性蛋白質。到此為止，有五種α抗原的一次結構已明確，它們來自BCG[J.Bacteriol.170，3847(1988)]、堪薩斯氏分枝桿菌[Infect.Immun.58，550(1990)]、鳥分枝桿菌(M.avium)[Infect.Immun.61，1173(1993)]、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)[Biochem.Biophys.Res.Commun.196，1466(1993)]、以及麻風分枝桿菌(M.leprae)[Mol.Microbiol.6，153(1992)]。在胺基酸序列的水平下它們具有80％程度的高同源性。並且比較其hydropathyprofile(親水性·疏水性圖)，由於非常相似，在分子表面的親水性區域的位置可以在各種的α抗原間存在。因此，來自各種抗酸菌種的α抗原都可以用作載體。
確定含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面的位點在該蛋白質的胺基酸序列中的哪個位點的方法是以明確了的該蛋白質的高級結構為基礎進行的。但是，要對蛋白質的高級結構完全了解，則是非常困難的。因此，實際上首先用Hopp和Woods的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，3824(1981)]確定該蛋白質的親水性區域。由於大多親水性的胺基酸殘基都集中在蛋白質的分子表面，因此，可推斷親水性區域即實際的分子表面區域。其次，考察這個區域是否實際上與可識別分泌蛋白質本身的抗體起反應，若反應，則可證明此區域就是分子表面區域。因此，即可設計融合蛋白質，使得在該區域插入外來抗原肽。為了確定親水性區域與實際的分子表面的區域是否一致，可使用下述方法在實際製備這樣設計的融合蛋白質並考察其抗原性的同時，用分泌表達該蛋白質的BCG對動物進行免疫，確認插入的外來抗原肽是否作為抗原決定基被殺傷T細胞識別以及是否作為抗原決定基被B細胞識別，從而有效誘導殺傷T細胞並顯著提高抗體產生的水平。
作為含信號肽的載體分泌蛋白質，在使用來自抗酸菌的α抗原時，該α抗原的第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基附近的區域是分子表面的區域。因此，可以在第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基之間插入外來抗原肽。
構成本發明的外來抗原肽即是在用其對動物進行免疫時，作為抗原決定基被殺傷T細胞識別，或作為抗原決定基被B細胞識別，從而有效地誘導殺傷T細胞或顯著提高產生抗體的水平。本發明的目的之一是提供用於治療、預防細菌性或病毒性疾病的疫苗，因此，理想的外來抗原肽是構成導致該疾病的細菌或病毒的蛋白質的一部分。作為具體實例，可舉出構成愛滋病毒的蛋白質，特別優選的是愛滋病毒表面抗原的抗原肽。更具體地說，由Asn Thr Arg Lys Ser Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列號1)19個胺基酸殘基構成的第三可變區域(V3抗原決定基)的抗原肽是最理想的。
愛滋病毒表面抗原gp120是從N末端開始按C1、V1、V2、C2、V3、C3、V4、C4、V5、C5的順序構成的，胺基酸序列相對穩定的恆定區和變化較多的可變區大體上交替存在，其中，夾在C2和C3恆定區間的區域叫作第三可變區，其中的抗原位點叫作V3抗原決定基。具體地說，就是夾在gp120的第303位和第338位的兩個Cys殘基之間的區域。這個區域據LaRosa認為[Science 249，932(1990)]是極度可變的區域，但是，它可成為強烈抑制各種各樣的變異株中病毒增殖的抗體的識別部位(B細胞抗原決定基)，這個抗體還可防止黑猩猩感染愛滋病毒。另外，由於這個區域含有能被體內有HLA-A2及A3的人所識別的殺傷T細胞的抗原決定基，它是用於開發能誘導中和抗體的產生和殺傷T細胞兩者的愛滋病疫苗的最理想的外來抗原肽。
V3抗原決定基的基因是根據聚合酶鏈反應(PCR)法[Science230，1350(1985)]利用以C2及C3區域中的鹼基序列為基礎合成的引物得到的。另外，還可按下述方法得到將由PCR法得到的DNA片段克隆到適當的載體中以確定鹼基序列，隨後在所確定的鹼基序列基礎上用化學方法合成DNA。
下面說明分泌融合蛋白質的BCG的製備方法，所述融合蛋白質是在含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面插入外來抗原肽得到的。使BCG表達並分泌該融合蛋白質的方法之一是用重組DNA技術製備編碼該融合蛋白質的DNA，將該DNA導入BCG細胞中，使其在細胞中穩定地存在，並且表達該DNA，從而分泌融合蛋白質。
下面說明用重組DNA技術製備目的BCG的方法。在此，含有信號肽的載體分泌蛋白質是來自抗酸菌的α抗原，在該α抗原的第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基之間插入作為外來抗原肽的愛滋病毒表面抗原的抗原肽，即由Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile GlyPro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列號1)19個胺基酸構成的第三可變區域的抗原肽，以此為例來說明。
為了使BCG表達並分泌在抗酸菌產生的α抗原的親水性領域插入外來抗原肽得到的融合蛋白質，將編碼外來抗原肽的合成DNA在位於對應於α抗原基因中的親水區域的適當的限制性內切酶位點插入公知的α抗原分泌載體pIJK-1[Infect.Immun.58，4049(1990)]中，然後將得到的重組分泌載體導入BCG中。
例如，利用對應於α抗原的親水性區域之一即第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基的DNA具有XhoI限制性內切酶位點這一事實，按照α抗原基因的讀碼框，將表面抗原即編碼由19個胺基酸殘基構成的V3區域肽的合成DNA導入pIJK-1的XhoI位點，從而得到重組分泌載體。
在沒有利用pIJK-1的情況下，首先製備編碼堪薩斯氏分枝桿菌的抗原的DNA。該DNA可含有編碼信號肽的區域。該DNA的製備方法採用的是Matsuo等的文獻[Infect.Immun.58，550(1990)]中所記載的方法。然後製備可在BCG的細胞內穩定存在的質粒pIS18。該質粒的製備方法採用的是Snapper等的文獻[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]中所記載的方法。用適當的限制性內切酶切斷這樣得到的質粒，使之成為直鏈狀，把它與DNA相連接，即可得到重組DNA。切斷的位置必須位於不分開為使該質粒能在BCG細胞內穩定地存在所必需的區域的位置。另外，為了表達該DNA，希望該DNA含有控制編碼堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原的DNA的表達的區域，例如啟動子。所述重組DNA用作構建重組分泌載體的起始物。
將重組分泌載體或重組DNA導入BCG的方法有電極化法，該方法在Snapper等的文獻[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]中有記載。
另外，可用電極化法將該重組分泌載體或重組DNA導入在BCG以外的諸如恥垢分枝桿菌等各種多樣的抗酸菌中。該重組分泌載體或重組DNA也可在恥垢分枝桿菌的細胞中穩定存在，該細胞可表達並分泌融合蛋白質。
對於本發明的BCG或恥垢分枝桿菌分泌的融合蛋白質的抗原性的評價方法如下在middlebrook 7H9培養基(Difco公司出品)或Sauton培養基[J.Bacteriol.，169，839(1987)]中培養BCG或恥垢分枝桿菌的細胞，然後用western blotting法[J.Bacteriol.170，3847(1988)]解析培養上清液中的蛋白質和可識別目的外來抗原的抗體間的反應性。作為抗體，可以使用通過用目的外來抗原肽或含該肽的抗原蛋白質與佐劑一起免疫得到的兔血清(多克隆抗體)。或者，可以使用通過下述方法得到的單克隆抗體從通常常規方法[Eur.J.Immunol.6，511(1976)]將同樣免疫後的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合得到的hybridoma中選擇能產生與目的外來抗原肽有反應性的株，隨後培養該細胞株。在抗原-抗體反應中，如果融合蛋白質與抗體的反應性高於未與目的抗原融合的原始載體蛋白質與抗體的反應性，則認為該融合蛋白質具有來自目的外來抗原肽的抗原性。
在用動物模型檢定BCG的抗體產生能力的情況下，可以將目的外來抗原肽或含該肽的抗原蛋白質擔載在適當的固相上，然後用酶連免疫測定法(ELISA法)或western blotting法測定其與用BCG免疫的動物的抗血清的反應。
另外，所產生的抗體對於各種病原體的有效性因各種各樣的病原體的不同，確認法也不同，大致有在培養細胞體系中(體外)的增殖抑制實驗和生物體內的增殖抑制試驗兩種。前者的具體例子是在感染愛滋病毒的人的細胞株的培養液中加入該抗體和愛滋病毒，將其培養一段時間，然後用常規法定量測定培養終了時培養上清液中的病毒粒子，從而評價抑制增殖效果的方法。後者的具體例子是利用向象重症複合免疫缺陷(SCID)的鼠一樣的缺乏T細胞和B細胞的鼠中，移植感染愛滋病的人的末梢血淋巴細胞得到的動物模型，即，給SCID鼠施用所述抗體和愛滋病毒，然後評價SCID鼠血液中的病毒增殖抑制的方法。
另一方面，CTL誘導能力可用CTL測定法來確定，此法是用鼠體系的以往的常規方法51Cr釋放法，用脈衝目的抗原肽的細胞作為靶細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，3105(1988)]。
表達分泌融合蛋白質的BCG可以作為疫苗使用。在BCG細胞的懸浮液中可使用生理鹽水、磷酸緩衝液。對於人和動物，雖然通常採用皮下接種的方法進行給藥，但根據不同情況，經口給藥、靜脈注射等也可以得到疫苗效果。在皮下接種時，給藥量可為2×107個活菌，可從出生後3個月的新生兒開始給藥，但對結核感染者或結核菌素反應陽性的人不能接種。接種後的副作用主要是局部淋巴結腫脹、局部潰瘍等，重症例子極少。
構成本發明的BCG分泌融合蛋白質，所述融合蛋白質是在來自抗酸菌的α抗原的分子表面插入外來抗原肽得到的。由於外來抗原肽的緣故，該融合蛋白質的抗原性及免疫原性顯著增加，因此在給動物接種的時候，能夠被可有效識別該抗原的B細胞識別，從而可有效地誘導產生抗該抗原的抗體。在給動物接種BCG自體時，它在動物體內繼續增殖，並且，由於繼續分泌該融合蛋白質，因此，可成為非常有用的疫苗。
來自以HIV為代表的各種病原體的B細胞抗原決定基多在分子表面沒有如α螺旋和β片一類的二次結構的部位。本發明所提供的分泌融合蛋白質的重組分泌載體使BCG分泌和表達來自各種病原體的B細胞抗原決定基，而B細胞抗原決定基可以保持其本來結構及高抗原性。該BCG株可成為具有高免疫原性的疫苗，可誘導產生為防禦各病毒、細菌、寄生蟲等的感染所必需的高效價的抗體和顯著的CTL活性。
實施例下面用實例更具體地說明本發明。實施例描述中採用以下的簡寫。A腺嘌呤，C胞嘧啶，G鳥嘌呤，T胸腺嘧啶，DNA脫氧核糖核酸，Ala丙氨酸，Arg精氨酸，Asn天冬醯胺，Asp天門氨酸，Gln穀氨醯胺，Glu穀氨酸，Gly甘氨酸，His組氨酸，Ile異亮氨酸，Leu亮氨酸，Lys賴氨酸，Met蛋氨酸，Pro脯氨酸，Ser絲氨酸，Thr蘇氨酸，Trp色氨酸，Tyr酪氨酸，Val纈氨酸，CTL殺傷T細胞，HLISA酶連免疫測定法，IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，HIV人免疫缺陷病毒，TBSTris緩衝鹽水，PBS磷酸鹽緩衝鹽水，SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，MHC主要組織適合抗原，SCID重症複合免疫缺陷症，TCID5050％組織培養感染量。
實施例1 α抗原的B細胞抗原決定基的確定首先，為了找出在α抗原的親水性區域裡確實露出分子表面的部位，確定α抗原自身的B細胞抗原決定基。考察來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原的親水性·疏水性圖[Infect.Immun.58，550(1990)]，選擇該α抗原中兩個親水性最高的區域，合成兩種編碼與該區域相當的約20個胺基酸殘基構成的肽的DNA。
一個DNA編碼具有從該α抗原的第38位的Leu殘基到第57位的Ala殘基的序列的肽，所述序列是5′-GATCCTCGACGGTCTCCGCGCTCAAGACGACTACAACGGCTGGGACATCAACACCCCGGCCGAGCTGCCAGAGGCGCGAGTTCTGCTGATGTTGCCGACCCTGTAGTTGTGGGGCCGGCTAG-5′(序列號2，序列號3)。
另一個DNA編碼具有從該α抗原的第184位的Ser殘基到第203位的Asn殘基的序列的肽，所述序列是5′-GATCAGTGACCCAGCCTGGCAGCGTAACGACCCGTCGCTGCACATTCCGGAGCTGGTCGCCAACTCACTGGGTCGGACCGTCGCATTGCTGGGCAGCGACGTGTAAGGAATCGACCAGCGGTTGCTAG-5′(序列號4，序列號5)。
使將各DNA在β-半乳糖苷酶基因的最下遊(相當於產物的C末端)融合得到的DNA在大腸桿菌的細胞中表達，得到兩種融合蛋白質。將兩個DNA片段與用BamHI切斷的pUR 289質粒[EMBO J.3，1429(1984)]連接。將得到的重組DNA導入大腸桿菌EQ 192株中。在含有50μg/ml氨必西林的L-液體培養基中於37℃下將所得各轉換株振蕩培養3小時，然後加入IPTG，使最終濃度為1mM，再在30℃下培養2小時。將通過離心分離得到的菌體懸浮在1/10容量的TBS緩衝液中，在200W下聲處理15分鐘，得到2個系列的菌體提取液。各萃取液中含有目的融合蛋白質。將10μl各萃取液分別進行7.5％SDS-PAGE電泳，將經電泳分離的蛋白質印跡到硝酸纖維濾膜上。可用western blotting法測定每種蛋白質與抗來自堪薩斯氏分枝桿菌的抗原的兔多克隆抗體及抗來自BCG的抗原的兔多克隆抗體的反應性(參照圖1)。
與β-半乳糖苷酶融合的含有從第38位的Leu殘基到第57位的Ala殘基的序列的肽與這兩種抗體都不反應(例2和5)，但與β半乳糖苷酶融合的含有從第184位的Ser殘基到第203位的Asn殘基的序列的肽與兩種抗體都有很高的反應性(例3、6)。由此可以明確，上述兩種抗酸菌共有的B細胞抗原決定基存在於從第184位的Ser殘基到第203位的Asn殘基的區域。可推測出這個區域露出在α抗原分子的表面。
圖1中，例1、例4是大腸桿菌EQ 192株的菌體提取液的電泳結果，所述菌株攜帶表達β-半乳糖苷酶的質粒pUR 289。例2、例5是大腸桿菌EQ 192株的菌體提取液的電泳結果。所述菌株攜帶表達由β-半乳糖苷酶與具有α抗原的第38位的Leu殘基至第57位的Ala殘基的序列的肽融合而成的蛋白質的質粒pUR 289+α-Leu38-Ala 57。例3、6是大腸桿菌EQ 192株的菌體提取液的電泳結果，所述菌株攜帶表達β-半乳糖苷酶與具有α抗原的第184位的Ser殘基至第203位的Asn殘基的序列的肽融合而成的蛋白質的質粒pUR 289+α-Ser 184-Asn 203。例1、2、3是用抗來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原的兔多克隆抗體來進行標記的。例4、5、6是用抗來自BCG的α抗原的兔多克隆抗體來進行標記的。圖中的帶相當於β-半乳糖苷酶-融合蛋白質。
實施例2 含有HIV-1表面抗原V3抗原決定基的融合蛋白質分泌載體的構建由於可以推測出α抗原的第184位的Ser殘基到第203位的Asn殘基的區域突出於分子表面，因此作了如下嘗試即利用對應於α抗原基因中第184位的Ser殘基的位置的XhoI位點，將HIV-1表面抗原V3抗原決定基與α抗原融合，使BCG及恥垢分枝桿菌分泌融合蛋白質。以下的說明參照圖2以便更容易理解。
將HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原決定基中由Arg Ile Gln ArgGly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(序列號6)15個胺基酸殘基構成的肽在上述第184位的Ser殘基的位置(DNA的XhoI位點)融合得到融合蛋白質，為得到此融合蛋白質，將用XhoI完全切斷含α抗原基因的質粒pKAH200得到的DNA片段分離，得到載體DNA。另一方面，也可用化學方法合成編碼由15個胺基酸殘基構成的肽的基因。其序列如下5′-TCGAGTCGGATCCAGAGGGGCCCTGGTAGGGCGTTCGTCACCATCGGCAAGCAGCCTAGGTCTCCCCGGGACCATCCCGCAAGCAGTGGTAGCCGTTCAGCT-5′(Xho I位點)(序列號7，序列號8)。將該合成DNA與上述載體DNA連接，得到重組DNA，將其導入大腸桿菌HB101株中，在轉化株內放大重組DNA。然後，為了將融合蛋白質基因分離成KpnI片段，將KpnI接頭插入來自pUC載體的HindIII位點。用KpnI消化所得到的質粒，分離出含融合蛋白質基因的KpnI-KpnI DNA片段。將KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌-大腸桿菌往復式載體pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位點，得到重組分泌載體。將其命名為pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)。
為使BCG及恥垢分枝桿菌分泌出HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原決定基和α抗原融合而成的融合蛋白質中的對照物，製備必要的重組分泌載體。在此是將HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原決定基中的ArgIle Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(序列號6)15個胺基酸構成的肽在對應於α抗原C末端附近的第280位的Gln殘基的位置的PstI位點融合，將由此得到的融合蛋白質作為對照物。分離將用PstI完全切斷含α抗原基因的質粒pKAH200得到的DNA片段，得到載體DNA。另一方面，可用化學方法合成編碼15個胺基酸的基因。其序列如下5′-CGGATCCAGAGGGGCCCTGGTAGGGCGTTCGTCACCATCGGCAAGTAGCTGCAACGTGCCTAGGTCTCCCCGGGACCATCCCGCAAGCAGTGGTAGCCGTTCATCG-5′(PstI位點)(序列號9，序列號10)。將該合成的DNA與上述載體DNA連接，得到重組DNA，將其導入大腸桿菌HB101株中，在轉化株內放大重組DNA。然後，為了將融合蛋白質基因分離成KpnI片段，將KpnI接頭插入來自pUC載體的HindIII位點。用KpnI消化得到的質粒，分離出含融合蛋白質基因的KpnI-KpnI DNA片段。將KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌大腸桿菌pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位點，得到重組分泌載體。將其命名為pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)。
實施例3 由恥垢分枝桿菌表達並分泌HIV-1V3抗原決定基-α抗原融合蛋白質按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]將實施例2中構建的重組分泌載體pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)和pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)分別導入恥垢分枝桿菌ATCC 607株中。將所得轉化株分別在70ml含30μg/ml卡那黴素的Sauton培養基[J.Bacteriol.169，839(1987)]中於37℃下靜置培養2周。通過離心分離和用微孔濾膜過濾除菌，得到培養上清液。向0.5ml各培養上清液中加入等量的10％三氯乙酸水溶液，在0℃下保溫30分鐘後，離心分離，使蛋白質沉澱。將各沉澱懸浮在20μl SDS-PAGE用樣品緩衝液(含60mM Tris，2％SDS，5％巰基乙醇，10％甘油，0.1％溴酚藍)中，然後在95℃加熱5分鐘使其溶解，得到電泳用樣品。將各樣品用15％ SDS-PAGE電泳分離。電泳後，按常規方法將蛋白質印跡到硝酸纖維素濾膜上，並用western blotting法解析。結果如圖3所示。與由來自HTLVIIIB株的15個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第280位的Gln殘基的位置融合得到的融合蛋白質(例3)相比，由來自HTLVIIIB株的15個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質(例2)與抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體gp120的反應性高50-100倍。也就是說，通過以露出α抗原的分子表面的方式表達V3抗原決定基，可以極大地提高V3抗原決定基的抗原性。
圖3中，例1是攜帶只分泌α抗原的載體pIJK-1[Infect.Immun.58，4049((1990)]的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，例2是攜帶pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自HTLVIIIB株的15個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合而成的融合蛋白質的抗原-抗體反應。例3是攜帶pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自HTLVIIIB株的15個胺基酸構成的肽在α抗原的第280位的Gln殘基的位置融合而成的蛋白質的抗原-抗體反應。
為了標記，使用抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體，該抗體可購自美國杜邦公司。
實施例4 含HIV-1(日本株)表面抗原V3抗原決定基的融合蛋白質分泌載體的構建實施例2、3對於通過將HIV-1(HTLVIIIB株)V3抗原決定基中由Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile GlyLys(序列號6)15個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質進行了試驗。這裡對於通過將HIV-1(日本株)V3抗原決定基中由Asn Thr Arg Lys Ser IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(序列號1)19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質進行試驗。
以下的說明參照圖2以便於理解。
為了得到通過將HIV-1(日本株)V3抗原決定基中由Asn ThrArg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala ThrGly Ser(序列號1)19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置(DNA中XhoI位點的位置)融合得到的融合蛋白質，分離用XhoI將含有α抗原基因的質粒pKAH200完全切斷得到的DNA片段，得到載體DNA。另-方面，也可用化學方法合成編碼19個胺基酸殘基的肽的基因。其序列如下5′-TCGAGTAACACGAGGAAGAGCATCCACATCGGGCCCGGGAGGGCATTCTACGCCACCGGGCATTGTGCTCCTTCTCGTAGGTGTAGCCCGGGCCCTCCCGTAAGATGCGGTGGCCCAGCT-5′(序列號11，序列號12)。將該合成DNA與上述載體DNA連接，將得到的重組DNA導入大腸桿菌HB101株中，在轉化株中放大重組DNA。然後，為了將融合蛋白質基因分離成KpnI片段，將KpnI接頭插入來自pUC載體的HindIII位點。用KpnI消化所得的質粒，分離出含有融合蛋白質基因的KpnI-KpnI DNA片段。將KpnI-KpnI DNA片段克隆到抗酸菌-大腸桿菌往復式載體pIS18[Infect.Immun.58，4049(1990)]的KpnI位點，得到重組分泌載體。將其命名為pIJK-V3(日本株-XhoI)。
實施例5 由恥垢分枝桿菌和BCG表達並分泌HIV-1V3抗原決定基-α抗原融合蛋白質按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]將實施例4中構建的重組分泌載體pIJK-V3(日本株-XhoI)導入恥垢分枝桿菌ATCC600株中。將所得的轉化株在70ml含30μg/ml卡那黴素的Sauton培養基[J.Bacteriol.169，839(1987)]中於37℃靜置培養2周，然後通過離心分離和用微孔濾膜過濾除菌，得到培養上清液。向0.5ml培養上清液中加入等量的10％三氯乙酸水溶液，在0℃保溫30分鐘後，離心分離，使蛋白質沉澱。將沉澱懸浮在20μl SDS-PAGE用樣品緩衝液(含60mM Tris，2％ SDS，5％2-巰基乙醇，10％甘油，0.1％溴酚藍)中，然後在95℃加熱5分鐘使其溶解，得到電泳用樣品。將樣品用15％ SDS-PAGE電泳分離。電泳後，按常規方法將蛋白質印跡到硝酸纖維素濾膜上，並用western blotting法解析。結果如圖3所示。結果表明，來自日本株的19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質也與抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體μ5.5強烈地反應(例5)。也就是說，對於日本株的情況，通過以露出α抗原的分子表面的方式表達V3抗原決定基。也可以極大地提高V3抗原決定基的抗原性。
圖3中，例4是攜帶pIJK-1的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果。例5是攜帶pIJK-V3(日本株-XhoI的恥垢分枝桿菌的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自日本株的19個胺基酸構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
為了標記，使用抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體μ5.5。該抗體是用下述方法得到的用在上述19個胺基酸殘基構成的肽(序列號1)的兩端加上Cys殘基得到的肽的三聚體免疫小鼠，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合得到hybridoma，並進行培養。
從開發抗來自日本攜帶者的病毒中最常見的HIV-1株的疫苗的觀點考慮，使BCG分泌融合蛋白質，所述融合蛋白質是將來自日本株的19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第18位的Ser殘基的位置融合得到的。實驗方法按採用恥垢分枝桿菌的方法進行。分泌的融合蛋白質用western blotting法解析，結果示於圖3中。結果表明，即使在由BCG分泌通過將來自日本株的19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質的情況下，融合蛋白質也與抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體μ5.5強烈地反應(例7)。將所得的BCG株命名為BCG-V3並用於下面的動物實驗中。牛分枝桿菌BCG-V3已保藏在通商產業省工業技術院生命科學工業技術研究所，保藏號為FERM BP-4759。
圖3中，例6是攜帶pIJK-1的牛分枝桿菌BCG的培養上清液的電泳結果。例7是攜帶pIJK-V3(日本株-XhoI)的牛分枝桿菌BCG的培養上清液的電泳結果，這是為了考察來自日本株的19個胺基酸殘基構成的肽在α抗原的第184位的Ser殘基的位置融合得到的融合蛋白質的抗原-抗體反應。
為了標記，使用抗HIV-1的V3抗原決定基的中和單克隆抗體μ5.5。
實施例6 豚鼠中抗HIV-1V3位點的抗體產生將BCG-V3和僅表達來自堪薩斯氏分枝桿菌的α抗原的BCG-α分別在5ml Middlebrook 7H9培養基(Difco制)中於37℃振蕩培養，當OD610nm達到0.6時(對數增殖期)集菌，用PBS洗滌一次，然後懸浮在10ml PBS中。用1ml BCG-V3的菌液(5mg，含約108BCG細胞)給4隻豚鼠皮下接種，並用相同量的BCG-α的菌液給另外3隻豚鼠皮下接種，6周後採血，用V3肽(19個胺基酸)抗原按ELISA法測定抗V3抗體效價(表1)。BCG-α免疫豚鼠陰性對照組的抗體效價低於可檢出界限，而用BCG-V3免疫的4隻豚鼠全部誘導產生了超過120-640倍的高效價抗體。其中2隻所誘導的抗體效價水平足以防止黑猩猩感染HIV-1[Nature 345，622(1990)]。
表1是豚鼠中抗V3抗體產生的試驗結果。其中，「正常」、「BCG-V3-1～4」和「BCG-α-K-1～3」分別表示什麼也沒接種的豚鼠、4隻BCG-V3免疫的豚鼠和3隻BCG-α免疫的豚鼠。
表1BCG-V3接種豚鼠血清中的抗V3抗體效價豚鼠 抗V3抗體效價Normal 0BCG-V3-1 640BCG-V3-2 160BCG-V3-3 120BCG-V3-4 320BCG-α-K-1 0BCG-α-K-2 0BCG-α-K-3 0皮下接種5mg的重組BCG後，用ELISA法測定6周後的抗V3抗體效價實施例7 BCG-V3接種豚鼠血清的體外病毒中和活性的測定使用實施例6得到的4隻BCG-V3接種豚鼠的6周後的血清測定體外病毒中和活性。用植物血細胞凝集素刺激人的末梢血淋巴細胞，向1天後的blast化的細胞中加入HIV-1MN株2000 TCID50和上述豚鼠血清的免疫球蛋白部分在37℃預保溫1小時得到的混合物，培養約1周，當觀察到細胞變性效果時，用核蛋白p24測定ELISA試劑盒測定培養上清液中的HIV粒子。結果示於表2中。採用正常豚鼠血清的對照樣末觀察到明顯的HIV-1中和活性，而4隻BCG-V3免疫的豚鼠全部觀察到顯著的HIV-1中和活性，這說明實施例6中得到的抗V3抗體實際上具有抑制HIV-1增殖的活性。
表2中，與各病毒反應所用的豚鼠血清免疫球蛋白量中細胞培養上清液中的p24蛋白濃度以pg/ml單位表示，若p24蛋白濃度低於使用正常豚鼠血清的場合，則可以說血清具有HIV中和活性。
表2BCG-V3接種豚鼠血清的病毒中和活性Ig濃度(μg/ml) BCG-V3-1 BCG-V3-2 BCG-V3-3 BCG-V3-4 正常 μ5.50 2390 2390 2390 2390 239023901 1308 1656 2880 1906 2250209610 1184635 1427804 1815 150 961 19906 47 1921 1「正常」表示正常豚鼠血清，BCG-V3-1～BCG-V3-4表示4隻BCG-V3接種豚鼠血清，μ5.5表示中和單克隆抗體。靶細胞培養上清液中的病毒核蛋白p24量用pg/ml單位表示。
實施例8 利用SCID米色小鼠的、BCG-V3接種豚鼠血清的體內病毒中和活性的測定給SCID米色小鼠(缺乏T、B細胞之外的天然殺傷細胞的小鼠)腹腔內接種2×107個人末梢血淋巴細胞，2周後，同時靜脈注射HIV-1 MN株的約6000TCID50和10mg實施例4中得到的BCG接種豚鼠血清的免疫球蛋白部分。84小時後脫血，收集靶細胞。將靶細胞與用植物血細胞凝集素刺激的人末梢血淋巴細胞一起培養7天，按與實施例7相同的方法測定培養上清液中的病毒量。結果示於表3中。在每一靶細胞中，當使用正常豚鼠血清時檢測到約100pg/ml的p24濃度，而使用BCG-V3-2血清時p24濃度在檢出界限以下，這說明其血清中的抗V3抗體即使在體內也具有HIV-1中和活性，可防止SCID小鼠中的末梢血淋巴細胞感染HIV-1。
表3示出了施用HIV-1 MN株和豚鼠血清免疫球蛋白的SCID米色小鼠的末梢血單核細胞、腹腔浸出細胞和脾細胞的培養上清液中的p24蛋白濃度(pg/ml)，「＜30」表示在檢出界限以下。
表3採用SCID米色小鼠的體外病毒中和活性靶細胞 正常豚鼠IgG BCG-V3-2豚鼠IgG末梢血單核細胞 95 ＜30腹腔浸出細胞90 ＜30脾細胞 104 ＜30給腹腔接種2×107人末梢血淋巴細胞2周後的SCID米色小鼠靜脈注射HIV MN株和10mg豚鼠血清IgG，收集細胞並培養，7天後的培養上清液的病毒核蛋白P24量以Pg/ml單位表示。
實施例9 小鼠中CTL的誘導給5隻Balb/C小鼠皮下接種0.1mg BCG-V3，2周後分離脾細胞，用10μg/ml V3肽(19個胺基酸)再刺激7天，得到效應細胞。用V3肽脈衝後的P815細胞(MHC class IH2d)作為靶細胞，用Cr釋放法測定效應細胞的CTL活性。5隻小鼠中均觀察到顯著的CTL活性的誘導(圖4A)。另外，當用含有MHC class I H2k分子的SW5147細胞用作靶細胞時，效應細胞不顯示這一活性。因此可認為這一活性來自MHC Class I限制性CTL(圖4B)。
實施例10 BCG-V3接種豚鼠血清的臨床分離病毒株中和活性的測定據報導，由正在作為預防愛滋病感染候補疫苗引起關注的亞單位gp120疫苗(通過基因重組動物細胞產生)誘導的中和抗體可中和諸如MN株一類的實驗室株，但不能中和臨床分離株[AIDS Res.HumanRetroviruses，10，631-632(1994)]。給每組20隻的兩組(共計40隻)豚鼠皮下接種5mg BCG-V3，用與實施例7相同的體外中和測定法測定6周後的血清抗體的臨床分離HIV-1株中和活性。所用的臨床分離病毒HIV-A和HIV-B分別通過用植物血細胞凝集素刺激日本HIV攜帶者的末梢血單核細胞後與正常人的末梢血單核細胞在RPM1640培養基(GIBCO制)中共同培養得到。提取培養上清液中不含細胞的病毒RNA，用OD3引物(nt 7345-7369＝5′-AAATTCCCCTCCACAATTAAAACTG-3′)(序列號19)和逆轉錄酶進行逆轉錄，得到DNA。用該DNA作為模板，利用夾持V3區域的兩種引物EB2(在nt 6989-7009上加上BamHI識別序列得到的＝5′-GCCGGATCCTCAACTCAACTGCTGTTAAAT-3′)(序列號20)和EC2(在nt 7314-7336上加上PstI識另序列和終止密碼子得到的＝5′-GCT CTGCAGTCAAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG-3′)(序列號21)進行PCR反應以放大DNA，然後用BamHI和PstI切斷，將得到的片段克隆到pUC18載體上。用373A DNA定序儀(Applied Biosystems-Perkin ElmerCo.)確定克隆後DNA的鹼基序列，從而推斷V3區域的胺基酸序列。將臨床分離的病毒100 TCID5O與通過用蛋白A瓊脂糖(PharmaciaP-L Biochemicals)柱純化20隻免疫豚鼠的混合血清得到的免疫球蛋白部分，在37℃下培養60分鐘，然後與106個用植物血細胞凝集素刺激的正常人末梢血單核細胞混合，在37℃下振蕩60分鐘。用PBS洗滌細胞，然後在含有重組人IL-2(40單位/ml)的PRM1640培養基中培養7天，用p24抗原ELISA試劑盒(Dinabot制)測定培養上清液中的HIV量。結果示於圖5B中，其中中和活性以在體系中加入抗體時得到的p24量與不加抗體的對照樣得到的p24量的比率(抑制率)表示。對於A、B兩種病毒，用GP-1、GP-2兩組豚鼠的血清進行同樣的實驗。BCG-α免疫的豚鼠和BCG-V3免疫前的豚鼠的血清免疫球蛋白幾乎沒有中和活性，而BCG-V3免疫組顯示了非常的中和活性，其90％抑制濃度為1μg/ml左右。這兩種病毒的V3區域中的中和抗原決定基(圖5A的陰影部分)的胺基酸序列與引入BCG-V3的日本株與HIV MN株的共有序列完全一致。這表明，如果是至少與V3中和抗原決定基的胺基酸序列相同的病毒，則無論是從HIV載體分離得到的株，還是MN株之類的實驗室再次培養得到的株，抗體實際上可同樣地中和病毒。
實施例11 豚鼠中產生的抗V3抗體的交叉反應性測定實施例10中製備的一組20隻豚鼠的混合血清(BCG-V3免疫後6周)與泰國A型和B型病毒V3區域的交叉反應性。通常，從病毒的分類上看，屬於clade B的北美型(MN株)和日本株與屬於clade E的泰國型株無血清學上的交叉反應。通過ELISA法採用19個胺基酸組成的泰國A型V3肽(Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr IleGly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp)(序列號18)和19個胺基酸組成的泰國B型V3肽(Asn Thr Arg Lys Ser IleHis Leu Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Thr Thr Gly Gln)(序列號22)分別與載體蛋白質鑰孔血藍蛋白(KLH)軛合得到的抗原測定交叉反應性。結果示於圖6中。
用於對照的正常豚鼠血清與泰國AV3肽或泰國BV3肽幾乎沒有交叉反應，而BCG-V3免疫的豚鼠血清與泰國AV3肽和泰國BV3肽都有交叉反應，這暗示了BCG-V3免疫豚鼠血清除了中和北美型、日本型病毒以外的中和泰國型病毒的活性。
實施例12 猴的中和抗體產生給4隻雄性猴(7-8歲，#2796-#2799)中的2隻(#2796，#2797)皮下接種30mg BCG-V3(6×108細胞)，給另2隻(#2798，#2799)皮下接種5mg BCG-V3(1×108細胞)，採用與KLH軛合的V3肽(19個胺基酸)抗原通過ELISA法測定2、4、6、8、12、27周後血清中的抗V3抗體效價。4隻猴中全部誘導了抗體產生。#2797和#2799兩隻猴中抗體效價的變化示於圖7中。2隻中均觀察到大於106的高效價的抗體產生，但免疫10周後，抗體效價呈逐漸減小的趨勢。按與實施例10相同的體外中和測定方法測定4周後血清抗體的HIV-1MN株中和活性，結果示於圖8中。任一隻猴的血清抗體均具有中和活性，特別是接種5mg BCG-V3的猴(#2798，#2799)具有很強的病毒中和活性，其90％抑制濃度為約10μg/ml。
實施例13 猴中HIV-SIV嵌合體病毒(SHIV)的感染防禦據報導，將可感染獼猴的猴免疫缺陷病毒(SIV)的外殼(pg120，gp41部分)用HIV-1的外殼代替後得到的HIV-SIV嵌合體病毒(SHIV)同樣可以感染獼猴。將外殼部分換成來自HIV-1(HTLVIIIB)的外殼所得的NM 3rN的分子克隆[J.Virol.65，3514(1991)]的V3區域用來自日本株的序列替換，製備嵌合體病毒NM-3rNJ1。構建的方法示於圖9中。用EcoRI和HpaI由NM-3rN基因切出外殼部分，將該外殼部分亞克隆到在HincII位點插入了HpaI接頭(寶酒製造)的pUC18的EcoRI-HpaI。用BglII切斷所得質粒，分離出大片段，以此作為載體。如實施例10所述，將由日本HIV攜帶者A的血液中分離得到的病毒RNA逆轉錄為DNA，用PCR法放大，將其作為BamHI-PstI片段亞克隆到pUC18中，用BglII切斷，得到含有V3區域的DNA片段，將其與上述載體連接，得到重組質粒。將該質粒導入大腸桿菌HB101株中並在所得轉化株中放大。將用EcoRI和HpaI切斷該質粒得到的小片段與用HpaI切斷NM-3rN得到的大片段連接，得到含有來自日本株的HIV-1的V3區域的基因的NM-3rNJ1。用常規的磷酸鈣法將NM-3rNJ1質粒轉染到M8166細胞中，在RPM1640培養基中培養1周。將釋放到培養上清液中的病毒(SHIV)再次轉染到M8166細胞中，將培養1周後所得培養上清液中的病毒用於感染實驗。對#2797和#2799兩隻猴，在免疫38周後，各自通過皮下接種100μg融合蛋白質進行追加免疫，所述融合蛋白質是將19個胺基酸的V3肽插入在大腸桿菌中表達並在直鏈澱粉樹脂柱上純化的麥芽糖結合蛋白質與α抗原的融合蛋白質中得到的，2周後確認抗V3抗體效價的升高後，靜脈注射SHIV(MN)10TCID50。在病毒免疫攻擊後2、4、6周採血，將分離出的末梢血單核細胞5×106個的2倍稀釋素到分別與M8166細胞一起培養，1周後用SIV p27抗原測定ELISA試劑盒(Ortho公司制)測定培養上清液中的嵌合體病毒濃度。4周後的結果示於圖10中。在#2797猴中，當細胞濃度為2.5×106以上時觀察到嵌合體病毒感染，但與接種嵌合體病毒10TCID50的正常獼猴陰性對照組相比，所產生的病毒量顯著降低。在#2799猴中，根本沒有檢出嵌合體病毒，這表明極好地防止了SHIV感染。
實施例14 表達HIV-1gp41中和抗原決定基的BCG株的確立製備表達和分泌pg41中和抗原決定基[J.Virol.67，6642-6647(1993)]和α抗原的融合蛋白質的重組BCG，據報導，所述gp41中和抗原決定基可被HIV-1V3抗原決定基以外的B細胞抗原決定基中具有強病毒中和活性的抗體識別。按與實施例2和3類似的方法，用化學方法合成編碼6個胺基酸(Glu Leu Asp Lys Trp Ala)(序列號23)的gp41抗原決定基而不是V3抗原決定基及N末端延長的13個胺基酸(Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu AspLys Trp Ala)(序列號13)的肽的基因(具有可在XhoI識別位點插入基因的附著末端)，並用於克隆。其序列如下5′-TCGAGTGAGCTGGACAAGTGGGCTCACTCGACCTGTTCACCCGAAGCT-5′(序列號24，序列號25)(編碼6個胺基酸)，5′-TCGAGTAAGAACGAGCAGGAGCTGCTGGAGCTGGACAAGTGGGCTCATTCTTGCTCGTCCTCGACGACCTCGACCTGTTCACCCGAAGCT-5′(序列號26，序列號27)(編碼13個胺基酸)。按與圖2所示V3抗原決定基的情況相同的方法，將這些DNA片段與用XhoI完全切斷質粒pKAH200得到的載體DNA連接，得到重組DNA，將其導入大腸桿菌HB101株中，並在轉化株內放大重組DNA。為了將融合蛋白質基因切成KpnI片段，將KpnI接頭插入來自pUC載體的HindIII位點，用KpnI消化得到的質粒，分離出KpnI-KpnI DNA片段。將該DNA片段克隆到pIS18載體的KpnI位點，得到重組分泌載體。對於6個胺基酸的，將所述載體命名為pIJKgp41-X6，對於13個胺基酸的，將其命名為pIJKgp41-X13。
按公知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6987(1988)]將載體導入BCG東京株中。將得到的各轉化株在5ml含有30μg/ml卡那黴素的Middlebrook 7H9培養基(Difco制)中於37℃振蕩培養6周。培養上清液經微孔濾膜過濾除菌後，加入等量的2倍濃度的SDS-PAGE樣品緩衝液，在95℃加熱5分鐘，然後供給15％ SDS-PAGE電泳。分離後，按常規方法將其印跡到硝酸纖維素濾膜上，用western blotting法解析。結果示於圖11中。攜帶pIJKgp41-X6的BCG(例2)和攜帶pIJKgp41-X13的BCG(例3)均與識別gp41抗原決定基的中和單克隆抗體2F5(Waldheim Pharmazeutika，奧地利)有明顯的反應性，而後者的反應性略強。同樣，可以將V3抗原決定基以外的中和抗原決定基插入α抗原的分子表面，由BCG分泌並表達。這些BCG株分別命名為BCG-gp41-X6(6個胺基酸)和BCG-gp41-X13(13個胺基酸)。
序列表序列號1序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala 161 5 10 15Thr Gly Ser 19序列號2序列長度61序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GATCCTCGAC GGTCTCCGCG CTCAAGACGA CTACAACGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC60C61序列號3序列長度61序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GATCGGCCGG GGTGTTGATG TCCCAGCCGT TGTAGTCGTC TTGAGCGCGG AGACCGTCGA60G61序列號4序列長度64序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GATCAGTGAC CCAGCCTGGC AGCGTAACGA CCCGTCGCTG CACATTCCGG AGCTGGTCGC60CAAC 64序列號5序列長度64序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GATCGTTGGC GACCAGCTAA GGAATGTGCA GCGACGGGTC GTTACGCTGC CAGGCTGGGT 60CACT64序列號6序列長度15序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1 日本株序列Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys 151 5 10 15序列號7序列長度51序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGAGTCGGA TCCAGAGGGG CCCTGGTAGG GCGTTCGTCA CCATCGGCAA G51序列號8序列長度51序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGACTTGCC GATGGTGACG AACGCCCTAC CAGGGCCCCT CTGGATCCGA C 51序列號9序列長度53序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列CGGATCCAGA GGGGCCCTGG TAGGGCGTTC GTCACCATCG GCAAGTAGCT GCA 53序列號10序列長度53序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA
序列GCTACTTGCC GATGGTGACG AACGCCCTAC CAGGGCCCCT CTGGATCCGT GCA 53序列號11序列長度60序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGAGTAACA CGAGGAAGAG CATCCACATC GGGCCCGGGA GGGCATTCTA CGCCACCGGG60序列號12序列長度60序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGACCCGGT GGCGTAGAAT GCCCTCCCGG GCCCGATGTG GATGCTCTTC CTCGTGTTAC60序列號13序列長度13序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala 131 5 10序列號14序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Val His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala 161 5 10 15Thr Gly Asp 19序列號15序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr 161 5 10 15Thr Gly Glu 19序列號16序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala 161 5 10 15Thr Gly Glu 19序列號17序列長度18序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr 161 5 10 15Thr Arg 18序列號18序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg 161 5 10 15Thr Gly Asp 19序列號19序列長度25序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列AAATTCCCCT CCACAATTAA AACTG 25序列號20序列長度30序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GCCGGATCCT CAACTCAACT GCTGTTAAAT 30序列號21序列長度35序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列GCTCTGCAGT CAAATTTCTG GGTCCCCTCC TGAGG35序列號22序列長度19序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Leu Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Thr 161 5 10 15Thr Gly Gln 19序列號23序列長度6序列類型胺基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽起源生物名人免疫缺陷病毒株名HIV-1序列Glu Leu Asp Lys Trp Ala1 5序列號24序列長度24序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGAGTGAGC TGGACAAGTG GGCT24序列號25序列長度24序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGAAGCCCA CTTGTCCAGC TCAC24序列號26序列長度45序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA
序列TCGAGTAAGA ACGAGCAGGA GCTGCTGGAG CTGGACAAGT GGGCT 45序列號27序列長度45序列類型核酸鏈數1條拓撲結構直鏈狀序列種類其他核酸 合成DNA序列TCGAAGCCCA CTTGTCCAGC TCCAGCAGCT CCTGCTCGTT CTTAC 4權利要求
1.含有分泌融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白質是在含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面插入外來抗原肽得到的。
2.根據權利要求1所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中含有信號肽的載體分泌蛋白質是來自抗酸菌的α抗原。
3.根據權利要求2所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中含有信號肽的載體分泌蛋白質是來自抗酸菌的α抗原，，融合蛋白質是在所述α抗原的第184位的Ser殘基和第185位的Asp殘基之間插入外來抗原肽得到的。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中外來抗原肽是愛滋病毒表面抗原的抗原肽。
5.根據權利要求4所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中外來抗原肽是愛滋病毒的第三可變區域的抗原肽。
6.根據權利要求5所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是下述由19個胺基酸殘基構成的第三可變區域的抗原肽Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro GlyArg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser。
7.根據權利要求5所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是由序列號14、15、16、17或18的胺基酸殘基構成的抗原肽。
8.用於治療、預防愛滋病的權利要求4-7中任一項所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗。
9.根據權利要求4所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，其中愛滋病毒表面抗原的抗原肽是下述由13個胺基酸殘基構成的抗原肽Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala。
10.用於治療、預防愛滋病的權利要求9所述的含有牛分枝桿菌BCG菌的疫苗。
全文摘要
一種含有分泌融合蛋白質的牛分枝桿菌BCG菌的疫苗，所述融合蛋白質是在含有信號肽的載體分泌蛋白質的分子表面插入外來抗原肽得到的。構成本發明的BCG分泌融合蛋白質，所述融合蛋白質是在由來自抗酸菌的α抗原的分子表面插入外來抗原肽得到的。由於該融合蛋白質具有極大地增加了的抗原性及免疫原性，因此在給動物接種時可被能有效地識別該抗原的B細胞識別，有效地誘導產生抗該抗原的抗體。當給動物接種該BCG本身時，隨著它在動物體內的繼續增殖，繼續分泌所述融合蛋白質，因此成為非常有用的疫苗。
文檔編號C07K14/35GK1136280SQ95190959
公開日1996年11月20日 申請日期1995年7月31日 優先權日1994年7月29日
發明者松尾和浩, 中條剛具, 山崎晤弘, 本多三男, 山崎修道, 田坂博信 申請人:味之素株式會社, 國立預防衛生研究所長代表的日本國