一種利用離體動物角膜模型多參數檢測眼刺激性的方法與流程

2024-03-30 14:02:05

本發明涉及一種利用離體動物角膜模型多參數檢測眼刺激性的方法。
背景技術：
：人類的眼睛可能會接觸到化妝品、藥品、農藥和環境汙染物等一種或多種物質，對這些外源物質的主觀接觸或意外暴露可能造成人群的健康風險。因此，評估可能接觸物質的潛在眼刺激性對保障人群健康具有重要意義。19世紀30年代，由於允許未經檢測含有對苯二胺的睫毛產品在美國市場售賣，導致消費者使用此類產品引起眼部過敏、角膜潰瘍和失明等不良反應。這一公共危害事件促使美國食品藥品和化妝品監督管理局(fda)在1938年採取行動，強制要求檢測眼部接觸產品的安全性。對於眼刺激性的毒理學評價，金標準採用的是1944年draize提出的兔眼刺激體內實驗。一直以來，雖然兔眼實驗被認為是評估眼刺激或腐蝕性的唯一標準方法，但其科學性和合理性備受質疑。傳統動物實驗的缺點包括：方法的主觀性、動物與人體反應的差異、周期長、通量低、使用活體動物造成動物痛苦死亡等。隨著國際動物福利運動的興起和新技術的發展，50多年前國外最先提出了以"減少(reduction)"、"替代(replacement)"和"優化(refinement)"為核心內容的「3r原則」，並在此基礎上大力開展動物實驗替代方法的研究。特別是近20年，以體外替代技術為核心的試驗方法，逐漸被許多國家和地區的監管部門所接收和認可。如歐盟化妝品指令《2003/15/ec》和法規《1223/2009/ec》對於化妝品動物實驗的禁止，歐盟新化學品法規reach(化學品的註冊、評估、許可和限制)鼓勵動物試驗替代方法的開發和應用。美國替代方法研究評價中心(iccvam)提出的一系列非動物測試方法等。全球範圍內多個地區和國家通過法規禁止/部分禁止或限制動物試驗的進行。尤其是在化妝品領域，2013年歐盟範圍內全面禁止銷售從原料到成品經過動物試驗的化妝品。用非活體動物的試驗系統進行眼刺激性評價是動物試驗替代技術的關鍵領域之一。體外替代試驗是根據體內眼損傷發生的機理開發的，目前開發中的眼刺激替代方法，其實驗系統可分為細胞系統、器官型系統、人工角膜等，其中，器官型系統主要有雞胚絨毛膜尿囊膜和離體角膜。離體角膜來源於廢棄的動物眼球組織，不需要額外動物來源，天然角膜與人體角膜接近，離體角膜在短期內可以維持正常生理活性，可以模擬人角膜暴露。牛角膜渾濁度滲透性試驗(tg437)經過oecd認可，作為替代傳統動物試驗評價急性眼刺激性的方法之一，用於分類和標示，其數據廣泛被接受。然而實際中可能接觸到多種外源化學物，且重複接觸，例如藥物、大氣汙染物等，國際上尚未認可多次眼刺激性體外方法。目前基於離體角膜的多參數重複暴露眼刺激性體外預測/評價方法未見相關專利和文獻報導。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題，就是提供一種利用離體動物角膜模型多參數檢測眼刺激性的方法，該方法具有快速、通量高、不使用活體動物等優點，可以對一種/多種物質多重/多次暴露眼刺激性進行快速評價/預測，且能廣泛應用。解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案來實現的。一種利用離體動物角膜模型多參數檢測眼刺激性的方法，其特徵是含以下步驟：s1，離體動物眼球的獲取s1-1，離體動物眼球來源於動物屠宰場，眼球的摘取應在動物死亡4h內進行；s1-2，採用剪刀或類似器械從眼眶進入，切斷與眼球連接的組織，完整取處眼球，摘取眼球的過程中不能接觸或損傷眼球組織及眼球表面的角膜；s1-3，將摘取下的眼球完全浸泡於含100iu/ml青黴素和100iu/ml鏈黴素、且4℃預冷的無菌hbss緩衝液，於7h內進行檢測；s2，離體角膜的製備s2-1，離體角膜指健康動物離體眼球分離的角膜，無肉眼可見的損傷或病變；s2-2，分離角膜前肉眼檢查角膜完整性，丟棄有劃痕、色素沉著、白班、混濁、機械損傷或異常者；s2-3，源於牛眼球的角膜直接分離，豬眼球應浸入含1％的聚維酮碘溶液2min，用無菌pbs衝洗，浸入含有0.1％慶大黴素的pbs15min消毒後進行角膜分離操作；s2-4，角膜分離應在潔淨的環境下進行，紫外燈照射房間至少30min；s2-5，角膜外周保留2-3mm鞏膜，以手術刀做切口，環切下角膜，夾住鞏膜，用鑷子剝除角膜內皮的玻璃體和虹膜附屬組織，操作中不得直接接觸角膜上皮或內皮組織；s2-6，將角膜內皮朝上置於無菌32±1℃預熱hbss緩衝液中清洗1-2次，去除附屬殘留組織；s2-7，將角膜上皮朝上，放置於角膜固定器的後室部分；穩定放上前室部分，以螺絲固定前後室，期間避免移動前室，以免造成角膜損傷；s2-8，角膜固定器的後室和前室分別依次填充無菌不含酚紅的mem培養基，水平置於培養箱(32±1℃，rh70±10％)中孵育1～2h，以恢復角膜正常生理活性；s3，受試物和對照組暴露s3-1，角膜孵育後，更換前後室培養基，依前後室順序將液體抽出，依次向後室和前室重新加入新鮮培養基，用角膜濁度儀測量並記錄每個角膜初始濁度值，根據濁度值進行角膜分組；s3-2，每個角膜加入1±0.5ml(g)受試物，並確保受試物完全覆蓋角膜；液體受試物直接從前室上方小孔加入，粘稠或固體受試物打開前室玻璃片，將受試物加入角膜表面；s3-3，多參數暴露條件：根據受試物的不同，選擇不同的暴露參數，所有陽性對照、陰性對照和溶劑對照均採用與受試物相同的暴露條件；s3-4，豎直放置角膜固定器，使受試物與角膜充分接觸，返回培養箱暴露；暴露結束後進行衝洗，以完全去除受試物，衝洗之後返回培養箱進行後孵育，後孵育結束後更換前後室培養基，再次測量並記錄每個相應的角膜濁度值；s4，收集後室培養基，保存用於酶活性和/或炎性因子測定；s5，去除前室培養基，加入1ml螢光素鈉溶液，繼續孵育90分鐘；收集後室所有液體，混勻後取液體360μl在490nm波長下讀取吸光度值；s6，評價指標的測量a.肉眼觀察，受試物暴露後，觀察角膜顏色、狀態或有無上皮脫落，記錄並作為附加評價的參考；b.渾濁度(op值)，角膜在受試物暴露前和暴露後濁度的變化，反應受試物對角膜的刺激性；c.滲透性(do490)，受試物暴露後，通過螢光素鈉定量，評估角膜上皮完整性；d.炎性物質的釋放，ldh活性、il-6或il-8等細胞因子定量檢測一個或多個炎性物質含量，並與做統計學分析，用於樣品精細分析；e.組織學檢測，完成試驗後的角膜固定在固定液中，進行組織學評估，作為附加評價參考。s7，預測模型1)角膜體外評分＝校正op值+15×校正od4902)細分類模型：組織學評分，炎性物質釋放刺激性體外評分刺激性預測≤3無刺激性＞3，≤15微弱刺激性＞15，≤55輕刺激性＞55嚴重刺激性/腐蝕性所述上述步驟中，涉及的所有操作器械經過無菌處理，所述的培養、暴露和孵育均處於無菌培養箱中，溫度為32±1℃，溼度70±10％。所述步驟s1中所述的動物離體眼球組織為牛眼球、豬眼球、羊眼球或兔眼球，不考慮動物的性別，動物的年齡範圍在12個月至60個月內；年齡和品種儘可能接近或一致，如能獲取此類信息對於有助於評估角膜均一性和差異性。所述步驟s1中所述的hbss緩衝液，粉劑購自sigma公司，每升添加0.35g分析純的碳酸氫鈉，使用18mω*cm的超純水配製，充分混勻後調節ph7.2-ph7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，加入青黴素100iu/ml和鏈黴素100iu/ml，4℃保存4周。所述步驟s2中所述的角膜固定器為角膜濁度儀配件，與角膜濁度儀一同使用(適用於牛角膜固定)，如是豬角膜、羊角膜或其他動物角膜，需配合使用與其相適應的角膜固定器；其他特製的角膜固定器需要符合傳統角膜固定器中暴露面積和後室容積比例，濁度儀通用；角膜固定器分為前室和後室兩部分，中間以角膜分隔。所述步驟s2中所述的mem培養基為細胞培養用mem培養基，購自sigma公司，同時需要含酚紅和不含酚紅兩種，每升添加2.2g的分析純碳酸氫鈉和0.292gl-穀氨醯胺(購自sigma公司)，使用超純水配製，充分混勻後調節ph7.2-ph7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃可保存4周，使用前加入1％胎牛血清(購自gibco公司)，32±1℃預熱；含酚紅mem培養基只在衝洗步驟使用，其餘均採用不含酚紅mem培養基。所述步驟s2和s6中所述的角膜濁度儀為專門用於檢測角膜混濁度的儀器，如德國basf生產的opacitometer3.0和法國riom生產的op-kit，通過光通量的改變反應角膜濁度的變化。操作方法為：打開儀器，讓光源穩定5分鐘，根據儀器說明書進行調整和校正，放入角膜固定器，直接讀取角膜濁度值(op值)，其中opacitometer3.0讀取的是照度值(i)，需要根據儀器說明將數據轉化為op值。獲取角膜基礎濁度後，根據儀器說明棄去不合要求的角膜。每次測量角膜濁度值前均需要用新鮮培養更換前後室中舊培養基，操作時避免產生氣泡，以免影響試驗。所述步驟s3中所述角膜分組，根據角膜基礎濁度值，選取濁度值最低的至少3個角膜作為陰性對照，其餘的角膜按濁度順序排序進行分組，每個樣品或對照需要至少3個平行。所述步驟s3中所述的受試物或對照組，每個角膜加入1±0.5ml(g)受試物或對照組。一般情況下，受試物均採樣原樣/原液進行測試，也可採用應用濃度或濃縮液進行，具體可以根據實際需要選擇合適的濃度(＞0，≤100％)。陰性對照採用超純水、生理鹽水(0.9％氯化鈉溶液)或mem培養基，陽性對照採用1-5％十二烷基硫酸鈉(或稱月桂醇硫酸鈉，sls，cas：151-21-3)，溶於超純水或無水乙醇(cas：64-17-5，分析純)。使用前均需要32±1℃預熱。所述步驟s3中所述暴露時間和後孵育時間的選擇：a.一般情況下，受試物均採樣原樣/原液進行測試，也可採用應用液或濃縮液進行，具體根據實際需要選擇合適的受試物濃度(＞0，≤100％)。b.液體受試物暴露時間5-30min，後孵育時間90-240min，時間的選擇需根據實際情況進行；固體受試物暴露時間90-240min，後孵育時間0-240min，時間的選擇需根據實際情況進行；所有陽性對照、陰性對照和溶劑對照均採用於受試物相同的暴露條件；c.長期或反覆使用或接觸眼睛的受試物，選擇暴露時間為30min，後孵育時間120分鐘；d.按順序成套使用的一組受試物，選擇暴露時間為第一種物質作用10min，去除受試物後再孵育30min，再更換第二種物質作用10min，去除受試物後再孵育30min，再更換第三種受試物質作用10min，依次類推，直至完成所有一組物的暴露；所述步驟s3中的暴露後衝洗，其具體步驟如下：對於液體受試物，通過上方加樣孔注入約5ml含酚紅mem，豎直方向上晃動固定器，去除含受試物培養基，觀察記錄顏色變化，重複此步驟至少3次，直至肉眼可見受試物無殘留，再用不含酚紅mem衝洗至少1次，直至去除含酚紅培養基。對於固體受試物，需再次打開加樣玻璃窗，加入約5ml含酚紅mem進行清洗，清洗步驟如同液體受試物清洗步驟，最後需要將玻璃窗安裝回固定器中。所述步驟s4中的酶活性/細胞因子包括：乳酸脫氫酶(ldh)、il-1α、tgf-α、fgf等所述步驟s5中的螢光素鈉溶液，分為4％(適用於液體受試物)和5％(適用於固體受試物)兩種。螢光素鈉(cas：518-47-8)，購自sigma公司，使用無菌不含ca2+、mg2+的dpbs(購自gibco公司)配製，充分混勻，4℃避光可保存8周，使用前32±1℃預熱。所述步驟s4中的肉眼觀察包括直接觀察和採用裂隙燈輔助，作為附加評價指標；直接觀察時需要記錄暴露前後所觀察到特徵，採用圖像記錄或文字描述；採用裂隙燈檢查時，將其調為亮度為中等的裂隙光，調整角度和寬度，角膜上皮檢查時光源角度45°，角膜基質和內皮檢查時，裂隙寬度2mm，對角膜進行檢查，記錄所檢查到的結果。所述步驟s4中的滲透性評價指標，去除角膜固定器前室液體，加入1ml螢光素鈉溶液，螢光素鈉透過角膜上皮滲透進入角膜固定器後室，反映角膜上皮完整性，混勻並取360μl後室液體，使用酶標儀或96孔讀板機，在490nm波長下讀取吸光度值(od490)。所述步驟s4中的酶活性和細胞因子檢測，收集後室液體，採用elisa法或其他檢測方法定量檢測相應指標，操作根據相應說明書進行，反應角膜在受試物作用下產生炎性反應的程度。所述步驟s4中的組織學評價指標，是指將角膜固定在4％多聚甲醛或中性福馬林溶液中，4℃固定至少24小時；按常規梯度乙醇脫水、二甲苯中透明、石蠟包埋，切片厚度為4～7μm，h-e染色，中性樹膠封片；顯微鏡觀察：分別對角膜上皮、基質和內皮進行組織學評價，並作圖像記錄和文字描述，評價指標可以角膜全層厚度、上皮厚度和完整性、基質厚度和水腫情況，以及內皮厚度，作為附加評價指標。所述步驟s5中的角膜體外評分＝校正op值+15×校正od490；校正op值＝op變化值-陰性對照op值；op變化值＝暴露後op值-基礎op值；校正od490＝角膜od490-陰性對照od490。所述步驟s5中的角膜炎性物質的釋放，定量檢測後，採用合適的統計學方法進行分析。本方法同時適用於多種物理狀態的受試物，揮發性物質有可能削弱其刺激性預測，暫不適用於氣體和氣溶膠物質；膏霜類、蠟狀或半固體等均視為液體處理。本發明具有如下有益效果：(1)本發明使用離體動物角膜組織，其結構接近人體角膜，結果可信，重複性好，預測能力良好；(2)本發明角膜來源與廢棄動物眼球組織，無需使用活體動物，符合3rs原則；(3)本發明採用多參數指標，為多重/多次暴露眼刺激性預測提供更多證據；(4)本發明建立的方法可以代替活體動物試驗，直接用於化學品、日化品、藥品等成品、配方或原料多重/多次暴露下眼刺激預測/評價，適用於配方的比較，原料篩選和產品評估等；(5)本發明定量檢測酶活性和/或細胞因子，具有靈敏度高，通量高等特點，適用於不同受試物的精細比較；(6)本發明利用附加組織學評價，可用於分析受試物刺激性程度和機制等方面的研究。附圖說明圖1是角膜固定器示意圖。具體實施方式本發明的利用離體動物角膜模型多參數檢測眼刺激性的方法，含以下步驟：s1，離體動物眼球的獲取s1-1，離體動物眼球來源於動物屠宰場，眼球的摘取應在動物死亡4h內進行；s1-2，採用剪刀或類似器械從眼眶進入，切斷與眼球連接的組織，完整取處眼球，摘取眼球的過程中不能接觸或損傷眼球組織及眼球表面的角膜；s1-3，將摘取下的眼球完全浸泡於含100iu/ml青黴素和100iu/ml鏈黴素、且4℃預冷的無菌hbss緩衝液，於7h內進行檢測；s2，離體角膜的製備s2-1，離體角膜指健康動物離體眼球分離的角膜，無肉眼可見的損傷或病變；s2-2，分離角膜前肉眼檢查角膜完整性，丟棄有劃痕、色素沉著、白班、混濁、機械損傷或異常者；s2-3，源於牛眼球的角膜直接分離，豬眼球應浸入含1％的聚維酮碘溶液2min，用無菌pbs衝洗，浸入含有0.1％慶大黴素的pbs15min消毒後進行角膜分離操作；s2-4，角膜分離應在潔淨的環境下進行，紫外燈照射房間至少30min；s2-5，角膜外周保留2-3mm鞏膜，以手術刀做切口，環切下角膜，夾住鞏膜，用鑷子剝除角膜內皮的玻璃體和虹膜附屬組織，操作中不得直接接觸角膜上皮或內皮組織；s2-6，將角膜內皮朝上置於無菌32±1℃預熱hbss緩衝液中清洗1-2次，去除附屬殘留組織；s2-7，將角膜上皮朝上，放置於角膜固定器的後室部分；穩定放上前室部分，以螺絲固定前後室，期間避免移動前室，以免造成角膜損傷；s2-8，角膜固定器的後室和前室分別依次填充無菌不含酚紅的mem培養基，水平置於培養箱(32±1℃，rh70±10％)中孵育1～2h，以恢復角膜正常生理活性；s3，受試物和對照組暴露s3-1，角膜孵育後，更換前後室培養基，依前後室順序將液體抽出，依次向後室和前室重新加入新鮮培養基，用角膜濁度儀測量並記錄每個角膜初始濁度值，根據濁度值進行角膜分組；s3-2，每個角膜加入1±0.5ml(g)受試物，並確保受試物完全覆蓋角膜；液體受試物直接從前室上方小孔加入，粘稠或固體受試物打開前室玻璃片，將受試物加入角膜表面；s3-3，多參數暴露條件：根據受試物的不同，選擇不同的暴露參數，所有陽性對照、陰性對照和溶劑對照均採用與受試物相同的暴露條件；s3-4，豎直放置角膜固定器，使受試物與角膜充分接觸，返回培養箱暴露；暴露結束後進行衝洗，以完全去除受試物，衝洗之後返回培養箱進行後孵育，後孵育結束後更換前後室培養基，再次測量並記錄每個相應的角膜濁度值；s4，收集後室培養基，保存用於酶活性和/或炎性因子測定；s5，去除前室培養基，加入1ml螢光素鈉溶液，繼續孵育90分鐘；收集後室所有液體，混勻後取液體360μl在490nm波長下讀取吸光度值；s6，評價指標的測量a.肉眼觀察，受試物暴露後，觀察角膜顏色、狀態或有無上皮脫落，記錄並作為附加評價的參考；b.渾濁度(op值)，角膜在受試物暴露前和暴露後濁度的變化，反應受試物對角膜的刺激性；c.滲透性(do490)，受試物暴露後，通過螢光素鈉定量，評估角膜上皮完整性；d.炎性物質的釋放，ldh活性、il-6或il-8等細胞因子定量檢測一個或多個炎性物質含量，並與做統計學分析，用於樣品精細分析；e.組織學檢測，完成試驗後的角膜固定在固定液中，進行組織學評估，作為附加評價參考。s7，預測模型1)角膜體外評分＝校正op值+15×校正od4902)細分類模型：組織學評分，炎性物質釋放刺激性體外評分刺激性預測≤3無刺激性＞3，≤15微弱刺激性＞15，≤55輕刺激性＞55嚴重刺激性/腐蝕性所述上述步驟中，涉及的所有操作器械經過無菌處理，所述的培養、暴露和孵育均處於無菌培養箱中，溫度為32±1℃，溼度70±10％。所述步驟s1中所述的動物離體眼球組織為牛眼球、豬眼球、羊眼球或兔眼球，不考慮動物的性別，動物的年齡範圍在12個月至60個月內；年齡和品種儘可能接近或一致，如能獲取此類信息對於有助於評估角膜均一性和差異性。所述步驟s1中所述的hbss緩衝液，粉劑購自sigma公司，每升添加0.35g分析純的碳酸氫鈉，使用18mω*cm的超純水配製，充分混勻後調節ph7.2-ph7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，加入青黴素100iu/ml和鏈黴素100iu/ml，4℃保存4周。所述步驟s2中所述的角膜固定器為角膜濁度儀配件，與角膜濁度儀一同使用(適用於牛角膜固定)，如是豬角膜、羊角膜或其他動物角膜，需配合使用與其相適應的角膜固定器；其他特製的角膜固定器需要符合傳統角膜固定器中暴露面積和後室容積比例，濁度儀通用；角膜固定器分為前室和後室兩部分，中間以角膜分隔。所述步驟s2中所述的mem培養基為細胞培養用mem培養基，購自sigma公司，同時需要含酚紅和不含酚紅兩種，每升添加2.2g的分析純碳酸氫鈉和0.292gl-穀氨醯胺(購自sigma公司)，使用超純水配製，充分混勻後調節ph7.2-ph7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃可保存4周，使用前加入1％胎牛血清(購自gibco公司)，32±1℃預熱；含酚紅mem培養基只在衝洗步驟使用，其餘均採用不含酚紅mem培養基。所述步驟s2和s6中所述的角膜濁度儀為專門用於檢測角膜混濁度的儀器，如德國basf生產的opacitometer3.0和法國riom生產的op-kit，通過光通量的改變反應角膜濁度的變化。操作方法為：打開儀器，讓光源穩定5分鐘，根據儀器說明書進行調整和校正，放入角膜固定器，直接讀取角膜濁度值(op值)，其中opacitometer3.0讀取的是照度值(i)，需要根據儀器說明將數據轉化為op值。獲取角膜基礎濁度後，根據儀器說明棄去不合要求的角膜。每次測量角膜濁度值前均需要用新鮮培養更換前後室中舊培養基，操作時避免產生氣泡，以免影響試驗。所述步驟s3中所述角膜分組，根據角膜基礎濁度值，選取濁度值最低的至少3個角膜作為陰性對照，其餘的角膜按濁度順序排序進行分組，每個樣品或對照需要至少3個平行。所述步驟s3中所述的受試物或對照組，每個角膜加入1±0.5ml(g)受試物或對照組。一般情況下，受試物均採樣原樣/原液進行測試，也可採用應用濃度或濃縮液進行，具體可以根據實際需要選擇合適的濃度(＞0，≤100％)。陰性對照採用超純水、生理鹽水(0.9％氯化鈉溶液)或mem培養基，陽性對照採用1-5％十二烷基硫酸鈉(或稱月桂醇硫酸鈉，sls，cas：151-21-3)，溶於超純水或無水乙醇(cas：64-17-5，分析純)。使用前均需要32±1℃預熱。所述步驟s3中所述暴露時間和後孵育時間的選擇：a.一般情況下，受試物均採樣原樣/原液進行測試，也可採用應用液或濃縮液進行，具體根據實際需要選擇合適的受試物濃度(＞0，≤100％)。b.液體受試物暴露時間5-30min，後孵育時間90-240min，時間的選擇需根據實際情況進行；固體受試物暴露時間90-240min，後孵育時間0-240min，時間的選擇需根據實際情況進行；所有陽性對照、陰性對照和溶劑對照均採用於受試物相同的暴露條件；c.長期或反覆使用或接觸眼睛的受試物，選擇暴露時間為30min，後孵育時間120分鐘；d.按順序成套使用的一組受試物，選擇暴露時間為第一種物質作用10min，去除受試物後再孵育30min，再更換第二種物質作用10min，去除受試物後再孵育30min，再更換第三種受試物質作用10min，依次類推，直至完成所有一組物的暴露；所述步驟s3中的暴露後衝洗，其具體步驟如下：對於液體受試物，通過上方加樣孔注入約5ml含酚紅mem，豎直方向上晃動固定器，去除含受試物培養基，觀察記錄顏色變化，重複此步驟至少3次，直至肉眼可見受試物無殘留，再用不含酚紅mem衝洗至少1次，直至去除含酚紅培養基。對於固體受試物，需再次打開加樣玻璃窗，加入約5ml含酚紅mem進行清洗，清洗步驟如同液體受試物清洗步驟，最後需要將玻璃窗安裝回固定器中。所述步驟s4中的酶活性/細胞因子包括：乳酸脫氫酶(ldh)、il-1α、tgf-α、fgf等所述步驟s5中的螢光素鈉溶液，分為4％(適用於液體受試物)和5％(適用於固體受試物)兩種。螢光素鈉(cas：518-47-8)，購自sigma公司，使用無菌不含ca2+、mg2+的dpbs(購自gibco公司)配製，充分混勻，4℃避光可保存8周，使用前32±1℃預熱。所述步驟s4中的肉眼觀察包括直接觀察和採用裂隙燈輔助，作為附加評價指標；直接觀察時需要記錄暴露前後所觀察到特徵，採用圖像記錄或文字描述；採用裂隙燈檢查時，將其調為亮度為中等的裂隙光，調整角度和寬度，角膜上皮檢查時光源角度45°，角膜基質和內皮檢查時，裂隙寬度2mm，對角膜進行檢查，記錄所檢查到的結果。所述步驟s4中的滲透性評價指標，去除角膜固定器前室液體，加入1ml螢光素鈉溶液，螢光素鈉透過角膜上皮滲透進入角膜固定器後室，反映角膜上皮完整性，混勻並取360μl後室液體，使用酶標儀或96孔讀板機，在490nm波長下讀取吸光度值(od490)。所述步驟s4中的酶活性和細胞因子檢測，收集後室液體，採用elisa法或其他檢測方法定量檢測相應指標，操作根據相應說明書進行，反應角膜在受試物作用下產生炎性反應的程度。所述步驟s4中的組織學評價指標，是指將角膜固定在4％多聚甲醛或中性福馬林溶液中，4℃固定至少24小時；按常規梯度乙醇脫水、二甲苯中透明、石蠟包埋，切片厚度為4～7μm，h-e染色，中性樹膠封片；顯微鏡觀察：分別對角膜上皮、基質和內皮進行組織學評價，並作圖像記錄和文字描述，評價指標可以角膜全層厚度、上皮厚度和完整性、基質厚度和水腫情況，以及內皮厚度，作為附加評價指標。所述步驟s5中的角膜體外評分＝校正op值+15×校正od490；校正op值＝op變化值-陰性對照op值；op變化值＝暴露後op值-基礎op值；校正od490＝角膜od490-陰性對照od490。所述步驟s5中的角膜炎性物質的釋放，定量檢測後，採用合適的統計學方法進行分析。本方法同時適用於多種物理狀態的受試物，揮發性物質有可能削弱其刺激性預測，暫不適用於氣體和氣溶膠物質；膏霜類、蠟狀或半固體等均視為液體處理。具體實施例1基於牛角膜檢測某化妝品套裝多重暴露下眼刺激性預測1、實驗材料的準備1.1溶液的配製1.1.1hbss溶液：hbss粉劑1包(購自sigma)，加入0.35g碳酸氫鈉(國產分析純)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，加入青黴素(100iu/ml)和鏈黴素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培養基：mem培養基粉劑1包(購自sigma)，加入2.2g碳酸氫鈉(國產分析純)和0.292gl-穀氨醯胺(購自sigma)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚紅和不含酚紅配製方法相同。使用前加入1％胎牛血清(購自gibco)。1.1.3螢光素鈉溶液：準確稱取螢光素鈉0.10g(購自sigma)，加入25mldpbs溶液(購自gibco)，配製成0.4％螢光素鈉溶液。準確稱取螢光素鈉0.125g，加入25mldpbs溶液，配製成0.4％螢光素鈉溶液。4℃避光條件下可保存8周。1.2試驗器械的準備所有取牛眼球的器械和分離角膜的器械都需要經過無菌處理。1.3受試物和對照組的準備1.3.1受試物準備：受試物為市售某化妝品公司生產的基礎護膚套裝，含有潔面乳、柔膚水和乳液。根據說明書，產品使用順序和方法為先用潔面乳清潔臉部3分鐘，用清水清洗，擦乾後取適量柔膚水輕拍臉上，接著均勻塗抹乳液。將受試物分為a(潔面乳)、b(柔膚水)、c(乳液)、d(a+b)、e(a+c)、f(b+c)和g(a+b+c)七組。1.3.2陰性對照組：超純水。1.3.3陽性對照組：無水乙醇。1.4離體牛眼球的獲取1.4.1將1lhbss溶液裝於2.5l廣口瓶中，4℃冷藏，保溫箱運輸至屠宰場。摘取牛眼器械置於不鏽鋼盒子中運輸。1.4.2本次牛眼由屠宰場經培訓的工作人員摘取，並立即放入冰冷hbss中，完成後運輸回實驗室。2試驗過程2.1離體角膜的製備2.1.1檢查眼球，棄去任何肉眼可見損傷或病變的眼球。2.1.2以手術刀在角膜外2-3mm孔膜處做一小切口，剪刀環切下角膜，外周保留2-3mm鞏膜，夾住鞏膜，以鑷子輕輕剝離玻璃體和虹膜。2.1.3將角膜內皮朝上置於hbss溶液中進行清洗，洗去殘舊的附屬組織。2.1.4將角膜上皮朝上置於角膜固定器後室，放上並固定前室。2.1.5固定之後，先後室再前室的順序加入mem培養基，排空氣泡。再次檢查角膜有無異常，棄去任何異常角膜。2.1.6將角膜固定器水平放置，置於培養箱中孵育1.5h。2.2濁度測量和分組2.2.1取出角膜固定器，按前室後室的順序抽出mem培養基，按後室前室的順序加入新鮮mem培養基，排空氣泡。2.2.2打開opacitometer3.0濁度儀，按照說明書進行調整並使用3個標準濾光片進行儀器檢測。放入一個含有mem培養基但不含角膜的固定器，記錄數值(i0)，單位lux，作為空白值。將每個角膜放入，記錄相應的數值(i)。2.2.3根據儀器說明書上提供的公式，對每個角膜濁度值進行判斷，棄去不符合要求的角膜。2.2.4將角膜順序按i的大小排序，選取數值最大的9個角膜作為陰性對照組(nc1-3)，其餘的角膜依次分為受試物組a、b、c、d、e、f、g和陽性對照組(pc1-3)，每組3個角膜，貼好標籤。2.3受試物暴露2.3.1去除前室所有液體。分別從加樣孔中加入0.75ml不同受試物進行暴露：2.3.1.1單獨暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為10min，暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.2雙重暴露：d和e組各自加入a受試物，f組加入b受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為10min，結束後進行衝洗步驟，完成後d組加入b受試物，e和f組各種加入c受試物。豎直放置，再次返回培養箱中，時間為10min，暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.3三重暴露：g組加入受試物a，豎直放置，返回培養箱中，時間為10min，結束後進行衝洗步驟；第二次加入b受試物，豎直放置，再次返回培養箱中，時間為10min，結束後進行衝洗步驟；第三次加入c受試物，豎直放置，最後一次返回培養箱中，時間為10min，至此暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.4衝洗2.4.1吸棄受試物，加樣孔加入約5ml含酚紅mem培養基，豎直方向晃動固定器，使液體充分接觸角膜，吸棄液體，重複此步驟至少3次，直至受試物無肉眼可見殘留。2.4.2最後一次吸棄含酚紅mem培養基，加入不含酚紅mem培養基，清洗至少1次，直至完全去除含酚紅mem培養基。2.4.3再次檢查有無受試物殘留，如有，繼續2.4.2衝洗，如無，需要多重暴露的受試物返回暴露步驟，或者衝洗結束進入後孵育。2.5後孵育衝洗完成後，前室重新填充新鮮mem培養基，返回培養箱進行後孵育，時間240min。2.6濁度測量2.6.1後孵育完成後，用新鮮mem培養基更換前後室液體，先前室再後室的順序吸棄液體，填充液體時順序為先後室再前室。2.6.2打開opacitometer3.0濁度儀，依次放入各組角膜，記錄相應數值。2.7螢光素鈉滲透吸棄前室液體，加入1ml0.4％螢光素鈉溶液，豎直放置，在培養箱中孵育90min。2.8吸光度測量2.8.1收集後室全部液體，充分混勻，取360μl後室液體，置於96孔板中，做好標記。2.8.2打開酶標儀，放入96孔板，選擇檢測波長490nm，讀取相應吸光度值(od490)。3數據分析3.1濁度值的換算根據儀器說明書，op值轉換公式如下：3.2體外評分的計算op變化值＝暴露後op值-暴露前op值校正op值＝op變化值-平均陰性對照op值校正od490＝受試物od490-平均陰性對照od490體外評分＝校正op值-校正od4903.3體外評分結果和眼刺激性預測3.4肉眼觀察結果pc組暴露後可見角膜渾濁或變白，nc組和受試物組各角膜均肉眼可見無明顯變化，角膜呈透明狀。4.結論4.1在本次試驗條件下，a、b和c組在標準暴露時間下，眼刺激性預測為無刺激性。4.2在本次試驗條件下，d、e和f組在雙重暴露下，d組預測為微弱刺激性，e和f組預測為無刺激性。4.3在本次試驗條件下，g組在三重暴露下預測為微弱刺激性。實施例2基於牛角膜檢測某品牌眼藥水多次暴露下眼刺激性預測1、實驗材料的準備1.1溶液的配製1.1.1hbss溶液：hbss粉劑1包(購自sigma)，加入0.35g碳酸氫鈉(國產分析純)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，加入青黴素(100iu/ml)和鏈黴素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培養基：mem培養基粉劑1包(購自sigma)，加入2.2g碳酸氫鈉(國產分析純)和0.292gl-穀氨醯胺(購自sigma)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚紅和不含酚紅配製方法相同。使用前加入1％胎牛血清(購自gibco)。1.1.3螢光素鈉溶液：準確稱取螢光素鈉0.10g(購自sigma)，加入25mldpbs溶液(購自gibco)，配製成0.4％螢光素鈉溶液。準確稱取螢光素鈉0.125g，加入25mldpbs溶液，配製成0.4％螢光素鈉溶液。4℃避光條件下可保存8周。1.1.4ldh檢測試劑盒(elisa)購自南京建成生物工程研究所。1.2試驗器械的準備所有取牛眼球的器械和分離角膜的器械都需要經過無菌處理。1.3受試物和對照組的準備1.3.1受試物準備：受試物為市售某品牌眼藥水，共3種眼藥水，均為乙類otc，無色透明液體，分別標記受試物abc。1.3.2陰性對照組：超純水。1.3.3陽性對照組：1.5％sls1.4離體牛眼球的獲取1.4.1將1lhbss溶液裝於2.5l廣口瓶中，4℃冷藏，保溫箱運輸至屠宰場。摘取牛眼器械置於不鏽鋼盒子中運輸。1.4.2本次牛眼由屠宰場經培訓的工作人員摘取，並立即放入冰冷hbss中，完成後運輸回實驗室。2試驗過程2.1離體角膜的製備2.1.1檢查眼球，棄去任何肉眼可見損傷或病變的眼球。2.1.2以手術刀在角膜外2-3mm孔膜處做一小切口，剪刀環切下角膜，外周保留2-3mm鞏膜，夾住鞏膜，以鑷子輕輕剝離玻璃體和虹膜。2.1.3將角膜內皮朝上置於hbss溶液中進行清洗，洗去殘舊的附屬組織。2.1.4將角膜上皮朝上置於角膜固定器後室，放上並固定前室。2.1.5固定之後，先後室再前室的順序加入mem培養基，排空氣泡。再次檢查角膜有無異常，棄去任何異常角膜。2.1.6將角膜固定器水平放置，置於培養箱中孵育1.5h。2.2濁度測量和分組2.2.1取出角膜固定器，按前室後室的順序抽出mem培養基，按後室前室的順序加入新鮮mem培養基，排空氣泡。2.2.2打開opacitometer3.0濁度儀，按照說明書進行調整並使用3個標準濾光片進行儀器檢測。放入一個含有mem培養基但不含角膜的固定器，記錄數值(i0)，單位lux，作為空白值。將每個角膜放入，記錄相應的數值(i)。2.2.3根據儀器說明書上提供的公式，對每個角膜濁度值進行判斷，棄去不符合要求的角膜。2.2.4將角膜順序按i的大小排序，選取數值最大的9個角膜作為陰性對照組(nc1-nc3)，其餘的角膜依次分為受試物組a1-a3、b1-b3、c1-c3和陽性對照組(pc1-3)每組3個角膜，貼好標籤。2.3受試物暴露2.3.1去除前室所有液體。分別從加樣孔中加入0.75ml不同受試物進行暴露：2.3.1.1單次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為30±3min，暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.2多次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為30min，結束後進行衝洗步驟，重複上述步驟2次，合計暴露兩次，至此暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.3多次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為30min，結束後進行衝洗步驟，重複上述步驟2次，合計暴露三次，至此暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.4衝洗2.4.1吸棄受試物，加樣孔加入約5ml含酚紅mem培養基，豎直方向晃動固定器，使液體充分接觸角膜，吸棄液體，重複此步驟至少3次，直至受試物無肉眼可見殘留。2.4.2最後一次吸棄含酚紅mem培養基，加入不含酚紅mem培養基，清洗至少1次，直至完全去除含酚紅mem培養基。2.4.3再次檢查有無受試物殘留，如有，繼續2.4.2衝洗，如無，需要多重暴露的受試物返回暴露步驟，或者衝洗結束進入後孵育。2.5後孵育衝洗完成後，前室重新填充新鮮mem培養基，返回培養箱進行後孵育，時間120min。2.6濁度測量2.6.1後孵育完成後，用新鮮mem培養基更換前後室液體，先前室再後室的順序吸棄液體，填充液體時順序為先後室再前室。2.6.2打開opacitometer3.0濁度儀，依次放入各組角膜，記錄相應數值。2.7螢光素鈉滲透吸棄前室液體，加入1ml0.4％螢光素鈉溶液，豎直放置，在培養箱中孵育90min。2.8吸光度測量2.8.1收集後室全部液體，充分混勻，取360μl後室液體，置於96孔板中，做好標記。2.8.2打開酶標儀，放入96孔板，選擇檢測波長490nm，讀取相應吸光度值。2.9ldh釋放量取2.8.1收集到的後室液體，用南京建成生物工程研究所的ldh試劑盒，根據說明書操作，用酶標儀在450nm處讀取吸光度值(od450)。3數據分析3.1濁度值的換算根據儀器說明書，op值轉換公式如下：3.2體外評分的計算op變化值＝暴露後op值-暴露前op值校正op值＝op變化值-平均陰性對照op值校正od490＝受試物od490-平均陰性對照od490體外評分＝校正op值-校正od4903.3體外評分結果和眼刺激性預測3.4肉眼觀察結果pc組暴露後可見角膜渾濁或變白，nc組和受試物組各角膜均肉眼可見無明顯變化，角膜呈透明狀。3.5ldh釋放量4.結論4.1在本次試驗條件下，a1、b1和c1組在單次暴露規定暴露時間下，眼刺激性預測為無刺激性。4.2在本次試驗條件下，a2、b2、c2、a3、b3和c3組在多次暴露規定暴露時間下，眼刺激性預測為無刺激性。4.3在本次試驗條件下，經統計學分析，c組在不同暴露條件下ldh含量百分比高於相應的a和b組，提示c組可能對角膜細胞產生微弱的作用，多次暴露下c組在眼刺激安全性上可能略差於a和b組。實施例3基於牛角膜檢測某品牌隱形眼睛護理液多次暴露下眼刺激性預測1、實驗材料的準備1.1溶液的配製1.1.1hbss溶液：hbss粉劑1包(購自sigma)，加入0.35g碳酸氫鈉(國產分析純)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，加入青黴素(100iu/ml)和鏈黴素(100iu/ml)，4℃冰箱可保存4周。1.1.2mem培養基：mem培養基粉劑1包(購自sigma)，加入2.2g碳酸氫鈉(國產分析純)和0.292gl-穀氨醯胺(購自sigma)，加入1l超純水，充分混勻，用鹽酸調節ph值到7.2-7.3，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱可保存4周。含酚紅和不含酚紅配製方法相同。使用前加入1％胎牛血清(購自gibco)。1.1.3螢光素鈉溶液：準確稱取螢光素鈉0.10g(購自sigma)，加入25mldpbs溶液(購自gibco)，配製成0.4％螢光素鈉溶液。準確稱取螢光素鈉0.125g，加入25mldpbs溶液，配製成0.4％螢光素鈉溶液。4℃避光條件下可保存8周。1.1.4ldh檢測試劑盒(elisa)購自南京建成生物工程研究所。1.2試驗器械的準備所有取牛眼球的器械和分離角膜的器械都需要經過無菌處理。1.3受試物和對照組的準備1.3.1受試物準備：受試物為市售某3種品牌隱形眼睛護理液，無色透明液體，分別標記受試物abc。1.3.2陰性對照組：超純水。1.3.3陽性對照組：3％sls1.4離體牛眼球的獲取1.4.1將1lhbss溶液裝於2.5l廣口瓶中，4℃冷藏，保溫箱運輸至屠宰場。摘取牛眼器械置於不鏽鋼盒子中運輸。1.4.2本次牛眼由屠宰場經培訓的工作人員摘取，並立即放入冰冷hbss中，完成後運輸回實驗室。2試驗過程2.1離體角膜的製備2.1.1檢查眼球，棄去任何肉眼可見損傷或病變的眼球。2.1.2以手術刀在角膜外2-3mm孔膜處做一小切口，剪刀環切下角膜，外周保留2-3mm鞏膜，夾住鞏膜，以鑷子輕輕剝離玻璃體和虹膜。2.1.3將角膜內皮朝上置於hbss溶液中進行清洗，洗去殘舊的附屬組織。2.1.4將角膜上皮朝上置於角膜固定器後室，放上並固定前室。2.1.5固定之後，先後室再前室的順序加入mem培養基，排空氣泡。再次檢查角膜有無異常，棄去任何異常角膜。2.1.6將角膜固定器水平放置，置於培養箱中孵育1.5h。2.2濁度測量和分組2.2.1取出角膜固定器，按前室後室的順序抽出mem培養基，按後室前室的順序加入新鮮mem培養基，排空氣泡。2.2.2打開opacitometer3.0濁度儀，按照說明書進行調整並使用3個標準濾光片進行儀器檢測。放入一個含有mem培養基但不含角膜的固定器，記錄數值(i0)，單位lux，作為空白值。將每個角膜放入，記錄相應的數值(i)。2.2.3根據儀器說明書上提供的公式，對每個角膜濁度值進行判斷，棄去不符合要求的角膜。2.2.4將角膜順序按i的大小排序，選取數值最大的9個角膜作為陰性對照組(nc1-nc3)，其餘的角膜依次分為受試物組a1-a3、b1-b3、c1-c3和陽性對照組(pc1-3)每組3個角膜，貼好標籤。2.3受試物暴露2.3.1去除前室所有液體。分別從加樣孔中加入0.75ml不同受試物進行暴露：2.3.1.1單次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為20min，暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.2多次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為20min，結束後進行衝洗步驟，重複上述步驟2次，合計暴露兩次，至此暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.3.1.3多次暴露：分別加入a、b和c受試物，豎直放置，返回培養箱中，時間為20min，結束後進行衝洗步驟，重複上述步驟2次，合計暴露三次，至此暴露結束，直接進入衝洗步驟。2.4衝洗2.4.1吸棄受試物，加樣孔加入約5ml含酚紅mem培養基，豎直方向晃動固定器，使液體充分接觸角膜，吸棄液體，重複此步驟至少3次，直至受試物無肉眼可見殘留。2.4.2最後一次吸棄含酚紅mem培養基，加入不含酚紅mem培養基，清洗至少1次，直至完全去除含酚紅mem培養基。2.4.3再次檢查有無受試物殘留，如有，繼續2.4.2衝洗，如無，需要多重暴露的受試物返回暴露步驟，或者衝洗結束進入後孵育。2.5後孵育衝洗完成後，前室重新填充新鮮mem培養基，返回培養箱進行後孵育，時間120min。2.6濁度測量2.6.1後孵育完成後，用新鮮mem培養基更換前後室液體，先前室再後室的順序吸棄液體，填充液體時順序為先後室再前室。2.6.2打開opacitometer3.0濁度儀，依次放入各組角膜，記錄相應數值。2.7螢光素鈉滲透吸棄前室液體，加入1ml0.4％螢光素鈉溶液，豎直放置，在培養箱中孵育90min。2.8吸光度測量2.8.1收集後室全部液體，充分混勻，取360μl後室液體，置於96孔板中，做好標記。2.8.2打開酶標儀，放入96孔板，選擇檢測波長490nm，讀取相應吸光度值。2.9ldh釋放量取2.8.1收集到的後室液體，用南京建成生物工程研究所的ldh試劑盒，根據說明書操作，用酶標儀在450nm處讀取吸光度值(od450)。3數據分析3.1濁度值的換算根據儀器說明書，op值轉換公式如下：3.2體外評分的計算op變化值＝暴露後op值-暴露前op值校正op值＝op變化值-平均陰性對照op值校正od490＝受試物od490-平均陰性對照od490體外評分＝校正op值-校正od4903.3體外評分結果和眼刺激性預測3.4肉眼觀察結果pc組暴露後可見角膜渾濁或變白，nc組和受試物組各角膜均肉眼可見無明顯變化，角膜呈透明狀。3.5ldh釋放量4.結論4.1在本次試驗條件下，a1、b1和c1組在單次暴露規定暴露時間下，眼刺激性預測為無刺激性。4.2在本次試驗條件下，a2、b2、c2、a3、b3和c3組在多次暴露規定暴露時間下，眼刺激性預測為無刺激性。4.3在本次試驗條件下，經統計學分析，b和c組在不同暴露條件下ldh含量百分比高於相應的a組，提示b和c組可能對角膜細胞產生微弱的作用，僅從眼刺激安全性考慮，長期使用a受試物可能優於b和c受試物。當前第1頁12