鹼性成纖維細胞生長因子的單克隆抗體的製作方法

2024-01-28 10:05:15 1

專利名稱：鹼性成纖維細胞生長因子的單克隆抗體的製作方法
鹼性成纖維細胞生長因子的單克隆抗體相關申請的交叉引用依據35U.S.C. § 119(e)，本申請要求於2008年5月四日提交的美國專利申請號 61/057，183和於2009年4月17日提交的美國專利申請號61/170，561的權益，所述專利申 請以其整體併入本文用於所有目的。對以計算機可讀格式提交的「序列表」、表格、或電腦程式列表的引用寫入文件022382-000820US_SEQLIST. TXT中的序列表為12，406位元組，創建於2009 年5月觀日，用於隨同提交的Kyimg Jin Kim等人"鹼生成纖維細胞生長因子的單克隆抗 體"的申請。該文件中所包含的信息特此併入作為參考。對於在聯邦政府資助的研究或開發下取得的發明的權利申明本申請中所描述的工作部分地得到美國國立衛生研究院的 Grant5R44CA101283-03資助。美國政府在本發明中擁有一定的權利。發明領域本發明一般地涉及組合單克隆抗體(mAb)和重組DNA技術用於開發新的生物學， 更具體地，例如涉及生產能夠與鹼性成纖維細胞生長因子結合併將其中和的單克隆抗體。
背景技術：
原型成纖維細胞生長因子(FGF)、酸性FGF(也稱為FGF1)和鹼性TO F(也稱為 FGF2)首次分離於 20 世紀 70 年代(FGF2 由 Gospodarowicz 等人，J. Biol. Chem. 250 :2515, 1975分離)。目前有22個已知的FGF家族成員，基於其活性和序列的相似性，可分成7個 亞家族(Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001)。然而，FGF家族成員僅與以組織特異 性方式表達的4種酪氨酸激酶受體(FGFR14)及其同種型結合。FGFl亞組由FGFl和FGF2 組成，其結合所有4種FGFR，其中FGF2與FGFRlc特別強地結合(Ornitz等人，J.Biol. Chem. 271 15292，1996)。成熟形式的人FGF2是ISkDa非糖基化多肽，其由衍生自155aa前體的146個氨 基酸組成(Ornitz 等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001 ；Okada-Ban 等人，Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32 :263, 2000) 0該18kDa形式的FGF2不編碼信號序列，但是可以通過不依賴 ER-Golgi複合物的非常規能量依賴性通道分泌(Mignatti等人，J. Cell Physiol. 151 :81， 1992 ；Florkiewicz 等人，J. Cell Physiol. 162 :388,1995)。除該 18kDa 形式之外，單拷貝 的FGF2基因還編碼該蛋白質的4個高分子量(HMW)形式，通過利用4個可選CUG起始位點 (提供各種大小的N-末端延伸)，產生22kDa(196個aa) ,22. 5kDa(201個aa) ,24kDa(210 個 aa)和 34kDa 088 個 aa)的蛋白質(Florkiewicz 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3978，1989 ；Prats 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :1836,1989)。HMW 形式不分泌，但 被轉運到細胞核，在細胞核中其可以以胞內分泌方式調節細胞生長或行為(Dclrieu，FEBS Lett. 468 :6,2000)。除了以高親和性結合FGFR1-4之外，FGF2還以較低的親和性與硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPG)結合。儘管FGF2以單體形式分泌，但是細胞表面HSPG使FGF2以非共價的並排構型二聚化，隨後這種構型能夠使FGF受體二聚化並活化(Mohammadi等人，Cytokine Growth Factor Revl6 =107,2005)。FGF和HSPG與FGFR的胞外結構域的結合誘導受體二聚化、活化和自磷酸化。FGF、特別是FGF2具有在各種細胞類型上的廣譜活性(Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001)。FGF2刺激包括成纖維細胞和內皮細胞在內的某些細胞增殖(即， 促有絲分裂的)，並且是某些細胞例如神經細胞的存活因子(抗細胞凋亡)(Okada-Ban，參 見上文所引文獻)。其還刺激內皮細胞的分化(形態發生)和遷移(運動性)(Dow等人， Urology 55:800,2000)。FGF2參與發育，尤其是神經系統的發育。重要的是，FGF2是強效 的生血管因子(Presta 等人，Cytokine and Growth Factor Rev. 16 :159,2005)。據認為，FGF2和其它FGF通過刺激血管生成和直接地刺激腫瘤細胞，在癌症中起 作用O^resta等人，參見上文所引文獻)。在腫瘤進展期間，癌症細胞可以響應從基質細胞 分泌(旁分泌)的胞外FGF2，然後這些腫瘤細胞自身可以分泌FGF2，並以自分泌方式響應 FGF2。已經顯示FGF2或其受體FGFRl在大多數神經膠質瘤中被表達或過表達(Takahashi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :5710，1990 ;Morrison 等人 Cancer Res. 54 :2794, 1994)。FGF2參與前列腺瘤的進展(Dow等人，toology 55 :800，2000)，並且是惡性黑素 瘤增殖的關鍵介質(Wang等人，Nature Med. 3 :887,1997) 對於唾液腺瘤(Myoken等人， J. Path. 178 :429，1996)、食管癌(Barclay 等人，Clin. Cancer Res. 11 :7683,2005)和甲狀 腺癌(Boelaert 等人，J. Clin. Endocrin. Metabol. 88 :2341，2003)，也已報導 FGF2 或 FGFRl 的過表達和/或其參與腫瘤進展。已報導，FGF2的多克隆抗體(抗血清)可以抑制小鼠內可移植軟骨肉瘤的腫瘤 生長(Baird 等人，J. Cell Biochem. 30 :79，1986)，體外中和 FGF2 的各種活性(Kurokawa 等人，J. Biol. Chem. 264 :7686,1989)，以及當被局部應用時可以抑制U87神經膠質瘤細 胞顱內異種移植物的生長(Man等人，J. Neurosurg. 82 :1044，1995)。在單克隆抗體中， 已報導DG2mAb可以在體外和在體內中和FGF2的活性(Reilly等人，Biochem. Biophys. Res. Com. 164 :736,1989 ；WO 91/06668)，適度抑制裸鼠中大鼠C6神經膠質瘤異種移植物的 生長(Gross等人，J.Nat. Cancer Inst. 85 :121，1993)，以及當損傷內遞送而非腹膜內或 靜脈內遞送時適度抑制大鼠軟骨肉瘤的生長(Coppola等人，Anticancer Res. 17 :2033, 1997)。類似地，已報導抗_FGF2mAb DE6體外抑制神經膠質瘤細胞的生長(Morrison等人， J. NeuroscienceRes. 34 :502，1993)。在另一方面，報導抗-FGF2mAb bFM-1 和 bFM_2 體外 抑制內皮細胞的生長，但是不體內阻斷腫瘤血管生成(Matsuzaki等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :9911,1989)。已報導中和性抗-FGF2mAblE6抑制RPMI4788結腸瘤異種移植 物的生長(Aonuma等人，19 :4039,1999)。已報導抗-FGF2mAb 254F1抑制人臍靜脈內皮 細胞(HUVEC)增殖，也已報導mAb FB-8體外抑制非小細胞肺癌細胞系增殖(Kuhn等人， LungCancer 44 :167，2004)。曾報導抗-FGF2mAb 3H3 抑制 U87MG 和 T98G 神經膠質瘤以及 HeLa細胞異種移植物的生長(Takahashi等人，FEBS Let. 288 :65，1991)，並且抑制小鼠內 K1000FGF2 轉染的 3T3 細胞系的生長(Hori 等人，Cancer Res. 51 :6180,1991)。本文所描述的GAL-F2抗_FGF2mAb在AACR 2009年會上於海報#1236中述及，其 為了所有目的整體併入本文。發明簡述
在一個實施方案中，本發明提供了人鹼性成纖維細胞生長因子(FGM)的中和 性mAb。該mAb抑制FGF2的至少一種、優選幾種或所有生物學活性，包括與4種FGF受體 FGFR1-4中的一種或多種的結合；誘導成纖維細胞、內皮細胞、Mv ILu貂肺上皮細胞和/或 各種人腫瘤細胞的增殖；和誘導血管生成。該抗_FGF2mAb當被用作單一活性劑時可以抑 制此類活性。優選的抗_FGF2mAb抑制小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。優選地，本發明的 mAb被遺傳工程化，例如嵌合、人源化或人mAb。示例性抗體是GAL-F2及其嵌合形式和人源 化形式，以及與GAL-F2具有相同表位或與GAL-F2發生競爭結合的mAb。還提供了產生此類 抗體的細胞系。在另一個實施方案中，提供了含有中和性抗-FGF2抗體例如嵌合或人源化 GAL-F2的藥物組合物。在第三實施方案中，將藥物組合物施用於患者以治療癌症或其它疾 病。附圖簡述圖 1. GAL-F2 與對照小鼠 mAb (mlgG)和人 FGF2 (hFGF2)與小鼠 FGM9 (mFGF2)的結 合ELISA。圖 2. FGFR-Fc/FGF2-Flag 結合 ELISA 顯示，GAL-F2 而非對照小鼠 mAb 5G8 對 4 種 FGF受體FGFR1-4中的每種具有抑制作用。
圖3.生物素化GAL F2與各種抗_FGF2mAb對人FGF2的競爭結合測定試驗。圖4. GAL-F2或對照mAb 5G8對FGF2誘導的BaF3細胞增殖的抑制，所述BaF3細 胞用FGFRl或FGFR2穩定轉染。「無(None)，，表示沒有FGF2 (或mAb)施用於細胞上。圖5. GAL-F2或對照mAb 5G8對TOF2誘導的Mv ILu貂肺上皮細胞增殖的抑制。 「無(None)」表示沒有FGF2(或mAb)施用於細胞上。圖6.在對照小鼠mAb (mlgG)、GAL-F2或bFM_l抗_FGF2mAb的存在下克隆在軟瓊 脂中的SMCC-7721細胞的顯微照片。圖7.從腫瘤接種後5天開始，用GAL-F2 (100 μ g，每周兩次)或PBS單獨處理的小 鼠中RPMI 4788人結腸瘤異種移植物的生長。圖8.從腫瘤接種後6天開始，用GAL-F2或bFM_l抗_FGF2mAb (100 μ g，每周兩次) 或PBS單獨處理的小鼠中RPMI 4788人結腸瘤異種移植物的生長。圖9.用PBS單獨、GAL-F2(100yg，每周兩次)、順鉬(100 μ g，每周一次)或用 GAL-F2和順鉬處理的小鼠中SMMC-7721人肝瘤異種移植物的生長。每組5隻小鼠。

圖10.從接種後6天開始，用PBS單獨、GAL-F2或M225抗-EGFRmAb (100 μ g，每 周兩次)或用GAL-F2和M225處理的小鼠中!fepG2人肝瘤異種移植物的生長。每組6隻小鼠°圖IlA禾口 11B.顯示HuGAL_F2 輕鏈(A) (SEQ ID NO 2)和重鏈(B)成熟可變區(SEQ ID NO 5)的胺基酸序列與小鼠GAL-F2(SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 4)及人受體V區(SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO 6)進行比對。GAL-F2序列中的CDR用下劃線標出，HuGAL_F2序列 中用小鼠L2G7胺基酸置換的胺基酸用雙下劃線標出。對於輕鏈和重鏈，均使用1字母氨基 酸代碼和Kabat編號系統。圖12.如本說明書所述進行的人源化(HuGAL-F2)和嵌合(ChGAL_F2)mAb與對照 人抗體hlgG的競爭結合。圖13.完整成熟 HuGAL-F2 抗體輕鏈(A) (SEQ ID NO 7)和重鏈(B) (SEQ ID NO 8)的胺基酸序列。對每行上的第1個胺基酸編號；編號是連續的。在輕鏈中，Ck區域的第 1個胺基酸用下劃線標出，而在重鏈中，CH 1區、鉸鏈區、CH2和CH3區的第1個胺基酸用下 劃線標出。發明詳述本發明提供了中和性抗-FGF2單克隆抗體、含有它們的藥物組合物以及使用它們 治療疾病的方法。1.抗體抗體是非常大的複雜分子(分子量為 150，000或約1320個胺基酸)，具有復 雜的內部結構。天然抗體分子含有相同的兩對多肽鏈，每對具有一條輕鏈和一條重鏈。每 個輕鏈和重鏈又由兩個區域構成參與結合靶抗原的可變區(「V")，和與免疫系統的其 它組分相互作用的恆定區(「C")。輕鏈和重鏈可變區在3維空間中靠在一起，形成與抗 原(例如在細胞表面上的受體)結合的可變區。在每個輕鏈或重鏈可變區內，有3個短片 段(長度平均為10個胺基酸)，被稱為互補決定區(「CDR")。抗體可變結構域中的6 個CDR(3個來自輕鏈，3個來自重鏈)在3-D空間中摺疊在一起，形成了鎖定在靶抗原上的 實際抗體結合位點。⑶R的位置和長度已由Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學重要的蛋白質的序列)，U. S. D印artment of Health and Human krvices，1983，1987精確地確定。未包含在⑶R中的可變區部分被稱為構架，其形 成了 CDR的環境。Chothia等人，J. Mol. Biol. 196 =901,1987已定義了由結構決定的超變區 或環的相關概念。人源化抗體是遺傳工程化抗體，其中來自小鼠抗體(「供體抗體"，也可以是大 鼠、倉鼠或其它非人物種)的CDR被移植到人抗體(「受體抗體")上。受體抗體的序列 可以是例如，成熟人抗體序列、人抗體序列的共有序列或種系序列。因此，人源化抗體是具 有來自供體抗體的CDR和來自人抗體的可變區構架和恆定區的抗體。此外，為了保留高的 結合親和性，可以使用兩個額外的結構要素中的至少一個。參考美國專利號5，530，101和 5，585，089(併入本文作為參考)，其提供了構建人源化抗體的詳細說明。人源化抗體通常 具有人源化重鏈和人源化輕鏈。通常，人源化重鏈的重鏈可變區構架和人源化輕鏈的輕鏈 可變區構架不包括超過10或12個置換，所述置換產生不存在於受體人重鏈或輕鏈可變區 構架(包括人共有可變區構架和複合人可變區構架)中的殘基。儘管人源化抗體通常摻入小鼠抗體的所有6個完整⑶R(如Kabat所定義)，但是 它們也可用少於小鼠抗體的全部CDR來製備(例如Pascalis等人，J. Immunol. 169 :3076, 2002)。在科學文獻中已記載過很多抗體，其中對於結合，可以省卻1個或2個⑶R。Padlan 等人，FASEB Journal9 :133-139(1995) ；Vajdos 等人，Journal of Molecular Biology, 320 :415-428(2002) ；Iwahashi 等人，Mol. Immunol. 36 :1079-1091, (1999) ；Tamura 等人， Journal of Immunology, 164 :1432-1441 (2000)。類似地，僅摻入 CDRs 的一部分，即結合所 需的CDR殘基子集(稱作SDR)，到人源化抗體中可能是必要的。可以基於先前的研究(例如⑶RH2中的殘基H60-H65通常是不需要的)，通過 分子建模和/或根據經驗，或如Gonzales等人，Mol. Immunol. 41 :863，2004所述，從位於 Chothia超變環之外的Kabat⑶R區域中鑑定不接觸抗原且不在SDR中的⑶R殘基。如果 省略CDR或其殘基，那麼其通常用在人受體序列中佔據相應位置的胺基酸置換，從而供給可變區構架序列。待包括的此類置換的數目反映競爭考慮的平衡。此類置換對減少人源化 抗體中的小鼠胺基酸的數目以及由此減少潛在的免疫原性，可能是有益的。然而，置換也可 能引起親和性的變化，優選避免親和性的顯著減少。也可根據經驗選擇CDR中置換的位置 以及待置換的胺基酸。在上文提及的用於在人源化抗體中保留高結合親和性的第一結構要素中，通過在 很多已知的人抗體中適當地選擇受體抗體，選擇人源化抗體的重鏈可變區的構架，使得與 供體抗體的重鏈可變區的構架具有最高序列同一性(65% 95% )。在第二結構要素中，在 構建人源化抗體時，依照規定的規則，將人受體抗體的構架中的選定胺基酸(CDR之外)用 來自供體抗體的相應胺基酸取代。具體來說，選擇構架中待取代的胺基酸是以其與CDR相 互作用的能力為基礎的。例如，如在3維空間中測量，被取代的胺基酸可以在供體抗體序列 中與⑶R鄰近，或在人源化抗體中位於⑶R的4-6埃內。嵌合抗體是其中小鼠(或其它嚙齒類動物)抗體的可變區與人抗體的恆定區組合 的抗體；通過遺傳工程的方法構建它們是眾所周知的。此類抗體儘管約2/3為人的，但保留 小鼠抗體的結合特異性。存在於小鼠、嵌合和人源化抗體中的非人序列的比例表明，嵌合抗 體的免疫原性介於小鼠與人源化抗體之間。與小鼠抗體相比可以具有降低的免疫原性的其 它遺傳工程化抗體類型包括利用噬菌體展示方法(Dower等人，W091/17271 ；McCafferty等 人，W092/001047 ；Winter, W092/20791 ；和 Winter, FEBSLett. 23 :92，1998，其各自併入本文 作為參考)或使用轉基因動物(Lonberg等人，W093/12227 ；Kucherlapati W091/10741，其 各自併入本文作為參考)製備的人抗體。如本文所用，術語"人樣"抗體指的是1條或2條鏈的胺基酸序列的相當部分 (例如約50%或以上)源自人免疫球蛋白基因的mAb。因此，人樣抗體包括但不限於嵌合、 人源化和人抗體。如本文所用，具有"降低的免疫原性"的mAb是當施用於人患者時預期 具有比小鼠抗體顯著更低的免疫原性的mAb。此類抗體包括嵌合、人源化和人mAb以及通 過取代小鼠抗體中可能對B-細胞或T-細胞表位作出貢獻的特定胺基酸(例如暴露的殘基 (Padlan，Mol. Immunol. 28 :489,1991))而製備的 mAb。如本文所用，"遺傳工程化"mAb 是已藉助於重組DNA技術將其編碼基因構建或放置到非天然環境中(例如小鼠中或噬菌體 上的人基因)的mAb，因而不包括例如用常規雜交瘤技術製備的小鼠mAb。mAb的表位是與mAb結合的抗原的區域。兩種抗體如果彼此一個競爭性抑制(阻 斷)另一個與抗原的結合，那麼它們結合相同的或重疊的表位。也就是說，在競爭結合分 析試驗中測量時(參見例如 Junghans 等人，CancerRes. 50 :1495，1990)，lx、5x、10x、20x 或IOOx過量的一種抗體可以抑制另一種抗體的結合達至少50 %，但優選75 %、90 %或甚至 99%。或者，如果兩者抗體結合抗原的相同區域，或者如果抗原中導致一種抗體的結合減少 或消除的基本上所有胺基酸突變都可以導致另一種抗體的結合減少或消除，則這兩種抗體 具有相同的表位。如果降低或消除了一種抗體的結合的某些胺基酸突變可以降低或消除另 一種抗體的結合，那麼這兩種抗體具有重疊的表位。2.中和性抗-FGF2抗體對於與FGF2結合的單克隆抗體(mAb)(即抗_FGF2mAb)，如果其結合部分地或完全 地抑制了 FGF2的一種或多種生物學活性(即當mAb作為單一活性劑使用時)，則其被稱為 可以中和FGF2，或是中和性的。中和性抗體可以抑制的FGF2生物學活性包括FGF2與4種FGF受體中的一種或多種結合的能力；刺激包括成纖維細胞、內皮細胞、Mv ILu貂肺上皮細 胞和各種人腫瘤細胞在內的某些細胞增殖(即促有絲分裂)的能力；刺激細胞例如內皮細 胞的分化和遷移或刺激血管生成的能力，例如通過刺激人血管內皮細胞(HUVEC)增殖或管 形成、或通過施加於雞胚尿囊絨膜(CAM)時誘導血管而測量。當通過在實施例中描述的方法或本領域已知的方法進行測定時，濃度為例如 0. 01,0. 1,0. 5、1、2、5、10、20或50 μ g/ml的本發明中和性mAb抑制FGF2的生物學功能約 至少50 %、但優選75 %、更優選90 %或95 %或甚至99 %、最優選約100 % (基本上完全抑 制)。通常，在使用的FGF2的量剛好足以完全刺激生物學活性或者為1、2或5ng/ml或0. 01、 0. 02,0. 05,0. 1,0. 5、1、3或10 μ g/ml時，測量抑制程度。優選地，mAb當作為單一活性劑使 用時是中和性的，即抑制生物學活性，但是任選地可以2種mAb —起使用以產生抑制。最優 選地，mAb中和不僅僅1種而是2種、3種或幾種上面列出的生物學活性；對本發明的目的而 言，作為單一活性劑使用時中和FGF2的所有生物學活性的抗-FGF2mAb被稱為「完全中和性 的」，這種mAb是最優選的。本發明的mAb優選對FGF2具有特異性，即它們將不結合或僅僅 以小得多的程度(例如小至少10倍)結合與FGF2有關的蛋白質，例如另一種FGF如FGFl， 和血管內皮生長因子(VEGF)。本發明的某些mAb結合人FGF2和小鼠FGF2，或結合人FGF2 以及小鼠、大鼠、兔、雞、狗和/或猴(例如食蟹猴)FGF2中的1種、2種或更多或所有。其它 mAb對人FGF2具有特異性。本發明的mAb通常對FGF2的結合親和性(Ka)為至少IO7M.1, 但優選IO8M4或更高，最優選IO9M4或更高或甚至ΚΓΜ—1或更高。本發明的mAb包括天然四聚體形式的抗-FGF2抗體Q條輕鏈和2條重鏈)，可以 是任何已知的同種型IgG, IgA, IgM, IgD和IgE及它們的亞型，即人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。本發明的mAb也意在包括抗體片段，例如Fv、Fab和 F(ab' )2 ；雙功能雜交抗體(例如 Lanzavecchia 等人，Eur. J. Immunol. 17 105，1987)、單 鏈抗體(Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879,1988 ；Bird 等人，Science 242 423,1988)；單臂抗體(Nguyen等人，Cancer基因Ther. 10 =840,2003)；和恆定區改變的抗 體(例如美國專利號5，624，821)。mAb可以是動物來源(例如小鼠、大鼠、倉鼠或雞)，或者 它們可以被遺傳工程化。齧齒動物mAb可以通過本領域眾所周知的標準方法來製備，包括 用適當佐劑中的FGF2通過腹膜內、靜脈內或腳墊內進行多次免疫，然後提取脾臟或淋巴結 細胞，並與適合的永生化細胞系融合，然後篩選產生結合FGF2的抗體的雜交瘤，例如參見 下面實施例。通過上面述及的本領域已知方法製備的嵌合和人源化mAb是本發明的優選實 施方案。人抗體，例如通過噬菌體展示或轉基因小鼠方法製備的人抗體，也是優選的(參見 例如 Dower 等人，McCafferty 等人，Winter, Lonberg 等人，Kucherlapati，同上)。下文所述的中和性抗_FGF2mAb GAL-F2是本發明的實施例。一旦具有本文所述的 中和FGF2的期望性質的單個原型抗-人_FGF2mAb例如GAL-F2已被分離，那麼通過使用本 領域已知方法產生具有類似性質的其它mAb是簡單的。例如，可以如上所述用FGF2免疫小 鼠，產生雜交瘤，並且對所得mAb與原型mAb競爭結合FGF2的能力進行篩選。也可以用含 有與GAL-F2結合的表位的更小FGF2片段，免疫小鼠。可以通過例如篩選與跨FGF2的一系 列重疊肽的結合來定位該表位。或者，Jespers等人，Biotechnology 12 :899，1994(其並 入本文作為參考)的方法可以用於指導選擇與原型mAb例如GAL-F2具有相同表位因而具 有類似性質的mAb。採用噬菌體展示法，首先將原型抗體的重鏈與一個(優選人)輕鏈庫進行配對來選擇FGF2-結合性mAb，然後將新輕鏈與一個(優選人)重鏈庫進行配對來選擇與 原型mAb具有相同表位的(優選人)FGF2-結合性mAb。或者GAL-F2的變體可以通過對得 自雜交瘤的編碼GAL-F2的重鏈和輕鏈的cDNA進行誘變而獲得。與GAL-F2具有相同或重疊表位的中和性mAb (例如與GAL-F2競爭結合FGF2的中 和性mAb)提供了其它實施例。GAL-F2的嵌合或人源化形式是特別優選的實施方案。本發 明還包括在重鏈和/或輕鏈可變區的胺基酸序列上與GAL-F^O %、95 %或99 %相同且保持 其功能性質的mAb、和/或與GAL-F2相差少數個功能上不重要的胺基酸置換(例如保守性 置換)、缺失或插入的mAb。還包括具有與GAL-F2的相應⑶R 90%、95%或99%或100%相 同的至少1個⑶R、優選所有6個⑶R的mAb。在這裡以及在本申請的其它地方，序列同一 性百分比用通過Kabat編號規則進行最大比對的抗體序列來確定。在比對後，如果主題抗 體區域(例如重鏈或輕鏈的整個成熟可變區)與參考抗體的相同區域正被相比，那麼主題 與參考抗體區域之間的序列同一性百分比是在主題與參考抗體區域兩者中被相同胺基酸 佔據的位置的數目除以兩個區域的比對位置的總數(不算空位)，再乘以100轉化為百分 比。可以由雜交瘤生產本發明的天然mAb。遺傳工程化mAb例如嵌合或人源化mAb可 以通過多種本領域已知的方法來表達。例如，編碼其輕鏈和重鏈V區的基因可以由重疊寡 核苷酸合成，並與可得C區一起插入到表達載體(例如，可從^witrogen商購)中，所述表 達載體提供必要的調控區例如啟動子、增強子、PlyA位點等。優選使用CMV啟動子-增強 子。然後使用各種眾所周知的方法例如脂轉染或電穿孔，將表達載體轉染到各種哺乳動物 細胞系例如CHO或非生產性骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)中，並且通過適合的抗生素篩選來 選擇表達抗體的細胞。參見例如，美國專利號5，530，101。更大量的抗體可以通過在商購的 生物反應器中生長細胞來產生。本發明的mAb或其它抗體一旦被表達，可以根據本領域的標準程序進行純化，例 如微濾、超濾、蛋白A或G親和色譜法、尺寸排阻色譜法、陰離子交換色譜法、陽離子交換色 譜法和/或基於有機染料的其它親和色譜形式等。對於藥物應用來說，具有至少約90或 95%同質性的基本上純的抗體是優選的，98%或99%或以上的同質性是最優選的。3.治療方法本發明提供了治療方法，其中將本發明的mAb (例如抗-FGF2)施用於患有疾病 (治療療法)或處於疾病發生或復發的危險中(預防療法)的患者。術語"患者"包括人 患者；獸患者，例如貓、狗和馬；家畜，例如牛、羊和豬；和用於試驗目的的實驗室動物，例如 小鼠和大鼠。該方法特別適合於治療人患者。治療人患者的方法中所用的mAb與人FGF2 蛋白結合，所述人FGF2蛋白的序列由例如Ornitz等人，Genome Biol. 2 :3005. 1,2001或 Okada-Ban等人，Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32 :263,2000 以及Swiss-Prot資料庫的 Locus P09038提供。針對人蛋白的mAb還可用於其它物種，其中該物種同源物與該人蛋白具有抗 原交叉反應性。在缺乏這種交叉反應性的物種中，使用對存在於該物種中的物種同源物具 有適當特異性的抗體。然而，在實驗室動物的異種移植物實驗中，通常使用對由異種移植物 表達的人蛋白具有特異性的mAb。在一個優選的實施方案中，本發明提供了含有本文所述的抗體的藥物製劑。該抗 體的藥物製劑在生理可接受的載體中含有mAb，任選帶有賦形劑或穩定劑，採用凍幹形式或9水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量和濃度下對接受體沒有毒性， 並包括PH通常為5. 0 8. 0、最通常為6. 0 7. 0的緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽或乙酸 鹽；造成等滲的鹽例如氯化鈉、氯化鉀等；抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水 性聚合物例如聚山梨醇酯80、胺基酸、碳水化合物、螯合劑、糖類，以及其它本領域技術人員 已知的標準成分(《雷明頓藥物科學》(Remington' s Pharmaceutical Science)第16版， Osol，A.編輯· 1980)。mAb通常以l-100mg/ml的濃度存在，例如10mg/ml。在另一個優選的實施方案中，本發明提供了使用藥物製劑中的抗_FGF2mAb治療 患者疾病的方法。製備成藥物製劑的mAb可以通過任何適當的途徑、特別是通過靜脈內輸 注或者肌內或皮下推注的胃腸外途徑施用於患者。靜脈內輸注可以在少至15分鐘內給予， 但是更通常進行30分鐘，或歷經1、2或甚至3小時。mAb也可以被直接注射到疾病部位 (例如腫瘤)中，或包囊在攜帶劑如脂質體中。給予的劑量足以至少部分減輕所治療的病 症(「治療有效劑量")，任選為0. 1 5mg/kg體重，例如1、2、3或％^/1^，但是可以高達 10mg/kg或甚至15、20或30mg/kg。也可以給予固定的單位劑量，例如100、200、500、1000或 2000mg，或劑量也可以基於患者的表面積，例如1000mg/m2。通常施用1 8個劑量(例如 1、2、3、4、5、6、7或8個劑量)來治療癌症，但是也可以給予10、20個或更多的劑量。mAb可 以根據例如mAb的半衰期，以每天、一周兩次、每周、每兩周、每月、或某些其它的時間間隔， 施用1周、2周、4周、8周、3-6個月或更長時間、或直到疾病進展。對於長期施用來說，重複 的治療過程也是可能的。可以有效地至少部分減輕存在於待治療患者中的疾病的劑量、施用頻率和施用途 徑的組合，被稱作是治療有效方案。有效地抑制或延緩患者疾病發作的劑量、施用頻率和施 用途徑的組合，被稱作是預防有效方案。對於使用本發明的抗_FGF2mAb治療特別敏感的疾病包括據認為需要血管生成或 與FGF2水平升高有關或與FGF2表達有關的實體腫瘤。適合於用抗_FGF2mAb治療的此類 腫瘤包括例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小細胞或非小細胞)、結腸癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮 內膜癌、胰腺癌、胃癌、肝細胞癌、或肝癌、頭頸部腫瘤、黑素瘤、肉瘤、癌和腦瘤(例如神經 膠質瘤例如膠質母細胞瘤)。惡性血液病例如白血病和淋巴瘤和多發性骨髓瘤也可對此類 治療敏感。適合於用本發明的抗-FGF mAb治療的其它與血管生成有關的疾病包括年齡相 關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網膜病變、新生血管性青光眼和其它眼睛疾病；銀屑病和 其它皮膚疾病；和類風溼性關節炎。在一個優選的實施方案中，抗_FGF2mAb與其它療法組合(即一起，也就是說，之 前、期間或之後)施用。例如，為治療癌症，抗_FGF2mAb可以與任何一種或多種已知的化療 藥物一起施用，例如烷化基，例如卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、丙卡巴胼和 環磷醯胺；抗代謝藥例如氟尿嘧啶、氟脲苷、氟達拉濱、吉西他濱、氨甲喋呤和羥基脲；天然 產物，包括植物生物鹼和抗生素例如博來黴素、多柔比星、柔紅黴素、伊達比星、依託泊苷、 絲裂黴素、米託蒽醌、長春花鹼、長春花新鹼和泰素(Taxol，紫杉醇)或相關的化合物例如 Taxotere ;拓撲異構酶1抑制劑伊立替康；特別批准用於腦腫瘤的藥劑，包括替莫唑胺 和含有卡莫司汀的Gliadel wafer ；酪氨酸激酶抑制劑例如Gleevec (甲磺酸伊馬替 尼)、Sutent (蘋果酸舒尼替尼)、Nexavar (索拉非尼)、Tarceva (埃羅替尼) 和Iressa (吉非替尼)；血管生成抑制劑；以及在wo 2005/0i7i07A2(在此併入本文作為參考)中列出的所有被批准的和實驗的抗癌藥。抗_FGF2mAb可以與用於標準化療方案的 這些其它藥劑中的1、2、3種或更多種組合使用。通常，該其它藥劑是早就已知對正在治療 的特定癌症類型有效的那些藥劑。抗_FGF2mAb尤其可以用於克服對化療藥物的耐藥性，因 而增加其有效性(參見 Song 等人 Proc. Natl. Acad. Sci USA 97 :8658, 2000)。為治療癌症可以與抗_FGF2mAb —起施用的其它藥劑包括生物藥例如單克隆抗 體，包括針對HER2抗原的Here印tin ；針對VEGF的Avastin ;或針對表皮生長因子 (EGF)受體的抗體例如Erbitux (西妥昔單抗)和Vectibix (帕尼單抗)。尤其優 選針對肝細胞生長因子(HGF)的抗體與抗_FGF2mAb —起使用，包括mAb L2G7(Kim等人， Clin Cancer Resl2 =1292,2006和美國專利號7，220，410)、特別是其嵌合和人源化形式例 如 HuL2G7(W0 07115049A2)；在 WO 2005/017107A2 中、特別是在 2. 12. 1 中所述的人抗-HGF mAb ；和在WO 07143090A2或WO 07143098A2中所述的HGF結合蛋白；以及其它與任意前述 mAb競爭結合的中和性抗-HGF mAb。與HGF的cMet受體結合的mAb也是優選的，例如已 被遺傳工程化成僅含有一個"臂"，即結合結構域，的抗-cMet mAb0A-5D5 (Martens等人， Clin. Cancer Res. 12 :6144,2006)。而且，抗FGF2mAb可以與任何形式的外科手術和/或放 射療法，包括外線束放射、調強放射療法(IMRT)和任何形式的放射外科手術例如伽瑪刀， 一起使用。包括抗-FGF2mAb抗體的治療(例如標準化療)，與不使用抗_FGF2mAb的同樣治療 (例如化療)相比，可以通過增加癌症患者的中位無進展存活時間或總存活時間至少30% 或40 %，但是優選50 %、60 %至70 %或甚至100 %或以上來減輕疾病。此外或備選地，包括 抗-FGF2mAb的治療(例如標準化療)，與不使用抗_FGF2mAb的同樣治療(例如化療)相 比，可以增加患有這些腫瘤(例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌和膠質母細胞瘤，特別是在 復發或難治療的時候)的患者的完全應答率、部分應答率或客觀應答率(完全+部分)至 少30%或40%，但是優選50%、60%至70%或甚至100%。通常，在臨床試驗中(例如II期、II/III或III期臨床試驗)，上面提到的與接受 僅化療(或加上安慰劑)的患者的對照組相比，用化療加上抗-FGF2mAb治療的患者的中位 無進展存活和/或應答率的增加，是有統計學意義的，例如在P = 0. 05或0. 01或甚至0. 001 水平上。完全和部分應答率通過癌症臨床試驗中常用的客觀標準(例如美國國家癌症研究 所和/或美國食品與藥品管理局所列出的或接受的客觀標準)來確定。4.其它方法本發明的抗_FGF2mAb也在診斷、預後和實驗室方法中有用。它們可以用於測量腫 瘤中或腫瘤患者的循環中FGF2的水平，以確定是否該水平是可測量的或甚至升高的，從而 跟蹤並指導腫瘤的治療，這是因為與可測量的或升高的FGF2水平有關的腫瘤將對於使用 抗-FGF2mAb的治療是最敏感的。例如，與高水平FGF2有關的腫瘤將對於使用抗_FGF2mAb 的治療特別敏感。在特定的實施方案中，mAb可以用於ELISA或放射性免疫分析，以測量例 如腫瘤活檢標本或血清中或FGF2分泌性細胞的細胞培養物的培養基上清液中的FGF2水 平。使用與不同表位結合(即非競爭結合)的兩個抗_FGF2mAb將在開發檢測FGF2的靈敏 性"三明治"ELISA中特別有用。對於各種分析方法來說，mAb可以用螢光分子、自旋標記 分子、酶或放射性同位素進行標記，並且可以以帶有所有進行FGF2分析所必需的試劑的試 劑盒形式供應。在其它應用中，抗_FGF2mAb可以用於例如通過親和色譜法純化FGF2。實施例實施例1 試劑和分析試驗GST-FGF2、FGF2-Fc 和 FGF2_Flag 的製備。合成人 TOF2 的 cDNA 序列(具有 155 個氨 基酸的前體形式；Sommer等人，1987) (GenScript，he)，進行PCR擴增，並克隆到pDisplay 載體(Invitrogen)的衍生物中。將這些質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)細胞，使用ImM IPTG誘導FGF2表達。FGF2表達的水平用FGF2特異性ELISA試劑盒(R&D Systems)來測 定；如所述(Wiedlocha 等人，Mol. Cell Biol. 16 :270，1996)，用肝素 S印haroseCL_6B 珠 (Amersham Biosciences)純化 FGF2。FGF2 分別與穀氨醯胺合成酶(GST-FGF2)、Flag 肽 (FGF2-Flag)和人IgGlFc結構域(胺基酸216至446 ；FGF2_Fc)的融合蛋白(其用於FGF2/ FGFR結合分析試驗以及用於免疫)，用標準分子生物學技術由適當的遺傳構建體，類似地 製得。GST-FGF2用抗-GST柱純化，FGF2_Fc用蛋白A/G柱純化，而在測定FGF2_Flag濃度 之後使用培養物上清液中的FGF-Flag。此外，購買純化的人FGF2 (QEDBioscience Inc.)和 鼠 FGF2(ProSpec-Tany Technogene Ltd.)。FGFR-Fc 蛋白的製備。人FGFRl α (IIIc)(被命名為FGFRlc)和人FG FR2C α (IIIc) (被命名為FGFR2c)的胞外結構域(ECD)被表達成免疫粘附素分子。將編碼FGFRlc和 FGFR2c的整個E⑶的DNA片段通過多肽接頭與人Fc融合。通過轉染人細胞、在293 表達培養基(Invitrogen)中在G418 (lmg/ml)的存在下選擇穩定的293轉染子，表達這些 FGFR-Fc分子。使用蛋白A/G柱純化由轉染細胞分泌的FGFR-Fc。此外，人!7G FR3c_Fc 和人FGFR4-Fc融合物得自R&D Systems。FGF2片段的合成。通過SynBioSci合成了由FGF2的胺基酸殘基四_44(肽#1)、 101-118 (肽#3)和137-155 (肽#4)組成的肽。額外的半胱氨酸殘基被加至肽#1與#3的 C-末端和肽#4的N-末端。然後將這些肽片段與鑰孔慽血蘭蛋白(KLH)綴合。FGF2結合性ELISA。在4°C將ELISA孔用50 μ g/ml肝素(Sigma)包被過夜，然後 在室溫(RT)與0. 3-1 μ g/ml人或小鼠FGF2孵育1小時，以使肝素能捕獲FGF2。在RT用 2% BSA封閉1小時後，在RT加入雜交瘤培養物上清液或純化過的mAb達1小時。通過在 RT加入HRP-山羊抗-小鼠IgG Fc達1小時、然後洗滌、加入TMB底物(Sigma)並在450nm 讀數，檢測結合的抗-FGF2抗體。FGFR-Fc/FGF2-Flag 結合性 ELISA。在 FGFR-Fc/FGF2_Flag 結合性 ELISA 中測 定抗-FGF2mAb的阻斷活性。在4 V將ELISA孔用2 μ g/ml對人IgG_Fc具有特異性的 山羊抗體包被過夜。在RT用2% BSA封閉1小時後，將各孔用0. Sy g/ml FGFRlc-Fc, FGFR2c-Fc、FGFR3c-Fc或FGFR4_Fc孵育1小時。在洗滌後，在各種濃度的mAb的存在下各 孔用FGF2-Flag(0. 2 μ g/ml)孵育1小時。通過加入HRP-抗-Flag M2抗體(Sigma)來檢 測結合的FGF2-Flag。實施例2 單克隆抗體的產生Balb/c小鼠(5-6周齡，雌性)通過下述進行免疫如下表所示，在小鼠後腳墊中， 用重新懸浮於 MPL/TDM(Sigma-Aldrich)中的 GST-FGF2、FGF2_Fc 和 / 或 KLH 綴合的 TOF2 合成肽，按1周的間隔注射14次。最後一次注射後3天，使用標準融合方法用35%聚乙二 醇將腿彎部的淋巴細胞與P3/X63-Ag8Ul小鼠骨髓瘤細胞融合，方法如所述(Chimtharapai等人，Methods Enzymol 288:15,1997)。融合後10天，利用上述的FGF2結合性ELISA對雜 交瘤培養物上清液結合FGF2的能力進行篩選。然後在FGFRl-Fc/FGF-Flag結合性ELISA 中對選擇的mAb的阻斷活性進行篩選。然後用有限稀釋技術，如所述(Harlow等人，1988)， 將所選雜交瘤克隆兩次。表免疫方案
權利要求
1.單克隆抗體(HiAb)，其結合併中和人鹼性成纖維細胞生長因子(FGF2)，其中所述mAb 被遺傳工程化。
2.權利要求1的mAb，其是嵌合的。
3.權利要求1的mAb，其是人源化的。
4.權利要求1的mAb，其是人的。
5.權利要求1的mAb，其完全抑制FGF2與FGF受體FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4之每 種的結合。
6.權利要求1的mAb，其抑制FGF2誘導的MvILu細胞的增殖。
7.權利要求1的mAb，其抑制小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
8.權利要求1的mAb，其是Fab或F(ab')2片段或單鏈抗體。
9.藥物組合物，其包含權利要求1的mAb。
10.治療患者癌症的方法，其包括向所述患者施用包含權利要求1的mAb的藥物組合物。
11.單克隆抗體(mAb)，其與雜交瘤PTA-8864產生的抗體競爭結合FGF2且具有降低的 免疫原性。
12.權利要求11的mAb，其抑制小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
13.權利要求11的mAb，其是人源化的或人的。
14.藥物組合物，其包含權利要求11的mAb。
15.治療患者癌症的方法，其包括向所述患者施用包含權利要求11的mAb的藥物組合物。
16.權利要求15的方法，其中所述癌症是肝細胞癌。
17.由PTA-8864雜交瘤產生的mAb的小鼠、嵌合或人源化形式。
18.人源化抗體，其包含人源化輕鏈和人源化重鏈，所述人源化輕鏈含有來自圖IlA中 序列(GAL-M) (SEQ ID NO 1)的CDR，所述人源化重鏈含有來自圖IlB中序列(GAL-M) (SEQ ID NO 4)的 CDR。
19.權利要求18的人源化抗體，其中Kabat編號的殘基Hl、H27、H30、H48、H67、H71和 H94被佔據圖IlB中所示重鏈(GAL-F2) (SEQ IDNO 4)的相應位置的殘基佔據。
20.權利要求18的人源化抗體，其中輕鏈可變區與圖IlA中所示序列(HuGAL-M)(SEQ ID NO 2)具有至少95%序列同一性，且所述重鏈與圖IlB中所示序列(HuGAL_F2) (SEQ ID NO 5)具有至少95%序列同一性。
21.權利要求18的人源化抗體，其含有圖IIA(HUGAL-M)(SEQ IDNO 2)和圖 11B(HuGAL-F2) (SEQ ID NO :5)中所示的3個輕鏈CDR和3個重鏈CDR。
全文摘要
本發明涉及鹼性成纖維細胞生長因子的中和性單克隆抗體、包含它們的藥物組合物以及包括向患者施用此類藥物組合物的治療方法。
文檔編號C07K16/00GK102046803SQ200980119682
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月28日 優先權日2008年5月29日
發明者H·帕克, K·J·金, L·王, M·瓦斯克茲 申請人:星系生物科技責任有限公司