基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物的製作方法

2024-01-25 23:03:15

專利名稱：：基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及多株益生菌混合發酵培養製得的營養組合物，特別是涉及以三種植物性原料為發酵底物，經五株益生菌混合發酵得到的培養物和其製備方法、由所說的發酵培養物與一種或多種醫藥上可接受的添加劑組成的營養組合物，以及所說的營養組合物在生產用於預防或治療便秘並調節人體的腸道菌群的藥物^保健食品中的應用。
背景技術：
：微生物是一類具有現實和潛在用途的生物資源，廣泛應用於農業、工業、醫藥、食品及環保等各個領域。人類對微生物的利用經歷過天然混合培養到純種培養兩個階段，純培養技術使得研究者擺脫了多種微生物共存的複雜局面，能夠不受幹擾地對單一目的菌株進行研究，從而豐富了我們對微生物形態結構、生理和遺傳特性的認識。但是，在長期的實驗和生產實踐中，人們不斷地發現很多重要生化過程是單株微生物不能完成或只能微弱地進行的，必須依靠兩種或多種微生物共同培養完成。微生物混合培養或混合發酵已越來越被人們所重視。科學家們對混合培養微生物資源進行了多方面的研究，不僅具有深遠的理論意義，更具有重大的應用價值。微生物發酵的生產水平不僅取決於菌種本身的性能，而且要在合適的環境條件下才能使生產能力充分表達。對混合發酵中較重要的幾個影響主要因素包括(1)混合系統中各微生物之間的相互關係及接種量比例混合發酵區別於一般微生物發酵的主要不同之處在於該體系由兩種或多種微生物組成，其中一種微生物為另一微生物提供營養來源或相互提供營養，有的情況下後者還可以通過利用這些產物為前者解除了降解物造成的抑制，從而組成一個使體系中的各微生物和諧共生的微環境，這對於微生物在利用一些比較難於利用的底物時尤其有利；(2)酸鹼度和(3)溫度。混合發酵的特點包括(1)多株菌混合發酵可實現共生酶系的互補現代研究試驗證明,不同的微生物有不同的代謝途徑，代謝產物各不相同。多種微生物協同作用能優勢互補、相輔相成，因而能起到單一菌株發酵難以起到的作用。(2)生長速度快，在混合培養中，第一類微生物可以產生有利於第二類微生物生長、發酵所需的基本物質(如碳源、氮源)和營養素(朔影等，雙歧桿菌混合培養初步研究，《中國食品添加劑試驗研究》，2006(2):63—73)。(3)混合培養能產生多種酶，因此可作用於許多種類的化合物，並能較好地消除和改變底物中的抑制物，提高原料的利用率(鄒鏡銘.多菌種混合制曲提高醬油質量.調味品.2005(4)33—34)。(4)多級轉化混合培養發酵可以完成一整套完整的多級轉化，這在單一菌種培養發酵幾乎是不可能做到的。以及(5)多種轉化可同時發生在混合發酵過程中，底物中可以同時進行多種轉化，而這對於單一種微生物的發酵過程來說根本不可能。人體腸道中的益生菌群是由不同的微生物群組成的，它們定植在腸道的不同部位，各自發揮著不同的生理效應。因此，利用多株益生菌進行發酵，製備和使用調節人體微生態穩定與平衡的營養組合物，將更符合人體的生理環境和需求。而且，多菌株混合發酵可以協調和彌補單菌株代謝產物的不足。特別是，選用燕麥、玉米、大豆等三種植物性原料作為發酵底物，不僅可以降低混合發酵培養物的成本，這些原料還可為益生菌生長提供必要的碳源、氮源，為組合物服用者提供更多的可溶性膳食纖維、大豆異黃酮、植物蛋白等有益的營養成分。為此，本發明人試圖在以前三株菌發酵的基礎上，進一步選用五株益生菌混合發酵，並使用植物性原料作為發酵底物，製備出生產成本更低，作用更加明顯，使用價值更加突出的多株益生菌混合發酵產品。
發明內容本發明涉及多株益生菌混合培養營養組合物，特別是涉及包括以三種植物性原料為發酵底物，經五株益生菌混合發酵得到的培養物和其製備方法，由所說的發酵培養物與一種或多種醫藥上可接受的添加劑組成的組合物，以及所說的組合物在生產用於預防或治療便秘並調節人體的腸道菌群的藥物或保健食品中的應用。本發明的一個目的是提供一種五株益生菌混合發酵產生的組合物，特徵在於所說的益生菌是兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種。本發明的另一個目的是提供生產上述營養組合物的方法，該方法包括使用經過浸泡生芽、蒸煮並用澱粉酶水解的玉米和燕麥以及經過浸泡生芽、蒸煮並用蛋白酶水解的大豆作為原料，接種預培養的各約0.4%(體積/體積)的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液,常規培養約2~6小時後再次接種各約0.4%(體積/體積)的嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌液，繼續發酵約20-22小時，當發酵液的pH值降低至3.04.0時結束髮酵，得到五株益生菌混合發酵培養物，然後再在所得到的培養物中加入一種或多種醫藥上可接受的添加劑，即得到本發明的營養組合物。根據本發明的一個優選實施方案，所說的一種或多種醫藥上可接受的添加劑是具有內源性益生菌生長促進活性的益生元類物質，以及選自常規賦形劑、香味劑、甜味劑、防腐劑的其他常規添加劑。所說的具有內源性益生菌生長促進活性的益生元類物質包括但不只限於低聚寡糖，例如大豆低聚糖、水蘇糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖。為了製備五株益生菌混合發酵培養物，可以使用經過浸泡生芽、蒸煮並用澱粉酶水解的玉米和燕麥，以及浸泡生芽、蒸煮並用蛋白酶水解的大豆作為發酵生產本發明五株益生菌混合發酵培養物的原料。一般說來，每100ml培養物中含燕麥5克、玉米4克，以及大豆10克。為了製備燕麥和玉米的提取物，可按物料配比稱取燕麥、玉米，漂洗乾淨後，水浸泡26小時(可根據不同季節選擇不同的浸泡時間)，然後在2227'C環境中培育64~72小時。此其間，用水不斷衝洗，保持燕麥和玉米籽粒生芽後的重量為原籽粒乾重的大約兩倍。應保持胚芽無異味、不發粘。按照待製備的培養物體積的大約50%加水混合、粉碎並磨漿。然後121'C蒸煮15分鐘，並冷卻至約8(TC。然後按照2025u/g原料的量加入耐高溫(i一澱粉酶，攪拌下80r酶解約36小時。酶解完成後，升溫至大約10(TC，保持1015分鐘。過濾後定容至待製備培養物體積的50%即為燕麥、玉米提取液。可按照下述方法製備大豆提取液。按物料配比稱取大豆並漂洗乾淨後浸泡2~6小時，2227X:環境中培育6472小時，其間不斷用水衝洗，要求豆胚芽的量為大豆籽粒乾重的3倍左右，同時保持胚芽無鬚根、無異味、不發粘。按所製備的培養物體積的大約45%加水。121X:蒸煮15分鐘並過濾，濾液溫度降至約45'C時，加入碳酸鈉(約為大豆重量的0.5%(重量/重量))，使溶液的pH值為大約8.0。然後，按大豆重量的0.8%(體積/重量)加入胰蛋白酶液，45'C酶解24小時。然後再按60"100u/g物料重量加入中性蛋白酶繼續酶解2~4小時左右。酶解完成後，IO(TC煮沸IO分鐘，過濾後，定容至製備培養物體積的50%，即為所需的大豆提取液。將以上預製備的燕麥和玉米混合提取液與大豆提取液按照大約l:l的體積比混合後，再加入葡萄糖1.5%(重量/體積)、蔗糖5.0%(重量/體積)；酵母粉0.3W(重量/體積)、無機鹽(硫酸亞鐵7H201.0mg/100ffll、硫酸鋅7H204.4rag/100ml、亞硒酸鈉5H200.024mg/100ml、硫酸鎂7H2070mg/100ml、硫酸錳H200.5mg/100ml、氯化鈉1.0mg/100ml、磷酸二氫鉀100mg/100ml、磷酸氫二鉀3H20100mg/100ml)，混勻，100T煮沸10分鐘，過濾、定容至原始培養基體積，調整pH7.0左右並115X:滅菌40分鐘後，即得到繼後用於益生菌發酵的特定營養培養基。當按上述方法製備的用於益生菌發酵的特定營養培養基的溫度降至39C左右時，接種預培養的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液，常規培養2~6小時後再依次分別接入嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌液。五個菌種的接種量均為0.4%(體積/體積)。繼續發酵大約20~22小時。當發酵培養物的pH降至3.04.0左右時結束髮酵。發酵完成後，向培養物中加入用於促進內源性益生菌生長的益生元類物質，例如水蘇糖，添加量為l~4g/100ml發酵培養物，或低聚木糖，添加量為0.3~0.8g/100ml發酵培養物。然後7(TC下保持4小時，以使發酵菌充分滅活。這裡所說的益生元(Prebiotics)是指一類不被宿主消化吸收的、但能選擇性地促進體內益生菌的代謝和增殖進而改善宿主健康的有機物質，有時也被稱為雙歧因子。用於本發明的益生菌(兩歧雙歧桿菌AS1.852、短雙歧桿菌AS1.2213、嗜酸乳桿菌AS1.1854、乾酪乳桿菌乾酪亞種AS1.29和德氏乳桿菌保加利亞亞種AS1.1480)均可由中國科學院微生物研究所購得，並在常規培養基中進行常規預培養。本發明進一步提供由五株益生菌混合發酵產生的培養物與一種或多種醫藥上可接受的添加劑組成的營養組合物。根據本發明的一個優選實施方案，所說的一種或多種醫藥上可接受的添加劑是具有內源性益生菌生長促進活性的益生元類物質，以及選自常規賦形劑、香味劑、甜味劑、防腐劑的其他常規添加劑。所說的具有內源性益生菌生長促進活性的益生元類物質包括但不只限於低聚寡糖，例如大豆低聚糖、水蘇糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖。發明的再一個目的是提供本發明的組合物在調節人或哺乳動物的腸道微生態平衡,改善腸道功能及在生產用於預防和治療便秘的藥物或保健食品中的應用。我們使用常規平皿培養實驗進行的研究發現，本發明選用的五株益生菌相互間的生長均未見明顯的抑制作用(參見實施例2)。為檢測本發明五株益生菌混合發酵培養物在抑制和殺滅致病細菌，保護胃腸道內微生態平衡中的生物學活性和作用，並與單菌株培養物的抑殺活性進行比較，我們使用常規平皿培養法實驗了的本發明的五株益生菌混合培養物對致病菌的體外殺傷活性。結果發現，本發明的益生菌培養物對腸道致病菌大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌6538均有抑制和殺傷作用，其中以對金黃色葡萄球菌的抑制和殺傷作用最強，並且，本發明的五株益生菌混合培養物抑殺活性高於單菌株的培養物的抑殺活性(參見實施例3)。該培養物作為營養口服液的可適用性，我們檢測本發明的五株菌發酵產生的風味物質雙乙醯含量高於單菌株發酵(參見實施例4)。我們的實驗研究進一步證實，本發明的益生菌混合培養營養組合物能夠有效的維持人腸道的微生態菌群平衡，並可有效地預防和治療便秘，具有潤腸通便和調節人體的腸道菌群的作用(參見實施例5-7)。經口投用本發明的益生菌混合發酵培養營養組合物10天。結果顯示，實驗組小鼠平均小腸推進率顯著高於模型對照組(P<0.01)，實驗組小鼠平均首次排便時間較模型對照組明顯縮短(P<0.01)，其6小時排便粒數和糞便重量明顯增加(P<0.01)。本發明的五株益生菌混合發酵培養營養組合物表現有明顯的潤腸通便的作用。同時，通過小鼠和人體試食試驗，本發明的益生菌混合培養營養組合物對受試者腸道益生菌菌群乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量增加明顯。當本發明基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物被使用者攝入後，其中的益生菌菌體進入機體並粘附於腸道的不同部位，發揮它們的生物屏障作用並抑制致病菌的粘附。另外，多種益生菌酸性代謝物可有效地促進腸蠕動。本發明所使用的原料也為服用者提供充分的可溶性膳食纖維、大豆異黃酮、植物蛋白等有效營養成分。再者，該營養組合物中添加的低聚寡糖益生元也有利於腸道內益生菌的生長。因此，本發明基於五株益生菌混合發酵製備的營養組合物，更符合人體的微生態環境，具有較高的生物學活性和營養價值。可以按照保健食品製備的常規方法，在本發明的五株益生菌培養物中加入醫藥上可接受的一種或多種賦形劑或其他添加劑，製成營養組合物。例如，可以在如上製備的益生菌培養物中加水或生理鹽水，以及適當量的選自調味劑、甜味劑和防腐劑等的添加劑，製成適於口服使用的營養組合物。也可以將本發明的益生菌培養物冷凍乾燥，並加入選自乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等的賦形劑；選自澱粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結晶纖維素等的崩解劑；選自硬脂酸鎂和滑石等的潤滑劑；選自明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等的黏結劑，和選自蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等的表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、分散劑等輔助成分，按常規方法將本發明的益生菌培養物製備成粉末劑、膠囊劑或片劑。實施例實施例1;本發明基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物的製備方法簡單地說，為了製備本發明基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物，可以使用經過浸泡生芽、蒸煮並用澱粉酶水解的玉米和燕麥以及用蛋白酶水解的大豆作為原料，接種預培養的各約0.4%(體積/體積)兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液，常規培養約2~6小時後再次接種預培養的各約0.4%(體積/體積)的嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌液。繼續發酵約2022小時後，當發酵液的pH值降低至3.04.0時結束髮酵，即得到本發明的五株益生菌混合發酵培養物。然後，在發酵液內加入適當比例的一種或多種醫藥上可接受的如低聚寡糖添加劑,便得到本發明的營養組合物。以下按步驟具體描述該方法。(1)發酵培養基的製備可使用經過浸泡生芽、蒸煮並用澱粉酶水解的玉米和燕麥和用蛋白酶水解大豆作為生產本發明五株菌混合發酵培養物的原料。一般說來，每100ml發酵培養物中約含燕麥5克、玉米4克，以及大豆10克。為製備燕麥和玉米的提取物，可按物料配比稱取燕麥、玉米，漂洗乾淨後，水浸泡6小時(根據季節選擇不同的時間)，然後在25'C環境中培育72小時，其間用水不斷衝洗，要求生芽後的重量為原籽粒乾重的兩倍左右。胚芽應無異味，不發粘。按照要製備培養物體積的50%左右加入水，粉碎並磨漿。12rC蒸煮15分鐘後，冷至80'C時。然後按照25u/g原料的量加入耐高溫a—澱粉酶，攪拌下8(TC酶解約4小時。酶解完成後，升溫至大約10(TC，保持10分鐘，過濾後定容至所需培養基體積的50%,即為燕麥、玉米提取液。為製備大豆提取物，可按照下述方法製備大豆提取液。按物料配比稱取大豆並漂洗乾淨後浸泡6小時，25'C環境中培育72小時，其間不斷用水衝洗，要求豆胚芽的量為大豆籽粒乾重的3倍左右，胚芽無鬚根，無異味，不發粘。按所製備培養物體積的大約45%加水，121C蒸煮15分鐘並過濾，濾液溫度降至約45。C時，加入碳酸鈉(約為大豆重量的0.5%重量/重量)，使溶液的pH值為大約8.0。然後，按大豆重量的0.挑(體積/重量)加入胰蛋白酶液，45-C酶解3小時後，再按100p/g物料重量加入中性蛋白酶，繼續酶解3小時左右。酶解完成後，ioox:煮沸io分鐘，過濾後定容至所需培養基體積的50%即為大豆提取液。將如上預製備的燕麥、玉米提取液和大豆提取液按照大約l:l的體積比混合後，再加入葡萄糖1.5%(重量/體積)、蔗糖5.0%(重量/體積)、酵母粉0.3%(重量/體積)、無機鹽(硫酸亞鐵7H201.Omg/100ml、硫酸鋅7H204.4mg/100ml、亞硒酸鈉5H200.024mg/100ml、硫酸鎂7H2070mg/100ml、硫酸錳H200.5mg/100ml、氯化鈉1.0mg/100ml、磷酸二氫鉀100mg/100ml、磷酸氫二鉀3H20100mg/100ml)，混勻，10(TC煮沸10分鐘，過濾、定容至原始培養基體積，調整pH7.0左右，並115'C滅菌40分鐘後，即得到繼後用於益生菌發酵的特定營養培養基。(2)五株益生菌的接種和混合發酵當如上製備的混合發酵營養培養基的溫度降低至39'C左右時，向其中接種預培養的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液，38。C培養2小時後再依次分別接入嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌液。五個菌種的接種量均為0.4%(體積/體積)。38t:繼續發酵約22小時，當培養物(發酵液)的pH降至4.0左右時結束髮酵得到所說的五株益生菌混合發酵培養物。(3)本發明營養組合物的製備發酵完成後加入滅菌的低聚寡糖(為促進內源性益生菌生長的物質)(例如低聚木糖添加量0.7g/100ml發酵培養物)。然後，70卩下保持4小時*以使發酵菌滅活。同時，再在如上製備的五株益生菌混合發酵培養物中，按適當的或常規的比例，加入一種或多種醫藥上可接受的其他添加劑，例如常規賦形劑、香味劑、甜味劑、防腐劑等，即得到本發明的不同劑型的營養組合物。實施例2:本發明所選五株益生菌菌株間相互間拮抗和生長抑制作用的觀察按照實施例1所述的方法製備用於五株益生菌混合發酵的營養培養基，分成5等份，滅菌後，分別單獨接種預培養的兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、乾酪乳桿菌菌液(各菌接種量均為2.0%(體積/體積))。常規培養24小時，分別以所得培養物作為各株菌的待檢樣品。採用培養平皿管碟法(中華人民共和國藥典，2005版，附錄XI抗生素微生物檢定法)檢測五株菌之間的相互作用。結果如下列表1所示。表l:本發明選用的各菌株培養物對其它益生菌的生長的影響PH值兩歧雙歧桿菌短雙歧桿菌嗜酸乳桿菌德氏乳桿菌乾酪乳桿菌兩歧雙歧桿菌培養物4，399短雙歧桿菌培養物4.312嗜酸乳桿菌培養物3.962德氏乳桿菌培養物3.882乾酪乳桿菌培養物3.686從表1所示結果可以看出，所選用的五株益生菌相互間的生長均未見明顯的抑制作用實施例3:本發明的益生菌混合發酵培養物對某些腸道致病菌的抑殺作用，並與單菌株發酵培養物的抑殺活性的比較本試驗採用本領域已知的常規管碟法檢測本發明的益生菌混合發酵培養物對腸道致病菌大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌6538(購自山東省疾控中心)的抑殺作用，並觀察五株菌混合發酵培養物和單一益生菌發酵培養物對致病菌抑殺作用的不同。按照前述方法製備培養基並分成六等份，滅菌後接種預培養的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液。38。C發酵2小時後，再接種德氏乳桿菌保加利亞亞種，嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌菌液，接種量均為0.4%(體積/體積)，38'C繼續培養22小時，作為混合發酵樣品。其它培養基分別單獨接種預培養的兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、乾酪乳桿菌菌液，各接種均為2.0%(體積/體積)並培養24小時。分別作為各益生菌的單獨發酵培養物樣品。用PBS洗下在營養瓊脂培養基斜面上培養15小時的致病菌，用細菌標準比濁管(中國藥品生物製品檢定所)標定後，將菌懸液稀釋至10'個細菌/ml。採用本領域已知的常規培養平皿管碟法檢測本發明五株益生菌混合發酵培養物對致病菌的抑殺作用。結果如下列圖2所示。表2:本發明五株益生菌混合發酵培養物與單菌株發酵培養物對致病菌的抑菌作用的比較檢測平板抑菌圈(mm)大腸桿菌25922(mm)金黃色葡萄球菌6538(mm)1、雙歧雙歧桿菌發酵培養物13222、短雙歧歧桿菌發酵培養物14253、嗜酸乳桿菌發酵培養物19324、德氏乳桿菌發酵培養物21325、乾酪乳桿菌發酵培養物22316、益生菌混合發酵培養物2336由表2可見，本發明益生菌混合發酵培養物中的所用發酵菌種及其代謝產物，無論是單獨發酵和混合發酵的，對致病菌大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌6538均具有抑制和殺傷作用。並且，在測試條件下，以本發明的五株益生菌混合發酵培養物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑殺作用為最強。實施例4:本發明五株益生菌混合發酵培養物與單菌株發酵培養物樣品中風味物質雙乙醯的含量比較乳酸菌在代謝過程中，能夠產生一些風味物質，賦予產品特殊的口感，本試驗是採用分光光度法測定本發明的益生菌混合發酵培養物以及各株益生菌單獨發酵的代謝產物中雙乙醯的含量。將實施例3製備的6個樣品各取10ml，按照"啤酒雙乙醯的試驗方法"(見GB/T4928-1991中華人民共和國國家標準)進行檢測。檢測結果如下列表3所示。表3本發明五株益生菌混合發酵培養物樣品與單菌株發酵培養物產物中雙乙醯含量比較樣品雙乙醯含量(mg/L)兩歧雙歧桿菌發酵培養物1.116短雙歧桿菌發酵培養物2.676嗜酸乳桿菌發酵培養物1.428德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵培養物0.525乾酪乳桿菌發酵培養物1.994益生菌混合發酵培養物3.063從表中可以看出，五株菌分級接種、混合發酵和每一株菌單獨發酵後，用分光光度法測定發酵培養物中的雙乙醯含量，混合發酵樣品雙乙醯含量明顯高於其它樣品，表明多菌株混合發酵可以比單株菌發酵產生更多的風味物質。實施例5:本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對小鼠的潤腸通便作用本實施例旨在藉助對小鼠的小腸推進試驗和排便試驗觀察和評價實施例1製備的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物的潤腸通便作用。試驗動物三級昆明種雄性小鼠，由中國藥品生物製品檢定所試驗動物中心提供(許可證編號2000第017號)。試驗包括小腸推進試驗排便試驗兩部分，每個試驗均分5組(按體重隨機分成5組)，其中三個劑量組，一個陰性對照組和一個便秘模型對照組，三個劑量組分別相當於人體推薦量(90ml/人/日)的10、20、30倍即15、30、45ml/kg.bw/d.(即15、30、45ml/公斤體重/天，下同)。1.本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對小鼠小腸推進能力的影響小腸推進試驗以灌胃方式給樣，連續10天，陰性對照組與模型對照組同樣方式給水。IO天后，各組小鼠禁食12小時(期間自由飲水)。模型對照組與三個劑量組灌胃給予複方地芬諾酯(50mg/kg.bw)，陰性對照組給水。0.5小時後，各劑量組分別給予含受試物的墨汁(5%)，對照組僅給墨汁；20分鐘後，頸椎脫臼處死動物，完整取出胃噴門至直腸末端段，置於木板上，將小腸自然擺成直線，分別測量從幽門到回盲部和到墨汁前沿的距離，計算小腸推進率。小腸推進率(％)=(幽門至墨汁前沿距離/幽門到回盲部距離)X100與陰性對照組比較，模型對照組小鼠平均小腸推進率顯著低於陰性對照(P<0.01)。與模型對照組比較，各劑量組小鼠平均小腸推進率顯著增加(P<0.01)，見表4。表4本發明的營養組合物對小鼠腸推進能力的影響(X±SD)組別/劑量動物數小腸推進率(％)(ml/kg.bw/d.)(只)陰性對照—1365.68±11.70模型對照一1345.02±6.48**低151363.76±7.67AA中301373.82±9.高451373.33±13.49厶A注**表示與陰性對照組比較，P<0.01,厶厶表示與模型對照組比較，P<0.012.本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對小鼠排便的影響排便試驗動物分組、給樣方式和時間均同小腸推進試驗。IO天后，各動物禁食12小時，(期間自由飲水)，模型對照組和三個劑量組灌胃給予複方地芬諾酯(50mg/kg.bw)，陰性對照組給水；0.5小時後，各劑量組分別給予含受試物的墨汁(5%)，對照組僅給墨汁；隨即動物單^飼養，正常飲水進食，記錄每隻動物首次排黑便時間、6小時排黑便粒數及重量。與陰性對照組比較，模型對照組小鼠平均首次排便時間明顯延長(P<0.01)，6小時排便粒數和6小時糞便重量明顯減少(P<0.01)。與模型對照組比較，低劑量組首次排便時間明顯縮短(P<0.01)，6小時排便粒數和6小時糞便重量明顯增加(P0.05)，見表5。表5本發明的營養組合物對小鼠排便的影響(X±SD)組別/劑量動物數首次排便時間(ml/kg.bw/d.)(只)(分)陰性對照一13模型對照一13低1513中3013高451374.54±18.39139.38±40.25**112.15±20.59A118.31±53.17118.00±26.426小時排便粒數(粒)_50,23土10，6234.46±9.53**46.92±10.94厶厶34.08±14.4735.54±12.746小時排便重量(g)_0.77±0.200.54±0.14*0.75±0.14A厶0.50±0.210.50±2.23-注**表示與陰性對照組比較，(P<0.01)，△A表示與模型對照組比較，(P<0.01)，△(P<0.05)分別按人體推薦量(90ml/人/閂)的10、20、30倍(即15、30、45ral/kg.bw/d)，經口投用本發明的益生菌混合發酵培養營養組合物10天。結果顯示，三個劑量組小鼠平均小腸推進率顯著高於模型對照組(P<0.01);15ml/kg.bw/d劑量組小鼠平均首次排便時間較模型對照組明顯縮短(P<0.01)，其6小時排便粒數和糞便重量明顯增加(P<0.01)。由此可以推測，本發明的五株益生菌混合發酵培養營養組合物表現有明顯的潤腸通便的作用。實施例6本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對小鼠腸道菌群的調節作用實驗動物為體重18-22克的雌性Balb/c小鼠(華西醫科大學實驗動物中心提供)。基礎詞料餵飼3天後，按隨機分組原則分15ml/kg^、30ml/kg.組和45ml/kg,組，(分別相當於成人日服用建議量的IO倍、20倍、和30倍)及對照組。實驗組以相應劑量的營養組合物灌胃，對照組以蒸餾水灌胃。灌胃14天後，無菌採集小鼠糞便0.l0.4克，IO倍梯度系列稀釋後，選擇合適的稀釋度，分別進行接種並培養。實驗方法按照《保健食品檢驗與評價技術規範》(中華人民共和國衛生部，2003年版)進行。五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對小鼠體內益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量的影響如下列表6至表9所示。tableseeoriginaldocumentpage15由上列表6-表9所示的數據可以看出，本發明的營養組合物可增加小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌的數量，具有調節小鼠腸道菌群的作用。實施例7本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物對正常人腸道益生菌和各種生理指標的影響受試對象篩選16-70歲年齡段、體檢指標基本正常的志願者43名(男20，女23)，實驗採用自身對照。受試者每日早飯後投服益生菌混合發酵培養營養組合物90ml，連續服用14天。第15天無菌採集受試者糞便進行10倍系列稀釋，選擇合適的稀釋度，分別接種在適當的培養基上，實驗方法按照《保健食品檢驗與評價技術規範》(中華人民共和國衛生部，2003年版)進行。本發明的營養組合物對人體腸道菌群數量的影響結果如下列表IO和11所示。表10.本發明的營養組合物對人體腸道菌群數量的影響測試菌種受試服用前菌，(cfWg糞便)服用後^_數(cfij/g糞便)P值人數(log!T土S)(loglT土S)腸桿菌437.41±0.757.44±0.70>0.05腸球菌435.77±1.165.96±1.10>0.05產氣莢膜梭菌436.78±0.796.85±0.72>0.05擬桿菌436.86士0.756.95±0.76>0.05乳酸桿菌437.32±0.737.46±0.61〈0.05雙歧桿菌438.33±0.968.41±0.920.05白細胞(X19個/L)439.77±0.119.77±0.10>0.05血紅蛋白(g/L)43136.40±13.74139.30±15.43〉0.05總膽紅素(pmol/L)439.42±2.189.64±2.18>0.05總蛋白(g/L)4372.43±3.4171.66±3.75>0.05白蛋白(g/L)4345.56±1.6744.95±2.68>0.05球蛋白(g/L)4326.56±2.0826.02±2.37>■05白球蛋白比例431.67±0.171.71±0.21>0.05丙氨酸氨基轉移酶OU/L)4315.40±5.3114.44土4.43>0.05門冬氨酸氨基轉移酶(IU/L)4316.91±4.8715.76±5.88>0.05尿素氮(umol/L)435.13±1.125.11±1.07>0.05血肌酐(umol/L)4380.23±10.9981.76±11.27>0.05結果可見，服用本發明的營養組合物14天後，受試者腸道內腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌及擬桿菌數量與服用前相比，差別無顯著性；而人體益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量有顯著性增加。另外，受試人群服用多菌株混合發酵營養組合物14天後，血常規、肝功能、腎功能指標與服用前相比差別均無顯著性(P〉0.05)。因此，本發明的基於五株益生菌混合發酵培養物的營養組合物有可能製備成一種營養組合物產品，可安全有效地調節人和哺乳動物的腸道菌群、改善微生態平衡和預防/治療便秘。權利要求1、五株益生菌混合發酵培養物，特徵在於所說的益生菌發酵培養物是使用經過浸泡生芽、蒸煮並用澱粉酶水解的玉米和燕麥以及經過浸泡生芽、蒸煮並用蛋白酶水解的大豆作為原料，接種預培養的各約0.4％(體積/體積)的兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌菌液，培養約2～6小時後再次接種各約0.4％(體積/體積)的嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌液，繼續發酵約20～22小時，當發酵液的pH值降低至3.0～4.0時結束髮酵，得到五株益生菌混合發酵培養物。2、根據權利要求l的混合發酵培養物，特徵在於所說的益生菌是兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌乾酪亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種。3、由權利要求1的混合發酵培養物與一種或多種醫藥上可接受的添加劑組成的營養組合物。4、根據權利要求3營養組合物，其中所說的一種或多種醫藥上可接受的添加劑是具有內源性益生菌生長促進活性的益生元類物質，以及選自常規賦形劑、香味劑、甜味劑、防腐劑的一種或多種其他添加劑。5、根據權利要求2的營養組合物在生產用於調節人體的腸道菌群失調、預防和治療便秘的藥物中的應用。6、根據權利要求2的營養組合物在生產用於調節人體的腸道菌群失調、預防和治療便秘的保健食品中的應用。全文摘要本發明涉及多株益生菌混合發酵培養製得的營養組合物，特別是涉及以三種植物性原料為發酵底物，經五株益生菌混合發酵得到的培養物和其製備方法、由所說的發酵培養物與一種或多種醫藥上可接受的添加劑組成的營養組合物，以及所說的營養組合物在生產用於預防或治療便秘並調節人體的腸道菌群的藥物或保健食品中的應用。文檔編號C12P1/04GK101560523SQ20081001553公開日2009年10月21日申請日期2008年4月17日優先權日2008年4月17日發明者吳炳新,孫筱林,牛紀江申請人:吳炳新