用於免疫刺激的多聚體的製作方法

2023-06-14 10:37:21 1

專利名稱：：用於免疫刺激的多聚體的製作方法用於免疫刺激的多聚體發明概述本發明涉及用於調節人或動物免疫系統活性的多聚體非編碼核酸分子，其製備方法和含有此多聚體非編碼核酸分子的疫苗。儘管在相應病原體特異性的淋巴細胞的選擇及其克隆擴充並分化成效應細胞後，獲得性免疫應答僅以滯後方式(3-5天)發揮作用，然而隨後它因"免疫記憶"的形成而提供免受相應病原體影響的長效保護作用，先天性免疫系統的細胞基於保守性病原體相關分子模式(PAMP)用生殖細胞編碼的受體識別病原體並立即應答。對於不同類型細胞不同的反應包括分泌細胞因子(例如IL-1、IL-6、TNF-a)和趨化因子(例如IL-8/CXCL8、MIP-lot/(3、MCP-1)、效應器機理激活(吞噬作用、呼吸放電(respiratorydischarge)、釋放殺菌性物質或裂解顆粒)、共刺激性分子(CD80、CD86)表達以及MHC分子表達增強。一方面，這召集並活化了能夠清除侵入病原體的效應細胞，而在另一方面，獲得性免疫系統的細胞接受自身活化所必需的信號。為產生改善的免疫應答，CpG寡核苷酸(CpGODN)已經作為新類型免疫調節分子使用。此類非甲基化CG基序存在於細菌DNA中並且代表對免疫系統而言的"危險信號"。作為"病原體相關分子模式"(PAMP)，它們主要引起先天性免疫系統的非特異性激活(Krieg，Nat.Med2003,9:831-835)。CpGODN通過白細胞介素-12(IL-12)細胞因子、幹擾素-y(IFN-力和腫瘤壞死因子a誘導TH1增強型免疫應答。含有上述CpG-ODN的免疫刺激性核酸序列(ISS)僅有幾個鹼基長度並且不通過表達在其序列上所編碼的蛋白質發揮作用。ISS是共價閉合的核酸分子。它們由寡核苷酸組成，其中所述寡核苷酸的鹼基可以發生局部自我配對，並且所述寡核苷酸的一個或兩個環包含30個鹼基及數個CG基序並且在下文中稱作載體分子。對細胞免疫應答的強烈刺激允許對調節性循環產生影響，其在不幹預時總是產生對患者不利的免疫活動。如在"CpGDNA"的穩定中所用，以硫代磷酸酯骨架修飾CpGODN具有若干嚴重缺點，特別包括觀察到的毒性[Heikenwalder2004，Levin1999]以及與蛋白質的非特異性結合[Brown1994]。出於該原因，己經開發了一個新類型共價閉合的免疫刺激性DNA(EP1196178)。這些DNA分子由兩種化學合成的DNA分子組成，其中所述的DNA分子在5'和3'末端具有帶回文重疊序列的自我互補區，從而這兩種DNA分子的連接產生共價閉合分子。在非互補區內帶CG基序的這些DNA分子顯現與CpGODN相似的活性(B細胞上表面分子CD80、CD40、MHC分子的增強表達以及PBMC細胞增強IL-6、IFN-y、IFN-ot、IL-12、TNF-a分泌)，但與具備硫代磷酸酯骨架的CpGODN相比，它們具有略微不同的表達模式和在小鼠中明顯更低的毒性。然而，就調節人或動物免疫系統活性而言，現有技術的此類免疫刺激性DNA具有若干缺點。並非總是可以在需要的水平上調節、尤其觸發人或者動物免疫系統的活性。鑑於上述現有技術，本發明目的旨在提供能夠觸發改良免疫應答的適宜免疫刺激性DNA分子、其製備方法以及含有所述免疫刺激性DNA分子的疫苗。在本發明上下文中，免疫刺激作用意指免疫系統的中介細胞和效應細胞，即特別是目前已知的具備輔助功能的胸腺細胞和細胞毒性胸腺細胞、B細胞及所謂NK(自然殺傷)細胞、巨噬細胞和單核細胞、樹突狀細胞及其前體細胞以及在免疫系統中承擔目前尚未闡明功能的細胞群體，因核酸分子的使用受到剌激以顯示增殖、移行、分化或活性。免疫調節意指，除上文定義的意義中的一般刺激作用之外，還存在對免疫反應的類型或特徵的影響，假定免疫反應參與其起源或成熟進程，或其在本質上改變先前建立的反應。本發明通過提供多聚體非編碼核酸分子解決此目的。多聚體分子可以通過包括以下步驟的方法產生-提供在水中的5-磷酸化寡脫氧核糖核酸序列，-凍幹直至獲得乾燥殘留物，隨後將其重懸於緩衝液中，-添加T4DNA連接酶，從而形成反應混合物，和-在37'C溫育該反應混合物至少30分鐘。最意想不到地，上述提及步驟的順序產生一種多聚體分子，其比現有技術的分子更好地適用於調節人或動物免疫系統的活性。在本發明含意中的多聚體分子基本上是脫氧核醣核酸分子，該核酸分子優選地具有至少100個核苷酸、更優選200個、特別優選超過300個核苷酸的長度。儘管EP1196178公開了就其莖-環結構而言可以稱作單體的分子，然而本發明的方法提供其中若干此類莖-環單體結構裝配成多聚體或寡聚體結構的分子。意想不到地，所得的裝配物有效調節免疫系統。令人驚訝的是以上提及的本身(pw")簡單及實驗室常用的處理步驟導致有效結構的形成。與根據EP1196178的結構相比，本發明的多聚體分子代表較早期的分子複合體。在本發明的優選實施方案中，寡聚體或多聚體裝配物(即本發明的分子)的特徵在於所述的寡脫氧核糖核酸序列包含以下序列a)GTTCCTGGAGACGTTCTTAGGAACGTTCTCCTTGACGTTGGAGAGAAC，或b)ACCTTCCTTGTACTAACGTTGCCTCAAGGAAGGTTGATCTTCATAACGTTGCCTAGATCA，或c)包含具有鹼基序列AACGTTCTTCGGGGCGTT的寡脫氧核糖核酸序列，.d)該寡脫氧核糖核酸序列具有40-1,600個核苷酸的長度。在本發明含意中的包含優選序列的多聚體裝配物特別適用於刺激家畜和人類中免疫系統的活性。在優選的方式中，依據特徵c)的鹼基序列被包含在以下序列中CCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC。意想不到地，上述序列的存在導致該分子的極高效果，其中所述的效果在本發明含意中理解為激活免疫系統。本發明的另一個優選實施方案構思所述分子包含部分單鏈的共價閉合的脫氧核糖核苷殘基鏈。正是在該分子的裝配寡聚體或多聚體結構內的部分單鏈、共價閉合的脫氧核糖核苷殘基鏈才是此分子在其中已經併入該分10子的靶生物體中有效活性延長的原因。本發明的另一個優選實施方案構思所述分子包含鹼基序列n'^cgn^n4,其中n'n2是來自gt、gg、ga、at或aa的基元，n3n4是來自ct或tt的基元，並且c是脫氧胞苷，g是脫氧鳥苷，a是脫氧腺苷，而t是脫氧胸苷。一個特別優選的實施方案構思鹼基序列n'n^gnSn4位於閉合脫氧核糖核苷殘基鏈的單鏈區內。特別是這些優選的分子才在免疫系統中顯示高度有效的活性。本發明還涉及共價地結合於若干取代基的本發明分子，所述的取代基優選地是肽、蛋白質、糖類、抗原結構、dna和/或rna分子。本發明還涉及包含至少一種本發明分子和化療藥的聯合劑。意想不到地，當本發明的化合物與熟知化療藥聯合併且針對腫瘤使用這種聯合劑時，由本發明分子對免疫系統的極高刺激作用甚至可以得以改進。在本發明含意中的聯合劑也可以以試劑盒的形式提供，其中本發明的藥劑與現有技術的化療藥分立地存在。因此，在優選的實施方案中，該試劑盒的至少兩種組分可以在相同時間或以時間交替方式應用。例如，本發明聯合劑的施用可以以如此方式激活免疫系統，從而隨後應用的化療藥可以尤其有效地發揮活性。顯而易見，還可以對人或動物生物體以時間交替方式首先應用化療藥並且隨後施用本發明的分子。對於特定腫瘤，優選同時施用本發明的分子和化療藥。在本發明的優選實施方案中，化療藥選自抗體、烷化劑、鉑類似物、嵌入劑、抗生素、有絲分裂抑制劑、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物和/或l-天冬醯胺酶、羥基脲、米託坦和/或鵝膏蕈鹼。在本發明的優選實施方案中，烷化劑選自包括以下物質的組-氮芥類衍生物，尤其-環磷醯胺，-異環磷醯胺，-曲磷胺，-美法侖，和/或-苯丁酸氮芥，-烷基磺酸酯，尤其-二甲磺酸丁酯，和/或-丁四醇磺酯，-亞硝基脲，尤其-亞硝基脲氮芥，-環己亞硝基脲，-啼啶亞硝基脲，-雌氮芥，和域-鏈脲黴素，-甲基苄肼和達卡巴嗪，-替莫唑胺，和/或-塞替派。垸化劑對腫瘤具有極高作用，因而抑制其生長。在本發明的優選實施方案中，鉑類似物選自包括以下物質的組-順鉑，-卡鉑，禾口/或-奧沙利鉑。本發明的另一個優選實施方案構思嵌入劑選自包括以下物質的組:-蒽環類，尤其-多柔比星(阿黴素)，-柔紅黴素，-表阿黴素，和/或-伊達比星，-米託蒽醌，-胺苯吖啶，和/或-去氧氟尿苷。本發明的另一個優選實施方案構思抗生素選自包括以下物質的組:-博萊黴素-放線菌素D(更生黴素)，和/或-絲裂黴素。12在本發明的另一個優選實施方案中，可以有利的是選擇來自包括以下物質的組的有絲分裂抑制劑-長春花生物鹼，尤其-長春瑞濱，-長春新鹼(安可平)，-長春花鹼和/或-長春地辛。在本發明另特別優選的實施方案中，紫杉烷類選自包括以下物質的組-紫杉醇，和/或-多西他塞。此外，可以優選的是選擇來自包括以下物質的組的拓撲異構酶抑制劑-拓撲異構酶I抑制劑，尤其-喜樹鹼，.-託泊替康，和/或-伊立替康，和/或-拓撲異構酶II抑制劑，尤其-足葉乙甙，-替尼泊苷。還優選在本發明具體實施方案中的抗代謝物選自包括以下物質的組-葉酸拮抗劑，尤其-甲氨蝶呤，-嘧咬類似物，尤其-5-氟尿嘧啶，-卡培他濱，-胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)，和/或-吉西他濱，-嘌呤類似物，尤其-6-硫代鳥嘌呤，-噴司他丁，-硫唑嘌呤，13-6-巰基嘌呤，-氟達拉濱，和/或-克拉屈濱。本發明還涉及一種試劑盒，其包含本發明分子和化療藥，任選地有關組合該試劑盒的內容物的信息。如上文所述，本發明也涉及一種藥用劑，其包含本發明的分子或聯合劑，任選地連同可藥用載體。此外，本發明也涉及所述分子、聯合劑或藥用劑的用途，用於製備用以調節人或動物免疫系統或調節該免疫系統活性的藥物。對人或動物免疫系統的調節理解為對免疫系統的任何影響，所述影響導致免疫系統對腫瘤或癌的抑制作用。對免疫系統活性的調節可以同義地理解為或描述本領域技術人員熟知的免疫系統的活性，所述的活性針對腫瘤，並且意想不到地由本發明的化合物提高強度。更具體地，調節因而是刺激或提高增強免疫系統的效果或免疫系統本身。因此，在優選的實施方案中，本發明的化合物可以用來刺激T細胞介導的免疫應答，還可以用來刺激不依賴T細胞的免疫應答。在本發明的優選實施方案中，此過程可以包含B細胞增殖或B細胞活化。在特別優選的實施方案中，調節免疫系統的活性導致如此方式的刺激，從而分泌或以更高水平分泌細胞因子。可以特別優選的是將本發明的分子或本發明的聯合劑用作治療性或預防性接種中的佐劑。以特別有效的方式，本發明的藥劑可以用在治療細胞生長疾病中，並且在優選的實施方案中，所述細胞生長疾病是腫瘤病。在優選的方式中，該腫瘤病選自包括以下疾病的組耳-鼻-喉部位腫瘤，其包括內鼻、鼻竇、鼻咽、唇、口腔、口咽部、喉、下咽部、耳、唾液腺和副神經節的腫瘤；肺的腫瘤，其包括非小細胞性支氣管癌、小細胞性支氣管癌；縱隔的腫瘤；胃腸道的腫瘤，其包括食管、胃、胰臟、肝臟、膽囊及膽道、小腸、結腸與直腸癌和肛門癌；泌尿生殖道腫瘤，其包括腎、輸尿管、膀胱、前列腺腺、尿道、陰莖和睪丸的腫瘤；婦科腫瘤，其包括宮頸、陰道、外陰的腫瘤、子宮癌、惡性滋養細胞疾病、卵巢癌、輸卵管(TubaFaloppii)腫瘤；腹腔腫瘤；乳腺癌；內分泌器官腫瘤，其包括甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質的腫瘤、內分泌性胰腺腫瘤、類癌瘤和類癌症候群、多發性內分泌腺瘤；骨和軟組織肉瘤、間皮瘤、皮膚腫瘤、黑素瘤，包括皮膚及眼內黑素瘤；中樞神經系統腫瘤；嬰兒期腫瘤，包括視網膜母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經纖維瘤病、神經母細胞瘤、Ewing肉瘤腫瘤家族、橫紋肌肉瘤；淋巴瘤，其包括非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、中樞神經系統原發性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包括急性白血病、慢性髓細胞性白血病和淋巴細胞性白血病、漿細胞瘤、脊髓增生異常症候群；副腫瘤性症候群、原發灶不明的腫瘤轉移(CUP症候群)；腹膜癌病；免疫抑制相關性惡性腫瘤，其包括AIDS相關惡性腫瘤如卡波西肉瘤、AIDS相關性淋巴瘤、中樞神經系統AIDS相關性淋巴瘤、AIDS相關性霍奇金病和AIDS相關性肛殖腫瘤；移植相關性惡性腫瘤；轉移腫瘤，包括腦轉移、肺轉移、肝轉移、骨轉移、胸膜和心包轉移，以及癌性腹水。不意圖限制，本發明將參考實施例而更詳細地闡述如下對於每項方法所需要的設備、材料和溶液在相應方法下表述。下表包括一系列已經使用且不從屬於具體方法的設備和材料以及為製備前述溶液所需要的化學品及溶液。表所用的設備、材料、化學品和溶液tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16所用的ODN和dSLIM，使用mfold的序列選擇使用在網址Oittp:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)可獲取的"mfold"軟體構建用來產生模型分子以研究dSLIM結構的眾多序列。"mfold"是用來基於熱力學數據預測核酸二級結構的程序[Zuker，2003]。在"DNAmfold"中輸入作為線型DNA的用來合成dSLIM的58個核苷酸的長度的DNA序列，以下稱為ODN，使用標準設置和下列參數溫度37。C，離子濃度150mMNa+和0.5mMMg2+，寡聚物校正。dSLIM-30Ll的序列用作該模型分子的基礎以研究G結構的形成。起初，以如此方式修飾G結構，從而連續的鳥嘌呤殘基不再存在，同時保留該互補區域的GC部分(下文稱為"莖")。以如此方式修飾非互補區序列(下文稱為"環")，從而Watson-Crick鹼基配對優選地將不可能進行並且連續鳥嘌吟殘基將不存在。作為修飾該環的結果，與30L1相比，位於此區域內的CG基序受到修飾。以如此方式構建的模型ODN將在下文稱為KG。GLODN對應於環內具有聚(G)序列的KG，其中與30L1中的聚(G)序列不同，所述的聚(G)序列不位於CG基序內。MSODN對應於起始分子30L1，但在莖內具有額外的鳥嘌呤殘基。GS、GLS和MLODN包括上述ODN的莖和環的組合。使用分子no30Ll和noGL(各自使CG由TG替換)作為用以所觀察CG基序效應的依賴性的對照分子。dSLIM-60Ll分子用作"二聚體"dSLIM-30Ll的模型分子，如可能通過連環化作用形成。它可以由兩個部分互補，但非自我互補的ODN(60Llforw和60Llrev)組成，其中所述的ODN在雜交後具有5'突出端，其中所述的5'突出端可以與其中具備相應3'突出端及自我互補性5'和3'區的另一種ODN(30L1-AGGG)連接。以上3禾中ODN的環的序列對應於30L1的那些環的序列。dSLIM-30Ll的級分由MelanieRothe(MologenAG)提供，其中所述的級分通過使用分離法藉助連續NaCl梯度在HPLC中分離大量的dSLIM-30Ll而獲得。用於此研究中的ODN從TIBMolbiol(Berlin)購買，其帶有5'磷酸化(例外M362，2006)，在HPLC純化後以3g/1濃度溶解於水中。17表所用的ODN(硫代磷酸酯:小寫字母)tableseeoriginaldocumentpage18由於其4個氫橋結合位點的取向，鳥嘌呤能夠通過鳥嘌呤-鳥嘌呤鹼基配對作用形成帶8個氫橋(G四集體)的環狀鹼基四集體。含有若干連續鳥嘌呤核苷酸的DNA序列因而能夠形成四聚物螺旋結構，其中鳥嘌吟鹼基以特殊堆積相互作用顯示高水平的平面性(planarity)。依據序列中鳥嘌呤核苷酸的位置、數量和分布，可以形成多種G結構，其中所述的G結構分成三組G2'DNA(雙分子的平行或反平行四鏈)、G4'DNA(單分子的反平行四鏈)或G4DNA(四分子的平行四鏈)。G4DNA能夠形成自裝配性納米結構(所謂G線(Gwire))。除了可用鳥嘌呤殘基的數目及其排列和周邊Watson-Crick鹼基配對作用之外，G結構的形成及穩定性取決於溫度、DNA濃度和各類陽離子(如Na+、K+、Mg2+、C^+)的存在，其中G結構的穩定性有時極高。例如，G4結構已在端粒序列、免疫球蛋白轉換區和HIVDNA中鑑定到[Sen1992，Marsh1994，1995]。其次，產生了包含各種環和莖序列的組合的多種單體分子和多聚體分子。每次使用了包含長基序、短基序或無聚(G)基序的三種環序列和三種莖序列，因而影響形成G結構的能力。穩定的G結構可以在適宜的條件下在短ODN(12聚物)中只用四個連續鳥嘌呤鹼基形成。在較長ODN中，較長基序是必需的，原因是形成穩定G結構的概率與有助於整體序列的鳥嘌呤鹼基的比例正相關[Sen,1992]。具有額外的長聚(G)基序的分子顯示多聚體分子的形成增強。另外，這些分子的洗脫曲線不同於無長聚(G)基序的那些分子，從而兩個峰出現，在較高洗脫體積上的峰對應於在瓊脂糖凝膠的上半區內遇到的DNA。對於其聚(G)基序位於環中的GL觀察到最引人注目的變化。這裡，可以在洗脫曲線中區別兩個明顯分開的峰，其中在較高洗脫體積上的峰比在較低洗脫體積上的峰具有更高的強度。對於GL而言，在單體條帶上方彌散性分散於凝膠中的DNA量是相對較大的，在其分布方面延伸至凝膠的加樣孔。這些觀察得出結論相對大量的DNA存在於多聚體複合物中。在HPLC洗脫曲線中的峰分布和在瓊脂糖凝膠電泳後的DNA分布是在莖內含有聚(G)基序的構建體(GS，MS)中相似的。它們顯示個在洗脫曲線中於較高洗脫體積上的第二小峰和一個在瓊脂糖凝膠中單體條帶上方的微弱可見的密著DNA分布。就峰模式(HPLC)和DNA分布(瓊脂糖凝膠)而言，在HPLC和瓊脂糖凝膠中對環和莖內具有聚(G)基序的分子(GLS)觀察到的遷移行為處於GL和GS及MS的遷移行為之間。在洗脫曲線中觀察到相等高度的兩個獨立峰，並且在凝膠的上半區域內分布的DNA量略微高於在莖內具有聚(G)基序的19分子(GS和MS)的相應DNA量，而低於GL的相應DNA量。因此，當聚(G)基序位於環內時，應當特別有利於多聚體分子的形成，如GL的情況即是如此。其原因在於單鏈環中缺乏Watson-Crick鹼基對形成與G結構形成之間的競爭。這個先決條件也存在於GLS分子中。然而在這種情況下，聚(G)基序作為相互作用的可能伴侶同時存在於莖和環中。因此，可以形成分子內G2結構，即不依賴於濃度而大量進行。因此，它們代表對分子間G結構形成的競爭，從而與GL相比時，對於GLS而言，較高分子量複合物的形成減少。在莖內具備聚(G)基序的分子中觀察到形成較高分子量複合物的最低趨勢，雖然這種情況下聚(G)基序比GL中的那些聚(G)基序更長。給定相等量的起始材料，沒有在如同GLS那樣在莖和環內具備聚(G)基序的單體分子30L1中觀察到上述特徵。其原因可能是一方面，該分子中的聚(G)基序比多聚體分子中的那些聚(G)基序更短，另一方面，來自"DNAmfold"的結構預測顯示在環中形成Watson-Crick鹼基對的趨勢更高，從而G結構形成的概率應當進一步降低。然而，如同具有長聚(G)基序的多聚體分子，藉助HPLC分離法從大量30L1中獲得的級分F4也顯示上述在凝膠上半區內的彌散DNA分布和在聚丙烯醯胺凝膠電泳中凝膠加樣孔內的滯留性DNA(見圖.3丄9)。顯然，G結構的較高分子量複合物的比例對於30L1是如此之低，以至於僅在使用更高數量的起始材料時才可以檢測到30L1。相反，對於在環內具有聚(G)基序的GL和GLS而言，凝膠加樣孔內的DNA份額沒有完全消失，並且可以識別到一個規則的額外帶型。這可能歸因於留在聚集體中的二聚體或四聚體或未降解的ODN，它們已經因變性而從聚集物中分離並且仍然通過鳥嘌吟-鳥嘌呤相互作用彼此結合。實驗特性顯示具有長聚(G)基序的多聚體分子實際上由G結構組成。除了密著DNA分布出現在凝膠上之外，該特性還包括在變性後出現規則條帶，如對GL和GLS在聚丙烯醯胺凝膠中所觀察到那樣。與從30L1分離的在凝膠上半區內的條帶不同，對KG和ML觀察到的條帶在變性後不再是可識別的(見圖.3丄6)。這些條帶因而是通過兩個單體分子間的鹼基對相互作用所形成的二聚體，並且因此，可以輕易地通過熱變性加以分離。這些條帶在KG和ML中的偏好性出現可能歸咎於支持兩20種分子相互作用的共有環序列。大量30L1分子的HPLC分級提供了在凝膠中顯示高度不同遷移行為的4種級分。對單種級分的濃縮能夠分別溶解它們，從而先前在凝膠中不可辨認的若干條帶變得可見。第一級分的遷移行為對應於觀察到的兩種單體構象，第二級分的遷移行為對應於這兩種構象的連續性混合，其中開放構象在使該級分變性後佔優勢，並且第三級分的遷移行為主要對應於如上所述的二聚體分子。由於具有留在凝膠加樣孔內的清晰可見DNA份額，因此第四級分在遷移行為上類似於MS。與在水中觀察到的凝膠內遷移距離相比，在細胞培養基中的條帶的遷移是明顯的，其中所述條帶對應於30L1的二聚體和30Ll級分3的二聚體。用考馬斯染色凝膠進行的對比顯示在培養基中的相應條帶在與低分子量蛋白帶(lowerproteinband)相同的水平上運行。因而，可以推斷該條帶的遷移由二聚體分子與蛋白質的結合引起。對應於單體構象的條帶的遷移行為幾乎不因添加培養基而改變，僅對GL觀察到對應於開放構象的條帶增加。經37。C溫育5小時後，在KG和30L1中見到先前觀察的DNA在兩個條帶之間彌散分布，其中對KG而言，對應於開放構象的條帶的強度降低。在所選條件下，與水溶液相比，開放構象略受支持。在培養基中溫育27小時後，對於ML和GL觀察到的DNA強度大為降低，並且甚至對於KG，僅在降低的強度上可見到低分子量條帶(thelowerband),然而對30L1觀察到強度下降最小。一種可能的解釋是開放構象比雙鏈構象更容易受降解。各類單體分子和多聚體分子的免疫刺激作用將通過確定IFN-y、IFN-a和IL-6在用這些分子刺激後的PBMC的上清液中的濃度進行研究，其中所述的PBMC來自人血捐助。用於利用來自人血捐助的PBMC確定所述分子的活性的試驗系統是高度複雜的系統，其中不同細胞可以通過相互作用和/或細胞因子分泌而相互影響，從而將觀察到的反應賦予具體細胞類型或反應途徑幾乎是不可能的。況且，在單個供體的結果之間存在巨大變異，從而需要更多數目的獨立試驗。本試驗系統的優勢在於它是所有可能完善建立的體外系統中最接近體內環境的。21該試驗證實目前使用的細胞活化檢測法因細胞培養條件而易受相對強烈的影響，原因是IL-8/CXCL8也應答於細胞應激誘導因子而分泌。尤其，對使用在刺激前不更換其培養基的細胞所獲得的結果(見圖.3.3.1)而言和其中甚至在未刺激的細胞中檢測到高濃度IL-8/CXCL8的情況下，這是顯而易見的。在未刺激細胞內測量的趨化因子濃度與在受刺激細胞中測量的趨化因子濃度的測定的比例是1.3，並且與其中已經更換培養基的細胞相比，該比例是極低的。後者具有2.3的比例。因此，為儘可能獲得更有信息的結果，本試驗中特別重要的是在基本無細胞應激條件下培養細胞。據推測，用接種24小時後受刺激的細胞獲得的結果為何不如用培育至匯合的細胞獲得的結果同樣清楚，其原因在於細胞應激。細胞傳代和相關細胞培養技術導致高度細胞應激。如在涉及刺激時間依賴性的試驗中所觀察(見圖.3.3.2)，在僅6小時後可以檢測到未刺激細胞與受刺激細胞之間趨化因子分泌量的差異。IL8/CXCL8的量在6小時-24小時之間增加，然而從24小時-48小時所觀察到的這種增加是小的。所述分子在該試驗系統中的活性在其中觀察到所用各種分子之間差異的兩個試驗內研究(見圖.3.3.3)。通過用GL刺激誘導了試驗中IL-8/CXCL8的最高分泌，其略微高於由ODN2006誘導的最高分泌。用KG和30L1刺激後所測量的IL-8/CXCL8的量是略微較低的，其中KG與30L1相比顯示略微較高的活性。在不同單體分子和多聚體分子的活性方面觀察到的差異可能歸因於觀察的結構差異。因此，可以證實KG和GL與30L1相比時，傾向具有帶CG基序的環區的開放構象，從而其單鏈形式是優選的。如Rutz等藉助表面等離子共振法證實，單鏈DNA比雙鏈DNA以更高親和力結合於TLR9[Rutz，2004]，這可能是KG及GL與30L1相比具有略微更高活性的原因。然而，CG基序即便在30L1和KG/GL中也不同，從而不同活性可能歸因於不同CG基序對受體的不同親和力。GL，即具有形成聚集體的最高能力的分子，在兩個試驗內顯示出受測試分子中的最高活性，這可能歸因於較高分子量複合物對受體的更強交聯作用。然而，用PBMC進行的試驗中沒有觀察到增強的GL活性。在另一方面，還有可能的是存在於更複雜系統PBMC中的其它模式識別受體參與本文中觀察到的單體分子和多聚體分子的免疫調節活性，其中所述的其它模式識別受體識別所述分子的其它結構特徵。因此，例如，識別有可能還通過其它核酸特異性受體如(如TLR8或TLR7)進行，從而產生協作或調節效果。總之，可以得出結論具體而言，聚(G)基序在單體分子的環中的存在有助形成多聚體複合物。此外，此類複合物具有針對熱變性的高度穩定性。為鑑定多種構建體的免疫調節作用的差異，在用PBMC的刺激實驗中使用所述的多種構建體。結果表明多聚體分子具備特別高的活性。DNA濃度的測定通過測量在260nm(A26o)處的吸收而確定ODN及單體DNA分子的濃度。正是核酸鹼基的芳環才導致在260nm處的吸收，每種鹼基具有不同的摩爾吸光係數s(A〉G〉T〉C)。因為生色團-生色團相互作用，雙鏈核酸具有比單鏈核酸更低的吸收(減色效應)。為測定所述濃度，首先將相應體積的待測定DNA溶液在Eppendorf管中用TE緩衝液稀釋於終體積300)il中(ODN1:200，dSLIM1:100)。隨後將DNA溶液轉入石英比色杯，並且在光度計中比照TE緩衝液測量在260nm處的吸收。根據下列公式從測量的吸收中計算濃度c(pg/ml)=A26QX稀釋係數X轉換係數轉換係數是一個近似值並且對雙鏈DNA估計為50pg/ml，而對於單鏈DNA估計為33昭/ml。鑑於雙鏈區在ODN和單體DNA分子中共有，使用標準轉換係數50嗎/ml。每次用獨立的稀釋物測定兩次，從中計算平均值。單體DNA分子的製備為製備單體DNA分子，使用貯存在-20。C的無菌(一次性)材料和新鮮緩衝液或無菌過濾的緩衝液而避免細菌汙染，因為剌激結果甚至可以由於少量內毒素而被曲解。在單體DNA分子製備中的第一步驟是使用T4DNA連接酶連接兩個ODN。T4DNA連接酶催化磷酸二酯鍵在帶平末端或粘末端的雙鏈DNA或RNA中5'-磷酸末端與3'-OH末端之間形成。此外，T4DNA連接酶能夠修23復雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體中的單鏈斷口。兩個ODN的連接在一個ODN的5'-磷酸突出端與另一ODN的3'末端之間進行，從而形成環狀分子。在反應期間，該反應類似地產生本發明的多聚體DNA分子。用於製備所述多聚體DNA分子的ODN起始量是500-1000嗎。為連接，ODN以0.55g/1濃度用於1X連接酶緩衝液中。為此目的，將ODN用Aquarinse稀釋並添加相應量的10X連接酶緩衝液。徹底混合後，T4DNA連接酶以如此量添加，從而出現0.01U/嗎DNA的比例。連接批次(batch)在水浴中於37'C溫育15-24小時。利用T7消化來降解未連接的ODN。T7DNA聚合酶是一種模板依賴性DNA聚合酶，其以5'-3'方向催化DNA合成，還對單鏈和雙鏈DNA具有3'-5'核酸外切酶活性，因而適用於降解未連接的ODN。在T7消化之前檢驗連接成功與否。為此目的，每次在3%的瓊脂糖凝膠上分離0.3|igODN、連接批次和試驗T7消化產物(atestT7digestion)(見2.4.1)。對於試驗T7消化，將過量T7DNA聚合酶以10U/1.1嗎DNA的比例用於21^1體積中。該反應在37r下進行1小時並且通過在70'C加熱10分鐘終止。對於T7消化，將連接批次用Aquarinse稀釋並添加相應量的10X連接酶緩衝液，從而DNA以0.3g/1濃度存在於1X連接酶緩衝液中。添加為產生比例0.03U/嗎DNA所需的T7DNA聚合酶量。該批次在水浴中於37°C溫育15-24小時。通過在3%瓊脂糖凝膠上分離0.3pg連接批次和0.3叱及0.9pg的T7消化批次檢驗連接成功與否。本發明分子的純化使用陰離子交換層析法實施純化。該方法的原理以多孔基質(固定相)中存在帶正電荷的基團為基礎，其中所述的基團與在pH值2以上帶負電荷的核酸磷酸酯基團相互作用，從而將後者結合於固定相上。相互作用的強度取決於pH值、移動相的離子強度和分子上存在的負電荷。不帶電分子不與固定相相互作用或僅微弱地與其相互作用，並且將該分子迅速用低離子強度的移動相洗脫。通過提高移動相的離子強度，將結合於固定相的分子從柱中置換。由於與固定相的更強相互作用，體積更大的核酸比體積更小的核酸更晚洗脫[Lottspeich，1998;Miilhardt，2003]。使用Fractogel-DMAE(—種帶二甲基氨基乙基的聚合物樹脂)作為純化中的固定相。NaCl進階梯度(0。/。、50%、100°/。1MNaCl)用於分離。在開始純化前，首先用Aquarinse淋洗HPLC裝置的全部出口和入口並且裝柱，其中所述的HPLC裝置在不運行時充以20。/。乙醇。為此目的，將1.6-1.8mlDMAE置於柱內、用水填充直至邊緣，並且搖動該柱以確保均勻分布。隨後，該柱以無空氣泡方式連接於HPLC裝置。此柱以lml/分鐘流速淋洗直至所述柱材料已經徹底沉積。將上位活塞以無空氣泡方式擰緊在基質(matrix)上，並且從柱中排出過量的水。將該柱再連接至HPLC裝置並以流速1ml/分鐘淋洗，並且通過重複淋洗步驟消除可能存在於基質和活塞之間的無效空間。如此裝填好的柱以及HPLC裝置隨後用T20緩衝液以流速1ml/分鐘平衡。柱的平衡使用大約10倍柱基質體積實施並且使用pH指示試紙來檢查。使用Hamilton注射器，將批次批經2ml進樣環注射至HPLC裝置中。藉助設計旨在實施自動分級的軟體方案控制HPLC裝置。但在一些情況下，通過手工分級出現的側峰。在施加樣品前，該柱用雙倍柱體積(CV)平衡，並且隨後用5CV的T20緩衝液實施洗脫未結合分子(蛋白質、核苷酸)，隨後用7CV的50%T20N1000緩衝液洗脫微弱結合的分子(ATP，ODN)，並且用7CV的100%T20N1000緩衝液實施dSLIM的洗脫。流速lml/分鐘。此後，該柱以10CV的T20緩衝液重新平衡用於下一輪樣品施加，並且用T20緩衝液手工淋洗HPLC裝置的入口和出口。使用乙醇沉澱法濃縮HPLC純化的分子並使其脫鹽。在一價陽離子存在下，醇中的核酸形成一種可以通過離心予以分離的不溶性沉澱。可以通過在70%乙醇中的洗滌去除大部分共沉澱的鹽，因為不同於核酸，所述的鹽是可溶性的。為在更不易沉澱的較少量核酸的情況下提高回收率，可以通過在低溫下沉澱和/或添加Mg^離子來進行。如果不幹擾後續用途，也可以添加載體材料如tRNA或糖原，其增加核酸的有效濃度[Lottspeich，1998;Miilhardt，2003]。為了沉澱，將HPLC純化的各級分轉入Corex離心玻璃管內並添加1/100體積的1MMgCl2、1/10體積3M乙酸鈉溶液和2.5體積96%乙醇。將所述批次混合併且在2(TC沉澱2-24小時。該批次隨後在4°C以10,000轉/25分鐘(ll,000g)離心30分鐘，移去上清液，以5ml70%乙醇洗滌並且在4'C以10,000轉/分鐘(ll,000g)離心額外10-30分鐘。移去上清液並且將DNA沉澱在空氣中乾燥直至乙醇味消散。將DNA溶解於100-350(ilAquarinse內並且轉入無菌1.5ml反應管。參考在製備中所用DNA的量估計用於重懸的體積，從而以50%回收率獲得1g/1濃度。瓊脂糖凝膠電泳對於分離和表徵核酸而言，凝膠電泳是一種適用的方法。核酸(其在寬泛pH值範圍內帶負電荷)在瓊脂糖或聚丙烯醯胺基質中暴露於電場並且向陽極遷移。它們的遷移率根據核酸大小不同。核酸(長達約10kb)在凝膠電泳期間的行為可以利用兩種理論的組合來描述。奧格斯頓氏(Ogs加n)篩分效應基於如此假設，即核酸採取球體形狀並且與凝膠基質碰撞越頻繁，則粒子周長越大，從而較大的分子比小分子更強烈受到遲滯。根據該理論，直徑大於凝膠孔徑的分子不應當遷移穿過凝膠。蛇行理論假定核酸在凝膠中喪失其球體形式並且以一端在前的蛇樣方式移動穿過凝膠，這種運動對於較長分子比短分子需要更長的時間。由於大小對核酸遷移率的影響，故二級結構的形成對凝膠中的遷移行為有影響。因此，例如，質粒DNA的遷移行為根據其構象而不同。遷移率從開環(I型)至線型(III型)、超螺旋(II型)至變性(螺旋)質粒DNA依次增加。對於線型雙鏈DNA(III型)，在廣大範圍內存在其長度(以bp計)的常用對數與凝膠中相對遷移距離之間的相關性，從而基於長度標準，可以相對精確地確定大小。可以通過使用溴化乙錠實施凝膠中核酸的檢測，其中所述的溴化乙錠因其平面結構而嵌入DNA中，從而採用在UV區(254-366nm)內的光迸行螢光激發是可能的，在橙紅區(590nm)內觀察螢光的發射[Lottspeich，1998]。瓊脂糖是從海藻中回收的多糖並且在冷卻後的水溶液中形成具有相對大的孔(P/。(w/v)約150nm)的凝膠。孔度與瓊脂糖濃度成反比。瓊脂糖凝膠適宜用於分離長度0.1-25kb的核酸。瓊脂糖凝膠的優勢在於它們相對大的分離範圍並且易於操作。然而，瓊脂糖凝膠對小DNA片段的解析度極低。適用於分離較小DNA片段的是篩孔瓊脂糖(SieveAgarose),這是瓊脂糖的一種衍生形式[Lottspeich,1998;Mtihlhardt,2003]。為分離ODN和本發明的分子，使用在含有0.125pg/ml溴化乙錠的1XTAE緩衝液中的3%的瓊脂糖凝膠。使用BioRad系統澆注水平凝膠(40ml用於具有8個加樣孔的小體積凝膠，100ml用於具有20個加樣孔的大體積凝膠)。待分析樣品在IX試驗緩衝液中隨合適的長度標準施加(參見2.4.3)。電泳在120V電壓下、在1XTAE的緩衝液中進行30min。使用凝膠記錄設備對凝膠照相。非變性聚丙烯醯胺電泳凝膠(PAGE)使用交聯劑N，N'-亞甲基雙丙烯醯胺，通過丙烯醯胺單體的自由基共聚作用形成聚丙烯醯胺凝膠。此凝膠的孔度是大約3-6nm並且依賴於丙烯醯月安總農度(％T=m丙稀醯胺+m雙丙怖醯胺)(w/v))禾口交聯度(。/oC=m雙丙飾醯胺/m丙灘醯肢+m鵬稀《)。它在恆定的C上隨T增加而降低，並且在恆定的T上在5%C上具有最小值。聚丙烯醯胺凝膠具備極佳的分辨能力，尤其對於小DNA片段(〈lkb)。然而，聚丙烯醯胺凝膠的分離範圍與瓊脂糖凝膠相比明顯較窄。分離範圍可以因使用梯度凝膠而變得更寬。聚丙烯醯胺凝膠的優異分辨能力能夠區分因其不同形式而具備不同遷移行為的不同DNA構象，而所述的遷移行為通過溫度和離子濃度加以影響。發現具有8%T、2.6%C的凝膠最佳用於所述分子的分離，並且具有12%T、5%C的凝膠在1XTBE中最佳用於分離ODN。在電泳前一天澆注水平凝膠(15ml/凝膠小體積，25ml/凝膠大體積)並且貯存在冰箱中過夜。在施加樣品前，將凝膠在70V(170V力柳)上預電泳直至觀察不到電流強度變化(10-11mA)。樣品在1X試驗緩衝液中連同不添加染料的合適長度標準施加(參見2.4.3)。為監測電泳進程，在單獨的泳道施加1X上樣染液。電泳在lXTBE中於恆定電壓70V(170V大體積)O9V/cm)下在室溫進行並且一旦溴酚藍到達凝膠底端就立即終止(約2小時)。在電泳後，凝膠用溴化乙錠溶液染色10-15分鐘並使用凝膠記錄設備照相。在背景過度染色的情況下，將凝膠在去礦化水中洗滌10-30分鐘。用於條帶分配的熱變性和復性由於單體DNA分子是環狀DNA分子，其極類似於質粒DNA而在凝膠中顯示複雜遷移行為，對凝膠中觀察到的條帶指定具體構象或尺寸不是簡單明了的事情。可以在區分中利用如下事實，即不同的構象可以在合宜的條件下可逆地相互轉化，與不同尺寸的分子相反。27不同構象具有不同的緻密度並且應當因其區別性遷移行為而可覺察的，其中緻密的DNA形式與大體積的開放DNA形式相比，往往在凝膠中具有更高遷移率。緻密形式應當可通過破壞氫橋轉化成開放形式。為了分配聚丙烯醯胺凝膠中所觀察到的條帶，通過加熱至95'C持續10分鐘使分子熱變性。變性的樣品立刻置於冰上以防止復性。為此目的，產生主混合物，其包含在lxTE緩衝液中濃度0.05g/1的相應dSLIM分子。將該批次分成兩等分並且將1個批次加熱而將1個批次保存在室溫。待施加於凝膠上的樣品取自所述批次，隨相應量的5X樣品緩衝液一起添加並且在非變性8%聚丙烯醯胺凝膠上分離。為觀察復性，將剩餘的變性的批次再次等分並且隨後分別在4'C和在37"C溫育3日。剩餘的非變性的批次貯存在4'C並且在3日之後類似地加以等分，並且將一部分進行如上所述的變性而另一部分則保存在室溫。所述批次隨相應量的5X樣品緩衝液一起添加並且在非變性8%聚丙烯醯胺凝膠上分離。在細胞培養基中的溫育所述分子的活性使用PBMC和HEK293細胞在體外測試。將所述分子溶解於含蛋白質的細胞培養基內而非緩衝液中，並且在溫度37°。溫育。其目的因此是研究這些修改的參數對所述分子及ODN的結構及穩定性的影響。可以以各種方式影響DNA分子活性的一個重要因素是與蛋白質的非特異性結合。與蛋白質的結合將改變DNA在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(非變性PAGE)中的遷移行為，因而可以識別在蛋白質存在下DNA條帶的遷移。在大多數情況下，DNA-蛋白質複合物的電泳遷移率與DNA相比降低；對於DNA微環，電泳遷移率也可以提高，若緻密程度因蛋白質結合而增加[Touhn^1995]。為了在刺激試驗中所遇到的條件就其行為而研究刺激試驗中所用的分子和ODN，將ODN及分子的溶液在培養基中稀釋成lpM濃度，並且在37。C在熱臺(hotstage)上溫育5小時或24小時，或者在添加適宜量的5X樣品緩衝液後，直接在聚丙烯醯胺凝膠上分離。稀釋在H20中的ODN和分子的溶液相應地用於比較。為驗證觀察到的變化因蛋白質的存在引起，包含本發明ODN和分子的批次在其中不添加FCS的培養基內稀釋成lpM濃度。為比較DNA和蛋白帶在凝膠中的遷移距離，因而得出關於蛋白質可能結合的結論，在凝膠中檢測DNA以及蛋白質。對蛋白質的額外檢測在核酸檢測後進行。將凝膠在固定液中固定30分鐘並隨後在考馬斯溶液染色30-60分鐘。通過在脫色液中過夜溫育去除過量的染料，並且使用凝膠記錄設備對凝膠拍照。所用的DNA長度標準對於長度標準，每次在1X樣品緩衝液中施加由供應商建議的量/mm加樣孔寬度。使用以下標準物GeneRuler100bpDNALadderPlus(固IFermentas)GeneRuler50bpDNALadder(MBIFermentas)10bpDNALadder(Invitrogen)25bpDNALadder(Invitrogen)細胞培養全部細胞培養操作在無菌的條件之下使用無菌一次性材料進行。培養箱中的條件是37°C，5%二氧化碳，90%溼度。研究所述分子在PBMC中的免疫調節作用。為研究多聚體分子的免疫調節作用，使用ELISA方法測量從人血捐贈中回收的淋巴細胞與單核細胞的細胞因子分泌。用於分離淋巴細胞和單核細胞(也稱為外周血單核細胞(PBMC"外周血的單核細胞級分)的起始材料是白細胞濃縮物，也稱為血沉棕黃層，其通過全血離心而獲得並且從DRK-BlutspendedienstBerlinWannsee購買)。使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，PBMC細胞可以與白細胞濃縮物的其它組分(原生質、血小板、紅細胞、粒細胞)分開。Ficoll-Hypaque分離介質是這樣的溶液，其包括Ficoll400、經表氯醇交聯的蔗糖單體的高度分支聚合物和泛影酸鈉(Hypaque)的批次，密度1.077g/ml。使用在頂端有一層稀釋的白細胞濃縮物的分離介質的等密度離心法，可以根據其不同密度分離不同組分，因而獲得在圖2.5.1中所述的級分[Luttmann，2004]。為分離PBMC，將每種白細胞濃縮物轉入無菌250ml瓶中並且用PBS進行1:2稀釋。每次將15ml的Ficoll-Hypaque溶液置於四個50ml離心管內，使用10ml吸管小心地覆蓋約30ml血-PBS混合物並且在關閉制動器的情況下在800g離心20分鐘(總時間約50分鐘)。用5ml吸管小心吸取含有PBMC的相間層並且轉入含有20ml冷PBS的50ml離心管內。為去除紅細胞、Ficoll/Hypaque及血小板雜質，將細胞依次進行若干洗滌步驟。儘管直至分離PBMC的全部步驟均在室溫下進行從而避免血小板聚集，然而所述的洗滌步驟在4'C進行，以防止單核細胞吸附於所用的塑料材料並因而防止其損失。在第一洗滌步驟中，細胞在4"C於400g離心8分鐘。吸去上清液並且將細胞沉澱重懸於5mi的冷PBS內並用冷PBS充盈至45ml。後續洗滌步驟以相同方式進行，在300g離心5分鐘。重複洗滌步驟直至上清液清亮並且沉澱具有黃色(約5-6次)。每次將細胞重懸於5ml冷培養基中並合併，並且用冷培養基填充體積以獲得30ml。使用自動細胞計數器在8pm排除尺寸上確定細胞數並且使用冷的培養基調節細胞數至濃度4X106個細胞/ml。濃度4X106個細胞/1111的600^1先前分離的PBMC置於24孔細胞培養板的每孔中。此後，添加對應體積的待測試分子，從而在該批次中的濃度是lnM。將細胞在培養箱中溫育2日(42-48小時)。將細胞混懸液轉入Eppendorf反應管並在BiofUge中以3000轉/分鐘離心4分鐘。把如此獲得的無細胞上清液轉入新的反應管內，並且直接用來由ELISA確定細胞因子濃度或貯存在-70'C。HEK293細胞的培養該細胞在162cn^細胞培養瓶中培養。它們以1.3-1.9XlS個細胞/cm2密度接種。在培養箱中溫育2-3日後，將細胞按1:3分瓶。為此目的，吸去培養基，將細胞用10mlPBS洗滌並隨後在室溫溫育3-5分鐘並且隨後用5ml胰酶-EDTA溶液脫離。通過添加5ml培養基終止該反應。將細胞重懸並且另外添加5ml培養基。每次將5ml細胞混懸液保持在細胞培養瓶中或轉入一個新細胞培養瓶中並添加45ml培養基。有時，一些細胞在吸去培養基之前從培養瓶的底部脫離。在此情況下，將細胞轉入無菌離心管並在300g離心4分鐘。此後，吸去培養基並且將細胞重懸於5ml胰酶-EDTA溶液中，如上所述，添加10ml培養基並轉入新的細胞培養瓶中。HEK293細胞的剌激為建立該試驗，將HEK293-TLR9和HEK293空白細胞每次以濃度300.6-1XK^個細胞/ml接種在24孔細胞培養板內的400^d體積中並且培養1-5日。使用細胞計數器在8pm排除尺寸上確定細胞數，並且調節為適宜濃度。對於長期培養，48小時後更換培養基。為此目的，小心地吸去培養基並且每次向細胞小心添加400|al新鮮培養基。另外，在一些批次中，培養基在緊接在添加刺激物之前更換。通過添加適宜體積的ODN/分子從而分別達到終濃度2.5^M和lpM來實行刺激。相應地，以濃度0.5^g/ml施加LPS。此後，將細胞在培養箱中溫育不同時間(6-48小時)。最後，將培養基轉入1.5ml反應管，在Biofoge內在1400轉/分鐘離心旨在沉澱細胞，並且將上清液用來由ELISA確定IL-8濃度。使用elisa檢測細胞因子/趨化因子為研究dSLIM對PBMC的免疫調節作用，測量了IL-6、IFN-a和IFN-y的誘導作用。IL-6是由多種活化的淋巴細胞和單核細胞分泌的多功能細胞因子，並且，除在肝細胞中誘導急性期蛋白外，還對淋巴細胞的生長、分化和吞噬具有促進作用[Kirchner，1994]。IFN-a具有若干亞型，屬於主要具有抗病毒作用的I型幹擾素素家族。大量IFN由pDC在激活TLR7、8或9後分泌[Perry，2005]，還參見第1.3.2部分。IFN-y主要由NK和T細胞分泌，但也由單核細胞、樹狀突細胞和B細胞分泌。它是唯一的II型幹擾素，並且與I類幹擾素不同，其具有免疫調節作用而非抗病毒作用。除在分化中的作用外，IFN-y是Th1指導的免疫應答中最重要的效應細胞因子。利用IL8/CXCL8的分泌作用來檢測轉化的HEK293細胞中TLR9的激活。IL-8是由白細胞分泌並也由成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞分泌的CXC趨化因子。對IL8/CXCL8的誘導例如由IL-1和TNF-Y進行，不過也由PRR和環境因素如低氧而進行。IL8/CXCL8的表達通過經協同性激活NFa和AP-1對轉錄的調節而加以調節並且在mRNA穩定的水平上受到調節。除作為嗜中性粒細胞的激活物起作用之外，IL8/CXCL8對各類白細胞具有趨化效應並且參與組織中白細胞的變移過程[Mukaida，2003]。為檢測PBMC和HEK293細胞的細胞培養上清液中的細胞因子，使用"夾心ELISA"式的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。此方法是定量性免疫測定法，其中針對待檢測蛋白質的特異性抗體通過吸附作用固定在微量滴定平板的表面上。抗原與相應抗體的結合類似地固定了該抗原，並且可以通過洗滌而去除其它組分。抗原和抗體的結合是一種平衡反應，因而結合的抗原的是濃度依賴性的。使用特異性生物素化的第二抗體實施對抗原的檢測，其中所述的第二抗體轉而結合於檢測中所用的鏈黴抗生物素-酶綴合物。在本文中所進行的測試法中，酶是辣根過氧化物酶(HRP)。所測量的實際量是通過酶在限定時間長度中反應產生的生色底物的量(濃度)。本文中所用的底物是TMB(3,3',5，5，-四甲基聯苯胺)，該底物在&02存在下被氧化以吸收波長370nm(藍色)的光。該反應通過添加112804終止，因而改變吸收的波長至450nm(黃色)[Luttmann，2004]。使用待確定細胞因子的已知濃度的標準稀釋度系列，可以按照這種方式確定未知細胞因子在細胞培養上清液中的濃度。從R&DSystems以試劑盒的形式購買所需的抗體配對、標準物、酶和底物溶液。用於實施的設備和材料在下表中列出。IL陽6和IFN陽y使用來自R&DSystems的DuoSetELISADevel叩mentSystem試劑盒，按照所包含的說明書實行對PBMC的細胞培養上清液中IL-6和IFN-Y的檢測。為此目的，將"捕獲抗體"用PBS分別稀釋至濃度4嗎/ml(IFN-力和2pg/ml(IL-6)，並且每次將100^1置於微量滴定平板的孔中。該平板在室溫溫育過夜，隨後以用洗滌緩衝液洗滌3次，並且與每孔300)^1封閉緩衝液溫育1-2小時以飽和游離結合位點。該平板用洗滌緩衝液洗滌3次，並且隨後每次將10(^1的樣品和標準物置於該平板上。對於檢測IL-6，上清液以試劑緩衝液中l:2稀釋度使用，並且對於IFN-y檢測，不作稀釋。適用於IL-6的標準稀釋度系列包含以下濃度:12.5;25;50;100;200;350;700pg/ml。適用於IFN-y的標準稀釋度系列包含以下濃度12.5;25;50;100;250;500;1000pg/ml。在每種情況下測定兩次。溫育時間是2小時。在用洗滌緩衝液洗滌3次後，每次將試劑緩衝液中的分別為100ng/ml(IL-6)和200ng/ml(IFN-力濃度的100^1"檢測抗體"置於該平板上。在2小時溫育時間後，該平板用洗滌緩衝液洗滌3次，並且將lOOpl的1:200稀釋於試劑緩衝液中的鏈黴抗生物素-HRP置於各孔內。溫育時間是20分鐘。在最終三次洗滌步驟後，每次添加100pl底物溶液(比例1:1的"顏色試劑"A和B)至平板中並在黑暗下溫育20分鐘。該反應通過添加50的1MH^04終止，並且在微量平板讀數儀中於450nm處測量每個單孔中的吸收。使用軟體SoftMaxPro2.6進行評估。標準曲線用"四參數擬合法"計算。IFN-a使用來自Biosource的人幹擾素-aELISA試劑盒，按照所包含的說明書實行對PBMC的細胞培養上清液中IFN-a的檢測。將每孔標準物和樣品添加至包含於試劑盒內的微量滴定板條中，其中所述的微量滴定板條已經配置以抗體並被封閉，並且在室溫下溫育1小時。使用了以稀釋緩衝液1:2稀釋的上清液，並且標準稀釋度系列包含以下濃度156;312;625;1250;2500;5000pg/ml。在一個洗滌步驟後，將100^1在稀釋緩衝液C中的抗體濃縮物D添加至各孔，並在室溫下溫育1小時。將平板洗滌3次，並且添加100nl在HRP稀釋液中的HRP至各平板內並且溫育1小時。通過洗滌4次除去所述溶液並且將100^1底物溶液G吸加至各孔內。將平板在黑暗下溫育20分鐘，並通過加入100^1終止溶液H終止所述反應。在微量平板讀數儀中測量在450nm處的吸收。用軟體SoftMaxPro2.6進行評估。標準曲線用點對點擬合法計算。IL-8/CXCL8使用來自R&DSystems的DuoSetELISADevelopmentSystem試劑盒，按照所包含的說明書實行對HEK293細胞的細胞培養上清液中IL-8/CXCL8的檢測，並與對於IL-6和IFN-口所述相同。標準稀釋度系列包含以下濃度31,25;62.5;125;250;500;1000;2000pg/ml。上清液以未稀釋的形式使用。使用的抗體濃度是捕獲抗體4pg/ml，檢測抗體20ng/ml。單體DNA分子的製備和說明為研究結構特性、尤其有利於形成G結構的那些結構特性的影響，使用本發明的方法產生在多個區域具有聚(G)基序的單體DNA分子的組合，其中除凍幹外，所述的方法與單體製備方法相一致。為此目的，每次組合了用於莖(S)和環(L)的三種不同序列，其中所述的序列在鳥嘌呤鹼基的數目和位置方面不同，還在由"DNAmfold"程序預測的二級結構方面不同。各自33序列及結構特徵在下表描述表3.1:結構特徵和序列L1-L3，Sl-S3(紅色聚(G))tableseeoriginaldocumentpage34GLS如上所示，在本發明含意中也可以稱為多聚體分子或者寡聚體分子的聚合dSLIM分子極適合於在生物體中誘導增強的免疫應答。增強的免疫應答能夠有利地使用與化療藥聯合的所述藥劑。與兩種藥劑的加性效應相比，化療藥與本發明藥劑的聯合導致腫瘤治療中的協同效應。因為與本發明藥劑聯合，額外使用的化療藥或細胞生長抑制劑的全部效果均得以增強，其中所述的本發明藥劑可以通過以上提及的方法步驟(見主權利要求)獲得。雖然單體形式的dSLIM分子已經與化療藥或細胞生長抑制劑聯合，然而通過聯合多聚體或聚合物形式的dSLIM與細胞生長抑制劑所實現的效果是完全意想不到的。在實際使用包含單體形式的dSLIM和細胞生長抑制劑的聯合劑中，發現僅可能改善細胞生長抑制劑的個別特性，而沒有如與多聚體形式聯合時那樣改善其總體特性。另外，與使用單體形式的細胞生長抑制劑相比，免疫系統因多聚體/聚合物形式的dSLIM所致的激活意外地更高，以致可以實現腫瘤治療中意想不到地得以改善的總體結果。因此，尤其，當細胞生長抑制劑/化療藥與這些藥劑一起施用時，轉移的形成因在生物體中使用多聚體dSLIM分子而被防止。聯合在本發明的含義中理解為是同時以及時間交替地施用兩種藥劑。圖3.1.1例示了dSLIM分子30Ll(如MS)和KG(如ML、GS、GL，GLS)的兩種不同二級結構用於由"DNAmfold"所推算的三個環序列。與30L1相反，對KG在所選條件下沒有預測到在環中的鹼基配對。各類單體分子和多聚體分子的製備圖3丄2表示在3y。瓊脂糖凝膠中分離不同dSLIM分子及30UODN的0.3嗎連接批次及試驗T7消化產物的結果。在其中分離不同分子的全部泳道內，可以在近距離上看到在直至標記物100bp片段遷移抵達的水平下方對應於單體分子的一個條帶。在含有30LlODN的泳道中，可見在單體分子條帶下方的一個條帶。對於含有L3(GL、GLS)的分子，可以在凝膠的上半區域內直至加樣孔處見到DNA的模糊分布，與連接批次對比，該分布在T7消化批次中對於GL分子是明顯較強的，而對於GLS是更弱的。對於含有長聚(G)基序的分子(GL、GS、GLS、MS)，在凝膠中的條帶與其餘分子(30L1、KG、ML)相比是相對模糊的。在其中施加T7消化批次的泳道中，與其中施加連接批次的泳道相比，螢光強度較低，尤其在凝膠的上半區域中。圖3.1.3表示不同分子的後續HPLC純化的色譜圖。每個色譜圖將260nm處的吸收(藍線)對注入待分離樣品後流過柱子的體積(粉紅虛線)作圖。綠線代表lMNaCl緩衝液(T20N1000)的0。/。、50%及100%的NaCl緩衝液梯度。在2.5ml和0。/。T20N1000(F2)上具有最大值的第一峰對應於未結合的分子，在8ml和50%T20N1000(F3)上具有最大值的第二峰對應於具有對固定相的低親和力的分子(儘管與級分F4相比，施加12倍的量，然而在瓊脂糖凝膠中對這兩種分級檢測不到DNA)。在14ml和100%T20N1000(F4)上具有最大值的第三吸收峰對應於單體分子。圖3丄3:不同單體分子和多聚體分子的HPLC純化的色譜圖。a)30Ll，b)ML，c)KG，d)MS，e)GS，f)GLS，g)GL，柱lmlDMAE;施加的量700昭；流速1ml/分鐘；緩衝液A:200mMTris，pH7;緩衝液B:20mMTris，1MNaCl，pH7;梯度0%、50%、100。/。緩衝液B。當比較不同分子的色譜圖時，顯而易見F4是針對不含有聚(G)基序的分子(即不是S3，也不是L3(30Ll、ML、MS))的單峰。相反，對含有S3的那些分子在F4上觀察到肩峰。對於含有L3(GL，GLS)的分子，最大值具有兩個峰，而在GL和GLS之間強度分布不同。對於GLS，兩個局部最大值具有大致相同的強度，對於GL，在較高體積上觀察到的局部最大值比在較低體積上的局部最大值具有更高的強度。分別通過手工操作分級出現的次要最大值(sidemaximum)或肩峰。所述的級分根據其洗脫時間順序命名為F1和F2。在乙醇沉澱後，將HPLC分離法的上述dSLIM級分(即終產物)施加在圖3丄4中表述的瓊脂糖凝膠上。在全部泳道中，可以在近距離上在100bp標記片段下方看到對應於單體分子的條帶。對於ML和MS，可以在近距離上在上述條帶上方辨認出一個較弱的第二條帶，其中所述的第二條帶對於ML具有較高強度。GL、MS和GLS在凝膠中比其它分子顯示略微更高的遷移率。對於不含聚(G)基序的分子(30L1、MS、MS)，可以在dSLIM條帶上方辨認出直至約200bp水平的密著強度分布。此外，可以對KG和ML分子辨認出在200bp標記片段的水平上的一條微弱帶。圖3丄4:乙醇沉澱後的各種單體分子和多聚體分子30/0瓊脂糖凝膠，施加的量0.3昭，標記100bp0.5嗎.(100bp、30Ll、30Ll、KG，ML，GL-F1、GL-F2、MS-F1、MS-F2、GS-F1、GS-F2GLS-F1、GLS-F2100bp)。對於其中觀察到多峰分布並且在HPLC純化法中最大值發生分級的分子，每種級分1主要對應於單體條帶，同時施加了級分2的泳道主要顯示在所述單體條帶上方在廣大範圍內的強度分布。此處，MS和GS具有相似強度分布，其中所述的強度分布大致從單體條帶開始，延伸直至對應於500bp的遷移水平。另一方面，對於GL，該強度分布在200bp上方開始，延伸直至凝膠的加樣孔。然而，對於GLS，可以觀察到從單體條帶開始的遍布整條泳道的DNA分布。圖3丄6:各種單體分子和多聚體分子的熱變性作用。非變性PAGE，8。/。凝膠(2,6。/。C)，施加的量0.25嗎，標記25bp0.3嗎(25bp，未處理，95。C變性IO分鐘30L1、MS、ML、KG、GS、GL-F2、GLS-F2)。圖3丄6顯示不同分子的熱變性對其在凝膠中遷移行為的影響。為此目的，將批次等分並且將一部份加熱至95。C持續10分鐘，並立刻在冰上冷卻並施加。觀察到的條帶對應於在3.1.5中所述的那些在凝膠中的條帶，但在這種情況下，對MS和GS也在凝膠加樣孔中可見到未分離的DNA，並且對MS，可見到第二條帶，該條帶在與30L1的第二條帶相同的水平上運行。GS和MS涉及不同於圖3.1.5中所示凝膠的產物批次(productionbatch)，其中並未分別收集HPLC分級法中的次要最大值。在凝膠中用變性和未變性的dSLIM進行的條帶比較顯示加熱後，在全部分子中第一個條帶的強度降低而第二條帶的強度提高。在ML和KG泳道中出現在凝膠上三分之一區內的條帶在變性後不再可見。同樣，變性後，不再能夠識別在施加MS和GS的泳道的加樣孔內的DNA。在GL-F2和GLS-F2泳道中，加樣孔內DNA的量類似減少，而另一方面，在第二條帶上可見大量規則排列的條帶。為檢驗因變性引起的變化是否可逆，將變性的樣品等分並在4'C和在37。C溫育3日。未處理的dSLIM批次貯存在4。C，在3日之後類似地加以等分，並且每次將一個等份試樣加熱至95。C持續10分鐘並且立刻置於冰上。用來分離批次的非變性PAGE的結果示於圖3丄7和3.1.8。未處理和變性的樣品在凝膠中顯示了如對圖3丄6中所示凝膠描述的相同遷移行為。在它們遷移行為方面，在4。C溫育的變性樣的品對應於在施加前才變性的樣品的遷移行為。在37X:溫育的樣品在凝膠中顯示這樣的遷移行為，其大體對應於未處理樣品的遷移行為。然而，第二條帶的強度對於30L1、MS和GS分子而言高於上文所述。GS和MS的另一種差異體現於留在凝膠加樣孔內的DNA量上，該DNA量與未處理樣品相比極低。二聚體分子和單體30LI級分為檢查在上半區中辨認出的條帶是否是對應於二聚體的條帶，將級分(F3)連同二聚體分子60L1—起施加在非變性PAGE上，其中所述的級分(F3)通過HPLC分離法從大量單體分子中獲得並代表該條帶應用於非變性PAGE。圖3丄9:級分3與二聚體分子60L1的比較37非變性PAGE，8。/0凝膠(5o/oC),施加的量0.25嗎，標記25bp0.3嗎(25bp、F3、F395。C、60Ll、60L195。C、來自HPLC純化dSLIM30Ll、60L1的級分1(F1)、級分2(F2)、級分3(F3)、級分4(F4))。觀察的條帶在相同水平上運行。在凝膠上施加變性形式的樣品時，與施加未處理樣品的泳道相比，在凝膠中找到處於較高水平上的條帶。此非變性PAGE的對應泳道示於圖3丄9，此圖還顯示了分離由HPLC分級法獲得的單體30L1的四種不同級分的結果。溫育培養基，蛋白質結合為研究細胞培養中的條件、尤其蛋白質存在對用於刺激的分子的影響，將所述分子在細胞培養基中於37i:溫育0.5小時和27小時並且使用非變性PAGE，連同溶解在水中的所述分子一起在非變性PAGE上分離。在DNA染色後，通過考馬斯染色法在凝膠中檢測存在於該培養基中的蛋白質。結果示於圖3丄10禾n3.1.11。圖3丄10:培養基中單體分子的溫育非變性PAGE，8%凝膠(5。/。C)，施加的量0.25嗎，標記25bp0.3嗎，標記50bp0.3嗎(50bp，27小時培養基，5小時培養基，0小時培養基，H20:30Ll、ML、F3、KG，25bp)。非變性PAGE，8%凝膠(2.6。/oC)，施加的量0.25fig，25bp0.35^.(27小時培養基，5小時培養基，0小時培養基，H20:GL，25bp)。考馬斯染色的部分，非變性8%PAGE(5%C)，圖3丄11a)(27小時培養基，5小時培養基，O小時培養基，H20:ML)。圖3丄10a)和3丄10b)顯示其上面施加所述分子的溴化乙錠染色的PAGE。圖3丄10c)給出來自考馬斯染色凝膠的用來比較遷移距離的示範表示。比較包含不同批次的泳道，顯示對於培養基中的全部分子，在凝膠加樣孔內出現一個條帶，其中該條帶在H20泳道中不存在(GL分子例外)。對於30Ll和級分3在H20中出現在凝膠上半區內的條帶顯示了在培養基中的較短遷移距離，其中所述的較短遷移距離處在低分子量蛋白質帶的水平上。DNA帶和蛋白質帶的強度隨溫育時間增加而減弱。對於GL，與H20相比，第二條帶的強度在培養基中提高。圖3丄ll:ODNM362在培養基中的溫育。38非變性PAGE,12%凝膠(5%C)，施加的量0.25嗎，標記25bp0.3嗎(25bp、H20，O小時培養基，5小時培養基，27小時培養基)。考馬斯染色的部分，非變性PAGE，12%凝膠(5%C),圖3丄12a).(H20，O小時培養基，5小時培養基，27小時培養基)。圖3丄11顯示其中施加硫代磷酸酯受保護的對照分子M362的非變性PAGE。如其中清晰所見，在凝膠底邊緣處於H20中可見的DNA帶已經在培養基中消散。另外，可以見到在凝膠上緣處的一個條帶，其在遷移距離上對應於低分子量蛋白帶(圖3丄llb)，和在加樣孔中的一個條帶。在此情況中也可以觀察到DNA帶的強度隨溫育時間增加而減弱。為驗證觀察的變化是因蛋白質存在而非培養基的其它組分引起，也將M362分子稀釋在不添加FCS的培養基中用於比較。在圖3丄12中，凝膠的相應泳道對dSLIM(KG)和M362舉例說明。其中在無FCS的培養基中的ODN和所述分子被分離的泳道在其強度分布方面對應於其中施加了作為在水中溶液的ODN及所述分子的那些泳道。相反，溶解於含FCS的培養基中的ODN和所述分子在非變性PAGE中顯示與圖3丄10禾B3丄11中對此類泳道所述遷移行為相對應的遷移行為，其中所述的泳道內施加了稀釋於培養基內的單體分子和ODN。免疫刺激作用PBMC的剌激不同分子的免疫刺激作用在從人血捐贈分離的PBMC上研究。為此目的，PBM與相應分子或對照分子M362在終濃度lpM上溫育48小時，並且使用ELISA測量IL-6、IFN-a和IFN-Y在細胞培養上清液中的量。與無添加劑溫育的細胞用作對照。從4個人血捐贈(供者A-D)中分離的PBMC上清液的ELISA結果以簡圖形式在圖3.2.1a-c中表示。相應值對應於雙重測定的平均值，並且誤差棒代表自其中所確定的雙重標準偏差。對於以*標記的值，進行針對PBMC刺激的額外雙重測定，並且所示值對應於所獲得的四個ELISA結果的平均值。誤差棒對應的是這四個值的雙重標準偏差。圖3.2.1a國c):IFN-Y(a)、IFN-a(b)、IL-6(c)PBMC的ELISA結果。用l^ildSLIM/ODNM362刺激48小時的不同供體A-D的PBMC(在600|il中每批次2.4乂106個細胞)的上清液，標準測量範圍---，*雙重測定細胞培養，誤差棒來自ELISA雙重測定的2X標準偏差C雙重測定細胞培養+雙重測定ELISA二4個值)。參見該簡圖，一個極醒目的特徵是在不同供者的上清液中的細胞因子濃度顯示強烈變化，因此妨礙比較數據。在細胞培養中作為雙重測定而額外確定的值的標準偏差是與僅在ELISA中從雙重測定所確定的標準偏差值可比較的，表明該差異歸因於PBMC的差異。在未受刺激的批次中，對於全部供者，未檢測到細胞因子濃度或僅檢測到極低的細胞因子濃度。在IL-6和IFN-Y濃度的測定中，所測定值中的某些值處在上限或在標準測量範圍之外，其中所述的測量範圍對於dSLIM是IFN-y至多到10,000pg/ml，IL-6至多到3，500ng/ml，並且對於M362是7,000嗎/ml。為允許更好比較來自不同供者的數據，將所得細胞因子值歸一化。為此目的，對每位供者計算了所測定的細胞因子濃度在對M362所測定的值中的百分比。經如此歸一化的來自四位供者的數據的平均值示於圖3.2.2a-c。每種誤差棒對應於平均偏差值。鑑於各位供者之間觀察到的巨大差異，誤差棒是極大的。然而，至少可以藉助該簡圖估計各種分子的趨勢。圖3.2.2a-c):IFN-Y(a)、IFN-a(b)、IL-6(c)的ELISA結果的歸一化平均值。ELISA結果見圖3.2.1，歸一化細胞因子量XM362每位供者，4位供者的平均值，誤差棒平均偏差值。就IFN-y而言，相對於M362的值，所測試分子的計算值在40%與80%之間，並且KG、MS和GLS-F2的值位於下半區內，並且GL-F2的值位於上半區內。不同構建體的IFN-a平均值百分數大體上對應於M362的平均值百分數，而對GL-F1、GLS-F1和GLF2所計算的值例外，其中所述的值僅是M362值的約50%)。M362的IL-6平均值百分數低於30Ll、MS、GS、GL-F2和GLS-F2的IL-6平均值百分數的50%，並且MS與GLS-F2(具有最低內毒素濃度的構建體)也具有最低值。相對於M362，GL-F1與GL-F2(無可用的內毒素值)的值略微高於50%。在用KG和ML刺激的細胞中找到最高IL-6值，其對應於M362的IL-6值或高於100%。另外，也對這兩個構建體測量到最高內40毒素濃度。圖3.3.2:ELISAIL-8HEK293-TLR9的刺激時間的結果上清液HEK293-TLR9:400^1/批(5X16個細胞/ml);用2.5jiMODN2006刺激6小時、24小時、48小時；0.5嗎/mlLPS;在細胞接種後(48小時後和進行剌激之前更換培養基)3日進行剌激；誤差棒2XELISA雙重測定標準偏差。在來自a)的受刺激/未刺激的批次中趨化因子的量的比率；誤差棒ELISA雙重測定相對誤差的總量。所測量的趨化因子濃度是相對低的。然而，IL-8/CXCL8量隨溫育時間的增加可以在全部批次中觀察到，其中所述的IL-8/CXCL8量從24小時至48小時變得極低。此處，受LPS刺激和未刺激的細胞的相應值在幅度上大致相等，並且對於用ODN2006刺激的細胞而言，與未刺激的細胞相比，這些值增加達1.5倍。在受刺激和未刺激的批次的IL-8iCXCL8量的比例中未能識別到差異，其中所述的比例在不同時間點上確定，出於此原因，進一步實行剌激24小時。圖3.3.4:各類單體分子的空白ELISAIL-8HEK293的結果。上清液HEK293空白400|il/批(1X106個細胞/ml);用2jiMODN2006/dSLIM刺激24小時；0.5昭/mlLPS;在細胞接種後(48小時後和進行刺激之前更換培養基)4日進行刺激；誤差棒2XELISA雙重測定標準偏差。在來自a)的受刺激/未剌激的批次中趨化因子的量的比率；誤差棒ELISA雙重測定相對誤差的總量。與未剌激的批次相比，在與所述不同剌激物溫育的任何批次中未觀察到IL-8/CXCL8分泌的顯著差異。4權利要求1.一種用於調節人或動物免疫系統活性的多聚體分子，所述的分子可以通過包括以下步驟的方法製備-提供在水中的5′-磷酸化寡脫氧核糖核酸序列，-凍幹直至獲得乾燥殘留物，隨後將其重懸於緩衝液中，-添加T4DNA連接酶，從而形成反應混合物，和-在37℃溫育該反應混合物至少30分鐘。2.根據權利要求1所述的分子，其特徵在於所述的寡脫氧核糖核苷酸序列包含以下序列a)gttcctggagacgttcttaggaacgttctccttgacgttggagagaac或b)ACCTTCCTTGTACTAACGTTGCCTCAAGGAAGGTTGATCTtcataacgttgcctagatca，或c)包含具有鹼基序列AACGTTCTTCGGGGCGTT的寡脫氧核糖核酸序列，d)所述寡脫氧核糖核酸序列具有40至1,600個核苷酸的長度。3.根據前述權利要求所述的分子，其特徵在於特徵c)的鹼基序列被包含於以下序列中cctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacccctaggggttaccaccttcattggaaaacgttcttcggggcgttcttaggtggtaacc。4.根據前述權利要求任一項所述的分子，其特徵在於所述分子包含部分單鏈的共價閉合的脫氧核糖核苷殘基鏈。5.根據前述權利要求任一項所述的分子，其特徵在於所述分子包含njn2cgn3n4減基序列，其中n'n2是來自gt、gg、ga、at或aa的基元，NS^是來自ct或tt的基元，並且c是脫氧胞苷，g是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷，而T是脫氧胸苷。6.根據前述權利要求任一項所述的分子，其特徵在於鹼基序列^nscgnv位於閉合脫氧核糖核苷殘基鏈的單鏈區內。7.根據前述權利要求任一項所述的分子，其特徵在於一個或多個取代基經共價鍵連接於所述分子。8.根據權利要求7所述的分子，其中所述的取代基選自肽、蛋白質、糖類、抗原結構、DNA和/或RNA之一。9.一種聯合劑，其特徵在於該聯合劑包含根據權利要求1-6任一項所述的分子和化療藥。10.根據前述權利要求所述的分子，其特徵在於所述化療藥選自抗體、垸化劑、鉑類似物、嵌入劑、抗生素、有絲分裂抑制劑、紫杉垸類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物和/或L-天冬醯胺酶、羥基脲、米託坦和/或鵝膏蕈鹼。11.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述垸化劑選自包括以下物質的組-氮芥類衍生物，尤其-環磷醯胺，-異環磷醯胺，-曲磷胺，-美法侖，和/或-苯丁酸氮芥，-烷基磺酸酯，尤其-二甲磺酸丁酯，和/或-丁四醇磺酯，-亞硝基脲，尤其-亞硝基脲氮芥，-環己亞硝基脲，-嘧啶亞硝基脲，-雌氮芥，和/或-鏈脲黴素，-甲基苄肼和達卡巴嗪，-替莫唑胺，和/或-塞替派。12.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述鉑類似物選自包括以下物質的組-順鉑，-卡鉑，和/或-奧沙利鉑。13.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述嵌入劑選自包括以下物質的組-蒽環類，尤其-多柔比星(阿黴素)，-柔紅黴素，-表阿黴素，和/或-伊達比星，-米託蒽醌，-胺苯吖啶，和/或-去氧氟尿苷。14.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述抗生素選自包括以下物質的組-博萊黴素-放線菌素D(更生黴素)，和/或-絲裂黴素。15.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述有絲分裂抑制劑選自包括以下物質的組-長春花生物鹼，尤其-長春瑞濱，-長春新鹼(安可平)，-長春花鹼和/或-長春地辛。16.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述紫杉烷類選自-紫杉醇，和/或-多西他塞。17.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於所述拓撲異構酶抑制劑選自包括以下物質的組-拓撲異構酶I抑制劑，尤其-喜樹鹼，-託泊替康，和/或-伊立替康，和/或-拓撲異構酶II抑制劑，尤其-足葉乙甙，-替尼泊苷。18.根據前述權利要求任一項所述的聯合劑，其特徵在於抗代謝物選自包括以下物質的組-葉酸拮抗劑，尤其-甲氨蝶呤，.-嘧啶類似物，尤其-5-氟尿嘧啶，-卡培他濱，-胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)，和/或-吉西他濱，-嘌呤類似物，尤其-6-硫代鳥嘌呤，-噴司他丁，-硫唑嘌呤，-6-巰基嘌吟，-氟達拉濱，和/或-克拉屈濱。19.一種試劑盒，其包含根據權利要求1-6任一項所述的分子和/或根據權利要求7-17任一項所述的聯合劑和任選地有關組合該試劑盒的內容物的信息。20.根據權利要求1-6任一項所述的分子和根據權利要求6-17任一項所述的聯合劑，其用作藥物。21.—種藥用劑，其包含根據權利要求1-6任一項所述的分子和/或根據權利要求7-17任一項所述的聯合劑，任選地連同可藥用載體。22.根據權利要求1-6任一項所述的分子、根據權利要求7-17任一項所述的聯合劑、根據權利要求20所述的藥用劑的用途，用於製備調節人或動物免疫系統或者調節所述免疫系統活性的藥劑。23.根據前述權利要求所述的用途，其特徵在於所述的調節為刺激或增強所述免疫系統的活性。24.根據前述權利要求所述的用途，其特徵在於刺激包括T細胞介導的或不依賴T細胞的免疫應答。25.根據前述權利要求所述的用途，其特徵在於所述的免疫應答包含B細胞增殖和/或B細胞活化。26.根據前述權利要求任一項所述的用途，其特徵在於對免疫系統的刺激包括細胞因子的分泌。27.根據前述權利要求任一項所述的用途，其特徵在於根據權利要求1-6任一項中所述的分子和/或根據權利要求7-17任一項中所述的聯合劑用作治療性或預防性接種中的佐劑。28.根據權利要求l-6任一項所述的分子、根據權利要求6-7任一項所述的聯合劑以及根據權利要求20所述的藥用劑的用途，用於製備治療細胞生長疾病的藥劑。29.根據前述權利要求任一項所述的用途，其特徵在於所述的細胞生長疾病是腫瘤病。30.根據前述權利要求所述的用途，其特徵在於腫瘤病選自包括以下疾病的組耳-鼻-喉部位腫瘤，其包括內鼻、鼻竇、鼻咽、唇、口腔、口咽部、喉、下咽部、耳、唾液腺和副神經節的腫瘤；肺的腫瘤，其包括非小細胞性支氣管癌、小細胞性支氣管癌；縱隔的腫瘤；胃腸道的腫瘤，其包括食管、胃、胰臟、肝臟、膽囊及膽道、小腸、結腸與直腸癌和肛門癌；泌尿生殖道腫瘤，其包括腎、輸尿管、膀胱、前列腺腺、尿道、陰莖和睪丸的腫瘤；婦科腫瘤，其包括宮頸、陰道、外陰的腫瘤、子宮癌、惡性滋養細胞疾病、卵巢癌、輸卵管(TubaFaloppii)腫瘤；腹腔腫瘤；乳腺癌；內分泌器官腫瘤，其包括甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質的腫瘤、內分泌性胰腺腫瘤、類癌瘤和類癌症候群、多發性內分泌腺瘤；骨和軟組織肉瘤、間皮瘤、皮膚腫瘤、黑素瘤，包括皮膚及眼內黑素瘤；中樞神經系統腫瘤；嬰兒期腫瘤，包括視網膜母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經纖維瘤病、神經母細胞瘤、Ewing肉瘤腫瘤家族、橫紋肌肉瘤；淋巴瘤，其包括非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、中樞神經系統原發性淋巴瘤、霍奇金病；白血病，包括急性白血病、慢性髓細胞性白血病和淋巴細胞性白血病、漿細胞瘤、脊髓增生異常症候群；副腫瘤性症候群、原發灶不明的腫瘤轉移(CUP症候群)；腹膜癌病；免疫抑制相關性惡性腫瘤，其包括AIDS相關惡性腫瘤如卡波西肉瘤、AIDS相關性淋巴瘤、中樞神經系統AIDS相關性淋巴瘤、AIDS相關性霍奇金病和AIDS相關性肛殖腫瘤；移植相關性惡性腫瘤；轉移腫瘤，包括腦轉移、肺轉移、肝轉移、骨轉移、胸膜和心包轉移，以及癌性腹水。全文摘要本發明涉及用於調節人或動物免疫系統活性的多聚體非編碼核酸分子，並涉及其製備方法和包含所述多聚體非編碼核酸分子的疫苗。文檔編號C12N15/117GK101490257SQ200780026142公開日2009年7月22日申請日期2007年5月11日優先權日2006年5月11日發明者B·維蒂希,J·勒爾,M·施密特,M·施羅夫申請人:莫洛根股份公司