一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體的製作方法
2023-06-14 05:44:16 1
一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。該高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID№.2所示的核苷酸序列；2）與1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。本發明的RNA和編碼該RNA的RNAi載體，可用來增強植物對TuMV或草銨膦除草劑的抗性，同時也為高抗TuMV轉基因植物的培育奠定了基礎。
【專利說明】—種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物抗病毒基因工程領域，具體涉及一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。
【背景技術】
[0002]完菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)屬馬鈴薯 Y 病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。TuMV寄主範圍十分廣泛，能夠侵染43科156屬超過318種植物。TuMV是十字花科作物中危害最大的病毒病。感染病毒後的作物還容易感染霜黴病和軟腐病，造成複合侵染，直接影響到產量和商品價值。
[0003]油菜是我國最主要的油料作物。蕪菁花葉病毒病是油菜的重要病害之一。近年來，在我國油菜主產區病毒病發生有日益流行加重趨勢。據調查發病田塊發病率一般為20%-30%，重的發病率在50%以上，造成油菜籽產量的重大損失。感病油菜不僅產量降低，而且產油率和種子萌芽率也明顯降低，品質下降。此外，我國白菜因該病毒危害平均每年造成5%的產量損失，有些年份減產10%以上，病害嚴重的地塊幾乎絕收。
[0004]TuMV主要是靠蚜蟲以非持久性的方式傳播，據報導目前至少有89種蚜蟲可傳播，而採用殺蟲劑不可能很快殺死全部的蚜蟲以阻止病毒的傳播，僅靠殺蟲劑殺蚜防治病毒病的效果不明顯，還易造成環境汙染。因此尋求新的抗病方法成為了一項迫切的任務。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是 提供一種高抗蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus, TuMV)的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。
[0006]本發明提供的一種RNA,具有下述核苷酸序列之一:
[0007]I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的核苷酸序列；
[0008]2)與I)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0009]所述具有相同功能具體指具有下述任一功能:
[0010]I)增強植物對TuMV的抗性；
[0011]2)增強植物對草銨膦除草劑的抗性。
[0012]所述植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
[0013]所述TuMV 具體為 TUMV-C4 和 / 或 BJ-ROI。
[0014]所述RNA的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。
[0015]含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌也屬於本發明的保護範圍。
[0016]所述重組載體具體為重組表達載體或重組克隆載體。
[0017]所述重組表達載體為將DNA片段插入出發載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區一X反向；X正向為SEQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向為X正向的反向互補片段。
[0018]具體的，所述出發載體為pBBBast。
[0019]所述的重組表達載體中，所述X正向一連接區一X反向片段具有序列表中SEQ IDN2.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0020]本發明的另一個目的是提供所述RNA、所述RNA的編碼基因、所述含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌的如下至少一種應用:
[0021 ] I)製備抗TuMV的產品；
[0022]2)增強植物對TuMV的抗性；
[0023]3)增強植物對草銨膦除草劑的抗性。
[0024]所述應用中，所述植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
[0025]所述應用中，所述TuMV具體為TuMV_C4和/或BJ-ROI。
[0026]本發明的再一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法，是將所述的重組表達載體轉入目的植物，得到轉基因植物；所述轉基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)對TuMV的抗性增強；2)對草銨膦除草劑的抗性增強。
[0027]所述方法中，所 述TuMV具體為TuMV-C4和/或BJ-ROl。
[0028]所述方法中，所述目的植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為中間載體的酶切驗證結果，其中M為分子量標記；泳道I為pHannibal+HC-Pro-RNAi載體的酶切結果；泳道2為連入反向片段pHannibal+HC-Pro (-)載體的酶切結果；泳道3為空pHannibal載體的酶切結果。
[0030]圖2為載體pBBBTu-HC-Pro的結構示意圖。
[0031]圖3為植物表達載體pBBBTu-HC-Pro的MluI酶切檢測結果圖，其中M為分子量標記；泳道I為pBBBTu-HC-Pro載體的酶切結果。
[0032]圖4為T1代苗噴灑草銨膦除草劑後結果，存活的為除草劑抗性株。
[0033]圖5為轉基因T1代苗PCR鑑定結果圖，其中M為分子量標記；泳道I為陰性對照col-0的結果；泳道2-8為除草劑篩選出的轉基因T1代苗的結果。
[0034]圖6為不同轉基因高抗株系接種TUMV-C4後的圖片，其中col代表野生型col-0的結果。
[0035]圖7為不同轉基因高抗株系接種TUMV-C4後種子收穫時的圖片，其中col代表野生型col-0的結果。
[0036]圖8為轉基因高抗株系59接種BJ-R01後的圖片，其中col代表野生型col-0的結果。
[0037]圖9為高抗株系接種TuMV_C4後的病情指數統計結果，其中col代表野生型col_0的結果。
[0038]圖10為TuMV-C4接種擬南芥後，RT-PCR半定量檢測TuMV基因在轉基因擬南芥中的表達，其中M為分子量標記；泳道I為H2O對照組結果；泳道2-5為轉基因植株的結果；泳道6為對照Col-O的結果。
[0039]圖11為TUMV-C4接種擬南芥後，螢光定量PCR分析結果，其中col代表野生型col-0的結果。
【具體實施方式】
[0040]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0041]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0042]1、材料
[0043]本實驗所用野生型擬南芥Col-O 購自 Arabidopsis Biological ResourceCenter0
[0044]北京地區蕪菁花葉病毒TuMV主要的流行強致病株系TUMV-C4獲自中國農業科學院蔬菜花卉所；參考文獻:馮蘭香、徐玲、劉佳、鈕心格、李秀生，北京地區大白菜蕪菁花葉病毒株系的鑑定，中國蔬菜，1988，4:11-13 ;公眾可從北京農業生物技術研究中心獲得該株系O
[0045]TuMV蘿蔔強致病株系BJ-ROl為發明人從田間採集並保存。參考文獻「葉豔英、曾鋼、聞曉紅、馬榮才、吳才君、姚磊，江西農業大學學報，2012,34(2):264 — 269」。公眾可從北京農業生物技術研究中心獲得。
[0046]大腸桿菌(E scherichia coli) DH5 α菌株購自Tiangen公司，產品目錄號為CBlOl ；
[0047]農桿菌(Agrobacteriumtumefacieus) GV3101 (pMP90)，參考文獻:Koncz, C.and Schell, J.(1986)The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specificexpression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binaryvector.Mol.Gen.Genet.204, 383 - 396。公眾可從北京農業生物技術研究中心獲得。
[0048]RNAi 載體 pHannibal 公眾可從 CSIRO (http:1Iwm.csir0.au/pi)獲得；參考文獻:Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A.Construct design forefficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The PlantJournal, 2001，27(6):581-590。
[0049]高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量標記購自全式金公司。質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。M-MLV反轉錄酶、定量PCR試劑、限制性內切酶和Klenow Fragment購自TaKaRa公司。T4連接酶購自Promega公司。TRIzol提取液購自Invitrogen公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。
[0050]實施例1、RNAi載體的製備
[0051](一)HC-Pro基因保守片段的製備
[0052]提取TuMV-C4菌株的總RNA，並反轉錄為cDNA，以該cDNA為模板，以下述HC-ProF和HC-Pro R (下劃線部分為酶切位點EcoR1、XbaI和Kpnl、ClaI)為引物，用高保真酶Fastpfu DNA Polymerase 進行 PCR 擴增:
[0053]HC-Pro F 5， -cggaattctctagaGTTAGCAAGTTACAGGGTGAC_3』 ；[0054]HC-Pro R 5』 -ggggtaccatcgatGACGTGATATCCAGTTGACAGT-3'。
[0055]PCR 擴增程序:94 °C 5min ；94°C 45s, 52 °C 30s, 72 °C lmin，35 個循環；72 °C 延伸7min。
[0056]PCR產物經瓊脂糖電泳純化後回收。所得PCR產物經測序證明核酸序列正確，其核酸序列具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核酸序列，其編碼的RNA的具有序列表中SEQID N0.2所示的核酸序列。
[0057](二)RNAi載體的構建
[0058]1、中間載體 pHannibal+HC-Pro-RNAi 的製備
[0059]I)製備過程
[0060]用ClaI和XbaI分別酶切pHannibal載體和上述製備的PCR產物。酶切後經純化回收約5800bp的載體骨架片段和約450bp的PCR產物片段，4°C連接過夜。連接產物經熱擊轉化大腸桿菌DH5ci。挑取克隆，提取質粒並用XbaI和EcoRI酶切驗證，獲得含反向片段的中間載體 pHannibal+HC-Pro (-)。
[0061]用KpnI和EcoRI分別酶切上述製備的PCR產物和連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)中間載體。酶切產物經純化後回收約6200bp載體骨架片段和約470bp的PCR產物片段，4°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取克隆，提取質粒並用XbaI和EcoRI雙酶切驗證，獲得同時含反向和正向片段的中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi。
[0062]2)所構建載體的酶切驗證過程
[0063]用XbaI和EcoRI分別雙酶切pHannibal+HC-Pro-RNA1、連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)和pHannibal空載體進行驗證實驗。實驗結果見圖1。圖1結果顯示:pHannibal+HC-Pro-RNAi載體被酶切成5001bp、1723bp和6bp的片段；連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)載體被酶切成5001bp和1264bp的片段；pHannibal空載體被酶切成5001bp和823bp的片段。酶切結果表明，中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi構建正確。
[0064]2、植物表達載體pBBBTu-HC-Pro的製備
[0065]I)製備過程
[0066]pHannibal的發卡結構兩端各含有I個NotI酶切位點。把含發卡結構的中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi用NotI酶切，再用Klenow和dGTP在酶切片段的兩個粘性末端各補兩個鹼基G，產物於1%瓊脂糖凝膠電泳純化，膠回收含發卡結構的3870bp的片段備用。經測序，所述含發卡結構的片段具有序列表中SEQ ID N2.3所述的核酸序列。所述發卡結構具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0067]植物表達雙元載體pBBBast可為將具有序列表中SEQ ID Na.4所示核酸序列的雙鏈DNA分子插入載體pBBRlMCS-2的SspI酶切位點，取代質粒pBBRlMCS_2的SspI酶切位點之間的小片段得到的重組質粒。
[0068]質粒pBBRlMCS-2公眾可以從北京農業生物技術研究中心獲得；參考文獻=KovachME, Elzer PHj Hill DS，Robertson GTj Farris MAj Roop RM 2nd，Peterson KM.Four newderivatives of the broad—host—range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995 Dec I;166(I):175-6。
[0069]用XmaI酶切植物表達雙元載體pBBBast，再用Klenow在兩個粘性末端各補兩個鹼基C，產物於1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收載體片段6559bp，再與上述製備的含發卡結構的3870bp片段連接，即得植物表達RNAi質粒pBBBTu-HC-Pro，其結構示意圖見圖2。
[0070]2)所構建載體的酶切驗證過程
[0071 ] 將上述製備的植物表達載體pBBBTu-HC-Pro進行MluI酶切檢測。pBBBast載體本身有一個MluI酶切位點，連接上述含發卡結構的片段的CaMV啟動子上另有一個MluI酶切位點，酶切後顯示2條帶的為陽性克隆。因是單酶切位點插入，根據酶切條帶大小可判斷插入是順時針正向連接或逆時針反向連接。正向連接酶切條帶為3935bp和6494bp，反向連接條帶為542bp和9889bp條帶。MluI酶切檢測結果見圖3。圖3結果表明針對HC-Pro基因保守片段的RNAi結構已經連入植物表達雙元載體pBBBast的XmaI酶切位點中，並且為正向連接。
[0072]實施例2、高抗TuMV的RNA及編碼該RNA的RNAi載體的功能驗證
[0073](—)擬南芥的遺傳轉化及陽性苗的篩選
[0074]利用電擊法將pBBBTu-HC-Pro載體轉入農桿菌GV3101 (pMP90)中，採用農桿菌介導的花序浸潰法侵染擬南芥。將收穫的擬南芥Ttl代種子播種於盛有營養土的培養託盤中，置於22°C (晝)/18V (夜)，光照周期為16h (光)/8h (暗)的人工氣候室。待幼苗長出兩片子葉後噴灑用水按體積數稀釋500倍的草銨膦除草劑(所述草銨膦除草劑為市場購買的商品化的除草劑，其中草銨膦濃度為200mg/L)，篩選陽性苗。
[0075]經噴灑2-3次草銨膦除草劑篩選後，共獲得60株除草劑抗性植株，篩選的部分抗性株見圖4。將能夠繼續生長且長勢良好的植株用小量快速法提取植物基因組DNA。用引物 HC-Pro F 和 HC-Pro R 進行 PCR 擴增檢測。反應條件為:94°C 5min ；94°C 45s, 52°C 30s,72°C 30s，35個循環；7 2°C 7min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，擴增出目的基因片段481bp的為轉基因陽性苗，共有26株為陽性苗。部分幼苗的PCR鑑定結果見圖5。
[0076]選取鑑定為陽性苗的轉基因T1代苗自交留種，T2幼苗噴灑用水按體積數稀釋500倍草銨膦除草劑(所述草銨膦除草劑為市場購買的商品化的除草劑，其中草銨膦濃度為200mg/L)後統計存活率。有13個株系符合3:1分離比，初步確定為單拷貝植株，並單株自交留種。後代繼續篩選至不分離株系即為純合株系。
[0077](二)轉基因植株的抗病鑑定
[0078]將13個單拷貝的純合株系的T3代幼苗、野生型Col-O和轉空載體擬南芥同時進行抗病接種鑑定。將T3代幼苗與野生型Col-O播種，待幼苗長至8-10片蓮座葉時期摩擦接種TuMV的TuMV-C4或BJ-ROl株系。接種液按病葉重/磷酸緩衝液體積(pH=7.0)約lg/10mL比例配製。每個株系接種12-16株，每株接種兩片較大葉片。以非轉基因野生型擬南芥Col-O和轉空載體擬南芥作為對照接種。接種幾分鐘後立即用清水衝洗葉片。在人工氣候室中網罩隔離觀察，約20天後進行抗病鑑定及病情指數統計。病情等級劃分:0級完全無症狀；1級1-2片未接種葉花葉或發黃，能抽薹；3級3-4片未接種葉花葉或發黃能抽薹；5級5-6片未接種葉花葉或發黃,影響抽薹；7級多數葉片花葉或發黃,不能抽薹；9級大部分葉片枯死，植株瀕臨死亡。
[0079]病情指數=100 X Σ (各級病株數X各級代表值)/ (調查總株數X最高級代表值)
[0080]抗病接種結果見圖6、7、8，鑑定結果見圖9。圖6結果顯示，接種TuMV-C4後20天左右，對照野生型Col-O已基本枯萎死亡,轉空載體對照結果與Col-O基本一致,而轉基因株系表現出不同的抗性，其中4個株系(12#，14#, 50#, 59#,)表現出較好的長勢。高抗株系除部分葉片發黃外，整株生長健壯，且能正常抽苔結實，表現出對TuMV-C4的高度抗性。圖7結果顯示，到種子收穫時期接種TUMV-C4的高抗轉基因株系可以正常結籽；而對照Col-O的植株已經全部死亡，無種子可收穫。圖9結果顯示，接種TUMV-C4後，病情指數統計顯示高抗株系的抗病性比對照提高約80%，轉空載體對照結果與Col-O基本一致。
[0081]高抗轉基因株系59#接種BJ-ROl後，圖8結果顯示，對照野生型Col-O發病顯症，而高抗轉基因株系59#表現出較好的長勢，其對BJ-ROl同樣具有高度的抗性。說明本發明對TuMV不同株系的抗性具有一定的廣譜性。
[0082]高抗轉基因株系留種，後代繼續進行抗病鑑定。結果顯示這些轉基因株系對TuMV的高抗性可以穩定遺傳。
[0083](三)半定量和相對定量檢測病毒的累積
[0084]4個高抗株系12# ，14#, 50#, 59#接種TuMV_C4後約15天，選取各株系未接種葉片分別提取總RNA，用M-MLV反轉成cDNA。分別以TuMV-CP的196bp片段為檢測對象，以擬南芥SAND基因(AT2G28390)的298bp片段為內參進行半定量和螢光定量分析。
[0085]擴增TuMV-CP基因的196bp保守區段的引物序列如下所示:
[0086]CP F 5，-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3，；
[0087]CPR 5， -TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3』 。
[0088]擴增內參基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示，上遊引物跨過內含子(一條下劃線是外顯子a，兩條下劃線是外顯子b)，以避免因基因組DNA汙染所造成的影響:
[0089]SAND F 5，- MGGCAGGAMTCACCAGGTTGTC -3:
[0090]SANDR 5』-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3』 。
[0091]RT-PCR 反應程序:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，30 個循環；72°C 7min。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
[0092]螢光定量PCR的反應以稀釋40倍的cDNA為模板，SYBR-green I做螢光指示劑，反應程序採用兩步法擴增。擴增條件為:95°C 30s ；95°C 5s, 57°C 30s, 72°C 30s，40個循環。每個株系樣品進行3次重複，取平均值。
[0093]半定量RT-PCR檢測結果見圖10。圖10結果顯示，在內參基因表達量差不多一致的情況下，對照Col-O植株體內能檢測到大量的病毒累積，轉空載體對照結果與Col-O基本一致，而在高抗轉基因株系體內只能檢測到微量的病毒。
[0094]螢光定量PCR的檢測結果見圖11。圖11結果顯示，與半定量的結果一致，在對照Col-O體內檢測到大量的病毒，轉空載體對照結果與Col-O基本一致，而4個高抗株系植物體內幾乎檢測不到病毒的複製。說明構建的RNAi載體在抗病毒中發揮了作用，轉基因植株的抗病性顯著提高。
【權利要求】
1.一種RNA,具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的核苷酸序列； 2)與I)限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
2.權利要求1所述的RNA的編碼基因。
3.含有權利要求2所述的編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌；所述重組載體具體為重組表達載體或重組克隆載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於:所述重組表達載體為將DNA片段插入出發載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區一X反向；X正向為SEQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向為X正向的反向互補片段。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於:所述X正向一連接區一X反向片段具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
6.權利要求1所述的RNA、權利要求2所述的編碼基因、權利要求3-5任一所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌的如下至少一種應用: O製備抗TuMV的產品； 2)增強植物對TuMV的抗性； 3)增強植物對草銨膦除草劑的抗性`。
7.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求4或5所述的重組表達載體轉入目的植物，得到轉基因植物；所述轉基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)對TuMV的抗性增強；2)對草銨膦除草劑的抗性增強。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述目的植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
【文檔編號】C12N15/63GK103451197SQ201310397713
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】姚磊, 葉豔英, 曾鋼, 曹鳴慶, 馬榮才 申請人:北京農業生物技術研究中心