包含支架,佐劑和抗原的異源多聚體化合物及其用途的製作方法

2023-06-14 10:29:11

專利名稱：包含支架,佐劑和抗原的異源多聚體化合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及大分子聚集體(macromolecular assembly)諸如融合蛋白等，其包括佐劑和抗原，所述聚集體與單獨的抗原相比可激發針對該抗原的增強的免疫反應。
背景技術：
佐劑增強對抗原的免疫反應，並由此可用於疫苗中。然而，僅許可有限數量的佐劑用於人體，由於從動物研究中得知了更強的佐劑，明顯地需要可安全用於人的更強的免疫佐劑。最近的綜述見「Advances in vaccineadjuvants」(nature Biotechnology，1999，第17卷，1075-1081頁)。任何可廣泛應用於人的佐劑的重要特徵是所述佐劑應非常安全，這一點在將它用於大量健康人的常規疾病預防時尤其重要。
補體系統由一系列血清蛋白組成，所述血清蛋白在免疫系統對外來抗原的應答中很重要。補體系統的初始組分(primary component)被切割時該系統被活化，且所得產物單獨或與其它蛋白一起可活化其它補體蛋白，從而導致蛋白水解級聯反應。所述補體系統的活化導致各種應答，包括血管通透性增加，對吞噬細胞的趨化作用，炎性細胞的活化，對外來顆粒的調理作用，直接殺死細胞以及組織損傷。
補體系統的活化可通過抗原-抗體複合物(經典途徑)激發，或者正常的慢速活化可在諸如細菌或病毒等的入侵微生物的細胞壁存在的條件下擴大(旁路途徑)。補體系統與細胞免疫系統通過涉及C3的具體途徑而發生相互作用，所述C3為經典和旁路途徑中的重要蛋白。C3的蛋白水解活化產生了大的片段(C3b)，並暴露了具有化學反應性的內部硫羥酸酯鍵，其可以與諸如入侵微生物或外源細胞的細胞表面蛋白等外部親核物質共價結合。結果，所述潛在的抗原由C3b「標記」，並在C3b經過進一步蛋白水解變為iC3b和C3d，g的過程中保持與其相結合。後兩種片段分別是補體受體CR3和CR2的配體；(CR2也稱為CD21)。因此，C3b對抗原進行標記可導致對攜帶這些受體的免疫系統細胞的靶向機制。
這種靶向對於放大免疫應答的重要性首先通過實驗顯示，所述實驗中，消耗小鼠的循環C3並隨後用抗原(綿羊紅細胞)進行攻擊。去除C3可減輕抗體對該抗原的應答(M.B.Pepys，J.Exp.Med.，140,126-145，1974)。C3的作用通過動物研究證實，所述動物的C3或可產生C3b的補體級聯反應上遊組分(即C2和C4)是遺傳缺陷的(J.M.Ahearn and D.T.Fearon，Adv.Immunol.，46，183-219，1989)。最近發現，與未修飾的抗原對照相比，模型抗原與兩個以上拷貝的小鼠C3d片段序列的線性結合導致的小鼠體內抗體應答大大增強(1000-10000-倍)(P.W.Dempsey等，Science，271,348-350，1996；W096/17625，PCT/GB95/02851)。所述增強可不使用傳統佐劑諸如Freud’s完全佐劑等而產生，所述佐劑對用於人體而言毒性太大。這一顯著效應的機制被證實是多價C3d構建體與B細胞上的CR2的高親和力結合，然後CR2與另一B細胞膜蛋白CD19以及膜結合的免疫球蛋白共-連接(co-ligation)，以對B細胞的細胞核發出信號。
然而，證明難以產生大量含有三個拷貝的C3d的同源重組蛋白。主要的問題是i)含有(三個)重複序列的構建體的遺傳不穩定性和ii) 重組蛋白的摺疊(或溶解和重摺疊)，所述重組蛋白來自大腸桿菌中形成的包涵體。
最小化含有C3d基因重複拷貝的構建體的遺傳不穩定性的一種方法描述於W099/35260和W001/77324中。這些應用中所述的技術是利用編碼C3d重複的DNA的非-同一性序列。
WO00/69907和WO00/69886(所述文獻的內容包含在本文中作為參考)描述了能夠組裝成多聚體形式的多肽單體。所述單體來自伴侶分子蛋白，具體是GroES或Cpn10家族的成員。
利用補體4結合蛋白(C4bp)的多聚化系統描述於WO 91/11461中。人C4b-結合蛋白(C4BP)是高分子量(570kDa)的血漿糖蛋白，其具有蜘蛛樣結構(spider like structure)，所述結構由7條相同的α鏈和單個β鏈組成。所述C4bpα鏈具有負責將該分子組裝成多聚體的C-末端核心區。根據標準模型，一個C4bp單體+498位的半胱氨酸與另一單體+510位的半胱氨酸形成二硫鍵。在人血漿中還發現了只包含7個α鏈的較小形式(minor form)。這種血漿糖蛋白的天然功能是抑制補體活化的經典途徑。
WO91/11461提出C4bp蛋白的多聚化能力可以用來製備包含全部或部分C4bp和目的(interested)生物蛋白的融合蛋白。這個融合蛋白將形成多聚體，該多聚體為目的蛋白提供平臺，其中所述蛋白有更長的血漿半衰期並且對其靶的親和力(affinity)或親合力(avidity)更強。在WO91/11461中，C4bp融合蛋白成為治療性產品的新的遞送和載體系統的焦點。
C4bp的大多數α鏈由8個長度約為60個胺基酸的結構域串聯排列組成，該結構稱為補體控制蛋白(complement control protein)(CCP)重複。WO91/11461中描述的融合蛋白中，優選包含一個或多個這樣的結構域。但是現已證實，所有的CCP都能缺失(只留下C-末端的57個胺基酸)，而不會抑制多聚化(Libyh M.T.等，(1997)Blood 90，3978)。C4bp的這個C-末端區域稱為C4bp核心。
Libyh等(1997)描述了基於C4bpα鏈C-末端部分的蛋白多聚化系統。C4bp的C-末端部分缺乏生物功能，但是它負責使產生C4bp的CHO細胞胞漿中的C4bp發生多聚化。Libyh等能夠用C4bp片段誘導相關抗體片段的自發多聚化，從而產生ScFv片段的同源多聚體。所用C4bp的C-末端部分被置於ScFv序列的C-末端，可選由MYC標記隔開(space)。
C4bp的用途還描述於Oudin等(2000，Journal of Immunology，164，1505)和Christiansen等(2000，Journal of Virology，74，4672)中。自我裝配型多聚體可溶性CD4-C4bp融合蛋白在Shinya等(1999，Biomed Pharmacother，53，471)中也已經得到了證實，所述融合蛋白可在人293細胞系中表達。
發明概述本發明提供了包含以下組分的產物第一組分，其為支架；第二組分，其為佐劑，優選是多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞、T細胞、濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；知第三組分，其為抗原。
第一組分提供了多拷貝的第二組分在多組分產物中的聚集，使得所述多拷貝的第二組分與一或多個拷貝的抗原結合。
在優選的方面，本發明提供了第一組分，其為多肽支架；
第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞、T細胞、濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為抗原。
所述第一和第二組分可以是融合蛋白。當第三組分為多肽時，所述三組分作為融合蛋白存在。可選，所述第三組分與前兩種組分的融合物共價連接。
一些情況下，當第一組分本身就是抗原時，所述第一和第三組分可以是同樣的分子。
為了避免有疑問，「第一」，「第二」和「第三」組分的命名不表示或表明所述三種組分在產物中的具體線性順序。所述三種組分可以以任何次序互相連接。
因此，當所有三種組分是多肽並且所述產物是融合蛋白時，這三種組分的N-到C-末端的順序可以是任何排列方式。此外，如下所述，一些情況下，所述第一組分可包括環區，所述環區可以由第二和第三組分之一取代。
本發明的產物提供了免疫刺激性第二組分，所述第二組分用於形成多組分產物，並可利用重組DNA技術進行表達而無需利用具有串聯重複序列的DNA序列。
本發明還提供了編碼所述第一和第二組分的融合蛋白的核酸，且當第三組分為多肽時，所述核酸編碼所有三種組分。本發明還提供了包含所述核酸的載體以及攜帶所述載體的宿主細胞。
另一實施方案中，本發明提供了製備產物的方法，其中所述產物包含第一組分，其為多肽支架；第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞、T細胞、濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為多肽抗原，所述方法包括表達編碼三種組分的融合蛋白的核酸，以及回收所述產物。
另一實施方案中，本發明提供了製備產物的方法，其中所述產物包含第一組分，其為多肽支架；第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞、T細胞、濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為非-多肽抗原，所述方法包括表達編碼第一和第二組分的融合蛋白的核酸，將所述融合蛋白與第三組分連接，以及回收所述產物。
製備所述產物的方法可以在真核或原核細胞中進行。
本發明還提供了誘導針對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括將有效量的本發明的產物給藥受體。
本發明還提供了本發明的產物在人或動物體的治療方法，尤其是誘導免疫應答的方法中的用途。
本發明還提供了藥物組合物，其包含本發明的產物和可藥用的載體或稀釋劑。


圖1顯示了C4bp核心蛋白的比對。
圖2顯示了表位-C3d-C4bp融合蛋白及C3d7(1)與CR2(已知為CD21)的結合相對於單體C3d和線性三聚體C3d即C3d3的比較。
圖3圖示了CR2結合實驗的模式。
圖4顯示了C3d7(1)與CR2(CD21)的結合相對於單體C3d和線性三聚體C3d即C3d3的比較。
圖5顯示了C3d7(1)，(2)和(3)與CR2(CD21)的結合相對於單體C3d和線性三聚體C3d即C3d3的比較。
圖6顯示了C3d7(1)，C3d7(2)和C3d7(3)與Raji和Jurkat細胞結合的流式細胞分析。

發明內容
支架支架指任何大分子聚集體，其能夠作為連接第二和第三組分的支架。所述支架可以是蛋白、其它聚合分子(例如由糖組成)、原核或真核細胞壁、或者病毒。所述細胞壁或病毒或蛋白可以是不完整的，即缺乏通常存在於其所在生物體中的組分；本發明的重要特徵是所述支架能夠使一個以上的佐劑分子以及一個以上的抗原包含在單個聚集體中。
如本文具體描述的，涉及兩種主要類型的支架。第一種是複合大分子產物，包括病毒或細胞，其上附著了多拷貝的第二組分，並在有利情況下還可附著第三組分，所述第二和第三組分可以是分離的或者是融合物。可選，所述支架與第二組分的比例為1∶1。當所述產物為融合蛋白時，第三組分與第二和第一組分的比例也為1∶1∶1。
細胞壁或病毒支架在本領域已知用於其它目的。已經描述了蛋白的表面展示，所述展示可以在原核細胞壁((Samuelson等，2002，J.Biotechnol96，129-154；Lang H.，2001，Nat.Biotechnol.，19，75-78)或真核細胞壁(Shusta E.V.等，1999，J.Mol.Biol.292,949-956)或病毒諸如細菌噬菌體(Sidhu S.S.，2001，Biomol.Eng.，18，57-63)上。本發明該方面的不同特徵是細胞壁上展示的對象包括與抗原同時存在的一個以上拷貝的佐劑分子。所述抗原可直接與佐劑(諸如C3d等)融合，但無需這樣。
因此在一個實施方案中，諸如細菌等細胞的表面，可作為支架。當所述佐劑與通常在該細菌表面表達的第二組分發生基因融合時，該佐劑的多個拷貝可展示在該細菌的表面。當所述細菌感染宿主時，上述結構可激發抗該細菌的、增強的免疫應答。所述抗原可以是細菌的細胞壁，或者分開但同時在該細菌表面表達的抗原。所述感染可以通過將修飾的細菌給藥宿主而有目的地產生。所述細菌可在被殺死之後給藥，或者以減毒活細菌的方式給藥。
類似地，真核細胞也可用作所述支架。在這種情況下，展示所述佐劑的一個以上拷貝的細胞表面可用來激發對其它(正常或異常)細胞表面組分的免疫應答。
與W096/17625(PCT/GB95/02851)中所述的融合蛋白相反，在所述抗原和佐劑之間可根本無需共價連接，或者所述共價連接可以僅僅是間接的，可由支架介導。此外，W096/17625教導了單拷貝的C3d蛋白與抗原的融合降低了對該抗原的免疫應答。在本發明中，通過直接比較，所述佐劑的多個單(單體)拷貝的展示，或者單拷貝的所述抗原與單拷貝佐劑的融合(其中所述佐劑隨後與支架融合)，均導致對所述抗原的免疫應答增強。
所述抗原可以是細胞壁本身或第二蛋白或糖蛋白。如果生物體的被膜(capsule)是保護性抗原(如肺炎球菌)，展示一個以上拷貝的佐劑將增強對所述被膜抗原的免疫應答。
對於病毒，所述抗原可以是病毒本身，因此病毒可同時作為抗原和支架。所述病毒的實例為B肝病毒表面抗原。製備重組HBsAg疫苗的方法在美國專利4,769,238中描述。儘管重組HBsAg是非常成功的疫苗，仍存在大量「反應較差的(poor responder)」疫苗受體。將新的佐劑加入已有的疫苗使得對這種反應較差的受體的接種以及對長期攜帶病毒者的感染後接種成為可能。一種將佐劑加入該疫苗的方法是對佐劑蛋白(諸如並優選人C3d蛋白)的編碼序列與編碼226個胺基酸殘基的蛋白(即B肝病毒S蛋白)的基因的C末端進行基因融合。可在框內(in-frame)將佐劑的編碼序列和上述美國專利4,769,238所述質粒中的S蛋白編碼序列相連接，所述佐劑的編碼序列最好具有在酵母中優選以高水平表達的密碼子。所述S蛋白的序列可被修飾成包含已知為「逃跑突變體(escape mutants)」的變體序列(Cooreman M.P.等，2001，J.Biomed.Sci.8,237-247)，或者包含通常不存在於B肝病毒疫苗中的抗原(Fomsgaard A.等1998，Scand.J.Immunol.，47,289-295)。如本文所述，含有C3d佐劑的修飾的疫苗可作為DNA給藥以便獲得免疫應答。
因此，在另一實施方案中，所述多肽支架本身可以是抗原。因此，B肝病毒的表面抗原(其組裝成寡聚物結構)可同時是本發明的第一和第三組分。如1956年首次提到的(FHC Crick，JD Watson，Nature，177,473)，病毒的有限核酸含量嚴重限制了病毒所編碼胺基酸的數目。結果，所述蛋白外殼不能由大量不同蛋白分子構建。反之，所述病毒外殼必須由以規則方式排列的許多相同的小亞基構建。因此，大多數病毒能夠同時作為本發明的第一和第三組分。
多肽支架為蛋白或其一部分，其功能為確定所述蛋白本身或者一組相關蛋白或其它分子的結構。因此，多肽支架在聚集時具有確定的三維結構，並且具有在所述結構內或所述結構上支持分子或多肽的能力。有利地，支架可呈現各種可行的幾何結構，所述幾何結構與所述支架的三維結構和/或所述多肽的插入位點有關。
另一實施方案中，所述支架可以作為佐劑，即第一和第二組分是相同的。作為佐劑的支架是C4bp核心蛋白或者C4bpα鏈的片段，其將在下文詳述。
一個實施方案中，所述支架是cochaperonin Cpn10/HsplO支架。Cpn10是Cpn60/Cpn10chaperonin系統的普遍組分。Cpn10的實例包括人線粒體Cpn10，細菌GroES和噬菌體T4Gp31。Cpn10家族的其它成員是本領域技術人員已知的。
本發明還包含天然存在的支架的衍生物的用途。支架(包括Cpn10和Cpn60家族的支架)的衍生物包括其含有胺基酸缺失，添加或取代(尤其是取代Gp31中的Cys殘基)的突變體，Cpn10或Cpn60家族不同成員融合形成的雜合子和/或環形的、完全突變的蛋白支架，所述衍生物保持本文所述的「寡聚化」性質。
多肽支架聚集形成多聚體產物。本發明中，所述多聚體產物可以是任何形狀，並可包含任何數量的單獨支架亞基。
優選，所述多聚體產物包含2-20個支架單位，有利地為5-15個單位，並理想為約10個單位。Cpn10家族成員的支架包含7個蛋白單位，其形狀為七元環或環帶(annulus)。因此有利地，所述多聚體產物是七元環。
已知Cpn10亞基的結構內具有「可動環(mobile loop)」。所述可動環位於大腸桿菌GroES序列的胺基酸15和34之間，優選位於胺基酸16-33之間，以及Cpn10家族其它成員的等同位置上。T4Gp31的可動環位於殘基22-45之間，有利地位於殘基23-44之間。第二或第三組分的多肽序列可通過置換Cpn10家族多肽的可動環的全部或部分而被插入。
當所述多肽支架是Cpn10家族多肽時，第二或第三組分多肽還可摻入其N或C末端(所述末端可以是天然的或者修飾的N或C末端)，或者摻入等同於Cpn10家族肽的頂端(roof)β髮夾結構的位置。該位置位於噬菌體T4Gp31的位置54和67之間，有利地為位置55-66之間，並有選為位置59-61之間，或者位於大腸桿菌GroES的位置43-63之間，優選位於位置44-62之間，有利地位於位置56-57之間。
另一實施方案中，所述多肽支架可以是C4bp蛋白或其保持C4bp核心蛋白區的部分。
人C4結合蛋白(hC4bp)是具有多種有吸引力的性質的分子，其為生物活性分子的遞送載體。人C4bp參與人補體系統-一組免疫系統蛋白，其功能包括溶解入侵的細胞，活化吞噬細胞和促進外來物質從該系統的清除。人C4bp調節該系統中蛋白尤其是C4蛋白的活性。結構上，hC4bp是柔性、通過二硫鍵結合的分子，預期其具有長血清半壽期，以及使生物活性分子靶向淋巴結的能力。hC4bp的血清形式的分子量為約590 kD。在還原性SDS凝膠上，hC4bp在約70kD產生強的條帶，指示二硫鍵結合的多聚體蛋白。
編碼C4bp單體的cDNA已經被克隆並表徵[L.P.Chung等，(1985)″Molecular Cloning and Characterization of thecDNA Coding for C4b-BingdingProtein of the Classical Pathway ofthe human ComplementSystem″，Biochem.J.，230，133-141]。Chung等稱hC4bp為549個胺基酸的多肽。從該DNA序列預測的多肽具有的分子量為約61.5kD，而不是在還原性SDS凝膠上實際測定的分子量即70kD。分子量的差異是由於所述多肽血清形式的糖基化。從Chung等所述序列的N末端起的前491個胺基酸可分為8個結構域，所述結構域稱為短共有序列重複區(SCR)，每個SeR都含有約60個胺基酸。這些區按從N末端到C末端的順序命名為SCR8-SCRl。所述SCR結構域可如下限定SCR8-+1到+61；SCR7-+62到+123；SCR6-+124到+187；SCR5-+188到+247；SCR4-+248到+313；SCR3-+314到+374；SCR2-+375到+432；SCR1-+433到+491。
這些結構域具有很高的序列同源性，每個結構域都含有4個位置相似的半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸殘基形成規則模式的結構域內(intra-domain)二硫鍵[J.Janatova等，(1989)″Disulfide Bonds Are Localized Within the ShortConsensus Repeat Units of Complement Regulatory ProteinsC4b-BindingProtein″，Biochemistry，28，4754-4761]。在每個SCR結構域中，第一個半胱氨酸殘基與第三個半胱氨酸殘基結合，第二個半胱氨酸殘基與第四個半胱氨酸殘基結合，形成雙環胺基酸序列。因此，SCR的連接就好像線上的珠(beadson a string)。這種模式的結構域內二硫鍵結合負責所述C4bp單體的構象可變性。除了所述8個SCR結構域以外，hC4bp在C末端還具有57個胺基酸即C4bp核心，其與所述蛋白的其它區沒有同源性。該區負責將所述分子組裝成多聚體。
因此，所述多肽支架可以是C4bp核心，並且可選地，一或多個SCR與所述核心融合。
在具體優選的實施方案中，所述多肽支架是C4bpα鏈的核心蛋白。
多肽支架還可包含N或C末端延伸，諸如柔性接頭例如(Glym-Ser)n(其中m和n-為1-4)。這些在本領域中可用於使蛋白結構域(尤其是抗體V結構域)相互連接。因此，所述第一組分可通過所述接頭與第二和/或第三組分相連。
優選當C4bpα鏈的核心蛋白是支架的時候，第一組分在所述產物的C末端。
C4bpα鏈的核心蛋白C4bpα鏈的核心蛋白在本文稱為「C4bp核心蛋白」或「核心蛋白」，或「C4bp支架」。這些術語可互換使用。該蛋白可以是哺乳動物C4bp核心蛋白或者其能形成多聚體的片段，或其能形成多聚體的合成變體。
多種哺乳動物C4bp蛋白的序列是本領域可得的，其包括人C4bp核心蛋白(SEQ ID NO1)。人C4bp核心蛋白的同源物是本領域可得的。共有兩種同源物直向同源物(orthologues)和共生同源物(paralogues)。直向同源物被定義為不同生物體中的同源基因，即所述基因與產生它們的物種形成事件(speciation event)有共同祖先。共生同源物被定義為源自基因、染色體或基因組複製品的相同生物體中的同源基因，即從最近的一次物種形成事件起出現的基因的共同祖先。
例如一項關於Genbank的搜索表明物種中的哺乳動物C4bp核心同源蛋白包括兔，大鼠，小鼠和牛來源(分別為SEQ ID NO2-5)。平行同源物已在豬(ApoR)，豚鼠(AM67)，和小鼠(ZP3)中鑑定，分別顯示為SEQ ID NO6-8。
SEQ ID No1-8的比對如圖1所示。可以看出儘管在C-末端有很大程度的變異，但所有的8個序列還是有高度的相似性。還可使用通常可得的搜索程序如BLAST，通過搜索DNA或蛋白序列的資料庫，鑑定C4bp核心蛋白。
當所需哺乳動物來源的C4bp蛋白在資料庫中不能獲得時，則該蛋白可以通過本領域已建立的常規克隆方法獲得。本質上，這種技術包括使用編碼可得的C4bp核心蛋白之一的核酸作為探針，來回收並確定來自其它目的物種的C4bp核心蛋白序列。大量的技術都可用於該目的，比如PCR擴增和採用適當的mRNA源(例如由胚胎，或活躍分裂的分化的細胞或腫瘤細胞)克隆所述基因，或者通過包括如下步驟的方法從哺乳動物獲得cDNA文庫，例如來自上述來源之一的cDNA文庫，在中到高嚴謹度條件下(如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約50-約60℃)用已知的C4bp核酸檢測所述的文庫，以及回收編碼全部或部分該哺乳動物C4bp蛋白的cDNA。如果獲得部分cDNA，那麼可通過引物延長技術測定編碼序列的全長。
能形成多聚體的C4bp核心蛋白的片段包括至少47個胺基酸，優選至少50個胺基酸。所述片段形成多聚體的能力的檢測可以通過如下方法進行在本發明原核宿主細胞中表達該片段，在導致共57個胺基酸的C4bp核心發生多聚化的條件下回收所述C4bp片段，以及確定該片段是否也形成多聚體。可取地，C4bp核心片段包含SEQ ID NO1的至少6-52位殘基，或其同源物的相應殘基。
人SEQ ID NO1的C4bp核心蛋白對應全長C4bp蛋白序列的胺基酸+493至+549。本領域中已知形成多聚體的片段相當於C4bp核心蛋白的胺基酸+498至+549。
也可用C4bp核心的變體和能形成多聚體片段，所述變體保留形成多聚體的能力(可如上文對所述片段的描述那樣來確定)。所述變體與野生型哺乳動物C4bp核心或其多聚體形成片段優選具有至少70％，更優選至少80％，甚至更優選至少90％，如至少95％或最優選至少98％的序列同一性。一方面，C4bp核心包含出現在SEQ ID No1-3和5-8的位置6和18的兩個半胱氨酸殘基。可取地，該變體能保留這2個殘基間的部分(relative spacing)。
上述具體程度的同一性是與SEQ ID No1-8之一或其複合物形成片段的同一性。
最優選上述具體程度的同一性是與SEQ ID NO1或其多聚體形成片段的同一性。
序列同一性程度由GAP算法決定，該算法是在本領域廣泛應用的「Wisconsin包(package)」的一部分，由Accelrys(formerly Genetics ComputerGroup，Madison，WI)提供。GAP使用Needleman和Wunsch算法對2個完整的序列進行比對，以使匹配的數量最大而缺口的數量最小。GAP可用於比對長度相似的密切相關的短序列，因此適合用來確定序列是否符合上述同一性水平。GAP可以使用默認參數。
哺乳動物C4bp核心蛋白的合成變體包括在C或N-末端有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的變體。其中取代是具體所考慮的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括下表所列出的取代，其中第二欄同一區的胺基酸和第3欄完全同一行的胺基酸可以互相取代。

可以製備並檢測其形成多聚體的能力的C4bp核心蛋白的片段和變體的例子，包括SEQ ID No9至16，如下表1所示

A＝SEQ ID NO；B＝序列，C＝％同一性，參照同樣長度的SEQ ID NO1片段計算。
除了N或C-末端平截外，在序列中進行缺失時，所述缺失優選被限定為不多於1、2或3個相鄰或不相鄰的缺失。
對核心蛋白序列進行插入或N-末端或C-末端延長時，所述延長可取地限定在一定數目以內，以使得核心蛋白的大小超過野生序列的長度不多於20，優選不多於15，最優選不多於10個胺基酸。因此，對於SEQ ID NO1，通過插入或延長來進行修飾的核心蛋白的長度可取地不超過77個胺基酸。
第二組分本發明的產物將包含如上述與第二組分直接或間接相連的支架，以及第三組分。
所述第二組分可以是CD21或CD19的配體，如US-A-6,238,670，和W099/35260所述，所述文獻的內容包含在本文中作為參考。所述第二組分也可以是B細胞或T細胞或濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體。
優選，所述第二組分是C3d，尤其是人C3d。
小鼠C3d的核苷酸和預測的胺基酸序列公開於Domdey等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797619-7623和Fey等(1983)Ann.N.Y.Acad.Sci.421307-312)。人C3d的核苷酸和預測的胺基酸序列公開於de Bruijn和Fey(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82708-712。編碼其它物種的C3d的核酸可利用人和小鼠序列的信息進行分離，從而製備一或多種用於標準雜交技術的探針。當C3d用於本發明並給藥受體時，C3d可以和待免疫的物種相配(例如，小鼠C3d用於小鼠，人C3d用於人等諸如此類)。此外，所選密碼子可根據待免疫的物種而優化，例如使用在哺乳動物宿主中有效翻譯的密碼子。
當第二組分通過肽接頭與第一和/或第三組分相連時，所述接頭可以為上述柔性接頭。
在優選的實施方案中，當所述支架是C4bp核心蛋白時，所述第二組分位於第一組分的N末端，且位於所述抗原(當該抗原是多肽時)的C末端。當所述抗原不是多肽時，其可以和第一或第二組分共價連接。
抗原抗原可以是任何有預防疾病的價值的產物；它們可以用於預防接種。本發明允許由核苷酸序列快速進展為產生附著於佐劑的多價形式的重組抗原。
細菌免疫原，寄生蟲免疫原，和病毒免疫原可用作多肽部分以產生多聚或異源-多聚C4bp融合蛋白，所述融合蛋白可用作疫苗。
這些免疫原的細菌來源包括那些導致細菌性肺炎，肺囊性肺炎(pneumocystis pneumonia)，腦膜炎，霍亂、破傷風，肺結核和麻風病的細菌。
寄生蟲來源包括瘧疾寄生蟲，如瘧原蟲(plasmodium)。
病毒來源包括痘病毒(poxviruses)，如牛痘病毒和orf病毒(orf virus)；皰疹病毒(herpes viruses)，如1和2型單純皰疹病毒，B-病毒，天花病毒(varicellazoster viruses)，巨細胞病毒和EB病毒；腺病毒(adenoviruses)，如哺乳動物腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovaviruses)，如乳頭瘤病毒如HPV-16，以及多瘤病毒(polyomaviruses)，如BK和JC病毒；細小病毒(parvoviruses)，如腺伴隨病毒；呼腸病毒(reoviruses)，如呼腸病毒1、2，和3；環狀病毒(orbiviruses)，如科羅拉多壁蝨熱病毒(Colorado tick fever)；輪狀病毒(rotaviruses)，如人輪狀病毒；甲病毒屬(alphavirases)，如東方腦炎病毒(Eastern encephalitis virus)和委內瑞拉腦炎病毒(Venezuelanencephalitisvirus)；風疹病毒(rubiviruses)，如風疹病毒(rubella)；黃病毒(flaviviruses)，如黃熱病病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，蜱傳腦炎病毒(Tiek-borne encephalitis)和C肝病毒；冠狀病毒(coronaviruses)如人冠狀病毒；副粘病毒(paramyxoviruses)，如副流感病毒1、2、3和4以及腮腺炎病毒；麻疹病毒(morbilliviruses)，如麻疹病毒(measles virus)；肺病毒(pneumovirus)，如呼吸道合胞病毒；水泡病毒(vesiculovirus)，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssaviruses)，如狂犬病毒；正粘病毒(orthomyxoviruses)，如流感病毒A和B；布尼亞病毒(bunyaviruses)，如LaCrosse病毒；白蛉熱病毒(phlebovirus)，如立夫特谷熱病毒(Rift valley fever virus)；內羅病毒(nairovirus)，如剛果出血熱病毒；嗜肝DNA病毒屬(hepadnaviridae)，如，B肝病毒；沙粒病毒(arenaviruses)，如1em病毒，Lasso病毒和Junin病毒；逆轉錄病毒(retroviruses)，如HTLV I，HTLV II，HIV-1和HIV-2；腸病毒(Enterouirus)，例如脊髓灰質炎病毒1，2和3，柯薩奇病毒(coxackie virus)，埃可病毒(echovirus)，人腸病毒，A肝病毒，戊肝病毒和諾沃克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒(rhinoviruses)，如人鼻病毒；和絲狀病毒屬(filoviridae)，如馬爾堡(病)病毒(Marburg(disease)virus)和埃鮑拉(Ebola)病毒。
來自這些細菌、病毒和寄生蟲來源的抗原可用於製備用作疫苗的多聚蛋白。所述多聚體可以包含攜帶不同抗原的單體的混合物。
可以製備用於研究或治療目的的人蛋白的免疫原。這些物質不僅可用於預防接種中，而且也可用於研究。例如由人類基因組工程產生的人類基因序列數據使得產生與新的多肽反應的抗血清成為迫切的需要。同樣的需要適用於原核細胞(如細菌)和其它真核細胞(包括真菌)的基因產物。
非多肽免疫原可以是，例如碳水化合物或核酸。奈瑟氏球菌(Neisseria)或肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖外殼是可用於本發明的碳水化合物的實例。
所述抗原可以是本領域中疫苗的任何常規大小，包括小的多肽到較大的蛋白。由於本發明的性質，抗原可達100kDa，更優選50kDa，諸如優選30kDa。
當非多肽免疫原是本發明的部分產物時，所述免疫原可用常規合成法與產物的第一和第二組分共價連接。通常，免疫原可附著於包含第一和第二組分的融合蛋白的N或C末端和/或附著於胺基酸側鏈基團(例如賴氨酸的ε-氨基)。每種融合蛋白可附加一種以上免疫原。為了促進偶聯，可將賴氨酸殘基加入融合蛋白，例如作為C末端。
本發明在產生免疫應答方面有很多優勢。例如，利用多聚體可允許同時將多個抗原呈遞給免疫系統。這允許製備多價疫苗，所述疫苗能激發對一種以上的表位的免疫應答，所述表位可存在於單個生物體上或多個不同生物體上。因此，根據本發明形成的疫苗可用於同時對一種以上的疾病進行免疫接種，或用於同時靶向給定病原體上的數個表位。所述表位可存在於單個的單體單位或不同的單體單位上，所述不同的單體單位相互結合以提供異源多聚體(heteropolymer)。
人C4bp核心融合蛋白或人Cpn10融合蛋白在免疫中是特別有用的，因為該核心蛋白和人Cpn10不僅通常不存在於免疫受體的血清或血漿中，而且它本身不誘發免疫應答。C4bp蛋白已知存在於許多哺乳動物種類中，並且本領域的熟練技術人員可使用標準基因克隆技術發現哺乳動物種類的適當同源物。
核酸本發明的產物可用編碼包含至少第一和第二組分的融合蛋白的核酸構建體，在原核或真核宿主細胞中表達所述融合蛋白來製備。當第三種組分是多肽時，可利用所有三種組分從核酸序列的表達來製備本發明的產物。
因此，本發明提供了核酸構建體，通常為DNA或RNA，其編碼本發明的產物。
所述構建體通常是可複製的載體，其中編碼所述蛋白的序列可操作地連接於適合在所需宿主細胞中表達該蛋白的啟動子。
所述載體可包含複製起點，並可選地包含啟動子的調節物。所述載體可含有一或多個選擇標記基因。本領域已知多種原核和真核表達載體，且本發明可依據本領域內熟練技術人員的個人偏好而利用任何載體。
多種原核宿主細胞可用於本發明的方法中。這些宿主包括埃希氏菌屬(Escherichia)，假單胞菌屬(Pseudomonus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，嗜熱菌屬(Thermophilus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，腸桿菌屬(Enterobacteriacae)或鏈黴菌屬(Streptomyces)的菌株。例如，埃希氏菌屬的大腸桿菌(E.coli)用於本發明方法時，該細菌的優選菌株包括BL21(DE3)和它們的衍生物包括C41(DE3)，C43(DE3)或CO214(DE3)，其在WO98/02559中描述並且可得。
甚至更優選，當啟動子不是T7啟動子時，可利用缺少原噬菌體DE3的這些菌株的衍生物。
原核載體包括細菌質粒載體，例如源自大腸桿菌的載體，包括ColEI，pCRl，pBR322，pMB9及其衍生物，宿主範圍廣泛的載體，例如RP4；噬菌體DNA，例如噬菌體A的多種衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌體，例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。這些和其它載體可用標準重組DNA法進行操作，以導入與啟動子可操作地連接的本發明的核酸。
所述啟動子可以是誘導型啟動子。適合的啟動子包括T7啟動子，tac啟動子，trp啟動子，λ啟動子PL或PR以及本領域熟練技術人員所熟知的其它啟動子。
可使用多種真核宿主細胞，包括例如酵母菌，昆蟲和哺乳動物細胞。哺乳動物細胞包括CHO和小鼠細胞，非洲綠猴細胞諸如COS-1等，以及人細胞。
已知許多適合用於表達蛋白的真核載體。這些載體可以設計為其染色體摻入真核細胞基因組或保持在染色體外，或者僅在真核細胞中短暫地保存。所述核酸可以與適宜的啟動子可操作地連接，所述啟動子諸如強病毒啟動子，包括CMV啟動子，和SV40T-抗原啟動子或逆轉錄病毒LTR。
為獲得本發明的產物，攜帶本發明載體的宿主細胞可在適合表達所述蛋白的條件下培養，並且從培養基中的細胞回收所述蛋白。
組合物根據本發明的產物可以製備為藥物組合物的形式，所述產物可與一種或多種可藥用的載體或稀釋劑一起存在。該組合物根據目的用途和給藥產物的途徑來製備。因此本發明提供了一種組合物以及其在治療或預防人或動物受體疾病的免疫治療法中的用途，所述組合物包含多聚體形式的本發明的產物以及一種或多種可藥用的載體或稀釋劑。
可藥用的載體或稀釋劑包括適合經口服，經直腸，經鼻，經局部(包括經頰和舌下)，經陰道或胃腸外(包括經皮下、經肌肉內、經靜脈內、經皮內、經鞘內和經硬膜外)給藥的配製劑中所用載體和稀釋劑。所述配製劑可以方便地作為單位劑量形式存在並由任何藥學領域已知的方法製備。
可藥用的液體組合物可以例如通過在載體中對本發明的融合蛋白以及可選的藥物佐劑進行溶解、分散等以形成溶液或懸液來製備，所述載體例如水，右旋糖鹽水溶液，甘油，乙醇等等。如需要，待給藥的組合物也可以是輔助物質例如pH緩衝劑等等。對那些本領域熟練技術人員來說，製備這種製劑形式的實際方法是已知的，或者顯而易見的，見Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Com泛y，Easton，Pennsylvania，19thEdition，1995。
在任何情況下，所給藥的組合物或製劑包含一定量的活性化合物，所述量能夠有效減輕治療對象的症狀。可以製備這樣的劑量形式或組合物，其包含的活性成分在0.25-95％範圍內，其餘部分由非毒性載體平衡。
經胃腸外給藥的特徵通常為注射，如經皮下、肌肉內、或靜脈內注射。注射劑可以製備成傳統形式，如液體溶液或懸液，適於在注射前溶解或懸浮於液體中的固體形式，或乳劑。適當的賦形劑為，例如水、鹽水、右旋糖、甘油，乙醇等。更新的經胃腸外給藥方法設計為植入緩釋或持續釋放系統，以便維持恆定的劑量水平。見例如美國專利3,710,795。
所述產物的劑量可有賴於所述抗原的性質，並可根據目前在傳統疫苗配製劑中給藥該抗原的實踐來確定。
DNA疫苗另一方面，本發明提供用於人體或動物體的治療的真核表達載體，所述載體包含編碼重組融合蛋白的核酸序列，所述重組融合蛋白包含本發明的三種組分的產物。
這種治療可通過引入編碼用於激發免疫應答的抗原的核酸序列來實現其治療作用。核酸的遞送可利用質粒載體(「裸露的」或配製劑形式)或重組表達載體來實現。為顯示本發明如何用質粒載體實施，Green T.D，等，2001，在Vaccine 20，242-248中公開的內容可作為實例。這些作者顯示了使用表達麻疹血凝素蛋白和三個拷貝的C3d的融合物的DNA疫苗，可提高中和抗體的滴度。本發明中，C3d的第二和第三個拷貝可用編碼C4bpα鏈核心的序列取代，產生寡聚的抗原-佐劑融合蛋白。該質粒可較小(由於核心編碼序列比編碼C3d的兩個拷貝的序列短得多)，並且由於缺失重複序列而更穩定。
各種可用於基因遞送的病毒載體包括腺病毒，皰疹病毒，痘病毒或RNA病毒如逆轉錄病毒。所述逆轉錄病毒載體可以是鼠或鳥逆轉錄病毒的衍生物。可插入單個外源基因的逆轉錄病毒載體的實例包括但不限於莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)，和勞斯肉瘤病毒(RSV)。當對象是人類時，可利用載體如長臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)。
所述載體將包括轉錄調節序列，特別是足以指導RNA合成開始啟動子區域。適合的真核啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等1982 J.Molec.Appl.Genet.1，273)；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，1982Cell 31，355)；SV40早期啟動子(Benoist等1981 Nature 290，304)；勞斯肉瘤病毒啟動子(Gorman等1982 Proc.NatlAcad.Sci USA 79，6777)；和巨細胞病毒啟動子(Foecking等1980 Gene 45，101)。
將本發明這一方面的載體作為質粒載體或作為部分病毒載體給藥受試者，可受許多不同途徑的影響。質粒DNA可用於直接或間接給藥，其可以是「裸露的」或與陽離子和中性脂質(脂質體)配製在一起或微囊化的。所述DNA序列也可以包含於病毒(如，腺病毒，逆轉錄病毒，皰疹病毒，痘病毒)載體中，所述載體用於直接或間接遞送。遞送途徑包括但不僅限於經肌肉內，皮內(Sato，Y.等1996 Science 273，352)，靜脈內，動脈內，鞘內，肝內，吸入，陰道內滴注(Bagarazzi等1997 J Med.Primatol.26，27)，直腸內，腫瘤內或腹膜內。
因此本發明包括本文所述作為藥物組合物的載體，其可用於允許用DNA載體轉染一些細胞，從而使治療性多肽得以表達並產生治療效果(即誘導對所述抗原的免疫反應)。本發明的藥物化合物可通過使本發明的構建體成為適合利用溶劑，載體，遞送系統，賦形劑和添加劑或輔助劑並給藥受試者的形式來製備。經常使用的溶劑包括無菌水和鹽水(緩衝的或非緩衝的)。載體包括金微粒，其通過基因槍(biolistically)遞送(如在氣壓(gas pressure)下)。其它常用的載體或遞送系統包括陽離子脂質體，螺旋物(cochleate)和微囊，所述載體或遞送系統可以為液體溶液，包含在遞送膠囊中或者或摻入食物中。
給藥基因遞送載體的另一可選配製劑包括脂質體。脂質體的被囊化(encapsulation)為給藥多核苷酸和表達載體提供了可選配方。脂質體是由含水區室周圍的一個或多個脂質雙分子層組成的微觀小泡。通常參見，Bakker-Woudenberg等1993 Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12，Suppl.1，S61，和Kim，1993 Drugs 46，618。脂質體的成分和細胞膜相似，所以脂質體可被安全地給藥，並且是可生物降解的。依賴這種製備方法，脂質體可以是單層的或多層的，並且脂質體的大小可不同，直徑範圍從0.02μM到大於10μM。參見，例如，Machy等1987 LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY ANDPHARMACOLOGY(John Libbey)，和Ostro等1989 American J.Hosp.Phann.46，1576。
利用標準技術可將表達載體包入脂質體中。許多不同的脂質體組合物和合成方法為本領域熟練技術人員所熟知。參見，例如，美國專利4,844,904，美國專利5,000,959，美國專利4,863,740，美國專利5,589,466，美國專利5,580,859，和美國專利4,975,282，以上全部文獻包含在本文中作為參考。
通常，脂質體-被囊化的載體的給藥劑量根據以下因素變化，如病人的年齡，體重，身高，性別，總體醫學情況和既往醫學記錄。具體配製劑的劑量範圍可通過利用適合的動物模型確定。
細胞培養本發明編碼融合蛋白的質粒可利用常規轉化技術引入宿主細胞，並且在促進該融合蛋白產生的情況下培養所述細胞。在利用誘導型啟動子時，細胞最初在缺乏誘導物的條件下培養，所述誘導物可在細胞生長到較高密度時加入以使蛋白回收最大化。
細胞培養條件是本領域內所熟知的，並且可根據已知方法使用。
在一個具體的方面，當第一組分是C4bp核心蛋白時，至少前兩種組分的融合物或在有利時所有三種組分的融合物，可在原核表達系統中表達。目前，基於C4bp核心蛋白的融合蛋白已經可在真核細胞中表達。真核細胞的融合蛋白產量很少達到2mg/每毫升培養基上清液，(Oudin等ibid)，並且只有在基因擴增進行數個循環後才能達到這樣的水平。這個水平對於許多治療用融合蛋白的經濟化大量生產來說太低了。
儘管WO 91/00567建議原核宿主細胞可以用於製備基於C4bp的蛋白，這種生產還未得到實驗證實。然而大量的考慮都提示使用原核系統是不利的。尤其是許多真核蛋白在諸如大腸桿菌等細胞中表達時，將失去它們的一些或全部有活性的摺疊結構。其它真核蛋白在原核細胞中表達時會變性或完全失活。
C4bp是哺乳動物的分泌蛋白，且本領域已知在原核細胞中製備摺疊形式的所述蛋白尤其困難。有二硫橋的蛋白和需要寡聚化的蛋白更麻煩。在細菌胞漿的還原性環境中二硫鍵無法正常產生，且它們一旦形成則會穩定所述蛋白的錯誤摺疊或聚集形式。
通常在原核細胞內表達的重組蛋白會在宿主原核細胞內的內含體中聚集。所述內含體是與細胞的其它成分分離的離散顆粒或小球，其包含通常是聚集或失活形式的表達的蛋白。表達的蛋白在包含體中的存在使得回收活性可溶形式的蛋白非常困難，因為重摺疊技術是無效而且費用高昂的。從內含體純化蛋白必須消耗大量勞動來操作，變性並重摺疊才能獲得相對低產量的活性、有功能的蛋白。
對於在原核細胞中表達C4bp核心融合蛋白，還必須考慮其它問題。首先，每個核心單體都保留兩個半胱氨酸殘基，根據本領域所接受的C4bp多聚體模型，這些半胱氨酸是在多聚體裝配過程中形成分子間二硫鍵所必需的。期望原核細胞胞質(例如細菌的胞質)的還原環境能通過減少這些二硫鍵來阻止C4bp核心多聚體的形成。
第二，多聚體通過真核細胞的分泌裝置(secretion apparatus)時被組裝，這些分泌裝置已知能輔助蛋白以原核細胞不能提供的方式(例如，存在蛋白質二硫化物異構酶和獨定的陪伴分子的條件下)進行摺疊，第三，即使在使真核細胞中獲得的產量相對較低(mg/dl)時，這個分泌路徑仍不能產生同源蛋白。
此外，本發明人發現了在原核表達系統中所產生的與C4bp核心融合的蛋白可保持其功能活性。本發明因此提供了獲得重組融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含C4bpα鏈的C末端核心蛋白支架和第二組分以及可選的第三組分，並能在原核宿主細胞的胞質中形成可溶的多聚體，所述方法包括以下步驟(i)提供攜帶編碼所述重組蛋白的核酸的原核宿主細胞，所述核酸與在該原核細胞中有功能的啟動子可操作地連接；(ii)在所述重組蛋白被表達的條件下培養該宿主細胞；和(iii)回收所述重組蛋白，其中所述蛋白以多聚體形式被回收。
我們發現本發明細胞培養物中蛋白的產量可相對較高，例如大於2mg/l培養物，如大於5mg/l培養基，優選大於10mg/l培養物，如大於20mg/l培養基，甚至更優選大於100mg/l培養物。
本發明的C4bp核心融合蛋白包含在N或C末端融合於本發明其它組分之一的C4bp核心蛋白序列。在優選的排列中，所述組分自融合蛋白的N到C末端的順序是N-第三組分-第二組分-第一組分-C。
我們發現包含在上述定義中的蛋白可以以多聚體形式在細菌表達系統中表達並被回收，而無需支架的重摺疊。我們表達了包括C4bp核心的蛋白和能攜帶抗原和第二組分的蛋白，其單體重量達約30kDa。本發明因此可用於表達該大小範圍內的蛋白，且更常用於表達約100kDa，更優選約50kDa的蛋白。
該系統允許在大腸桿菌中製備可溶蛋白的事實，使得可利用該系統將由於缺少C-末端和/或N-末端的限制(constraint)因而在其獨自表達時不摺疊的蛋白製備為例如摺疊的可溶蛋白、結構域或片段。改造具體的切割位點能產生目的游離結構域。類似地，在重摺疊過程中限制目的肽的N-末端和/或C-末端是有益的。此外，由於寡聚化結構對於變性和分解(disassembly)有很強的抵抗力，在插入的蛋白發生變性的過程中所述結構將保持穩定。因此，在重摺疊過程中，對於等量的目的蛋白，游離蛋白的實際濃度可通過與寡聚化數目等同的因素而降低。寡聚化反應對於純化也是有益的，因為蛋白技術中許多方法對於蛋白，且特別是低分子量的肽而言不是最佳的。
從培養物中回收蛋白當細胞生長到允許產生所述蛋白時，可從該細胞中回收所述蛋白。我們驚奇地發現所述蛋白保持可溶狀態，因此進一步高速(如15rpm，000進行1小時)離心之後，細胞通常例如經旋轉沉下(spun down)並通過超聲處理而溶解，此過程中使蛋白級分保持可溶狀態並允許所述級分保留於上清液中。
上清液蛋白級分中的融合蛋白可通過標準蛋白層析技術的任意適合組合而進一步純化。我們採用離子交換層析，之後用凝膠過濾層析。其它層析技術，如親和層析，也可被應用。
在一個實施方案中，我們發現在溶解產物離心後或在任何其它純化步驟後加熱上清液樣品，將有助於所述蛋白的回收。所述樣品可被加熱到約70-80℃、持續大約10到30分鐘，但該實施方案在第二組分是C3d時不是優選的。
依據蛋白的目的用途，可對所述蛋白進行進一步的純化步驟，例如透析，或濃縮步驟，例如冷凍乾燥。
以下實例將說明本發明。
實施例1表位-C3d-C4bp融合蛋白該實施例顯示了表位(包含人Cpn10的胺基酸8-22)與人C3d的融合，所述人C3d本身與人C4bp核心蛋白的N末端融合。所述融合蛋白可在細菌菌株C41(DE3)中表達並從中純化。所述蛋白在凝膠過濾中的表現與寡聚物相似。
本實施例中所示的方法可被擴展到提供本發明的三種組分的產物，例如用下述構建體中其它抗原-編碼DNA取代Cpn10表位來進行。可選，回收的蛋白可與其它方法提供的抗原共價連接。
克隆來自pAVD 95(下文實施例2中用於C3d7(1)的表達構建體)的975bp的XbaI-BamHI片段(編碼T7核糖體結合位點，人Cpn10的殘基8-22(所述表位)和人C3d的殘基995-1287)被連入pAVD 77(pRSETa-Db-C4bp)，所述pAVD 77已經用XbaI和BamHI消化過。該過程將人Cpn10和C3d蛋白片段與人C4bpα鏈C末端的57個殘基融合。所述構建體稱為pAVD94，其可通過PCR和雙重消化檢驗。
所述構建體的融合蛋白的胺基酸如下MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVHYLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPSTWLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIHQEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEARD ICEEQVNSLP GSITKAGDFLEANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQLYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVFQALAQYQKDA PGSETPEGCE QVLTGKRLMQ CLPNPEDVKM ALEVYKLSLEIEQLELQRDS ARQSTLDKEL(SEQ ID NO17).
SEQ ID NO17的殘基2-16對應人Cpn10(所述表位)的殘基8-22，SEQID NO17的殘基19-311對應人C3d殘基995-1287，且SEQ ID NO17的殘基314-370對應人C4bp核心蛋白的57個殘基。上述序列中以粗體顯示的GS接頭序列位於三種組分之間。
所述蛋白的估計分子量為41,485道爾頓，理論上pI為5.51，且估計消光係數為45090M-1cm-1。以此為基礎，計算我們所用的濃度Abs 0,1％(＝1g/l)＝1.087。
表達編碼表位-C3d-C4bp核心蛋白的質粒pAVD94在大腸桿菌菌株C41(DE3)中表達。在沒有誘導的條件下在25℃生長過夜後，所述蛋白表達良好。在20mM Tris-HCl緩衝液pH8/100mM NaCl中，利用弗氏壓濾器(Frenchpress)，幾乎一半蛋白見於上清液中。
C3d-C4bp的純化表位-C3d-C4bp的可溶級分利用三個純化步驟從1L培養物純化陰離子交換柱，陽離子交換柱和凝膠過濾柱。
陰離子柱(Mono Q HR16/10)該柱在20mM Tris-HCl緩衝液pH 8/100mM NaCl中平衡。所述蛋白用20倍柱體積的梯度溶液即20mM Tris-HCl緩衝液pH 8/100mM NaCl(緩衝液A)到20mM Tris-HCl緩衝液pH8/1M NaCl(緩衝液B)洗脫。所述蛋白在約350mM NaCl洗脫。
含有表位-C3d-C4bp的MonoQ級分用20mM Tris-HCl緩衝液pH 7/100mM NaCl透析，然後加樣在陽離子柱上。
陽離子柱(Mono SHR10/10)經過Mono Q柱的級分含有表位-C3d-C4bp，將所述級分上樣於用20mM Tris-HCl緩衝液pH 7/100mM NaCl平衡的陽離子柱(Mono S HR 10/10)上。所述蛋白用20倍柱體積的梯度溶液即20mM Tris-HCl緩衝液pH 7/100mM NaCl(緩衝液A)到20mM Tris-HCl緩衝液pH7/1M NaCl(緩衝液B)洗脫。所述蛋白在約350mM NaCl洗脫。
收集沒有主要汙染物(＞66Kda)的、含表位-C3d-C4bp的級分，對所述級分進行濃縮並上樣於凝膠過濾柱。
凝膠過濾柱(Superdex 20026/60製備級(prep grade))
將來自Mono S柱的含表位-C3d-C4bp的級分上樣於用50mM磷酸鈉pH 7.4/150mM NaCl平衡的凝膠過濾柱(Superdex 200 26/60 prep grade)。所述蛋白用152.69ml緩衝液洗脫，其洗脫峰非常對稱。該洗脫體積顯示，所述蛋白是寡聚物。經過該柱以後，所述蛋白的濃度為0.45mg/ml。所述蛋白被濃縮到1.5mg/ml並與10％甘油一起儲存在-70℃。所述蛋白為至少90％純。
實施例2 將人C3d分子插入人Cpn10(C3d7)的可動環本實施例描述了三種類似的C3d7構建體的可溶部分的純化以及其在25℃的表達C3d7(1)42.85kDa三裂體融合蛋白在25℃、自大腸桿菌菌株C41(DE3)中的質粒pAVD 59表達，所述融合蛋白包含取代人Cpn10(在其N末端被截短)可動環的人C3d以及C末端myc標記表位，其胺基酸序列為SEQ ID NO18。
MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVHYLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPSTWLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIHQEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEAKD ICEEQVNSLP GSITKAGDFLEANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQLYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVFQALAQYQKDA PGSGKVLQAT VVAVGSGSKG KGGEIQPVSV KVGDKVLLPEYGGTKVVLDD KDYFLFRDGD ILGKYVDeqk liseedl (SEQ ID NO18)SEQ ID NO18的人Cpn10胺基酸序列是殘基1-16和311-377。人C3d胺基酸序列是SEQ ID NO18的17-310，且myc-標記表位胺基酸序列為SEQ ID NO18的378-387。
編碼該融合蛋白的DNA序列(NdeI-HindIII限制酶切片段)克隆在pRSET來源的質粒的NdeI-HindIII位點之間，使得所述編碼序列在T7啟動子的控制下。
C3d7(2)類似地構建第二融合蛋白，其僅在插入人C3d以取代人Cpn10的可動環的位置上有所不同。其序列為SEQ ID NO19
MKFLPLFDRV LVERSAGETV TVDAERLKHL IVTPSGSGEQ NMIGMTPTVIAVHYLDETEQ WEKFGLEKRQ GALELIKKGY TQQLAFRQPS SAFAAFVKRAPSTWLTAYVV KVFSLAVNLI AIDSQVLCGA VKWLILEKQK PDGVFQEDAPVIHQEMIGGL RNNNEKDMAL TAFVLISLQE AKDICEEQVN SLPGSITKAGDFLEANYMNL QRSYTVAIAG YALAQMGRLK GPLLNKFLTT AKDKNRWEDPGKQLYNVEAT SYALLALLQL KDFDFVPPVV RWLNEQRYYG GGYGSTQATFMVFQALAQYQ KDAPGKVLQA TVVAVGSGSK GKGGEIQPVS VKVGDKVLLPEYGGTKVVLD DKDYFLFRDG DILGKYVDeq kliseedl (SEQ ID NO19)胺基酸殘基1-20和315-378源自人Cpn10，所述殘基位於人C3d胺基酸序列側翼。myc-標記表位胺基酸序列為379-388。
C3d7(3)同樣製備第三種融合蛋白C3d7(3)，其胺基酸序列為MKFLPIFDRV LVERSAGETV DAERLKHLIV TPSGSGEQNM IGMTPTVIAVHYLDETEQWE KFGLEKRQGA LELIKKGYTQ QLAFRQpSSA FAAFVKRAPSTWLTAYVVKV FSLAVNLIAI DSQVLCGAVK WLILEKQKPD GVFQEDApVIHQEMIGGLRN NNEKDMALTA FVLISLQEAK DICEEQVNSL PGSITKAGDFLEANYMNLQR SYTVAIAGYA LAQMGRLKGP LLNKFLTTAK DKNRWEDPGKQLYNVEATSY ALLALLQLKD FDFVPPVVRW LNEQRYYGGG YGSTQATFMVFQALAQYQKD APLQATVVAV GSGSKGKGGE IQPVSVKVGD KVLLPEYGGTKVVLDDKDYF LFRDGDILGK YVDeqklise edl (SEQ ID NO20)人Cpn10胺基酸序列是1-18和313-373(與人C3d胺基酸序列側接)，且myc-標記表位的胺基酸序列是374-383。
C3d7(1)的表達為了使所述蛋白可溶，我們在25℃於大腸桿菌菌株C41(DE3)中表達pAVD95。在25℃用0.5mM IPTG誘導過夜後，所述蛋白被表達並且幾乎一半的所述蛋白見於上清液中。
純化C3d7(1)的可溶級分可利用兩個純化步驟來純化，即陰離子柱，然後使凝膠過濾柱。
陰離子柱(Mono Q HR16/10)
所述柱可在20mM Tris pH 8中平衡。所述蛋白可用20倍柱體積的梯度溶液即20mM Tris pH 8到20mM Tris pH 8，1M NaCl來洗脫。所述蛋白用大約350mM NaCl在一個5ml的級分(E3)中洗脫。
凝膠過濾柱(Superdex 20026/60 prep grade)將柱Mono Q的級分E3加樣於用50mM磷酸鈉pH 7.4，150mM NaCl平衡的凝膠過濾柱(Superdex 200 26/60 prep grade)。所述蛋白用150ml緩衝液洗脫。在所述柱上卵清蛋白(MW＝43Kd)的洗脫體積為167ml。這表明本發明所述蛋白是寡聚物。
圓二色性通過遠UV(Far UV)圓二色性分析蛋白表明存在二級結構。所述光譜的去褶合(deconvolution)顯示α-螺旋的百分比為約49％。該百分比與通過模擬(modeling)測定的百分比(48％的α-螺旋)一致。這表明所述蛋白是正確摺疊的。
所述蛋白在50mM磷酸鈉，pH7.4，150mM NaCl中濃縮至1.2mg/ml。
實施例3-C3d7(1)和表位-C3d-C4bp的CR2結合活性ELISA分析法如實施例1中製備的表位-C3d-C4bp分子和如實施例2中製備的C3d7(1)在500nM-0.01nM的濃度範圍內進行分析，並相對於人C3d(Calbiochem)和人C3d的線性三體(稱為C3d3或APT2029)進行比較，所述人C3d的線性三體如W099/35260中所述構建和製備。結果顯示於圖2和4。
簡言之，所述分析法如下表達IgG恆定區-CD21融合蛋白並在組織培養細胞中進行純化，並用純化的蛋白包被ELISA板的孔。將一定範圍濃度的各種C3d分子加入這些孔並進行保溫。保溫後，徹底洗滌這些孔，然後加入生物素化的抗-C3d單克隆抗體。保溫並洗滌後，加入辣根過氧化物酶(HRP)-標記的抗生物素抗體。進一步保溫和洗滌後，加入HRP的底物並在450nm測定通過HRP從所述底物產生的有色產物。所述分析圖示在圖3中。
明顯地，在數個濃度條件下，表位-C3d-C4bp分子與C3d受體CD21的結合比單體C3d與所述C3d受體CD21的結合要好得多，甚至比線性三體C3d3還要好，如圖2所示。
所述實驗用C3d7(1)重複三次，並且對每次應答的梯度進行平均和比較。圖4顯示了這些分析之一的結果。
比較C3d7(1)和Calbiochem C3d(其為單體形式)的結果時，C3d7(1)的Abs 450開始增加時的濃度低於單體C3d。這表明C3d為多聚體形式。
實施例4-C3d7(1)，(2)(3)的CR2結合活性如實施例3中所述，用C3d7(1)，(2)和(3)重複實施例3的結合實驗，其中C3d7(1)，(2)和(3)都如上述實施例2中所述來製備。
在ELISA分析中，這三種蛋白的結合如圖5所示。數據顯示，C3d7(1)，C3d7(2)和C3d7(3)都確實與CR2結合。所述結合曲線線性部分的斜率表明所述蛋白發生了多聚化，表現為C3d3的線性三體(稱為APT2029)的斜率比單體C3d(由Calbiochem提供)的增加3.4倍。三種C3d7構建體的線性部分斜率提示，它們都是多聚化的。
實施例5 通過免疫螢光流式細胞術進行分析檢測了人C3d7構建體在無限繁殖化的CD21+Raji類淋巴母細胞系以及人CD20+/CD4-/CD8-外周血淋巴細胞上的CR2結合活性。流式細胞分析用Becton Dickenson FACSCalibur進行；獲得了10,000事件(events)。
無限繁殖化的Raji(B細胞)和Jurkat(T細胞)細胞在PBS中洗滌，並與FITC偶聯的抗人，CD3(泛-T細胞標記物)、CD20(泛-B細胞標記物)和CD21(CR2標記物)(DAKO)單克隆抗體(Mabs)的優化稀釋液一同保溫。這證實了Raji細胞是CD21+，CD20+的，而Jurkat細胞為CD21dim，CD3+。
在Raji(CD21+/CD20+)而不是Jurkat(CD3+/CD21dim)上檢測到C3d7(1-3)的結合利用單染色免疫螢光分析模式，將洗滌後的Raji和Jurkat細胞(1×106/ml)與各100nM(終稀釋度)C3d7(1)、C3d7(2)、C3d7(3)、人單體C3d(Calbiochem)以及人線性三體C3d3(APT2029)一同在室溫保溫30分鐘，在冰冷的PBS終洗滌後，與Cys(粉色螢光團)偶聯的抗-人C3d單克隆抗體的優化稀釋液一起在4℃於暗處保溫30分鐘，再次洗滌並重懸於0.5ml冰冷的PBS中。圖6顯示了該分析的結果。
C3d7(1)和C3d7(2)確實與CD21+細胞結合，而不與CD3+/CD21dim細胞結合。信號強度的增加提示多聚化，表現為相對於C3d(Calbiochem)而言，C3d7(1)和C3d7(2)的信號強度之間分別增加了7和9倍，而C3d3(APT2029)增加了6.4倍。
C3d7(1)在CD20+/CD4-/CD8-人外周血淋巴細胞(PBL)表面的結合該實驗利用復染免疫螢光分析模式進行。人PBL用Ficoll通過密度梯度離心而從血液中分離。通過裂解去除汙染性紅細胞。1×106/ml經過洗滌的PBL與200nM(終稀釋度)C3d7(1)或人線性三體C3d3(APT2029)一同在室溫保溫30分鐘，在冰冷的PBS中洗滌，隨後與Cy3-抗-人C3d Mab和FITC-抗CD4(Th細胞標記物)、抗CD8(CTL標記物)、抗-CD20(B細胞標記物)Mabs(DAKO)的優化稀釋液在4℃於暗處一同保溫30分鐘，洗滌並重懸於0.3ml冰冷的PBS中用於流式細胞分析，獲得了5,000事件。
數據的分析表明C3d7(1)確實和PBL B(CD20+)細胞群(推定為CD21+)結合，所述結合的方式與對線性三體人C3d3(稱為APT2029)所觀察到的相似。
序列表110阿維迪斯公司(AVIDIS SA)120包含支架，佐劑和抗原的異源多聚體化合物及其用途130AHB/FP6164701140
141
150EP 02292042.51512002-08-1416020170PatentIn Ver.2.1210121157212PRT213人(Homo sapiens)4001Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55210221157212PRT213穴兔(Oryctolagus cuniculus)4002Glu Val Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Gln Ala Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Ala Asp Pro Tyr Glu Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Leu Leu Glu Leu Gln Arg Asp Lys Ala35 40 45Arg Lys Ser Ser Val Leu Arg Gln Leu50 55
210321155212PRT213家鼠(Rattus sp.)4003Glu Val Pro Lys Asp Cys Glu His Val Phe Ala Gly Lys Lys Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Ser Asn Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Thr Leu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Leu Gln Ile Asp Lys Ala35 40 45Lys His Val Asp Arg Glu Leu50 55210421154212PRT213小家鼠(Mus sp.)4004Glu Ala Ser Glu Asp Leu Lys Pro Ala Leu Thr Gly Asn Lys Thr Met1 5 10 15Gln Tyr Val Pro Asn Ser His Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Thr Leu Glu Val Glu Leu Leu Gln Leu Gln Ile Gln Lys Glu35 40 45Lys His Thr Glu Ala His50210521167212PRT213牛(Bos sp.)4005Glu Tyr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Val Thr Gly Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Gln Cys Leu Ser Arg Pro Glu Glu Val Lys Leu Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Ile Leu Gln Thr Asn Lys Leu Lys Lys35 40 45Glu Ala Phe Leu Leu Arg Glu Arg Glu Lys Asn Val Thr Cys Asp Phe50 55 60Asn Pro Glu
65210621157212PRT213野豬(Sus scrofa)4006Glu Tyr Pro Glu Asp Cys Glu Gln Val His Glu Gly Lys Lys Leu Met1 5 10 15Glu Cys Leu Pro Thr Leu Glu Glu Ile Lys Leu Ala Leu Ala Leu Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Thr Asn Leu Leu Glu Leu Gln Ile Asp Lys Glu35 40 45Lys Lys Ala Lys Ala Lys Tyr Ser Thr50 55210721156212PRT213豚鼠(Cavia porcellus)4007Glu Val Pro Glu Glu Cys Lys Gln Val Ala Ala Gly Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Glu Cys Leu Pro Asn Pro Ser Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Val Lys35 40 45Ile Gln Glu Lys Phe Ser Lys Glu50 55210821159212PRT213小家鼠(Mus sp.)4008Glu Val Leu Glu Asp Cys Arg Ile Val Ser Arg Gly Ala Gln Leu Leu1 5 10 15His Cys Leu Ser Ser Pro Glu Asp Val His Arg Ala Leu Lys Val Tyr20 25 30Lys Leu Phe Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu His Gln Lys Glu Lys Trp35 40 45Ile Gln Leu His Arg Lys Pro Gln Ser Met Lys50 55
210921152212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體4009Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn1 5 10 15Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu20 25 30Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu35 40 45Asp Lys Glu Leu502101021157212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體40010Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 552101121152212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體
40011Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn1 5 10 15Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu20 25 30Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu35 40 45Asp Lys Glu Leu502101221157212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體40012Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 552101321157212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體40013Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55
2101421150212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體40014Glu Gly Cys Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu1 5 10 15Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser20 25 30Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser35 40 45Thr Leu502101521157212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體40015Glu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Ser Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 552101621152212PRT213人工序列220
223人工序列的描述C4bp核心蛋白變體
40016Glu Gly Ser Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Ser Leu1 5 10 15Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser20 25 30Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser35 40 45Thr Leu Asp Lys5021017211370212PRT213人工序列220
223人工序列的描述融合蛋白40017Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala1 5 10 15Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser20 25 30Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala35 40 45Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu50 55 60Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln65 70 75 80Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg85 90 95Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu100 105 110Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val115 120 125Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu130 135 140Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn145 150 155 160Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln165 170 175
Glu Ala Arg Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser180 185 190Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln195 200 205Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly210 215 220Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp225 230 235 240Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala245 250 255Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe260 265 270Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly275 280 285Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala290 295 300Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Ser Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu305 310 315 320Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu325 330 335Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu340 345 350Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys355 360 365Glu Leu37021018211387212PRT213人工序列220
223人工序列的描述融合蛋白40018Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala1 5 10 15Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser20 25 30Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala35 40 45
Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu50 55 60Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln65 70 75 80Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg85 90 95Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu100 105 110Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val115 120 125Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu130 135 140Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn145 150 155 160Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln165 170 175Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser180 185 190Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln195 200 205Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly210 215 220Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp225 230 235 240Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala245 250 255Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe260 265 270Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly275 280 285Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala290 295 300Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Ser Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr305 310 315 320Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln325 330 335Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly340 345 350
Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp355 360 365Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu370 375 380Glu Asp Leu38521019211388212PRT213人工序列220
223人工序列的描述融合蛋白40019Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala1 5 10 15Gly Glu Thr Val Thr Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val20 25 30Thr Pro Ser Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr35 40 45Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe50 55 60Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr65 70 75 80Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe85 90 95Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val100 105 110Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys115 120 125Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val130 135 140Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu145 150 155 160Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile165 170 175Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu180 185 190Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met195 200 205Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala210 215 220
Gln Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr225 230 235 240Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn245 250 255Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp260 265 270Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr275 280 285Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln290 295 300Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Lys Val Leu Gln Ala305 310 315 320Thr Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile325 330 335Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr340 345 350Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg355 360 365Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser370 375 380Glu Glu Asp Leu38521020211383212PRT213人工序列220
223人工序列的描述融合蛋白40020Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala1 5 10 15Gly Glu Thr Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro20 25 30Ser Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile35 40 45Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu50 55 60Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln65 70 75 80
Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys85 90 95Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser100 105 110Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala115 120 125Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln130 135 140Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn145 150 155 160Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu165 170 175Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly180 185 190Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu195 200 205Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met210 215 220Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys225 230 235 240Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu245 250 255Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp260 265 270Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly275 280 285Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu290 295 300Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val305 310 315 320Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser Val325 330 335Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val340 345 350Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu355 360 365Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu370 375 380
權利要求
1.一種產物，其包括第一組分，其為支架第二組分，其為佐劑；和第三組分，其為抗原。
2.權利要求1的產物，其中所述第二組分是多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞或T細胞或濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體。
3.權利要求1或2的產物，其中所述第三組分是多肽抗原。
4.權利要求1或2的產物，其中所述第三組分是非多肽抗原。
5.權利要求1-3之一的產物，其中所述支架和抗原是相同的。
6.權利要求5的產物，其中所述支架和抗原是病毒外殼蛋白。
7.權利要求6的產物，其中所述病毒外殼蛋白是B肝表面抗原。
8.權利要求1-3之一的產物，其中所述支架和佐劑相同。
9.權利要求8的產物，其中所述支架和佐劑是C4bp核心蛋白。
10.藥物組合物，其包含權利要求1-9之一的產物以及可藥用的載體或稀釋劑。
11.誘導針對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括將有效量的權利要求1-10之一的產物給藥受試者。
12.製備產物的方法，所述產物包括第一組分，其為多肽支架；第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞或T細胞或濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為多肽抗原，所述方法包括表達編碼這三種組分的融合蛋白的核酸，以及回收所述產物。
13.製備產物的方法，所述產物包含第一組分，其為多肽支架；第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞或T細胞或濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為非多肽抗原，所述方法包括表達編碼第一組分和第二組分的融合蛋白的核酸，將所述融合蛋白與該第三組分相連，以及回收所述產物。
14.權利要求12或13的方法，其中所述核酸在原核宿主細胞中表達。
15.權利要求14的方法，其中所述融合蛋白以多聚體的形式被回收。
16.權利要求15的方法，其中所述重組蛋白的濃度為至少2mg/l細胞培養物。
17.權利要求15或16的方法，其中所述原核宿主細胞是大腸桿菌。
18.一種表達載體，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白為以下組分的融合蛋白第一組分，其為多肽支架；第二組分，其為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞或T細胞或濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和可選地第三組分，其為多肽抗原，所述核酸序列可操作地連接於在宿主細胞中有功能的啟動子。
19.細菌宿主細胞，其由權利要求18的表達載體轉化。
20.真核宿主細胞，其由權利要求18的載體轉化。
21.權利要求20的表達載體在人或動物體的治療方法中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種產物，其包括第一組分，其為支架；第二組分，其為佐劑，優選為多肽，所述多肽是CD21的配體或者是B細胞、T細胞、濾泡樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的細胞表面分子的配體；和第三組分，其為抗原。
文檔編號C07K14/47GK1688607SQ03824203
公開日2005年10月26日 申請日期2003年8月12日 優先權日2002年8月14日
發明者皮埃爾·安德裡奧雷蒂, 勞倫斯·杜蒙, 費高爾·希爾, 米歇爾·朱利恩, 讓·B·馬錢德, 伊曼紐爾·裡西 申請人:阿維迪斯公司