一種製備結直腸癌抗原特異性T細胞的方法與流程

2023-06-14 15:37:36 1

本發明涉及免疫細胞領域，更具體地涉及一種製備結直腸癌抗原特異性t細胞的方法，以及由所述方法獲得的結直腸癌抗原特異性t細胞。

背景技術：

結直腸癌是全球第三大最常見癌症，每年有100萬左右的新增病例和超過50萬人死於該病。結直腸癌的治療以手術為主，並結合輔助放療、化療，雖然輔助放化療能在一定程度上延長患者的生存期，但也伴隨嚴重的副反應，且即使經過積極的聯合治療，該病依然存在很高的復發轉移率。目前迫切需要開發出能有效延長患者生存期，減少復發和轉移風險的治療策略。

轉化生長因子βii型受體(tgfβrii)和o位n-乙醯葡萄糖胺糖基轉移酶(ogt)基因的框移突變產生一種具有人白細胞抗原a2(hla-a2)限制性的新生抗原，存在於20-40％hla-a2限制性結腸癌患者並且不存在於正常人和其他腫瘤中，提呈後的抗原肽為slykfspfpl和rlsscvpva。

越來越多的證據表明免疫系統可以預防腫瘤生長和轉移擴散。包括細胞因子、腫瘤疫苗、免疫效應細胞，以及基因改造t細胞受體、單克隆抗體等成為國內外免疫治療研發的熱點。目前已開展多項結腸癌免疫治療臨床試驗研究，包括促進免疫系統的細胞因子、免疫檢查點阻斷、抗原疫苗和過繼性細胞治療等。儘管目前基因改造細胞成為免疫治療中翹楚，但由於製備工藝複雜，並存在脫靶效應，使得其在治療實體瘤的臨床階段推進受到阻礙。

以往針對細胞因子誘導殺傷性細胞，自然殺傷細胞治療包括結腸癌在內的實體瘤的研究認為這些治療方法存在一定的療效，但由於缺乏抗原特異性文獻報導臨床治療效果參差不齊。

腫瘤細胞表面的抗原通過抗原提呈細胞(apc)加工成抗原肽與主要組織相容複合物(mhc)分子形成複合物提呈並參與活化給t細胞，形成腫瘤抗原特異性的細胞毒性t淋巴細胞(ctl)。腫瘤為了逃避識別，下調甚至不表達mhc分子，部分腫瘤患者免疫細胞數量下降功能低下都會造成腫瘤抗原無法提呈，導致t細胞無法活化。所以使用抗原呈遞細胞輔助形成殺傷性t細胞是常用的方法，但是這些方法不穩定且不夠方便。

綜上所述，尚需要更加有效簡單的免疫療法和抗原特異性t細胞更加簡單和高效的製備方法。

技術實現要素：

為了解決現有技術面臨的問題，本發明人開發了一種製備抗原特異性t細胞，特別是結直腸癌抗原特異性t細胞的方法，其解決或部分解決了以上問題。

本發明的一個方面涉及抗原特異性t細胞的製備方法，其包括使t細胞與腫瘤特異性抗原共孵育。

進一步地，所述方法中的腫瘤特異性抗原可以為結直腸癌特異性抗原。

在一些實施方案中，所述結直腸癌特異性抗原為肽rlsscvpva。

在一些實施方案中，本發明方法中的t細胞在混懸液中，進一步地，所述混懸液可以為外周血單核細胞混懸液或者外周血。

在一些實施方案中，本發明方法中的t細胞為cd8+t細胞。

本發明的一個方面涉及由本發明方法獲得的抗原特異性t細胞，特別是結直腸癌抗原特異性t細胞。

本發明還涉及由本發明方法獲得的結直腸癌抗原特異性t細胞在製備用於治療結直腸癌的製劑中的用途。

本發明中使用的肽slykfspfpl(下文可簡稱為「抗原肽1」、「1號肽」或「p1」)和肽rlsscvpva(下文可簡稱為「抗原肽2」、「2號肽」或「p2」)可以是化學合成的或者經生物工程技術產生的，其具有較高的，例如大於99％的純度，具有良好的均質性。直接使用肽slykfspfpla，或者肽slykfspfpl和肽rlsscvpva的混合物處理pmbc獲得抗原特異性t細胞的方法，步驟大為簡化，可重複性好，具有良好的可操作性和實用價值。

附圖說明

圖1示出製備的肽的純度；圖1a抗原肽rlsscvpva合成質譜分析的離子峰，在12.245』出現；圖1b抗原肽rlsscvpva合成質譜分析的主要碎片峰僅有一個，該碎片分子量為931.76，豐度為100％，接近rlsscvpva的理論分子量。圖1c抗原肽slykfspfpl合成質譜分析的兩個離子峰，分別出現在16.731』和21.317』。圖1dogt抗原肽slykfspfpl合成質譜分析的主要碎片峰，有兩個，碎片的分子量(豐度)分別為1198.70(99％)和1220.81(1％)，第一個碎片的分子量接近slykfspfpl的理論分子量。

圖2示出了在不同效應細胞靶細胞比例(簡稱「效靶比」)情況下，使用1號肽(p1)、2號肽(p2)、1號肽和2號肽的等比例混合物(p1+2)以及未添加抗原肽(np)的情況下，誘導產生的細胞毒性t淋巴細胞(下文簡稱「ctl」)對dld1殺傷活力的影響。

圖3示出了效靶比為5/1(a)和10/1(b)時dc負載抗原誘導的ctl與抗原肽直接刺激活化ctl殺傷dld-1效能比較。

圖4示出了對效靶比為5/1(a)和10/1(b)兩組的ctl活化後ifn-γ分泌量的測定；每組對比中較前顏色的左側為負載抗原肽的dc刺激pbmc得到的ctl(dc+t)，右側為相應抗原肽直接刺激pbmc得到的ctl(pbmc)。

具體實施方式

一、實驗材料

1、結腸癌細胞系dld1來自解放軍總醫院腫瘤中心實驗室。

2、外周血樣來源

2.1患者組：

收集2014年11月至2015年8月就診於解放軍總醫院腫瘤中心的確診的結腸癌病人，診斷經過經組織或細胞病理學確認，通過納入,排除標準篩選後，共計42例，其中有hlaa2限制性的患者34例，為最終納入的患者。組織病理學標本由手術病理或腸鏡檢查獲得並經病理科檢測確定。所有實驗經解放軍總醫院倫理委員會批准，病人知曉並籤署知情同意書。患者的納入和排除標準如下：

患者組納入標準：

①經病理學確診的結腸癌患者，病理類型僅包括腺癌(高/中/低分化)；

②入院前未經過細胞治療；

③表達hlaa2限制性分子

患者組排除標準：

①其他部位原發腫瘤的結腸部轉移或侵犯；

②距離上一次放療/化療結束1月內的患者，既往接受過細胞治療患者；

③不表達hlaa2限制性分子

④伴有自身免疫性疾病和血液系統疾病患者；

⑤病理，隨訪資料不完善的患者；

⑥伴有其他傳染疾病患者。

結腸癌腺癌的診斷和病理類型確定根據2013年美國國立綜合癌症網絡(nccn)發布的結腸癌診療指南，患者臨床分期參考國際抗癌聯盟(uicc)和美國癌症聯合委員會(ajcc)制定的tnm分級法。根據納入患者的入院記錄和相關檢查，記錄包括性別，年齡，病理類型，臨床分期，既往治療方案，併發症，合併其他疾病，結腸癌相關遺傳疾病或家族史等信息。

2.2對照組：同期在解放軍總醫院體檢中心參加體檢的10例健康對照者和4例志願者的外周靜脈血作為對照組。

入選標準為：

①與病人組年齡和性別構成相近

②表達hlaa2限制性分子

排除標準為：

①1個月內有急性或慢性炎症

②由結腸癌或結腸疾病家族史

③不表達hlaa2限制性分子

④自身免疫性疾病，血液系統疾及其他傳染疾病患者

二、主要實驗試劑如下，所有其他實驗試劑為常規試劑，本領域技術人員可容易地購買得到

註：mts試劑盒是應用新型的水溶性化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑(金翁)，內鹽；mts]快速高靈敏度檢測細胞增殖和細胞毒性的比色檢測產品。

三、主要實驗儀器

四、肽rlsscvpva和slykfspfpl的合成、純化以及鑑定

4.1肽的合成

肽rlsscvpva和slykfspfpl交由北京中科亞光生物科技有限公司進行商業合成。

4.2合成的肽

北京中科亞光生物科技有限公司提供了在xevog2-sqtof質譜儀上獲得的檢測結果，具體參見附圖1。獲得了純度為100％的tgf-βrii抗原肽rlsscvpva和99.05％的ogt抗原肽slykfspfpl。

五、外周血採集

在實驗組對象入院時空腹情況下抽取外周血20毫升至抗凝管(肝素抗凝)中，採血管帽採血前後用碘伏消毒，保證無菌。採集之後兩小時內處理血樣，以4℃，2500轉/分離心15分鐘的條件離心。收集上層血漿吸取1ml保存至凍存管中，分裝之後置於-80℃冰箱，待檢測。以同樣的方法和步驟收集14例健康對照者，分裝1ml血漿保存至-80℃冰箱，剩餘血漿吸入15ml無菌離心管，封口膠密封，置於56℃水浴30分鐘。水浴結束後血漿置23℃，2500轉/分離心15分鐘的條件離心。離心後密封置於4℃保存留用。

六、外周血單核細胞(pbmc)的獲取與體外培養方法

(1)準備：實驗開始前一天，將抗人cd3和抗人cd28以1:100加入到無菌1xpbs中混勻，以3ml稀釋液加入t25培養瓶中，液體均勻覆蓋瓶底，用封口膠密封錫箔紙包裹後放入4℃過夜。

(2)pbmc分離：

稀釋：將離心後去除血漿的血細胞用1xpbs稀釋，血細胞：pbs體積比＝1:2；分層：取兩支50ml離心管，分別加入15ml淋巴細胞分離液(下層)，傾斜緩慢加入約35ml稀釋血細胞(上層)；

離心：室溫條件，2000轉/分離心20分鐘。

(3)洗滌：吸取分層液中間的白膜層加入到新的50ml離心管。吸取時注意，旋轉吸取，勿將下層紅細胞吸取。用2或3倍體積的1xpbs吹打混勻，離心2000轉/分鐘離心10分鐘。洗滌過程進行兩次。如果紅細胞層表面有白色絮狀物或離心後發現分層不清可將分層不清的液體用pbs洗滌後再次用淋巴細胞分離液分離。由此獲得pbmc，隨後可進行體外培養。

(4)計數接種：洗滌第二次後用培養基重懸，用細胞計數板進行計數，將細胞濃度調整為5×106-1×107/ml，將包被液吸出回收，把細胞懸液接種到包被好的培養瓶中。

(5)細胞因子：白細胞介素1(il-1α),重組白細胞介素-3(ril-3),重組幹擾素(rifn-γ)按下表1中的濃度加入培養基中，並調整培養基總量為15ml，一併加入培養瓶中。

(6)第2天：觀察細胞情況，按500u/ml濃度加入重組白細胞介素-2(ril-2)，並將培養基總體積加至10ml。此後每隔1-2天擴大容積一次並根據細胞克隆團生長情況加入ril-2。根據細胞生長情況，加入自體血清平均濃度為5％(2.5％-10％)。

表1.細胞因子濃度及其添加時間

(7)第4天：體系加至20ml，並維持5％自體血清和300u/mlril-2濃度。

(8)第7天：觀察細胞生長情況，將細胞輕柔吹打，擴至t75培養瓶，總體系達40ml，維持5％自體血清和300u/mlril-2濃度。此後根據細胞生長情況補充液體量。如果細胞量足夠，在培養到第11天或12天時取出1×107細胞。緩慢地混合均勻，製成細胞混合液。細胞在4℃，1800轉/分離心10分鐘，回收上清繼續作為培養基，細胞用cellbankerii按5×105至5×106細胞/ml凍存液緩慢混勻凍存至超低溫冰箱或液氮備用。

(9)自第11天起，將ril-2濃度調整為100u/ml，參考既往文獻發現較低濃度的il-2可以獲得較高比例的cd8+t細胞。

(10)收集細胞：第14天：收集細胞到無菌50ml離心管中，按1800轉/分離心10分鐘，去上清，細胞計數。

(11)將收集的細胞用biolegend公司流式抗體pe抗人cd3，fitc抗人cd4，pe-cy7抗人cd8，fitc抗人cd56，pe抗人cd19對細胞進行標記。細胞用1xpbs混勻，取3×106細胞均分至3個流式管，每管體積500ul；按下表順序加入抗體，抗體加入流式管底部，震蕩後室溫避光20分鐘；再次震蕩，隨後進行流式檢測。

流式檢測的結果顯示，從0至14天發生了如下變化，培養過程中cd19+b細胞消失，cd8+t細胞在兩組中都明顯上升，患者組為培養前35.7％，培養後74％；健康對照組為培養前26.4％，培養後78.2％，兩組在培養後cd8+t比例無明顯差異(p>0.05)。cd3+cd56+表型在健康組表達為59.2％，在患者組為44.7％，兩組間有明顯統計學差異(p0.05)，紅色虛線示無ctl存在，僅有dld-1的陽性對照，od值為2.328，見圖2a。5/1效靶比時(圖2b)，p2，p1+2處理條件下患者組和健康組都出現了殺傷效果的明顯差異；其中5/1靶比下的p2處理條件患者組殺傷的od值分別為1.198±1.134；健康對照組殺傷od值為0.784±0.663。在5/1效靶比下的p1+2處理的患者組od值為0.759±1.526；健康對照的od值為：0.456±0.773。在np處理條件下僅10/1效靶比顯示患者組的ctl殺傷能力優於健康對照(p<0.05)，od值為患者組：0.465±0.443健康組：0.539±0.092。說明肽slykfspfpla，或者肽slykfspfpl和肽rlsscvpva的等比例混合物的添加可以有效的提高ctl的比例，繼而有效的抑制dld1的活力。

實施例二：樹突狀細胞(dc)負載的抗原肽和抗原肽單獨對ctl產生的影響的比較。

樹突狀細胞是提呈能力最強的抗原提呈細胞，本領域技術人員已知，使dc負載抗原肽得到dc疫苗，一般而言，dc疫苗對於單獨抗原肽產生ctl的效率將更高。然而本發明人通過以下實驗的結果，出人意料發現單獨施加抗原肽獲得了比負載抗原肽的dc疫苗更好的效果。

1、獲得負載抗原肽的dc

(1)將外周血樣與1xpbs按1:1體積稀釋後緩慢加入淋巴細胞分離液中，室溫條件下，2000轉/分離心20分鐘；吸取分層液中間的白膜層加入到新的50ml離心管。用2或3倍體積的1xpbs吹打混勻，離心2000轉/分鐘離心10分鐘。洗滌過程進行兩次，得到pbmc。；

(2)將pbmc置於6孔板(6×106-8×106細胞/孔)(5×107細胞/6孔板)，37℃培養1-3小時，輕輕吸取非貼壁細胞。

(3)貼壁細胞在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培養液中培養，添加800u/ml的gm-csf和500u/ml的ril-4，第3天半量換液並補充細胞因子至原濃度，第5天所得的非貼壁細胞即誘導分化而來的未成熟dc。

(4)為了獲得成熟dc，第5天向未成熟dc中加入100ng/ml的lps刺激48小時。

(5)第6天加入1號肽和2號肽，分別按10ug/ml，20ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml一次性加入，刺激細胞到第8天，獲得負載抗原肽的dc。

(6)第8天，收集細胞進行流式分析檢測細胞表型，5管單染配同型對照：fitc抗人cd80、pe抗人cd86、pe抗人cd83、fitc抗人cd11c、pe抗人hla-dr。

(7)第8天，負載抗原體的dc分三組(p1，p2，p1+2)刺激自體pbmc，第四組為不負載抗原的dc與pbmc共培養,培養基更換為lonzax-vivo15，加入5％的自體血清和300u/mlil-2。同時根據實施例1對相應的志願者pbmc進行抗原肽(p1，p2，p1+2)和pbs(陰性對照)的直接刺激。培養到第14天收集所有細胞。

2、ctl殺傷效能

(1)腫瘤細胞鋪板：在步驟1中的細胞培養的第13天對使用rpmi-1640/dmem等體積混合培養基培養的dld-1，用pbs洗滌兩遍，用胰酶消化，含血清培養基終止消化後以900轉/分離心8分鐘，含10％胎牛血清的rpmi-1640/dmem等體積混合培養基重懸計數，將細胞濃度調整到1×103/100ul，鋪96孔板，每孔100ul，每種細胞15個孔(分四個實驗組和一個空白對照組，每組3個復孔)，放入37℃，5％co2培養箱中貼壁6-12小時。

(2)ctl殺傷：在第14天，將p1，p2，p1+2，np四組健康人的ctl和dc負載抗原刺激的健康人t細胞，根據細胞來源的個體一一對應，分別按1×103/100ul、5×103/100ul、1×104/100ul、2×104/100ul濃度加入腫瘤細胞的四個組每孔100ul，效靶比分別為1/1，5/1，10/1，20/1。分別在3天後，7天後進行mts測定，評估各處理組ctl對腫瘤細胞的殺傷情況。

(3)mts殺傷實驗與ifn-γ分泌情況：第3天和第7天將96孔板所有孔中的培養基吸出，按組別分裝進1.5mlep管並標記，凍存入-30℃冰箱備測細胞因子分泌情況。根據promega說明書，按rpmi-1640/dmem等體積混合培養基:mts＝100ul:20ul/孔，將所有孔中加入mts稀釋液，37℃，5％co2培養箱中孵育2-3小時，取出後冰上避光，用酶標儀測492nm波長時的吸光度(od)值，空白對照組僅有培養基無細胞(blank(空白)，所有組別樹脂減去blank的平均值是腫瘤細胞相對吸光度值，即腫瘤細胞相對活力)，陽性對照組僅有腫瘤細胞。ifn-γ分泌量使用elisa方法測定。

實驗結果參見圖3，效靶比為5/1(a)和10/1(b)時dc負載抗原誘導的ctl與抗原直接刺激活化ctl殺傷dld-1效能比較。p1dc+t、p2dc+t、p1+2dc+t、p0dc+t分別代表dld-1與分別由負載抗原肽1、抗原肽2、抗原肽1+2和未負載抗原肽的dc刺激pbmc得到的ctl共孵育。pbmc+p1、pbmc+p2、pbmc+p12、t細胞分別表示dld-1與分別由抗原肽1、2、1+2直接刺激的pbmc得到的ctl和無抗原肽刺激pbmc得到的ctl。

dc負載抗原誘導的ctl與抗原直接刺激活化ctl對dld-1殺傷效果殺傷活性公式為:

blankod值為0.0403，dld-1的od值是3.523，在效靶比為5/1時，負載抗原肽1的dc與抗原肽1直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為26.7％和65.8％(p＝0.054)，負載抗原肽2的dc與抗原肽2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為20.7％和81.3％(p＝0.039)，負載抗原肽1+2的dc與抗原肽1+2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為39.9％和69.2％(p＝0.048)。在效靶比為10/1時，負載抗原肽1的dc與抗原肽1直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為36.3％和88.8％(p＝0.0384)，負載抗原肽2的dc與抗原肽2直接刺激的pbmc得到ctl對dld-1的殺傷率分別為37.5％和89.7％(p＝0.0224)，負載抗原肽1+2的dc與抗原肽1+2直接刺激pbmc得到的ctl對dld-1的殺傷率分別為45.6％和86.6％(p＝0.043)。

對效靶比為5/1，10/1時兩組的ctl活化做ifn-γ分泌量的測定，如圖4，兩處理條件下都顯示在接受p2或p1和p2的混合物(p1+2)刺激時健康人的pbmc活化的ctl更有優勢。

根據實施例2的實驗結果可以看出，使用抗原肽直接刺激pbmc特別是接受兩個抗原肽刺激的情況下，在細胞因子存在的同時，獲得的ctl對dld-1的殺傷能力比使用dc負載抗原後刺激活化同一志願者pbmc來源的ctl的殺傷能力強。使用抗原肽直接刺激pbmc模擬了體內外周血成分接受抗原肽刺激的情形，在活化dc之外，抗原肽同樣活化了其他免疫應答的環節，不同於全腫瘤細胞或腫瘤細胞碎片激活t細胞，腫瘤新生抗原肽優化了識別過程，使得僅擁有特異性抗原tcr的t細胞擴增活化，能夠更加精準靶向腫瘤細胞，因此使用直接使用抗原刺激外周血也可以實現相同的效果。

序列表

上海市東方醫院

一種製備結直腸癌抗原特異性t細胞的方法

2

patentinversion3.3

1

10

prt

人工序列

1號肽，即轉化生長因子βii型受體框移突變產生的新抗原肽

1

serleutyrlyspheserpropheproleu

1510

2

9

prt

人工序列

2號肽，即o位n-乙醯葡萄糖胺糖基轉移酶框移突變產生的新抗原肽

2

argleusersercysvalprovalala

15