新型高等植物的製作方法以及高等植物的生長促進方法

2023-06-13 22:15:21 2

專利名稱：：新型高等植物的製作方法以及高等植物的生長促進方法
技術領域：
：本發明涉及在葉綠體的類嚢體腔內具有細胞色素C6的新型高等植物的製作(作出)方法、以及使細胞色素C6存在於上述類嚢體腔中從而促進高等植物生長的方法、或促進高等植物的固碳能力的方法。
背景技術：
：以往，關於促進陸地植物等所謂高等植物生長的技術，有提高核酮糖二磷酸羧化酶等酶的活性等與光合作用暗反應(Calvin-Bensoncycle,卡爾文本森循環)相關的報告的例子，具體有通過導入相關酶基因使葉增大的報告例(Shigeoka等人.，Naturebiotechnology,19，965-969(2001))等。但是，在對各種高等植物應用方面上述技術的通用性非常欠缺。已知細胞色素C6是光合作用光反應中的電子傳遞蛋白質，本來只存在於一部分藻類(藍藻類等)中，其電子傳遞能力極為優異(即氧化還原電位是高電位)(圖l)。因此人們強烈希望開發出能夠在各種高等植物的葉綠體中(具體來說在類嚢體腔內)中表達細胞色素c6並發揮其功能，從而提高光合作用能力的通用性優異的技術。作為在細胞內表達細胞色素c6的4支術，例如已知有F.P.Molina-Heredia等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，243，302-306(1998);T.Satoh等人.，FEBSlett.，531，543-547(2002);R.Gupta等人.，Nature,417,567-571(2002);D.R.Hickey等人.，Gene,105，73-81(1991)等文獻中記載的技術。但是，這些技術均使用大腸桿菌、酵母或藍藻等非高等植物的宿主細胞，其目的只是大量生產上述細胞色素C6或與其類似的蛋白質或進行功能分析，其包含在以往本領域技術人員通常進行的基因表達方法中。在高等植物中，關於使細胞色素C6發揮光合作用光反應的電子傳遞體功能，也就是說，使細胞色素C6存在於高等植物細胞內的葉綠體中的類嚢體腔內的成功的例子，目前完全未見，被認為是極為困難的
發明內容本發明要解決的課題在於提供在葉綠體的類嚢體腔內具有細胞色素C6的新型高等植物的製作方法，進而提供促進高等植物生長的方法，促進選自ATP、NADPH、澱粉和蛋白質中的至少一種的合成的方法，以及促進固碳的方法。本發明人為解決上述課題進行了深入的研究。結果發現，如果將附加有特定信號肽的細胞色素C6蛋白質的基因導入高等植物的基因組DNA中並使其表達，則可以使以往被認為不可能的細胞色素"向葉綠體被膜內和類嚢體膜內的轉運(通過)成為可能，從而完成了本發明。即，本發明如下(1)在葉綠體類嚢體腔內具有細胞色素C6的高等植物的製作方法，其特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中，其中所述融合蛋白是在細胞色素C6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(2)高等植物的生長促進方法，其特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體的類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素c6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(3)促進高等植物的選自ATP、NADPH、澱粉和蛋白質中的至少一種的合成的方法，其特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體的類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素C6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(4)促進高等植物固碳的方法，其特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素"存在於葉綠體的類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素"蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。上述(l)-(4)的方法中，上述融合蛋白可以是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質。(a)含有SEQIDN0.2所示胺基酸序列的蛋白質(b)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDNO,2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。(C)含有下述胺基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。(d)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列和相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列分別有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。上述(l)-(4)的方法中，上述基因可以是含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA(b)在嚴謹條件下與含有互補鹼基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，其中所述互補鹼基序列是與含有SEQIDNO.1所示鹼基序列的DNA互補的鹼基序列。(5)在細胞色素C6蛋白質上附加50-80個胺基酸殘基的信號肽而成的融合蛋白。上述(S)的融合蛋白可以是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質。(a)含有SEQIDNO.:2所示胺基酸序列的蛋白質(b)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列(c)含有下述胺基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列是SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述細胞色素Q蛋白質的胺基酸序列有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列(d)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列和相當於上述細胞色素"蛋白質的胺基酸序列分別有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。(6)編碼上述(5)的融合蛋白的基因。(7)含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA(b)在嚴謹條件下與含有互補鹼基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，其中所述互補鹼基序列是與含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA互補的鹼基序列。(8)含有上述(6)或(7)的基因的重組載體。(9)轉化體，該轉化體是將上述(8)的重組載體導入宿主而成。上述(9)的轉化體可以是宿主為土壤桿菌的轉化體。(10)轉化高等植物，其中，上述(6)或(7)的基因被導入到植物基因組中。上述(10)的轉化高等植物優選在植物細胞葉綠體類嚢體腔中具有細胞色素C"圖l是表示葉綠體類嚢體膜的光合作用電子傳遞系統的圖。圖2是表示本發明的經由土壤桿菌的細胞色素"基因導入和植物內細胞色素C6表達方式的模式圖。圖3是表示藍細菌和藻類與高等植物間電子傳遞系統的區別的圖。圖4是表示條斑紫菜(Porphyrayezoensis)細胞色素"的cDNA鹼基序列以及推定的胺基酸序列的圖。圖5是表示通過PCR擴增條斑紫菜細胞色素C6基因的成熟蛋白質區的結果圖。圖6是表示在植物導入用細胞色素C6基因的構建中使用的pBluescriptIISK+A栽體的圖。圖7是表示來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的質體藍素的信號肽和來自條斑紫菜的細胞色素C6成熟蛋白質區融合得到的基因鹼基序列和推定的胺基酸序列的圖。圖8是表示通過三親本雜交進行的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉化法的模式圖。圖9是表示通過PCR確定導入到植物中的細胞色素C6基因的電泳結果圖。(A)是使用基因組DNA作為模板時的結果，(B)是使用總RNA作為模板時的結果。圖10是表示通過電泳確定在植物內表達的細胞色素C6的結果圖。(A)是CBB染色的結果，(B)是與細胞色素c6抗體反應的蛋白質印跡結果。圖ll是表示伴隨生長天數的增加，野生型(O)和轉化擬南芥(，)的高度的變化圖。圖的各數值表示平均土S.D.(標準偏差)(n-20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖12是表示伴隨生長天數的增加，野生型(0)和轉化擬南芥(*)的根長的變化圖。圖表的各值表示平均土S.D.(標準偏差)(1^20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖13是表示伴隨生長天數的增加，野生型(O)和轉化擬南芥(，)的葉的大小的變化圖。圖的各值表示平均土S.D.(標準偏差)(n-20)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖14是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後葉綠素含量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標準偏差)(11=8)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖15是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後ATP含量變化的圖。圖的各值表示平均土S.D.(標準偏差)(n-8)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖16是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後NADPH含量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標準偏差)(11=8)。星號(*)表示在5°/。顯著水平下可見顯著差異的值。圖17是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後二氧化碳同化能力的變化圖。圖的各值表示平均±S.D.(標準偏差)(11=10)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖18是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後澱粉量的變化圖。圖的各值表示平均土S.D.(標準偏差)(n-10)。星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。圖19是表示伴隨生長天數的增加，野生型和轉化擬南芥在光照射3小時後蛋白質量變化的圖。圖的各值表示平均±S.D.(標準偏差)(11=8).星號(*)表示在5%顯著水平下可見顯著差異的值。具體實施方式以下對本發明進行詳細說明，但本發明的範圍並不受限於這些說明，對於以下所列舉的內容以外的內容，可以在不損害本發明宗旨的範圍適當變更實施。本說明書包含本申請優先權主張的基礎-日本特願2005-27012號說明書整體。本說明書中所引用的全部現有技術文獻、以及公開公報、專利公報及其它專利文獻可作為參考引入本說明書中。1.本發明的概要本發明涉及將編碼細胞色素C6與信號肽的融合蛋白的基因導入高等植物內，使發揮光合作用光反應電子傳遞體作用的細胞色素C6在高等植物細胞內的葉綠體類嚢體腔中表達，且發揮功能，由此促進高等植物生長的方法(圖2)。根據本發明，高等植物細胞內的ATP、NADPH、澱粉和蛋白質的合成得到促進，與其相伴，將二氧化碳(C02)轉換為碳水化合物的光合作用暗反應(固碳反應)也得到促進。本發明包含上述促進高等植物中ATP等的合成或固碳的方法，還包含可促進生長、促進ATP等的合成、以及促進固碳的高等植物的製作方法。通常，在光合作用光反應(光合作用電子傳遞反應)中，葉綠素的電子獲得太陽光的能量，使類嚢體腔內(類嚢體膜中)的電子傳遞鏈依次轉移，此時，葉綠素由水獲得電子，使氧(02)游離，伴隨上述電子傳遞反應，經由類嚢體膜吸收H+，並通過由此產生的質子的驅動力，在葉綠體基質內合成ATP。一系列反應的結果是入0+(與H+—起)接受高能量電子，合成NADPH。與此相對，在光合作用的暗反應(固碳反應)中，在光合作用光反應中合成的ATP和NADPH分別作為能量來源和還原力發揮作用，由此在葉綠體基質內和細胞質中，C02轉化成碳水化合物。通過該固碳反應，在植物的葉等中合成蔗糖。蔗糖被轉運到其它組織中，作為各種有機分子的合成材料、繼而作為植物自身生長所需的能量來源使用。通常，高等植物的光合作用光反應的電子傳遞體(電子傳遞蛋白)是質體藍素(PC)，關於電子傳遞能力(氧化還原電位的高低)，已知作為藻類的電子傳遞體的細胞色素C6明顯優異(圖3)。因此，以往為了使該細胞色素"在高等植物內表達或發揮功能，從而促進光合作用光反應和暗反應，作了各種嘗試。但是，上述嘗試在實際應用時極為困難，目前尚未有成功的例子。高等植物中，為了使基於細胞內的基因組信息而表達的蛋白質發揮光合作用光反應電子傳遞體的功能，存在於類嚢體腔中是必須條件。為此，通常需要通過"葉綠體被膜"和"類嚢體膜"兩種膜。這一點是細胞色素C6在高等植物中表達功能極為困難的主要原因。因此，本發明人通過基因重組技術，將細胞色素C6基因導入高等植物的基因組中時，在構建了預先附加有信號肽序列的基因的基礎上進行上述導入，使細胞色素C6蛋白質以附加有特定的信號肽(特定長度或特定胺基酸序列的信號肽)的融合蛋白的形式進行表達。結果，導入該基因而製作的植物體中，可見在類嚢體腔中有細胞色素C6蛋白質(沒有信號肽)的存在，結果顯示，表達的融合蛋白通過其信號肽的作用，可通過上述兩種膜，從而完成了本發明。(1)PYC6基因導入系統的研究目前已知PYC6的氧化還原電位是高電位，另外，該PYC6基因序列已經解明。本發明中，首先將PYC6基因連接到雙元載體("^於U^^夕夕^)上，製備轉化用土壤桿菌。擬南芥(Arabidopsisthaliana)在播種後進行低溫處理，然後在長日照條件下生長，在抽苔(抽臺)階段通過減壓浸潤進行轉化。接著對所得轉化物進行基因導入和表達的分析，以從植物體提取的基因組DNA和RNA作為模板，分別進行PCR、RT-PCR。結果，可見PYC6基因的擴增，通過DNA測序儀確認該鹼基序列與PYC6基因相同。接著，為了分析轉化體中確認的PYC6基因是否作為蛋白質表達，從植物體提取葉綠體蛋白質級分，進行電泳，然後進行蛋白質印跡分析。結果確認了PYC6蛋白質的表達。另外，對所得轉化體中的PYC6蛋白質的N末端胺基酸序列進行分析，結果，與導入的PYC6胺基酸序列(PIRaccessionNo.:JC5849)—致。該結果表明，在高等植物A.thaliana內成功地表達了來自藻類的cytc6(PYC6)。(2)PYC6導入對植物體的影響如後述實施例所示，觀察導入PYC6的植物的生長，發現葉的大小比野生型(WT)增大約1.2-1.3倍，高度增大約1.5倍。導入PYC6的植物在生長初期階段與WT比較，生長速度提高。對導入PYC6的植物中的葉綠素量進行測定，結果為WT的大約1.1-1.2倍。該通過導入PYC6而在植物體中觀察到的現象的原因推測可能是由於利用了作為光反應最終產物的能量物質，光合作用的反應整體活化。為此，通過螢光素■螢光素酶法對導入PYC6的植物的ATP量進行測定，結果與WT比較，約增大1.7倍。這被認為是由於除了在擬南芥(A.thaliana)中發揮功能的質體藍素之外，紅藻CytC6作為新的電子傳遞體發揮了功能，由此光反應的電子傳遞被活化，其最終產物ATP量增加，並且植物整體的生長被活化。該融合蛋白通過上述兩種膜時，在通過第一膜(葉綠體被膜)時使用了信號肽的一部分，在通過第二膜(類嚢體膜)時使用了其餘的部分，分別使用後脫離，PYC6最終以沒有信號肽的狀態轉運到類嚢體腔內。該轉運的PYC6蛋白質在該類嚢體腔內與血紅素(、厶)(血紅素c)結合，且通過摺疊，形成可發揮電子傳遞體功能的細胞色素C6。2.新型高等植物的製作方法本發明的製作方法如上所述，是在葉綠體的類嚢體腔內具有細胞色素C6的新型高等植物的製作方法，該方法的特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入到高等植物的基因組中，其中所述融合蛋白是細胞色素"蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。(1)作為製作對象的高等植物可在本發明的製作方法中使用的高等植物、即可轉化為在葉綠體的類嚢體腔內具有細胞色素C6的高等植物並沒有限定，例如可以是以下高等植物。本發明中，作為對象的植物是指植物整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束、柵欄組織、海綿組織等)或植物培養細胞(包含愈傷組織等的組織培養)的任意一種。轉化使用的植物包括C3、C4、CAM植物和它們的中間植物等，例如有屬於十字花科、茄科、禾本科、豆科、藜科、薔薇科、菊科、百合科、石竹科、葫蘆科、旋花科、莧科、鳳梨科、仙人掌科和聲薈科等的植物(包含果實、蔬菜、花卉等)(參照下述)，但並不限於這些植物。[C3植物十字花科擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘿蔔(Raphanus)等.茄科菸草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanum)等.禾本科水稻(Oryzasativa)、玉米(zeamays)、小麥(Triticun)等豆科大豆(Glycinemax)、豌豆(Pisum)等-藜科菠菜(Spinacia)等.薔薇科山櫻(Prunus)、薔薇(Rosa)等菊科一年蓬(飛蓬屬)、蒲公英(Taraxacun)等-葫蘆科南瓜(Cucurdida)、黃瓜(Cucumis)等-旋花科紅薯(Ipomea)等-蘭科羽蝶蘭(Poneorchis)等[C4植物禾本科玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、穀子(Setariaitarica)等莧科尾穗莧(Amaranthaceae)等[CAM植物鳳梨科菠蘿(Ananascomosus)等.仙人掌科翠冠玉(，7-—廿)(Lophophoradifusa)、仙人掌屬(Opuntiaspp.)等，薈科木立，薈(Aloearborescens)、蘆薈(Aloevera)等[C3-C4中間植物-蕃杏科輪生粟米草(Mollugoverticillata)等禾本科黍子(Panicummilioides)等其中，作為本發明的製作方法的效果，從可獲得促進生長效果高的植物考慮，例如對於市場性高的植物本發明的利用價值高，具體優選列舉食葉植物(菠菜、巻心菜等)、賞花植物(薔薇、蝴蝶蘭等)、食莖植物(馬鈴薯、藕等)、食根植物(牛蒡、蘿蔔等)、穀物(水稻、小麥等)、果實植物(菠蘿、葡萄等)、觀賞植物(松樹、楓樹等)、木材(杉樹、柏樹等)等。(2)融合蛋白本發明的製作方法中，向高等植物的基因組中導入編碼特定融合蛋白的基因，該融合蛋白是在細胞色素C6蛋白質上附加有特定長度的信號肽的融合蛋白，這是非常重要的。對於上述融合蛋白，信號肽的長度為50-80個胺基酸殘基是重要的。這樣，由於信號肽足夠長，因此細胞色素C6蛋白質葉綠體被膜和類嚢體膜均可通過。信號肽的序列通過由高等植物進行基因克隆來確定。上述融合蛋白中的信號肽通常優選附加在細胞色素C6蛋白質的N末端。本發明中，上述融合蛋白例如優選為以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質。(a)含有SEQIDNO.:2所示胺基酸序列的蛋白質(b)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDNO.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列(c)含有下述胺基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDNO,2所示胺基酸序列中的相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列(d)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列和相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列分別有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列上述(a)的蛋白質如SEQIDN0.2所示，是共含有157個胺基酸的蛋白質，該157個胺基酸是在含有構成細胞色素C6蛋白質的85個胺基酸(SEQIDN0.6)的序列的N末端一側附加(連接)含有構成信號肽的72個胺基酸(SEQIDN0.4)的序列而成的；也可以是含有SEQIDN0.2所示胺基酸序列的融合蛋白。信號肽並不限於上述72個。這裡，對細胞色素C6蛋白質的來源沒有特別限定，可以使用紅藻(Porphyrayezoensis,條斑紫菜)、藍藻、褐藻、硅藻和綠藻等，優選來自紅藻(P.yezoensis)的蛋白質。來自P.yezoensis的細胞色素c^蛋白質的胺基酸序列是公知的(PIRaccessionNo.:JC5849)，可通過資料庫檢索獲得。上述(b)的蛋白質只要是含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力即可，沒有限定，所述胺基酸序列為構成上述(a)的蛋白質的全部胺基酸序列中的相當於上述信號肽的72個胺基酸序列(SEQIDNO.4)有l或多個(例如l個-10個左右，優選l個-5個左右)胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。上述(b)的蛋白質與上述(a)的蛋白質同樣，是具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力的蛋白質，這點是^f艮重要的，因此優選第53號-第72號的胺基酸等被認為是對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜重要的部分的胺基酸序列不被從上述(a)蛋白質的胺基酸序列中突變置換。上述(c)的蛋白質只要是含有下述胺基酸序列、且具有(光合作用光反應)電子傳遞能力的蛋白質即可，沒有限定，所述胺基酸序列為構成上述(a)的蛋白質的全部胺基酸序列中的相當於上述細胞色素C6蛋白質的85個胺基酸序列(SEQIDNO.2)有l個或多個(例如l個-10個左右，優選l個-5個左右)胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。這裡，上述"具有電子傳遞能力的蛋白質"在本發明中是指含有胺基酸序列的胺基酸序列的i白;，是指在與血紅"^(血紅素，)結合後具有電子傳遞能力的蛋白質。上述(C)的蛋白質與細胞色素C6蛋白質同樣，是具有電子傳遞能力的蛋白質，這是非常重要的，因此，優選例如第14號-第18號胺基酸、以及第47號-第60號胺基酸等被認為對於在高等植物的光合作用光反應中發揮電子傳遞功能而言重要的部分的胺基酸序列不被從上述(a)蛋白質的胺基酸序列中突變置換。上迷(d)的蛋白質只要是含有下述胺基酸序列，且有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜的能力，以及(光合作用光反應)電子傳遞能力即可，沒有限定，所述胺基酸序列為構成上述(a)的蛋白質的全部胺基酸序列中的相當於上述信號肽的72個胺基酸序列(SEQIDN0.4)有1個或多個(例如1個-10個左右、優選l個-5個左右)胺基酸缺失、置換或附加，而且相當於上述細胞色素C6蛋白質的85個胺基酸序列(SEQIDN0.6)有l個或多個(例如1個-10個左右、優選l個-5個左右)胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。這裡，上述"具有電子傳遞能力的蛋白質"的含義與上述(c)蛋白質的情形相同。上迷(d)的蛋白質與上述(a)的蛋白質同樣，是具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質，除此之外，還與細胞色素"蛋白質同樣，是具有電子傳遞能力的蛋白質，這也是非常重要的，因此，優選例如第53號-第72號的胺基酸等被認為對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜而言重要的部分的胺基酸序列、第14號-第18號胺基酸和笫47號-第60號胺基酸等被認為對在高等植物的光合作用光反應中發揮電子傳遞體功能而言重要的胺基酸序列不被從上述(a)蛋白質的胺基酸序列中突變置換。可通過立體結構分析和氧化還原電位的測定來確認上述(c)和(d)的蛋白質是否具有電子傳遞能力，以及具有電子傳遞能力時進行測定。細胞色素C6的氧化還原電位大約是350-370mV左右。編碼上述SEQIDN0.2所示胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、插入或附加的胺基酸序列的多核苷酸可按照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6)等記載的位點專一性誘變法等方法製備。製備編碼上述胺基酸缺失、置換或附加等的突變型的基因時，例如可通過Kunkel法或缺口雙鏈體法等公知的方法，4吏用利用位點專一性誘變法的突變導入用試劑盒、例如QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(只h歹夕司制)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(47匕*卜口^工7公司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan國SuperExpressKm等夕力，,《4才公司制)等進行。(3)基因本發明的製作方法中，向高等植物的基因組中導入的基因是編碼上述融合蛋白的基因，這是很重要的。本發明中，上述基因例如優選是含有下述(a)或(b)的DNA的基因。要說明的是，以下的(a)和(b)的DNA均是上述融合蛋白的結構基因(即，編碼信號肽的基因與細胞色素C6或與其具有同樣的電子傳遞能力的蛋白質的結構基因相連接而成的基因)，含有這些DNA的基因可以只含有這些DNA，還可以含有這些DNA作為一部分，除此之外，還可以含有該融合蛋白的結構基因表達所必須的公知的鹼基序列(轉錄啟動子、SD序列、Kozak^列、終止子等)，沒有限定。編碼細胞色素C6的鹼基序列例如在日本DNA資料庫(DDBJ)中已經公開發表，為公知的(accessionnumber:AB40818)。(a)含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA(b)在嚴謹條件下與含有互補鹼基序列的DNA雜交的DNA,且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，其中所述互補鹼基序列是與含有SEQIDNO.1所示鹼基序列的DNA互補的鹼基序列。上述(b)的DNA可使用含有上述(a)的DNA或與其互補的鹼基序列的DNA、或者它們的片斷作為探針，實施集落雜交、噬菌斑雜交、以及DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫或基因組文庫獲得。文庫可以利用按照z〉知方法所製備的文庫，也可以利用市售的cDNA文庫或基因組文庫，沒有限定。編碼信號肽部分的鹼基序列(SEQIDN0.3)、編碼細月包色素C6的鹼基序列(SEQIDN0.5)兩者或其中一方的一部分可以發生突變。雜交方法的詳細步驟可適當參照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等，實施雜交法中，"嚴謹條件"是指雜交後洗滌時的條件，是指緩衝液的鹽濃度為15-750mM、溫度為25-65*€，優選鹽濃度為15-150mM、溫度為45-55t:的條件。具體來說，可列舉例如50mM、50t)等的條件。並且，除上述鹽濃度、溫度等條件之外，還可以考慮探針濃度、探針長度、反應時間等各條件，適當設定獲得上述(b)的DNA的條件。上述(b)的DNA可按照本領域技術人員所公知的方法，使用適當的片斷製備探針，使用該探針，通過集落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫和基因組文庫獲得。上述雜交中，嚴謹的條件例如可列舉lxSSC-2xSSC、0.10/o-0.5。/。SDS以及30lC-80t:的條件，更具體地說可列舉以下條件在60-68X:下進行30分鐘以上的預雜交，然後添加探針，在68C保持1小時以上，形成雜種，然後在2xSSC、0.:r/。SDS中、在室溫下洗滌5-15分鐘，進行l-2次。雜交的DNA優選為與上述(a)的DNA鹼基序列至少具有70%以上同源性的鹼基序列，更優選80%以上，進一步優選90/。以上，更進一步優選95%以上。上述(b)的DNA是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，這是很重要的，因此在考慮翻譯後的胺基酸序列時，優選具有下述鹼基序列使例如第53號-第72號胺基酸等被認為對通過上述葉綠體被膜或類嚢體膜而言重要的部分的胺基酸序列、或者第14號-第18號胺基酸以及第47號-第60號胺基酸等被認為是對在高等植物的光合作用光反應中發揮電子傳遞功能重要的部分的胺基酸序列沒有被從上述(a)的蛋白質的胺基酸序列中突變置換的鹼基序列。上述(b)的DNA例如並不與上述(a)的DNA完全相同，可優選列舉將其中的第103號的鹼基由"T(胸腺嘧啶)"置換為"A(腺嘌呤)"，所翻譯的胺基酸由"Ser(絲氨酸)"變異為"Thr(蘇氨酸)"的DNA;第216號的鹼基由"C(胞嘧啶)"置換為"T(胸腺嘧啶)"，但所翻譯的胺基酸不變化的DNA;以及將這些鹼基置換組合而變異的DNA等。本發明中，上述基因是在高等植物中表達，因此與胺基酸對應的密碼子必須含有在轉錄後顯示通常的植物中使用的密碼子(優選使用頻率高的密碼子)的DNA。(4)基因的導入方法不改變高等植物的其它形態，向其基因組中導入編碼上述融合蛋白的基因(目標基因)，製作新型高等植物(轉化高等植物)，對該方法沒有特別限定，可以任意採用土壤桿菌法、電穿孔法、以及基因槍法等公知的基因重組技術。例如優選採用導入了含有目標基因的雙元載體的土壤桿菌屬細菌(根癌種病菌(根頭力s厶種病菌))的減壓浸潤法等。以下進行詳細說明。(i)重組栽體對含有編碼上述融合蛋白的基因的重組栽體沒有限定，優選可作為上述雙元載體使用的栽體。具體來說，優選將要整合入植物基因組中的目標基因(取代GUS基因)插入到具有因Vir區基因的作用而切取的T-DNA區的載體的該T-DNA區中，從而構建的載體。上述具有T-DNA區的載體優選pBI121載體(Clontech公司制；以卡那黴素耐性基因作為選擇標誌(選択7—力一)，在35S啟動子的下遊含有GUS基因)、pBI101栽體(Clontech公司制；以卡那黴素耐性基因作為選擇標誌，含有GUS基因)等。另外，雖然不能用於減壓浸潤法，但向適合宿主細胞的公知的表達載體中插入目標基因而構建的重組栽體也包含在本發明的重組載體中。還可根據需要，通過PCR等，在該基因的上遊附加轉錄啟動子或SD序列(宿主為原核細胞時)或Kozak序列(宿主為真核細胞時)，在下遊附加終止子。上述轉錄啟動子等融合蛋白表達所必須的各要素可以含在目標基因中，原本含在表達載體中時也可以使用其，沒有限定。上述重組栽體例如可以用於上述融合蛋白的大量生產等。這些各種重組載體的製備中，可以適當採用使用限制酶的方法、使用拓樸異構酶的方法等公知的基因重組技術和條件等進行。(ii)導入重組栽體而成的轉化體對導入重組栽體的宿主沒有限定，最終進行減壓浸潤法時，作為導入雙元載體的宿主，可使用土壤桿菌屬細菌(Agrobacteriumtumefaciens，根癌土壤桿菌等)。使用土壤桿菌屬細菌時，通常使用預先進行了轉化的菌體(土壤桿菌屬細菌的轉化體)，即，該細菌原本所具有的Ti質粒上的T-DNA區中的癌基因被破壞或者被除去等。除此之外，作為重組栽體，導入表達載體時，可以使用公知的宿主，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、黴菌、人或小鼠等各種動物細胞等。對宿主的轉化方法沒有限定，可以考慮宿主與重組栽體的組合，由公知的方法中適當選擇實施。例如可優選實施電穿孔法、脂轉染法、熱休克法、PEG法、磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法等。所得轉化體中，實際使用的宿主與重組載體中所含有的EBNA1突變體基因的密碼子型的宿主可以一致，也可以不同，沒有限定。(iii)高等植物的轉化和轉化高等植物對向高等植物的基因組中導入目標基因，製備轉化高等植物的方法沒有限定，優選上述減壓浸潤法。另外，進行轉化的植物體的狀態優選使用成體或愈傷組織。通過減壓浸潤法進行高等植物的轉化的方法，具體如下(a)使含有重組載體(雙元栽體)的轉化細菌(土壤桿菌屬細菌的轉化體)感染高等植物的葉片，其中所述重組載體中插入有編碼上述融合蛋白的基因；(b)在含有卡那黴素等抗生素的選擇性培養基中培養；(c)形成不定芽愈傷組織，栽培，得到轉化高等植物。進行減壓浸潤法時，各處理步驟的方法和處理條件等都可由公知的範圍適當選擇進行，沒有限定。上述所得到的轉化高等植物中，其基因組中導入了編碼上述融合蛋白的基因。以該基因為基礎表達的融合蛋白具有上述信號肽，具有通過植物細胞中的葉綠體被膜和類囊體膜的能力。從而，所得轉化高等植物在類嚢體腔內具有細胞色素"(優選作為光合作用光反應的電子傳遞體的細胞色素C6)。所得轉化高等植物中，作為光合作用光反應的電子傳遞體，不僅質體藍素(PC)，細胞色素C6也發揮該功能，有效地實現了促進生長。轉化高等植物成體的大小(高度、根長、葉的大小等)沒有限定，與野生型相比，例如可以是l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.5倍以上(例如約1.9倍)。轉化高等植物中，與促進生長的效果同樣，也可得到使各細胞中各種分子數增加的效果。例如葉綠素分子的量與野生型相比例如約為l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.5倍以上(例如約1.6倍)，光合作用能力進一步提高，但並不限於此。所得轉化高等植物中，光合作用效率提高，對其產物ATP的合成量沒有限定，與野生型相比例如為l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.5倍以上(例如約1.7倍)，同樣，對NADPH的合成量沒有限定，與野生型相比例如為l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.5倍以上(例如約1.7倍)。所得轉化高等植物中，由於ATP和NADPH的合成量增加，它們發揮了能量源或還原力的作用，因此光合作用暗反應效率也提高.例如，轉化高等植物中，將二氧化碳(C02)轉換為碳水化合物的固碳能力與野生型的相比例如為l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.4倍或以上。並且，所得轉化高等植物中，光合作用的光反應、暗反應效率得到促進，由此蛋白質合成效率也提高。例如，轉化高等植物的蛋白質含量例如為l.l倍以上，優選1.2倍以上，進一步優選1.5倍以上。也有望獲得硫酸和硝酸代謝或者各種胺基酸合成、脂類合成量、色素以及花的增加等。所得轉化高等植物中，優選至少具有一種上述各種作用效果，更優選其有兩種以上，進一步優選具有所有效果。3.高等植物的生長促進方法，促進ATP、NADPH、澱粉和蛋白質合成的方法以及促進固碳的方法如上所述，在所得轉化高等植物中，可見(i)促進生長、(ii)促進ATP、NADPH、澱粉和蛋白質的合成、以及(iii)促進固碳的效果。因此，本發明也包含高等植物生長促進方法，促進高等植物的選自ATP、NADPH、澱粉和蛋白質中的至少一種的合成的方法，以及高等植物的固碳促進方法。這些方法的具體特徵是將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體的類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素C6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。這些方法中，對於融合蛋白、編碼該蛋白質的基因、該基因向高等植物基因組中導入的方法、以及所得轉化高等植物的各種作用效果等均與上述本發明的高等植物的製作方法中的說明和列舉等同樣。以下給出實施例，更具體地說明本發明，但本發明並不受其限定。[實施例l]導入用細胞色素^基因和植物表達用載體的構建(1)來自條斑紫菜的細胞色素C6成熟蛋白質區基因的製備本實施例中，通過克隆得到來自條斑紫菜的細胞色素C6基因，與載體連接，製備質粒.以該質粒為模板，擴增本說明中的目標DNA—來自條斑紫菜的細胞色素"成熟蛋白質區基因。然後進行電泳，通過凝膠提取，提取目標基因，然後用限制酶(SacI，Pstl)消化，製備基因。反應液按照以下的組成，在0.5ml輔助PCR用離心管(777卜PCR用於二一7，)中製備。模板(質粒DNA(細胞色素Ce全長))1.0"I引物(1)(10pmol/〃D1.0引物(2)(10pmol/"l)1.010xExTaq緩衝液(1^2、1115)(1^2+濃度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0"IDMSO1.25//1滅菌水16.1"1TaKaRaExTaq(5U///I)0.15"1總體積25.0#1引物(1):PYC6-Oter邁SacI(lOpmol/jil)(30邁er，GC-Cont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)引物(2):Cyt-SD(10pmol/pl)(29邁er，GOCont,:48.2%)5'-GCGGGGAGAGGTTAAATTGAAGAAGAAGG-3'(SEQIDNo.8)在上述反應液中鋪15jil的礦物油。然後用PTC-10TM可控熱循環控制儀(ProgrammableThermalController)進4亍反應。反應是以94"C48秒、62t)48秒、72X:i分24秒的反應為一個循環，進行31個循環。反應終止後，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向20nl所得PCR產物中加入4fil凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在100V下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。從2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠中切取被認為是目標DNA的條帶，儘量切細。然後將該凝膠裝入AmiconUltrafree(註冊商標)DA中，以7，300rpm、4"C離心10分鐘。離心後，取下UltrafreeMC(上側的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯盼，使用渦流攪拌器(求少亍？夕只)進行充分攪拌。然後以14,000rpm、4X:離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5Y。乙醇2vo1.。充分攪拌，然後在-20t:下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500pl75%乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清。將沉澱風乾一定程度，然後溶解於50jilTE中。接著，按照下述所示組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，通過在37X:下溫育120分鐘，用限制酶SacI進行消化。凝膠提取後樣品5.0#110XL緩衝液2.0/ilSac10.5滅菌水12.5//I總體積20.0jUl向溫育後的樣品溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器充分攪拌。然後以14，000rpm、4TC離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌後，在-20TC下放置30分鐘。然後以14,000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500jil75%乙醇，充分洗滌沉澱。再以14,000rpm、4*€離心5分鐘，棄去上清。將沉澱風乾一定程度，然後溶解於20nl的TE中。接著，按照以下所示組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，通過在37t:下溫育120分鐘，用限制酶PstI進行消化。限制酶消化後樣品5.0AM10XH緩衝液2.0Pstl0.5/il滅菌水12.5jul總體積20.0/iI反應終止後，通過2。/o(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向20nl所得PCR產物中加入4nl凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在IOOV下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光革的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。然後，從2。/o(w/v)瓊脂糖凝膠中切取被認為是目標DNA的條帶，儘量切細。然後將該凝膠裝入AmiconUltrafree(註冊商標)DA中，以7，300rpm、4t:離心10分鐘。離心後，取下UltrafreeMC(上側的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器進行充分攪拌。然後以14,000rpm、4"C離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌，然後在-20C下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4t:離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500jil75%乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4TC離心5分鐘，棄去上清。將沉澱進行一定程度的風乾，然後溶解於20jilTE中。結果如下所示。以插入了來自條斑紫菜的細胞色素C6基因(全長)的質粒作為模板，通過PCR擴增細胞色素C6成熟蛋白質區(PYC6)基因(圖4)。然後將PCR產物進行2。/c(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在357bp附近可見單一的條帶(圖5)。該條帶可認為是PYC6基因.將該PYC6基因用兩種限制酶(SacI、Pstl)消化，進行2%(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，將被認為是PYC6基因(保有SacI、PstI位點)的265bp附近的條帶從凝膠中提取，用苯酚提取，用乙醇進行沉澱，得到保有SacI、Pstl位點的PYC6基因。(2)向細胞色素C6附加通過葉綠體被膜和類嚢體膜的肽的基因本項中，是將進行了BamHI和PstI限制酶處理和脫磷酸化(BAP處理)的通過葉綠體被膜和類嚢體膜的肽的基因、與進行了SacI和PstI限制酶處理的來自條斑紫菜的細胞色素C6成熟蛋白質區的基因進行連接。然後與克隆載體(pBluescript(註冊商標)IISK+)連接，進行亞克隆，確認植物導入用細胞色素C6(sp+PYC6)基因的鹼基序列。DNA測序時使用下述通用引物。FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/iil)5'-GGCCAGGGTTTTGCGAGTCACGAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用正向引物(M13Rv引物)(2pmol/pl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(SEQIDNo.10)(2-1)植物導入用細胞色素C6基因的製備按照以下組成製備反應液。通過葉綠體被膜和類囊體膜的肽的基因(經BAP處理)4.0JLMP.yezoensis細胞色素ce成熟蛋白質區基因4.0/iI10x連接緩衝液2.0〃I2mg/mlBSA溶液2,5〃I酶溶液(T4DNA連接酶)1.0〃I滅菌水6.5〃I總體積20.0jul將製備的反應液在低溫恆溫槽(161C)下溫育過夜，進行連接反應。接著，向該溶液中加入鹼性磷酸酶，進行脫磷酸化。按照以下組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，在37X:下溫育3小時，通過細菌鹼性磷酸酶進行脫磷酸化處理。連接後樣品10.0/il10xBAPBuffer10.0#1細菌鹼性褲酸酶(BAP)2.5jUl滅菌水77.5/il總體積100.0jUl向溫育後的樣品溶液中加入等量的PE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分攪拌。然後以14，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌，在-20t:下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500nl75%乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清，將沉澱風乾一定程度，然後溶解於20fil的TE中。(2-2)克隆載體pBluescript(註冊商標)IISK+的製備按照以下組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，通過在37C下溫育5小時，用限制酶SacI進行消化。pBluescriptG主冊商標)IISK+20//110xL緩衝液5//1Sac12/iI滅菌水23//I總體積50;Ul向溫育後的樣品溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分攪拌。然後以14，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌後，在-20"C下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4t:離心10分鐘，棄去上清，向沉澱中加入500nl75。/。乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4X:離心5分鐘，棄去上清。將沉澱風乾一定程度，然後溶解於20jU的TE中。接著，按照以下組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，通過在37t:下溫育5小時，用限制酶BamHI進行消化。限制酶消化後樣品20A>9一^棒)將100ji1、50|11菌體液分別塗抹在整個板上，在37C下培養過夜。(2-4)通過鹼-SDS法製備質粒鹼-SDS法按照公知的方法進行(Weiss.B，等人.，J.Biol.Chem.，243,4543-4555(1968)、Birnboim，H.C.，MethodsEnzymol.，100,243(1983))。即，向1.5ml微量離心管中分別注入1.5ml在3mlLB-氨苄青黴素液體培養基中以200rpm、37*C振蕩培養16小時得到的菌體液，以6,000rpm、4"C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。向沉澱(菌體)中加入100jd溶液I(50mM葡萄糖、25mMTris國鹽酸(pH8.0)、10mMEDTA)，用渦流攪拌器充分攪拌，加入200fi1溶液II，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘後，再加入150(il溶液III(0.2NNaOH-l。/oSDS)，在冰上放置30分鐘，然後加入IOOjil氯仿，以14，000rpm、4"C離心10分鐘。將上清回收到新的管中，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，輕輕地顛倒攪拌，在室溫下放置15分鐘。然後加入5001170%乙醇，以14，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得沉澱用TOMYMICROVac乾燥3-5分鐘，溶解於20ji1TE中。為了確認在所得質粒中整合了目標DNA,按照下述組成，在1.5fi1微量離心管中製備樣品，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶SacI、BamHI進行消化。質粒DNA5.0/il10XL緩衝液2.0/ilSacI0.5AHBamHI0.5/il1mgAnlRNaseA0.5/il滅菌水11.5/il總體積20.0/il反應終止後，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向10jil所得PCR產物中加入2fil凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在IOOV下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。結果，只對整合了目標DNA的樣品，從在3mlLB-氨千青黴素液體培養基中培養的殘餘的菌體液(1.5ml)中取100Hl，接種於5mlLB-氨苄青黴素液體培養基中，以200rpm、37C振蕩培養16小時。(2-5)通過QIAGENSpinMiniprepKit製備質粒將在5mlLB-氨節青黴素液體培養基中培養的菌體液以6,000rpm、4"C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。向沉澱(菌體)中加入試劑盒(QIAGENSpinMiniprepKit(250)(QIAGEN))中包含的緩衝液P1250ji1，使其充分混懸。QIAGENSpinMiniprepkit(250)(QIAGEN)中含有採集管(Collectiontube)、QIApr印Spin柱、緩衝液P1、緩衝液P2、緩衝液N3、緩衝液PB、緩衝液PE、緩衝液EB。向上述懸浮液中加入250fil緩衝液P2，輕輕地顛倒，攪拌使溶液均勻。再加入350jil緩衝液N3，輕輕地顛倒攪拌，以13，000rpm、4"C離心10分鐘。將這裡所得到的上清轉移至預先設置於採集管的QIApr印Spin柱中，以13，000rpm、4"C離心1分鐘。棄去積在採集管中的濾液，向QIAprepSpin柱中加入500jil的緩衝液PB，以13，000rpm、4"C離心1分鐘，再次棄去濾液。再向QIAprepSpin柱中加入750jil緩衝液PE，以13，000rpm、4E離心1分鐘，棄去濾液，再次以13，000rpm、4*C離心1分鐘，只將QIAprepSpin柱轉移至新的1.5ml微量離心管中，向QIAprepSpin柱的中央加入50[il緩衝液EB，在室溫下放置l分鐘，以13，000rpm、4t:離心l分鐘，將該濾液作為質粒樣品。為了確認所得質粒中整合了目標DNA，按照以下所示組成，在1.5ml微量離心管中製備樣品，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶SacI、BamHI進行消化。質粒DNA5.0//I10XL緩衝液2.0jUlSacl0.5/ilBamHI0.5jUl滅菌水12.0#1總體積20.0反應終止後，通過2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向10jil所得PCR產物中加入2[il凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在IOOV下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。這裡，將整合了目標DNA並確認其單一性的DNA作為測序樣品。(2-6)通過雙脫氧法確定鹼基序列鹼基序列的確定使用自動測序儀，按照公知的方法(Sanger，F.，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))確定。鹼基序列確定後，《吏用分析軟體GENETYX-MAC進行數據分析。(2-7)結果將進行了兩種限制酶(BamHI、PstI)消化和脫磷酸化(BAP處理)的sp基因與進行了兩種限制酶(SacI、Pst1)消化的PYC6基因連接，再次進行BAP處理，用苯酚提取，用乙醇沉澱，由此可以製備植物導入用細胞色素"(sp+PYC6)基因。為了確認該sp+PYC6基因的鹼基序列，將克隆載體pBluescriptIISK+(圖6)用兩種限制酶(BamHI、SacI)消化，將sp+PYC6基因與其連接，進行亞克隆，然後通過雙脫氧法進行測序，確定sp+PYC6基因的全部鹼基序列474bp(圖7)。使用GENETYX-MAC將測序結果與已知的sp基因與PYC6基因進行比較，除信號肽序列中第103號的T(胸腺嘧啶鹼基)突變成A(腺嘌呤鹼基)之外，其餘完全一致。另外，附加到引物序列中的限制酶位點也得到確認(圖7)。其中所確認的鹼基的突變是將所編碼的胺基酸由Ser變成Thr，但其性質和分子量均類似，由此導致的二級機構(a螺旋等)沒有變化，對信號肽的通過膜的功能沒有影響，因此可以將該樣品(sp+PYC6)用於以後的實驗。(3)植物導入用細胞色素C6表達載體的製備本實施例中，將確認了鹼基序列的植物導入用細胞色素C6(sp+PYC6)基因插入表達栽體pBI121中，構建用於導入植物的細胞色素C6表達載體(pBICytc6)。(3-1)植物表達用載體pBI121的製備在1.5ml微量離心管中製備樣品，使組成如下，通過在37t:溫育5小時，用限制酶SacI進行消化。pB"2120jUl10XL緩衝液5#lSacI滅菌水23jWl總體積50#l向溫育後的樣品溶液中加入等量的PE-飽和苯酚，用渦流攪拌器充分攪拌。然後以14，000rpm、4"C離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5。/o乙醇2voL。充分攪拌後，在-20"C下放置30分鐘，然後以14，000rpm、4C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500fil75。/o乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4t:離心5分鐘，棄去上清。將沉澱風乾一定程度，然後溶解於20jil的TE中。接著，在1.5ml微量離心管中製備樣品，使組成如下，通過在37匸溫育5小時，用限制酶BamHI進行消化。限制酶消化後的樣品20jul10xH緩沖液5/ilBamHI2#1滅菌水23/il總體積50/il反應終止後，通過1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向20jil所得PCR產物中加入4jil凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是4吏用電泳緩沖液(lxTAE)，在IOOV下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。然後從1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中切除認為是目標DNA的條帶，將IOOng凝膠換算成100向其中加入3vo1.Nal溶液，充分攪拌，在551C下溫育5分鐘，使凝膠溶解。向其中加入IOfilGLASSMILK，在室溫下劇烈攪拌15分鐘，以14,000rpm、4"C離心5秒鐘，回收沉澱。向該沉澱中加入300piNEWWASH,充分攪拌，然後以14,000rpm、4TC離心5秒鐘，回收沉澱。將該操作重複三次，乾燥所得沉澱，溶解於20jil滅菌水中。然後將溶液轉移至0.5ml輔助PCR用的離心管中，以14，000rpm、4X:離心30秒鐘。將所得上清轉移至新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌，然後在-20t:下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500^1175%乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14，000rpm、4"C離心5分鐘，棄去上清。將沉澱風乾一定程度，然後溶解於20jil的TE中。(3-2)植物表達用細胞色素C6表達載體(pBIcyt")的製備用如上製備的導入用細胞色素C6(sp+PYC6)基因製備反應液，使組成如下。sp+PYC6基因(BamHI,SacI消化後)(BAP處理)4.0j(iIpBI121(BamHI,Sac1消化後)8.0/yI10X連接緩沖液2.0AH2mg/mlBSA溶液2.5"I酶溶液(T4DNA連接酶)1.0jliI滅菌水2.5jul總體積20.0//I將製備的反應液在低溫恆溫槽中(161C)溫育過夜，進行連接反應。結果如下所示。將確認了鹼基序列的sp+PYC6基因(BamHI、Sacl消化、BAP處理過的)與用兩種限制酶(BamHI、SacI)消化植物表達用栽體(pBI121)所得物質連接，製備植物導入用細胞色素C6表達載體(pBIcytc6)。[實施例2轉化植物(導入細胞色素q的擬南芥)的製備(1)用於感染植物的根癌土壤桿菌的製備(1-1)導入細胞色素C6表達栽體(pBIcytC6)的大腸桿菌的製備本實施例中，將植物表達用載體(pBIcytC6)轉化宿主大腸桿菌HB101,其中所述植物表達用栽體中插入了植物導入用細胞色素C6基因。然後選擇幾個集落，在3ml的LB-卡那黴素液體培養基上培養，通過鹼-SDS法進行質粒的製備，確認載體的構建以及對宿主大腸桿菌HB101轉化的有無。如下對大腸桿菌進行轉化。首先，在水上將150jil的感受態細胞(HB101)溶解一定程度，向其中緩慢加入連接了的反應液4jil，用移液器吸頭的先端輕輕攪拌混合，在冰上放置30分鐘。放置結束後，在42X:下進行20秒鐘的熱休克。然後在冰上靜置3分鐘，使用接種環，在LB-卡那黴素上，分別將100ji1、50nl菌體液塗抹在整個板上，在37"C下培養過夜。培養後，隨機挑取20個克隆轉化體(集落)，將該集落接種於3mlLB-卡那黴素培養基中，以200rpm、37t:振蕩培養16小時。將各1.5ml培養的菌體液分注到1.5ml微量離心管中，以6，000rpm、4C離心10分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。向沉澱(菌體)中加入100nl溶液I(同前)，用渦流攪拌裝置充分攪拌，加入200jil溶液II(0.2NaOH-l°/。SDS)，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘後，再加入150jil溶液III(同前)，在水上放置30分鐘，然後加入IOOjil的氯仿，以14,000rpm、4"C離心10分鐘。回收上清，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，輕輕地顛倒攪拌，在室溫下放置15分鐘。然後加入500jd的70。/。乙醇，以14，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得沉澱用TOMYMICROVac乾燥3-5分鐘，溶解於20nlTE中。為了確認所得質粒中整合了目標DNA，在1.5ml微量離心管中製備樣品，使組成如下，通過在37"C下溫育120分鐘，用限制酶BamHI和SacI進行消化。tableseeoriginaldocumentpage36反應終止後，通過1.5"/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向10fil所得PCR產物中加入2jil凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTAE)，在100V下進行30分鐘。電泳終止後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色IO分鐘.將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。結果如下所示。將植物導入用細胞色素C6表達載體(pBIcytC6)轉化到宿主大腸桿菌HBIOI(圖8)。然後隨機挑取20個克隆轉化體(集落)。結果，可以確認20個樣品中的3個克隆在被認為是sp+PYC6基因的大小(474bp)附近具有單一條帶。從而顯示，該質粒內插入了sp+PYC6基因。將保有該質粒的大腸桿菌HB101用於以後的實驗。(1-2)轉化根癌土壤桿菌的製備和篩選本項中，為了製備向高等植物擬南芥中導入目標基因所必須的宿主土壤桿菌(根癌土壤桿菌)，進行三者混合培養(三親本雜交(hy^:r^y夕^吖7—>歹))，在所得的轉化體中選多個集落，在3mlLB-卡那黴素液體培養基中培養，通過鹼-SDS法進行質粒的製備，由此確認是否對宿主土壤桿菌進行轉化。(1-2-1)各種菌體的培養(a)根癌土壤桿菌(LBA4404^保有pAL4404用白金環，將菌體的甘油原種(to—少7卜、;/夕)溶液在YEP-鏈黴素瓊脂培養基(板)(30(ig/ml鏈黴素)上，在整個板上劃線塗布，在301C下培養約40小時。培養後挑取集落，將該集落在5mlYEP-鏈黴素(:30ng/ml鏈黴素)培養基中，以100rpm、30"€振蕩培養30小時。(b)大腸桿菌(HBIOI)六保有pRK2013用白金環將菌體的甘油原種溶液在LB-卡那黴素瓊脂培養基(板)(40嗎/ml卡那黴素)上，在整個板上劃線塗布，在37r下培養16小時。培養後挑取集落，將該集落在5mlLB-卡那黴素(40嗎/ml卡那黴素)培養基中，以200rpm、37"C振蕩培養16小時。(c)大腸桿菌(HBIOI)A保有pBIcytc6用白金環將菌體的甘油原種溶液在LB-卡那黴素瓊脂培養基(板)(40ng/ml卡那黴素)上，在整個板上劃線塗布，在37t:下培養16小時。培養後挑取集落，將該集落在5mlLB-卡那黴素(40嗎/ml卡那黴素)培養基中，以200rpm、37"C振蕩培養16小時。(1-2-2)三親本雜交三親本雜交可按照公知方法進行(駒嶺穆、野村港二"生物化學實驗法41，，植物細胞工學入門，學會出版電y夕一，298-302(1998))。即，將在5mlYEP-Sm.液體培養基或LB-Km.液體培養基上振蕩培養的三種菌體液(根癌土壤桿菌(LBA4404)頭保有pAL4404、大腸桿菌(HBIOI)*保有pBIcyt&、大腸桿菌(HB101)頭保有pRK2013)以5，000rpm、4"C離心5分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。為了進行洗滌，將培養時使用的液體培養基(YEP培養基或LB培養基)加入到沉澱(菌體)中，充分攪拌，再一次以5,000rpm、4t:離心5分鐘。離心後，將菌體溶解於培養時所使用的液體培養基(YEP培養基或LB培養基)3ml中。接著滴加各菌體液各30pl，覆蓋在MinA-卡那黴素瓊脂培養基(板)上，以靜置的狀態、在30C培養三天。培養後，將在極限培養基(最少培地)MinA-卡那黴素瓊脂培養基(板)上生長的菌體用白金環全部挑取，將該菌體溶解於IOmMMgSO4200fil。然後用白金環將該菌體溶液再次在MinA-卡那黴素瓊脂培養基(板)上、在整個板上劃線塗布，在30"C下培養大約三天。培養後挑取集落，將該集落在5mlYEP-卡那黴素(40嗎/ml卡那黴素)培養基上以200rpm、30"C振蕩培養40小時。(1-2-3)通過鹼-SDS法製備Ti質粒將在5mlYEP-卡那黴素(40jig/ml卡那黴素)液體培養基上以200rpm、30t:振蕩培養40小時的菌體液各1.5ml分注到1.5ml微量離心管中，以5000rpm、4匸離心10分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。將lml的S-緩衝液加入到沉澱(菌體)中，用渦流攪拌器充分攪拌，以8，000rpm、4X:離心10分鐘，用吸氣器吸引上清並除去。S-緩衝液如下製備稱量13.512gC6H1206(葡萄糖(M.W.:180.16))，加入12.5ml1MTris-鹽酸(pH8.0)、10ml0.5MEDTA(pH8.0)，用超純水定容為500ml，進行高壓釜處理(121t:、IO分鐘)。再向沉澱中加入S-緩衝液IOOnl和10mg/ml溶菌酶5jil，在室溫下放置10分鐘。向其中加入200jil溶液II、30jilTE-飽和苯紛，輕輕地顛倒攪拌。在室溫下放置5分鐘後，再加入150fil溶液III，在-20"C下放置15分鐘，然後以12，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌，然後在-20t:下放置30分鐘。然後以14,000rpm、4"C離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500nl75。/。乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14，000rpm、4匸離心5分鐘，棄去上清。將沉澱進行一定程度的風乾，然後溶解於20nlTE中。向所得質粒中加入lmlRNaseA,在37"C下溫育卯分鐘以進行RNase處理。反應結束後，通過1.5。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確i人。向10jil所得PCR產物中加入2nl凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是使用電泳緩沖液(lxTAE)在100V下進行30分鐘。電泳結束後，用O.lmg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相才幾記錄在照片上。結果如下所示。根癌土壤桿菌(LBA4404)在YEP-Sm.培養基中培養，大腸桿菌(HB101)在LB-Km.培養基中培養。然後通過三親本雜交(三者混合培養)向根癌土壤桿菌(LBA4404)中導入pBIcytc6，進行轉化。接著，隨機挑取10個克隆的通過三親本雜交導入了Ti質粒(pBIcytc6)的轉化體根癌土壤桿菌。將該集落在3mlYEP-Km.培養基中培養，然後通過鹼-SDS法製備質粒，將其進行l。/。(w/v)瓊脂糖凝膠(TAE)電泳。結果，在1個克隆中，在被認為是pBIcytC6大小(13.5kbp)處確i人到條帶。由此顯示，Ti質粒(pBIcytC6)導入到轉化體根癌土壤桿菌中。(2)轉化植物(導入細胞色素C6的擬南芥)的製備(2-1)擬南芥的栽培將蛭石裝入經充分水洗的7.5x7.5圓形盆(pot)中，裝滿至九成。接著，將HYPONeX原液稀釋2，000倍，準備500ml所得的溶液，然後加入用刀切成厚度為lcm左右的石棉。用鑷子夾取充分含水分而潤溼的石棉，在7.5x7.5圓形盆上各放3個。將廚房用的濾水三角網袋(三角3一於一0,"y-)裁成可覆蓋盆口的大小，充分水洗，覆蓋盆口，用橡膠圏固定。向該盆中各播種一粒種子。播種種子後，在4TC下進行三天低溫處理，低溫處理結束後，轉移至植物培養用光照射培養室內，在22"C、長日照條件下栽培。發芽後，每兩天澆一次水，每周給予一次稀釋l,000倍的HYPONeX作為液體肥料。進行適當的間苗，大約三周後植物體開始抽苔，此時掐芯，利用竹棍(支柱)支撐生長的植物，待種子完全成熟後採種，在乾燥狀態下保存。(2-2)轉化根癌土壤桿菌對植物體的感染接著，為了向高等植物擬南芥(col-O)中導入植物導入用的細胞色素c6(sp+PYC6基因)，通過土壤桿菌法之一的減壓浸潤法製備轉化植物(Bechtold，N.，Pelletier，G.，MethodsinMolecularBiology,82(1998))。具體如下。(2-2-1)根癌土壤桿菌的培養用白金環，將菌體的甘油原種溶液在MinA-Km.瓊脂培養基(板)(40jig/ml卡那黴素)上，在整個板上劃線塗布，在30t:下培養約40小時。培養後挑取集落，將該集落在10mlYEP-Km.(40嗎/ml卡那黴素)培養基中，以200rpm、30"C振蕩培養30小時(預培養)，將該培養液全量地加入到新的100mlYEP-Km.(40ng/ml卡那黴素)培養基上，再以200rpm、30n振蕩培養30小時(正式培養)，(2-2-2)植物體擬南芥(col-0)的栽培作為進行轉化的植物使用的擬南芥(col-O)由播種直到採集種子期間的栽培條件如下，低溫處理4t;(暗處)下靜置三天。植物培育溫度22匸照射光長日照條件(100nEmY1)液體肥料HYPONeX(l/l，000倍稀釋)根據植物個體而多少有些差異，當為野生型植林時，在播種後7天(包括低溫處理的3天)發芽，發芽後20天前後植物抽苔。然後進行掐芯處理，5-6天側枝開始伸長，同時開始最初開花、結果.採種是從綠色的角果(§々)變為淺茶色、並且開始縱向裂開的之中回收。從一個角果大約獲得約50粒種子。回收的種子在播種之前在乾燥的狀態下保存。(2-2-3)對植物體的感染將感染用植物體擬南芥(coI-0)按照上述(2-2-2)所述的方法栽培，培育至開始抽苦。然後，在由莖誘導出莖生葉(莖葉)時進行掐芯，切除已經開花、結果的花。實驗是將該植物體和上述(2-2-l)菌體培養液的準備調節得同步進行。首先，在進行浸潤操作的實驗臺上鋪無塵室抹布(年A夕才》)。接著，將根癌土壤桿菌培養液用浸潤用混懸培養基稀釋大約2/3倍，加入到容量為lL的燒杯中。將該燒杯放在吸引鍾(吸引鐘)內，為了使植物體不過分吸收培養混懸液而使其在之前充分吸水，將各個栽種了剛充分吸水的植物體擬南芥的盆倒放於燒杯上固定，將植物體浸漬在培養混懸液中。在減壓浸潤法中使用的根癌土壤桿菌培養液是使用用浸潤用混懸培養基稀釋約2/3倍，使OD60(^1.2-1.5變為OD6Q(H).8的培養液。以減壓浸潤時間為30秒、l分鐘、5分鐘、IO分鐘進行研究，結果5分鐘最佳。這是由於，減壓浸潤時間越長，則之後植物體的生長變得越差，處理5分鐘時，其生長發育未見顯著惡化，花數和結果的角果(種子)數也與處理l分鐘的沒有大的差異。接著將浸漬在培養混懸液中的植物體放入吸引鍾內，通過吸氣器進行減壓。減壓結束後，由吸引鍾內取出植物體，用無塵室抹布除去多餘的培養混懸液，將該植物體橫放在塑料託盤內，向其端部滴加水，蓋上蓋子，在20X:放置2-3天(其間不給予水)。然後將盆扶起，在植物培養用光照射培養箱內、在22t:、長日照條件下進行通常的栽培。每兩天進行一次澆水，作為液體肥料，每周給予一次稀釋l，OOO倍的HYPONeX。進行適當的間苗，大約3周後植物體開始抽莒，掐芯，利用竹棍(支柱)支撐生長的植物體，待種子完全成熟時進行採種，在乾燥狀態下保存。[實施例3轉化植物中的細胞色素"基因導入和表達的分析(1)使用PCR法對基因組DNA中的導入基因進行分析本實施例中，由轉化體擬南芥中提取基因組DNA，以該基因組DNA為模板，通過PCR確認是否有導入基因擴增，從而確認是否導入到植物體內。(1-1)由轉化體提取基因組DNA將葉為2-3片左右的轉化體擬南芥放入到預先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體呈粉末狀。然後將呈粉末狀的試樣放入1.5ml微量離心管中稱量。向Washbuffer中加入2-巰基乙醇，使終濃度為0.5%,將lml該溶液加入到上迷稱量後的試樣中，充分混合。以12，500rpm、4t:離心10分鐘後，棄去上清。向溶液I中加入2-巰基乙醇，使終濃度為1%，向上述離心沉澱物中加入300fil所得溶液，用渦流攪拌器充分混合。接著加入1%NaBH430fil、溶液II150fil，用渦流攪拌器攪拌數秒鐘，在50t:溫育10分鐘，向該溶液中加入ISOPLANTII(NIPPONGENE)中含有的100jil溶液III-A和120jil溶液III-B，在冰上放置10分鐘。以12,500rpm、4X:離心10分鐘，回收水相，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，立即以8，000rpm、室溫離心l分鐘，棄去上清。再加入lml70°/。乙醇，以8，000rpm、室溫離心l分鐘，棄去上清。將沉澱物風乾至一定程度，溶解於50jil的TE中。向該溶液中加入1mg/mlRNaseA1Hl，在37"C溫育30分鐘。然後，為了確認基因組DNA的提取，向5nl所得基因組DNA中加入1jil凝膠加樣緩衝液，使用3iHindlII作為標誌、用1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳使用電泳緩衝液(lxTAE)，在100V下進行30分鐘。電泳結束後，用O.lmg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。通過電泳確認基因組DNA存在後，為了測定其濃度，將基因組DNA溶液稀釋100倍，用分光光度計進行UV測定。根據計算的濃度製備基因組DNA溶液，使其濃度為10ng/111，用於今後的實驗。(l畫2)PCRPCR按照公知的方法進行(Sambrook，J.D.，W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual，3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork)。在0.5ml輔助PCR用離心管中製備以下組成的反應液。模板(基因組DNA(10ng))1.0jul引物(1)(10pmol///l)1.0AM引物(3)(10pmol/jul)1.0"I10XExTaq緩衝液(Mg2+plus)(Mg2"濃度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0//IDMSO1,25"I滅菌水16.1"ITaKaRaExTaq(50,15JUI總體積25'0"1向該反應液鋪15(U的礦物油。然後使用PTC-10TM可控熱循環控制儀進行反應。使用的引物如下。引物(3)ATP-NA1Ba邁(10pmol/pl)(31mer,GC-Cont.:54.8%)5'-GGATGCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'加QIDNo.ll)引物(l)PYC6.C-termSacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/ji1)5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA(;GAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/nl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAC;AGG-3，(SEQIDNo.10)反應是在(94XM8秒、64XM8秒、72*Cl分24秒)x31個循環的條件下進行。反應終止後，通過2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確i^。向10jil所得PCR產物中加入2nl凝膠加樣緩衝液，製成電泳樣品。電泳是4吏用電泳緩衝液(lxTBE)，在100V下進行30分鐘。電泳結束後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。(1-3)PCR產物的凝膠提取從2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠中切取認為是目標DNA的條帶，儘量切細。然後將該凝膠裝入AmiconUltrafree(註冊商標)DA中，以7，300rpm、4"C離心10分鐘。離心後，取下UltrafreeMC(上側的柱部分)，向洗脫出來的溶液中加入等量的TE-飽和苯酚，使用渦流攪拌器進行充分攪拌。然後以14，000rpm、4t:離心10分鐘。將水層轉移到新的1.5ml微量離心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分攪拌，然後在-20C下放置30分鐘。然後以14，000rpm、4TC離心10分鐘，棄去上清。向沉澱中加入500jil75%乙醇，將沉澱充分洗滌。再以14,000rpm、4t:離心5分鐘，棄去上清。將沉澱進行一定程度的風乾，然後溶解於20jilTE中。為了確認該溶液中是否有目標DNA被單一地提取、純化，進行2％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳。向10jil所得樣品中加入2jil凝膠加樣緩衝液，電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在IOOV下進行30分鐘。電泳結束後，用0.1mg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。(1-4)PCR產物的亞克隆PCR產物的亞克隆按照公知方法進行(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166(4)，557-580(1983).;中山廣樹等乂W才,，7卜1/一亍;yKII遣伝子解析cD基礎，秀潤社，83-88(1996))。將PCR產物調製成以下組成，tableseeoriginaldocumentpage44將製備的反應液在低溫恆溫槽(i6t;)中溫育過夜，進行連接反應。對大腸桿菌的轉化如下進行。首先在冰上將150nl感受態細胞(DH5a)溶解一定程度，向其中緩慢加入4nl連接了的反應液，用移液器吸頭的先端輕輕攪拌混合，在冰上放置30分鐘。放置結束後，在42TC進行20秒鐘的熱休克。然後在冰上靜置3分鐘，使用接種環，在LB-Ampicilin-X-Gal畫IPTG板上，按照Vector:insert=1:1、1:3,將IOOjil、50jil菌體液分別塗抹在整個板上，在37"C下培養過夜。(1-5)利用鹼-SDS法製備質粒本項中的質粒製備按照與實施例l(2-4)所述內容同樣進行。(l畫6)通過QIAGENSpinMiniprepKit製備質粒本項的質粒製備按照與實施例l(2-5)所述內容同樣進行。(1-7)雙脫氧法確定鹼基序列本項的鹼基序列的確定按照與實施例1(2-6)的方法同樣進行。結果如下所示。使用ISOPLANTII，從轉化體擬南芥的2-3片葉中提取純度高的基因組DNA。以該基因組DNA溶液為模板，為了確認植物導入用細胞色素C6基因是否導入，通過PCR擴增目標基因。然後將該PCR產物進行2。/n(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在474bp附近確認了單一條帶(圖9)。為了確認該擴增的基因的鹼基序列，在凝膠提取後進行亞克隆，通過雙脫氧法進行測序，由此確定了擴增的基因的全部鹼基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由該測序結果與已知的sp基因序列和PYC6基因序列進行比較，與導入基因同樣信號肽基因序列中第103號的T(胸腺嘧啶鹼基)突變為A(腺嘌呤鹼基)，除此之外完全一致。以上結果顯示，植物體(擬南芥)內導入了sp+PYC6基因。(2)使用RT-PCR法對總RNA中的表達基因進行分析本項是由轉化體擬南芥中提取總RNA，以該總RNA為模板，通過RT-PCR，確認是否有導入基因的擴增，從而確認植物體內的基因的表達。引物(3)ATP.NAlBam(lOpmol/pl)(31mer，GC.Cont.:54.8%)5'-GGATCCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'卿IDNo.8)引物(l)PYC6-Oter邁Sacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.3)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2p邁ol/pl)5'-CGCCAGGGTTTTCGGAGTCAGGAC-3'(SEQIDNo.6)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/ji1)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAGAGG-3'(SEQIDNo.7)(2-l)由轉化體中提取總RNA由轉化體中提取總RNA是使用市售的試劑盒(RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)),按照說明書進行。(2-2)PCRPCR按照7i^知方法進4亍(Sambrook，J.D"W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual,3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork),在0.5ml輔助PCR用離心管中製備以下組成的反應液。模板(總RNA(10ng))1.0//1引物(1)(10pmol/jUl)1,0^1引物(3)(10pmol///l)1.0jt/l10xExTaq緩沖液(Mg"plus)(Mg2+濃度20mM)2.5〃ldNTP混合物(各2.5mM)2.0//1DMSO1.25)Ul滅菌水16.1jUlTaKaRaExTaq(5U///I)0.15"I總體積25.0//I向該反應液鋪15nl礦物油。然後使用PTC-10TM可控熱循環控制儀進行反應。反應終止後，通過2y。(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行確認。向ioni所得PCR產物中加入2fil凝膠加樣緩衝液，作為電泳用樣品。電泳是使用電泳緩衝液(lxTBE)，在100V下進行30分鐘。電泳終止後，用O.lmg/ml溴化乙錠進行7分鐘染色，用超純水脫色10分鐘。將進行了脫色的凝膠置於UV透射儀上，用帶有手動遮光罩的一次成形(寶麗來)照相機記錄在照片上。(2-3)PCR產物的凝膠提取本項中的PCR產物的凝膠提取與實施例3(l-3)同樣進行。(2-4)PCR產物的亞克隆本項中的PCR產物的亞克隆按照實施例3(l-4)的方法同樣進行。(2-5)通過鹼-SDS法製備質粒本項中的鹼-SDS法按照公知方法，與實施例1(2-4)的方法同樣進行(Weiss.B，等人"J.Biol.Chem.，243，4543-4555(1968);Birnboim,H.C"MethodsEnzymol.，100，243(1983))。(2-6)通過QIAGENSpinMiniprepKit製備質粒本項中的通過QIAGENSpinMiniprepKit製備質粒是與實施例1(2-5)的方法同樣進行。(2-7)通過雙脫氧法確定鹼基序列本項中的鹼基序列的確定與實施例1(2-6)的方法同樣進行(Sanger,F.，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))。(2-8)結果使用RNeasyPlantMiniKit,從已確認導入了基因的轉化植物(PYC6導入植物)的2-3片葉中提取表達的總RNA。以該總RNA溶液為模板，為了確認有否sp+PYC6基因的表達，通過RT-PCR擴增目標基因。然後將該PCR產物進行2。/。(w/v)瓊脂糖凝膠(TBE)電泳，在474bp附近確認了單一條帶(圖9)。為了確認該擴增的基因的鹼基序列，在凝膠提取後進行亞克隆，通過雙脫氧法進行測序，由此確定了擴增的基因的全部鹼基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由該測序結果與已知的sp基因序列和PYC6基因序列進行比較，發現與導入基因同樣信號肽基因序列中第103號的T(胸腺嘧啶鹼基)突變為A(腺嘌呤鹼基)，除此之外完全一致。以上結果顯示，sp+PYC6基因在植物體(擬南芥)內表達。(3)使用蛋白質印跡法對表達蛋白質的分析本項中，由轉化體擬南芥中提取葉綠體，確認了在由此得到的葉綠體蛋白質級分中導入的細胞色素C6表達。(3-1)葉綠體級分的製備葉綠體級分按照公知方法製備(中村研三等(監修)，植物的蛋白質實驗手冊(植物0夕^八。夕質実験y口卜3—小)，細胞工學系列(細胞工學^y—X、)第9巻，秀潤社，114-117(1998))。將5-6g左右轉化體擬南芥裝入預先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體成粉末狀。然後向粉末狀的試樣中加入20ml冰冷卻的破碎Buffer(破砕Buffer)，充分攪拌，用4層Miracloth(5，夕口只)過濾。將所得濾液轉移到15ml容積的Corningtube中，以7,000rpm、4上清。向沉澱中加入5vol.破碎Buffer，混合至均勻，輕輕地倒入預先加入了10ml30。/o珀可(八。一3—々)的玻璃離心管中，以2,000rpm、4"C離心3分鐘。結束後除去上清中的珀可，將沉澱用5ml破碎Buffer混合至均勻，再以2,000rpm、4t:離心3分鐘(將該操作重複兩次)。最後將沉澱溶解於lml破碎Buffer中，將該溶液作為葉綠體級分。(3-2)蛋白質印跡向上述(3-l)所得葉綠體級分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4t:離心10分鐘，將所得上清作為葉綠體蛋白質提取溶液。向1.5ml微量離心管中加入1fig/nl分子量標準標記5fil和超純水5nl，加入葉綠體蛋白質提取溶液，分別向管中加入等量的試樣用緩衝液，充分攪拌。將製備的管在40t:下、熱水浴中培養30分鐘，作為電泳用試樣。在電泳槽中加入陽極和陰極電極液、SDS-PAGE凝膠，向孔(Well)中小心加入20jd電泳用試樣，在30V的恆定電壓下將電泳用試樣電泳至分離凝膠的上端，在100V的恆定電壓下，使標記由凝膠的下端電泳約5mm左右。電泳過程中，預先將濾紙各兩張浸漬在印跡緩衝液A、B、C中，將PVDF膜在少量的甲醇中浸漬5秒，再浸漬到印跡C液中。電泳結束後，將凝膠從玻璃板上取下，浸漬在印跡C液中約5分鐘。在半乾印跡裝置中，從下面開始依次重疊兩張A的濾紙、兩張B的濾紙、PVDF膜、凝膠、兩張C的濾紙，設置後，以60mA的恆定電流轉印卯分鐘。印跡結束後，立即按照以下所示操作進行抗原抗體反應的操作。(i)將PVDF膜浸在TBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(ii)浸漬在含5。/。BSA的TBS中l小時，振蕩過夜。(iii)浸在TBS中，振蕩5分鐘。(iv)浸在st-抗體中，振蕩2小時。(v)浸在TTBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(vi)浸在第二抗體中，振蕩1小時30分鐘。(vii)浸在TTBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(viii)浸在TBS中，振蕩5分鐘(兩次)。(ix)浸在第二抗體展開試劑中，振蕩20分鐘(避光)，(X)用超純水洗滌。(3-3)結果通過珀可的密度梯度離心，從PYC6導入植物中分離葉綠體級分，將所得葉綠體蛋白質通過SDS-PAGE進行電泳，通過分子量進行篩分。接著將分離的所有的蛋白質轉印到PVDF膜上，然後使用識別來自條斑紫菜的細胞色素C6的第一抗體(兔抗體)和抗兔抗體(第二抗體)進行抗原抗體反應，可以只在PYC6導入植物中檢測出抗原抗體反應(圖10),由以上結果表明，在PYC6導入植物中導入的PYC6在葉綠體中表達。(4)表達的細胞色素C6蛋白質的N末端胺基酸序列分析本項中，對在上述(3)中顯示抗原抗體反應的PYC6蛋白質的N末端胺基酸序列進行分析，確認是否有信號肽的切斷。向上述(3-l)中得到的葉綠體級分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4匸離心10分鐘，將所得上清作為葉綠體蛋白質提取溶液。向1.5ml微量離心管中加入1ng/jil分子量標準標記5jil和超純水5fil，加入葉綠體蛋白質提取溶液，分別向各管中加入等量的試樣用緩衝液，充分攪拌。將製備的管在40"C、熱水浴中培養30分鐘，作為電泳用試樣。在電泳槽中加入陽極和陰極電極液、SDS-PAGE凝膠，向孔中小心加入20fil電泳用試樣，在30V的恆定電壓下將電泳用試樣電泳至分離凝膠的上端，在100V的恆定電壓下使標記由凝膠的下端電泳約5mm左右。電泳過程中，預先將濾紙各兩張浸漬在印跡緩衝液A、B、C中，PVDF膜在少量的曱醇中浸漬5秒，再浸漬到印跡C液中。電泳結束後，將凝膠從玻璃板上取下，浸漬在印跡C液中約5分鐘。在半乾印跡裝置中，從下面開始依次重疊兩張A的濾紙、兩張B的濾紙、PVDF膜、凝膠、兩張C的濾紙，設置後，以60mA的恆定電流轉印90分鐘。印跡結束後，進行CBB染色、脫色操作，將目標蛋白質部分切成lmmx5mm大小，轉移至1.5ml微量離心管中。將其作為測序樣品，用A卯liedBiosystemsProteinSequencer492型進行胺基酸序列分析，通過埃德曼法，對與由轉化植物得到的與PYC6抗體顯示抗原抗體反應的分子量約為9.1kDa的蛋白質N末端胺基酸序列進行分析，結果，該序列是從其N末端笫1個殘基開始依次為ADLDNGEKVF(SEQIDNo.l2)(參照下表)。tableseeoriginaldocumentpage51這與PYC6成熟蛋白質區的N末端胺基酸序列完全一致，表明在植物體內進行了信號肽的切斷，正確地通過了葉綠體類嚢體膜，在腔內一側表達。即，由所得轉化體中PYC6蛋白質N末端胺基酸序列的分析結果可以證實，與葉綠體轉運信號被切斷後的成熟區的胺基酸序列一致，由此表明sp+PYC6基因在轉錄、翻譯後轉運到葉綠體中。[實施例4轉化植物的生長發育測定和表現型(表現型)的觀察(1)生長發育觀察(高度、根長、葉的大小)本項中，對轉化體擬南芥播種後的生長發育情況進行觀察。播種轉化體後，每隔10天觀察測定植物體的"高度"、"根長"和"葉的大小"。植物試樣是對野生林和轉化體共20個個體進行，計算其平均值，通過統計處理求出顯著差異。對PYC6導入植物的生長(表現型)進行觀察，結果，PYC6導入植物的高度最大比野生型(WT)大1.9倍(播種後40天)，約第60天時增大1.3倍(圖ll)。根長最大比WT大1.35倍(播種後40天)，約第60天時增大1.17倍(圖12)。葉的大小最大有1.9倍(播種後40天)的差異，在約第60天增大1.3倍(圖13)。可以認為，在這些PYC6導入植物中觀察到的現象是由於植物體內的PYC6的表達，以某種形式激活了對於植物的生長發育非常重要的光合作用反應，由於該影響使植物體的生長發育速度提高。(2)總葉綠素量的測定本項中，用丙酮從轉化體擬南芥中提取總葉綠素，並定量。將轉化體擬南芥的葉用葉片打孔採樣器(i;一7Ay亍)採集，稱量。將試樣放入預先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，勻漿至植物體呈粉末狀。然後向呈粉末狀的試樣中加入80%丙酮，定容至4ml。用分光光度計UV-VISIBLESPECTROPHOTOMETER測定該溶液在663nm和645nm下的吸光度。將所得663nm和645nm下的吸光值代入以下所示式子中，計算葉綠素量。總葉綠素量(jig/ml)-8.02xABS(663)+20.21xABS(645)測定PYC6導入植物中的葉綠素量，結果，在播種後40天-70天期間，比WT增大1.1-1.2倍(圖14)。這可能是由於PYC6的導入使光反應活化，由此增大的光反應最終產物一能量物質(ATP)被用於葉綠素的合成。[實施例5轉化植物的光合作用活性測定(1)方法和結果分別按以下所示方法測定作為光合作用活性指標的三磷酸腺苷(ATP)含量、NADPH量、二氧化碳同化能力、澱粉量和蛋白質的量。(1-1)總ATP含量的測定本實施例中，由轉化體擬南芥中提取總ATP，通過螢光素■螢光素酶法進行定量。預先稱量轉化體擬南芥的葉。稱量後，裝入預先冷卻的乳缽中，迅速加入液氮，用乳缽棒勻漿至植物體成粉末狀。然後向粉末狀的試樣中加入2ml0.25M高氯酸，將該溶液回收到15ml容量的Corningtube中。以10，000rpm、4"C離心10分鐘，將所得上清轉移到另外的15ml容量Corningtube中，用1NKOH調節至pH7.0。製備後，用0.2M磷酸緩衝液(pH7.2)定容至5ml，將其作為ATP提取液。將100nlATP提取液裝入1.5ml微量離心管中，添加20jilENLITEN螢光素酶/螢光素試劑，然後在90秒後用發光計(GENELIGHT55)累積計算10秒鐘內反應液的發光強度，由所得的RLU值計算溶液的ATP濃度，由此換算成單位植物重量的ATP量。結果，PYC6導入植物的總ATP量最大增大1.93倍(播種後60天X圖15)。這可能是由於PYC6導入植物中，除發揮功能的質體藍素之外，還有作為新的電子傳遞體的紅藻cyt"(PYC6)發揮功能，由此光反應的電子傳遞被活化，使最終產物ATP的量增加。(1-2)總NADPH含量的測定本實施例中，由轉化體擬南芥中提取總NADPH進行定量，預先稱量轉化體擬南芥。然後加入在70t:左右的熱水浴中加溫的O.lNNaOH,用求y卜口少勻漿器破碎。然後轉移到冰浴中，加入約2ml的0.1NHC1，調節至用pH試紙測pH為7.5。接著加入O.lml甘氨醯甘氨酸緩衝液(pH7.5)，充分攪拌，轉移到量筒中測定液量。測定後，轉移至15ml容量的Corningtube中，以10，000rpm、4t:離心20分鐘。離心後，將上清回收至15ml容量的Corningtube中，在-80"C下冷卻過夜，溶解後，以10，000rpm、4t:離心20分鐘，用於定量。將IOO.OnlNADPH提取液、346.0fil0.1M甘氨醯甘氨酸緩衝液(pH7.4)、200.0nl0.2M煙醯胺、82.0jd3.2mg/ml吩溱硫酸甲酯(PMS)、67.0fil5mg/ml嚷唑藍、200jd葡萄糖-6-磷酸二鈉水合物混合，設置於分光光度計U3310上，在570nm、25"C下測定。在U3310上安裝溫度控制單元，設定成25t:。然後每隔30秒測定570nm下的吸光度變化，測定2分鐘。由所得吸光值的差計算NADPH的量，由其計算單位植物重量的NADPH量。結果，導入PYC6植物的總NADPH量在播種後40-70天增大1.2-1.4倍(圖16)。這可能是由於將PYC6導入高等植物，電子比野生型更多地傳遞，最終產物NADPH的量增加。(I-3)二氧化碳同化能力的測定本實施例中，使用轉化體擬南芥的葉測定二氧化碳的同化能力。二氧化碳的同化能力是使用C02氣體分析儀CIRAS-1(小絲工業製造)進行。另外，二氧化碳的供應量設定為350ppm，在飽和光下測定。結果，PYC6導入植物的二氧化碳同化能力最大增加2.2倍(播種後天)(圖17)。這可能是由於PYC6對高等植物的導入使得ATP或NADPH的量增加，由此利用該能量的暗反應(卡爾文本森循環)被活化，二氧化碳的同化能力增加。(1-4)澱粉量的測定本實施例中，從轉化體擬南芥中提取澱粉，進行定量。採集植物葉後進行乾燥(70度、2天)。稱量約5mg放入乳缽中，加入3ml32%高氯酸，用乳缽棒充分破碎。然後全部轉移到試管中，在20匸下靜置20分鐘。接著，用6.0cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk過濾，向濾液中加入5ml硤溶液，充分混合，在約4"C靜置30分鐘。然後用1.5cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk過濾，使濾器乾燥。將乾燥的濾器放入試管中，加入4ml0.75M硫酸，在沸騰水浴中溫育30分鐘。然後回收上清，通過苯酚硫酸法進行顯色，使用分光光度計測定485nm下的吸收。結果，PYC6導入植物的澱粉量在播種後40-70天時增大1.15-1，25倍(圖18)。這可能是由於向高等植物導入PYC6，C02的同化能力增加，與此相伴，澱粉的合成也得到促進。(1-5)蛋白質的量的測定本實施例中，由轉化體擬南芥提取蛋白質，使用Lowry法進行定量。測定植物體的重量並記錄，將適量的植物體放入乳缽中，在液氮下，用乳缽棒充分破碎。恢復至常溫後，向每lg植物體中加入2mlCelLyticP(Sigma制)，用乳缽棒充分磨碎，轉移至試管中。在室溫下顛倒混合15分鐘，然後離心。將該上清作為提取蛋白質，接著，製備LowryA液0.1N的氫氧化鈉溶液中加入碳酸鈉，使濃度為2%;LowryB液0.5%硫酸銅五水合物和1%檸檬酸鈉；LowryC液1N苯酚溶液；LowryD液LowryA液+LowryB液，然後向O.lml提取的蛋白質溶液中加入l.OmlLowryD液，用渦流攪拌器進行攪拌，然後在30"C下溫育15分鐘。接著加入O.lmlLowryC液，迅速用渦流攪拌器攪拌，然後在30TC下溫育30分鐘，測定770nm下的吸光值。結果，PYC6導入植物的蛋白質量最大增加1.3倍(播種後50天)(圖19)。這可能是由於向高等植物導入PYC6，增產的ATP或NADPH激活了蛋白質的合成。(2)考察作為由本發明得到的認識，PYC6導入植物與WT比較，生長速度提高。推測原因如下由於PYC6導入植物中的ATP和NADPH增加，因此，除了在擬南芥中發揮功能的質體藍素之外，新導入的電子傳遞體紅藻cytC6也發揮功能，由此，光反應的電子傳遞形成兩個迴路，其最終產物ATP和NADPH的量增加，並且植物整體的生長發育活化。目前，關於通過對陸地植物暗反應(卡爾文'本森循環)相關酶的補強來促進成份量增加的研究正在進行，但象本發明這樣的使光反應活化的例子尚未見到。目前，以發揮cyt"功能為目的導入植物的例子尚未見到，本發明的內容在其它種類的植物中也可以應用，可以說是作為有用的植物生長促進方法或植物生產技術(果實植物(果実物)、葉片植物(葉物)、鮮花(生花)等)等的基礎的通用性高的發明。並且，通過利用在植物體內增產的ATP和NADPH,其它物質代謝也被活化，在汙染物(C02等)的除去方法領域中也極為有效。產業實用性本發明可提供在葉綠體的類嚢體腔內具有細胞色素C6的新型高等植物的製作方法，進而提供高等植物的生長促進方法，促進ATP、NADPH、澱粉和蛋白質合成的方法，以及促進固碳的方法，本發明還提供可以轉運至葉綠體類囊體腔內的、附加有信號肽的細胞色素"蛋白質，編碼該蛋白質的基因，含有該基因的重組載體，含有該重組栽體的轉化體，以及該基因導入到植物基因組中得到的轉化高等植物。序列表文本SEQIDNo.7:引物SEQIDNo.8:引物SEQIDNo.9:引物SEQIDNo.l0:引物SEQIDNo.ll:引物權利要求1.葉綠體類囊體腔內具有細胞色素c6的高等植物的製作方法，其特徵在於，將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中，其中所述融合蛋白是在細胞色素c6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。2.高等植物的生長促進方法，其特徵在於，將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體的類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素c6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。3.促進高等植物的選自ATP、NADPH、澱粉和蛋白質中的至少一種的合成的方法，其特徵在於，將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素c"6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。4.促進高等植物固碳的方法，其特徵在於，將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中並使其表達，使細胞色素C6存在於葉綠體類嚢體腔內，其中所述融合蛋白是在細胞色素C6蛋白質上附加有50-80個胺基酸殘基的信號肽的融合蛋白。5.權利要求l-4中任一項所述的方法，其中，上述融合蛋白是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(a)含有SEQIDNO.:2所示胺基酸序列的蛋白質(b)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列；(c)含有下述胺基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列；(d)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物的葉綠體被膜和類嚢體膜能力、以及電子傳遞能力的蛋白質，所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列和相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列分別有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。6.權利要求l-5中任一項所述的方法，其中，上述基因是含有以下(a)或(b)的DNA的基因(a)含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA(b)在嚴謹條件下與含有互補鹼基序列的DNA雜交的DNA，且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，其中所述互補鹼基序列是與含有SEQIDNO.1所示鹼基序列的DNA互補的鹼基序列。7.融合蛋白，該融合蛋白是在細胞色素￡"6蛋白質上附加50-80個胺基酸殘基的信號肽而成的。8.權利要求7所述的融合蛋白，該融合蛋白是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(a)含有SEQIDNO.!2所示胺基酸序列的蛋白質；(b)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列；(c)含有下述胺基酸序列，且具有電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述細胞色素C6蛋白質的胺基酸序列有1或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列；(d)含有下述胺基酸序列，且具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜能力、以及電子傳遞能力的蛋白質，其中所述胺基酸序列為SEQIDN0.2所示胺基酸序列中的相當於上述信號肽的胺基酸序列和相當於上述細胞色素"蛋白質的胺基酸序列分別有l或多個胺基酸缺失、置換或附加的胺基酸序列。9.基因，該基因編碼權利要求7或8所述的融合蛋白。10.基因，該基因含有以下(a)或(b)的DNA:(a)含有SEQIDNO.l所示鹼基序列的DNA;(b)在嚴謹條件下與含有互補鹼基序列的DNA雜交的DNA,且是編碼具有通過高等植物葉綠體被膜和類嚢體膜的能力、以及電子傳遞能力的蛋白質的DNA，其中所述互補鹼基序列是與含有SEQIDNO.1所示鹼基序列的DNA互補的鹼基序列。11.重組載體，該重組載體含有權利要求9或10所述的基因。12.轉化體，該轉化體是將權利要求ll所述的重組栽體導入宿主而成。13.權利要求12所述的轉化體，其中，宿主為屬於土壤桿菌屬的微生物。14.轉化高等植物，其中，權利要求9或10所述的基因導入到植物基因組中。15.權利要求14所述的轉化高等植物，其中，在植物細胞的葉綠體類嚢體腔中具有細胞色素C6。全文摘要本發明提供在葉綠體的內囊體腔內具有細胞色素c6的高等植物的製作方法，其特徵在於將編碼融合蛋白的基因導入高等植物的基因組中，其中所述融合蛋白是在細胞色素c6蛋白質上附加50-80個胺基酸殘基的信號肽而成。文檔編號C07K19/00GK101111595SQ20068000378公開日2008年1月23日申請日期2006年2月1日優先權日2005年2月2日發明者中澤愛子,千田浩隆,奧忠武,河內隆,西尾俊幸申請人:學校法人日本大學