抗B肝病毒表面抗原s的人源化抗體及其製備方法

2023-06-13 07:21:36

專利名稱：抗B肝病毒表面抗原s的人源化抗體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及抗B肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其製備方法。具體地說，它涉及這樣一種人源化抗體，它包括在其可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來源於人抗體的胺基酸序列的重鏈和輕鏈，通過從上述人源化抗體的重鏈刪除結合MHC II類分子的肽序列而使人抗-小鼠抗體(HAMA)的應答最小化，它還涉及含有上述人源化抗體的各個重鏈和輕鏈基因的表達載體，通過用重鏈和輕鍊表達載體轉染的能夠產生人源化抗體的轉化體，以及通過培養上述轉化體大規模生產人源化抗體的方法。
背景技術：
B肝病毒(HBV)侵入人體，導致慢性和急性肝炎。如果情況更糟的話，它可能是一種導致肝硬化和肝癌的病原。據估計全世界高達三億患者感染HBV(Tiollais和Buendia，Sci.Am.，264，48，1991)。HBV的包膜由三種蛋白質組成。具體地說，它由包括S抗原的主要蛋白質、包括S抗原和前S2抗原的中間蛋白質、以及包括S抗原、前S2抗原和前S1抗原的大蛋白質組成(Neurath，A.R.和Kent，S.B.H.，Adv.Vir.Res.，3465-142，1988)。上述所有的HBV表面抗原蛋白質均能夠誘導中和HBV的抗體。其中，S抗原佔總包膜蛋白的約80％，並且具有通常在所有HBV亞型中都存在的稱之為「共有a」的中和表位。
當HBV感染時，例如，HBV陽性母親生產的新生兒或接觸HBV的醫學研究所的職員或接受HBV相關肝病患者的肝移植的接受者情況下，已用HB免疫球蛋白(HBIG)預防HBV感染(Beasley等，Lancet，2，1099，1983；Todo等，Hepatol.，13，619，1991)。然而，目前使用的HBIG由人血漿製備，因此存在抗抗原的特異性低和汙染的可能性相對較高的缺點。而且，必須連續提供人血。
為了克服這些缺點，已經研製出應用抗HBV表面抗原的小鼠單克隆抗體的方法。通常，小鼠單克隆抗體具有對抗原高度親和和能夠大規模生產的優點，但是，它也具有這樣的缺點，即當施用到人體中時會在人體中產生人抗小鼠抗體的應答(在下文中，稱之為「HAMA應答」)(Shawler等，J.Immunol.，135，1530，1985)。
為了克服這些缺點，已經研製出人源化抗體，其中小鼠單克隆抗體的高親和性和特異性被維持，而HAMA應答被降至最低。通過基因工程方法將小鼠單克隆抗體的互補決定簇(下文稱之為「CDRs」)移植到人抗體的構架區構建人源化抗體。已經報導這種人源化抗體在人體中表現小得多的免疫原性(Riechmann等，Nature，332，323，1988；Nakatani等，Protein Engineering，7，435，1994)。然而，據報導，這種方法產生的人源化抗體也有缺點，即當反覆給人體施用時，則抗體中來源於小鼠的CDRs能夠引起免疫應答(Stephens等，Immunology，85，668-674，1995；Sharkey等，CancerResearch，55，5935s-5945s，1995)。因此，期望當人源化抗體中來源於小鼠抗體的CDRs的胺基酸殘基被取代為人抗體的殘基時，HAMA應答將被降低。
在抗體分子的可變區中有3個重鏈CDR環-HCDR1，HCDR2和HCDR3-和3個輕鏈CDR環-LCDR1，LCDR2和LCDR3。為了用本領域上述方法生產人源化抗體，移植了全部6個CDR環。然而，因為CDR中並不是所有殘基都直接結合抗原(Padlan等，FASEB J.，9，133，1995)，所以通過將直接涉及抗原結合的小鼠單克隆抗體的特異性決定殘基(下文稱之為「SDRs」)移植到人抗體的構架區而構建的人源化抗體將產生比已知的人源化抗體更低的HAMA應答。
另一方面，輔助T細胞在免疫應答中的早期的活化過程中是必需的，MHC(主要組織相容性複合物)II類分子在選擇和活化T細胞中發揮必要的作用。MHC II類蛋白結合從蛋白質抗原消化得到的具有9個胺基酸殘基的肽，它在抗原呈遞細胞的表面表達。當通過與識別上述MHC II類分子的T細胞受體(TCR)的複合物形成激活T細胞時，則免疫應答起始(Germain，R.N.Cell 76，287-299，1994)。因此，沒有可能結合MHC分子的肽序列的人源化抗體將不在人體中誘導免疫應答。
以前，本發明人提供了一種通過應用抗HBV表面抗原的小鼠單克隆抗體H67的基因的CDR-移植法構建的人源化抗體，韓國專利申請號163163(1998年9月3日)，並且在這個抗體基礎上，研究出了與上述人源化抗體相比具有的免疫原性降低的人源化抗體HZII-H67，且也申請韓國專利，申請號為98-32644。
因此，為了通過對上述人源化抗體HZII-H67的進一步人源化來使HAMA應答最小化，本發明人研究出這樣的人源化抗體，它們包括在其可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來自人抗體的胺基酸序列的重鏈和輕鏈，通過從上述人源化抗體的重鏈刪除了結合MHC II類分子的肽序列，而使人抗-小鼠抗體(HAMA)應答最小化，並且通過證明它在人體中的最小化了免疫應答的可能性並具有良好的抗原結合能力，使它成為預防和治療B肝病毒感染的優秀候選物，從而完成本發明。
發明概述本發明的目的在於提供抗HBV表面抗原S的人源化抗體，其使人體中的免疫原性降至最低，而同時具有優秀的抗原結合能力，本發明還提供了其製備方法，以便有效預防和治療B肝病毒感染。
附圖簡述

圖1顯示人源化抗體HZII-H67的重鏈可變區和本發明的抗HBV表面抗原S的人源化重鏈可變區突變體之間的核苷酸和胺基酸序列的比較結果。
圖2提供示意圖說明人源化重鏈突變體I34V(其中纈氨酸取代小鼠HCDR1的第34位的異亮氨酸)的製備方法。
圖3顯示包括由圖2的方法製備的I34V突變體的表達載體pcDdA-HzSIIIh-I34V的限制性酶切圖譜。
圖4顯示說明抗表面抗原S的具有本發明的人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結合能力的ELISA結果，A；HCDR1突變體，B；HCDR2突變體，C；HCDR3突變體，H/K；由HZII-H67的重鏈和輕鏈組成的人源化抗體HZII-H67。
圖5顯示說明包括本發明的兩種以上人源化重鏈突變的人源化抗體的抗表面抗原S的抗原結合能力的ELISA結果。
圖6顯示人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區和本發明的抗HBV表面抗原S的人源化輕鏈可變區突變體之間的核苷酸和胺基酸序列的比較結果。
圖7顯示示意圖，說明人源化重鏈突變體Q89L(其中亮氨酸取代小鼠LCDR1的第89位穀氨醯胺)的製備方法。
圖8顯示包括由圖7的方法製備的Q89L突變體的表達載體pcDdA-HzSIIIh-Q89L的限制性酶切圖譜。
圖9顯示ELISA結果，說明具有本發明的人源化輕鏈突變體的抗表面抗原S的人源化抗體的抗原結合能力。
H/K；由HZII-H67的重鏈和輕鏈組成的人源化抗體HZII-H67圖10顯示Western印跡分析結果，說明具有本發明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的人源化抗體HzS-III的存在。
A；HzS-III，B；HZII-H67圖11顯示ELISA結果，說明具有本發明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的抗HBV表面抗原S的人源化抗體HzS-III的抗原結合能力。
圖12顯示競爭性ELISA的結果，說明具有本發明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的抗HBV表面抗原S的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的抗原結合親和性。
圖13顯示本發明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈可變區和野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的重鏈可變區之間的胺基酸序列比較結果。
圖14顯示本發明的人源化抗體HzS-III和野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區之間的胺基酸序列比較結果。
發明詳述本發明提供抗HBV表面抗原S的人源化抗體，它包括用人源胺基酸殘基取代鼠源的重鏈和輕鏈可變區上CDRs的胺基酸殘基的重鏈和輕鏈；包括各個人源化抗體的重鏈和輕鏈基因的表達載體；以及用上述表達載體轉染的轉化體。
下面，將更詳細地描述本發明。
本發明提供了人源化重鏈突變體，其中用人源重鏈抗體上的胺基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的人源化抗體的相應重鏈可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3區上的鼠源胺基酸殘基，以及包括上述人源化重鏈突變體的表達載體。
比較鼠源人源化抗體HZII-H67抗體的重鏈可變區中HCDR1，HCDR2和HCDR3與人源抗體的相應HCDR1，HCDR2和HCDR3區上的胺基酸序列，篩選最相似的CDR序列。然後，用人抗體源的胺基酸殘基取代不影響抗原結合活性的鼠源胺基酸殘基，而構建本發明的人源化抗體。
為了用人源胺基酸取代人源化抗體HZII-H67中HCDR1區的鼠源胺基酸殘基，SEQ.ID.NO1代表的Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln，本發明人將小鼠HCDR1區的胺基酸序列與人抗體的相比較。結果發現小鼠HCDR1與來自Kabat資料庫ID號35920的SEQ.ID.NO2表示的人HCDR1抗體序列的HCDR1的胺基酸殘基Asp-Tyr-Asn-Val-Asn高度同源。因此，本發明構建了HCDR1突變體，其中顯示不同的第4和第5位胺基酸殘基被取代。
為了這麼做，構建了突變體I34V或Q35N，其中纈氨酸或天冬醯胺取代第34或第35位胺基酸殘基的異亮氨酸或穀氨醯胺，這兩位胺基酸殘基在小鼠和人抗體HCDR1區之間是不同的。
通過PCR和重組PCR，應用人源化抗體的重鍊表達載體pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)作為模板構建所述突變體(參見圖1和圖2)。
結果，分別應用從SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No4代表的HL和P1引物對以及SEQ.ID.No5和SEQ.ID.No6代表的P2和HC引物對得到的DNA片段作為模板，應用HL和HC作為引物對，用重組PCR反應構建了人源化抗體的重鏈可變區突變體I34V。之後，將上述I34V突變體克隆到已經克隆了人源化重鏈抗體的cDNA的表達載體中，而構建重組表達載體，它被命名為pcDdA-HzSIIIh-I34V(參見圖3)。當進行了人源化抗體的重鏈可變區I34V突變體的核苷酸序列分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區I34V突變體已經正確插入上述重組表達載體。
應用SEQ.ID.No3，SEQ.ID.No7，SEQ.ID.No8和SEQ.ID.No.6代表的引物對，通過同樣方法用PCR和重組PCR構建了Q35N突變體，其中在鼠和人抗體的HCDR1序列上顯示不同的胺基酸殘基中，用來自人重鏈的天冬醯胺取代第5位胺基酸殘基上的穀氨醯胺。之後，將Q35N克隆到表達載體中產生重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-Q35N。
另外，在本發明的人源化抗體中，其中來自人抗體的胺基酸殘基取代人源化抗體HZII-H67的鼠HCDR2區上的胺基酸殘基，優選人源HCDR2胺基酸序列取代所有鼠源HCDR2胺基酸序列，除了直接涉及抗原結合的胺基酸殘基。為了將人源化抗體HZII-H67中的來源於小鼠HCDR2的胺基酸殘基改變為人源胺基酸殘基，將小鼠和人源HCDR2區上的胺基酸序列作比較。找到小鼠HCDR2和人抗體DP-15重鏈上的HCDR2區之間的同源性後，用上述相同方法，通過取代不直接涉及與抗原結合的胺基酸殘基，而構建HCDR2突變體。
結果，構建了在HCDR2的第51位胺基酸殘基上用甲硫氨酸取代異亮氨酸的I51M突變體(應用SEQ.ID.No9和SEQ.ID.No10代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-I51M，以及在第54位胺基酸殘基上用絲氨酸取代蘇氨酸的T54S突變體(應用SEQ.ID.No11和SEQ.ID.No12代表的引物對)和包括該突變體重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-T54S，以及在第65位胺基酸殘基上用甘氨酸取代絲氨酸的S65G突變體(應用SEQ.ID.No13和SEQ.ID.No14代表的引物對)和包括該突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-S65G。
另外，在本發明的人源化抗體中，其中來自人抗體的胺基酸殘基取代了人源化抗體HZII-H67的鼠HCDR3區上的胺基酸殘基，優選人源HCDR3胺基酸序列取代所有鼠源HCDR3胺基酸序列，除非胺基酸殘基直接涉及抗原結合。為了將人源化抗體HZII-H67中的來源於小鼠HCDR3的胺基酸殘基改變為人源胺基酸殘基，首先進行小鼠HCDR3的丙氨酸掃描誘變，以便驗證那些胺基酸殘基直接涉及抗原結合。
結果，構建了在HCDR3的第95位胺基酸殘基上用丙氨酸取代天冬氨酸的N95A突變體(應用SEQ.ID.No15和ISEQ.ID.No16代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-N95A，在第96位胺基酸殘基上用丙氨酸取代酪氨酸的Y96A突變體(應用SEQ.ID.No17和SEQ.ID.No18代表的引物對)和包括該突變體重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-Y96A，在第97位胺基酸殘基上用丙氨酸取代甘氨酸的G97A突變體(應用SEQ.ID.No19和SEQ.ID.No20代表的引物對)和包括該突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-G97A，在第98位胺基酸殘基上用丙氨酸取代酪氨酸的Y98A突變體(應用SEQ.ID.No21和SEQ.ID.No22代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-Y98A，在第99位胺基酸殘基上用丙氨酸取代天冬醯胺的D99A突變體(應用SEQ.ID.No23和SEQ.ID.No24代表的引物對)和包括該突變體重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-D99A，在第100位胺基酸殘基上用丙氨酸取代穀氨酸的E100A突變體(應用SEQ.ID.No25和SEQ.ID.No26代表的引物對)和包括該突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-E100A，以及在第100位胺基酸殘基上用丙氨酸取代絲氨酸的S100aA突變體(應用SEQ.ID.No27和SEQ.ID.No28代表的引物對)和包括該突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-S100aA。
如上所述，通過用人源化抗體CDR區上的人源胺基酸取代不直接涉及抗原結合的鼠源胺基酸，而使本發明的人源化抗體比現有技術的更加人源化，並因此期望不影響抗原結合親和力。具體地說，在本發明中使用SDR-移植法，以使人源化抗體具有較少的HAMA應答，並改善治療作用，其中直接涉及結合HBV表面抗原S的SDR區被取代為人抗體。這與小鼠抗體的CDR區中表現同源性的所有胺基酸均被取代為人抗體的現有技術的方法不同。
為了證明本發明的人源化抗體的重鏈上存在突變的人源化抗體可表達，本發明人用包含重鏈上各種突變基因的每種重組表達載體轉染動物細胞。通過夾層ELISA測定從上述轉染體表達的抗體濃度後，再用間接ELISA測定包括抗表面抗原S的人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結合能力。結果發現，在所有HCDR1突變體中，抗HBV表面抗原S的I34V的結合能力幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈的結合能力相同。對於HCDR2突變體，T54S和S65G表現幾乎與野生型抗體相同的抗原結合能力(參見圖4)。對於HCDR3突變體，E100A表現比野生型抗體略微較低的抗原結合能力，說明HCDR3突變體的穀氨酸殘基(E100)在與HBV表面抗原S結合中不重要。
因此，將資料庫中的人抗體HCDR3的胺基酸序列與人源化抗體HZII-H67中的鼠HCDR3的胺基酸序列相比較，以便將鼠HCDR3的胺基酸序列中的穀氨酸殘基取代為人抗體的胺基酸殘基。結果發現，在與鼠HCDR3序列表現高度同源性的人抗體序列中(Kabat資料庫ID No 24562，39669，44760)，HCDR3的第100和101位胺基酸殘基上的絲氨酸和甘氨酸是共有胺基酸殘基。因此，本發明人構建了這樣的突變體，其中分別用絲氨酸或甘氨酸取代第100和101胺基酸位置上的穀氨酸或丙氨酸，然後測定它們的抗原結合能力。
用上述同樣方法，構建了E100S突變體，其中絲氨酸取代了第100位胺基酸殘基上的穀氨酸(應用SEQ.ID.No29和SEQ.ID.No30代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-E100S，A101G突變體，其中甘氨酸取代了第101位胺基酸殘基上的丙氨酸(應用SEQ.ID.No31和SEQ.ID.No32代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-A101G。測定了抗表面抗原S的具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結合能力後，發現E100S的抗原結合能力類似於野生型的抗原結合能力，而A101G表現略微較低的抗原結合能力。
從上述結果，本發明人確定在所有人源化重鏈突變體中，I34V，T54S，S65G和E100S的抗原結合能力類似於野生型的抗原結合能力。因此，我們同時構建了包括上述全部4種突變的重組突變體。
首先，為了構件包括T54S和I34V突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-T54S作為模板通過前面描述的同樣方法，進行PCR和亞克隆，這樣構建的表達載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V。
同時，為了構建包括T54S，I34V和E100S突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-I34V作為模板，通過前面描述的同樣方法，進行PCR和亞克隆，這樣構建的表達載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S。
另外，為了構建包括T54S，I34V，E100S和S65G突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-E100s作為模板，通過前面描述的同樣方法，進行PCR和亞克隆。從中構建了包括T54S，I34V，E100S和S65G所有突變的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G，它被命名為pcDdA-HzSIIIh。
為了考察本發明的在人源化抗體的重鏈上具有突變的人源化抗體的抗原結合能力，本發明人用包括上述突變的重組表達載體轉染動物細胞，並用間接ELISA測定抗表面抗原S的人源化抗體的抗原結合能力。
結果，分別含有I34V+T54S，I34V+T54S+E100S和I34V+T54S+E100S+S65G突變的每種人源化重鏈與野生型人源化抗體HZS-H67幾乎表現相同的抗表面抗原S的結合能力(參見圖5)。表達顯示抗HBV表面抗原S的抗原結合能力的重鏈重組突變體的表達載體pcDdA-HzSIIIh已經於2000年9月22日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10083BP。分析了從表達載體pcDdA-HzSIIIh表達出的人源化抗體HzS-III的胺基酸序列後，本發明人發現它由包括SEQ.ID.No43代表的可變區胺基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VH組成。
進一步，本發明提供了通過SDR-移植法生產的人源化輕鏈突變體，其中用來自人的輕鏈抗體上的胺基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的人源化抗體的相應輕鏈可變區的LCDR1，LCDR2，LCDR3區上的胺基酸殘基，以及包括突變體的表達載體。
本發明的人源化抗體是這樣構建的，即用人源輕鏈胺基酸殘基取代人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區的LCDR1，LCDR2和LCDR3上的胺基酸殘基。對於人源化輕鏈，人源化抗體HZII-H67的LCDR1和LCDR2已經具有來自人抗體的胺基酸殘基(對於LCDR1是D27cS，S31N，M33I；對於LCDR2是Q54K，S56T)。因此，本發明人試圖改變LCDR3上的胺基酸殘基。具體地說，為了將人源化抗體HZII-H67的LCDR3區上的鼠源胺基酸殘基改變為人抗體的胺基酸殘基，本發明人比較了人源化輕鏈的胺基酸序列和與它表現高度同源性的人源化B1抗體輕鏈的LCDR3胺基酸序列(參見圖6)。從這本發明人推測鼠源LCDR3的第89和91位胺基酸殘基上的穀氨醯胺和蘇氨酸不直接涉及抗原結合。因此，我們將它們取代為人抗體中的胺基酸殘基亮氨酸和絲氨酸。
結果構建了Q89L突變體，其中亮氨酸取代了第89位胺基酸殘基上的穀氨酸醯(應用SEQ.ID.No33到SEQ.ID.No36代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIk-Q89L(參見圖7和圖8)，以及T91S突變體，其中絲氨酸取代了第91位胺基酸殘基上的蘇氨酸(應用SEQ.ID.No33，SEQ.ID.No36，SEQ.ID.No37和SEQ.ID.No38代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達載體pcDdA-HzSIIIk-T91S。
為了考察本發明的人源化抗體輕鏈上具有突變的抗HBV表面抗原S的人源化抗體的抗原結合能力，本發明人用包括各突變體的重組表達載體轉染動物細胞，用間接ELISA測定人源化抗體的抗原結合能力。
結果，含有T91S突變體(其中絲氨酸取代了第91位胺基酸殘基上的蘇氨酸)的人源化輕鍊表現與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈相同程度的抗表面抗原S的結合能力，本發明的表達T91S突變體的表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S被命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk。表達具有抗HBV表面抗原S的抗原結合能力的突變體T91S的表達載體pcDdA-HzSIIIk已經於2000年9月22日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10084BP。分析了從表達載體pcDdA-HzSIIIk表達出的人源化抗體HzS-III的胺基酸序列後，本發明人發現它由包括SEQ.ID.No42代表的可變區胺基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VL組成。
本發明還提供了這樣的人源化抗體，它包括用來自人的胺基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的小鼠單克隆抗體H67的重鏈和輕鏈可變區上的鼠源胺基酸殘基的重鏈和輕鏈。
為了構建包括重組重鏈和輕鏈突變體的人源化抗體，本發明人用人源化重鍊表達載體pcDdA-HzSIIIh和人源化輕鍊表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉染動物細胞。之後，溫育選擇出來的轉化體48小時，來表達同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III。通過夾層ELISA法測定培養基上清液中存在的人源化抗體HzS-III的濃度後，在應用間接ELISA測定抗原結合能力。
結果發現，人源化抗體HzS-III表現與野生型人源化抗體HZS-H67(H/K)幾乎相同程度的抗表面抗原S的結合能力(參見圖11)。
另外，本發明人用競爭性ELISA(競爭性ELISA，Ryu等，J.Med.Virol.，52，226，1997)測定了人源化抗體HzS-III的抗原結合親和性。結果發現，儘管用人源胺基酸殘基取代了鼠源氨酸酸殘基，但本發明的人源化抗體HzS-III的抗原結合親和性與野生型人源化抗體HZII-H67的幾乎相同(參見圖12)。
篩選了人源化抗體HzS-III重鏈中結合MHC II類分子的肽序列後，本發明人構建了不期望結合MHC II類分子的有胺基酸殘基取代的人源化重鏈，並測定了它們的抗原結合能力。為了生產所述人源化重鏈，構建了用蘇氨酸取代第44位上的絲氨酸的S44T突變體(應用SEQ.ID.No46和47代表的引物對)和用天冬氨酸取代第68位上的蘇氨酸的T68D突變體(應用SEQ.ID.No48和49代表的引物對)以及包括它們的重組表達載體。該表達載體已經於2001年9月26日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10080BP。將人源化重鍊表達載體pcDdA-HzSIVh和人源化輕鍊表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉染到動物細胞系中後，將上述轉化體保溫48小時，使它表達人源化抗體HzS-IV。測定得到的上清液中存在的人源化抗體HzS-IV的抗原結合親和性，發現本發明的人源化抗體HzS-IV表現與人源化抗體HzS-III幾乎相同的親和性(參見圖12)。
將表現優秀的針對HBV表面抗原S的結合能力和抗原結合親和性的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列與野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的胺基酸序列相比較。結果發現，本發明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV比小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67含有較少的鼠源胺基酸，因為重鏈HCDR1，HCDR2，HCDR3或輕鏈LCDR1，LCDR2，LCDR3上的某些鼠源胺基酸殘基已經改變為人源胺基酸殘基。而且，在本發明的人源化抗體HzS-IV重鏈可變區上的胺基酸序列中，在構架區有兩個可能通過結合人MHC II類分子而誘導免疫應答的胺基酸殘基被改變，從而使免疫應答最小化(參見圖13和圖14)。
因此，本發明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV能夠成為預防B肝病毒感染的優秀候選，因為它們表現比現有技術的人源化抗體更優秀的HBV結合活性和誘導更低的HAMA應答。
下面，我們將通過實施例更詳細描述本發明。
然而，下面的實施例目的在於說明本發明，而不是為了限制本發明。實施例實施例1編碼人源化重鏈抗體的基因的突變1-1HCDR1突變體的構建為了用人源胺基酸取代人源化抗體HZII-H67的HCDR1區的鼠源胺基酸殘基，SEQ.ID.NO1代表的Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln(Korea韓國專利申請號98-32644)，本發明人比較了鼠HCDR1區與人抗體HCDR1區的胺基酸序列。結果發現，鼠CDR1與來自Kabat資料庫ID編號為35920的SEQ.ID.NO2代表的人HCDR1抗體序列的HCDR1胺基酸殘基Asp-Tyr-Asn-Val-Asn高度同源。因此，本發明人構建了顯示不同的第4和5位胺基酸殘基被取代的HCDR1突變體。1-1-1在第34位胺基酸殘基上纈氨酸取代異亮氨酸的突變體的構建為了構建第34位胺基酸殘基上纈氨酸取代異亮氨酸的突變體，在該位置上小鼠和人抗體的HCDR1區顯示不同而且該位置認為不是抗原的直接結合表位，用SEQ.ID.No3到SEQ.ID.No6代表的序列作為引物、人源化抗體HZII-H67pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)的重鍊表達載體作為模板進行PCR和重組PCR(圖1和圖2)。具體地說，用Taq DNA聚合酶(Takara Co.)進行30次PCR循環反應，94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。
結果發現，用SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No4代表的HL和P1引物從PCR反應擴增得到長度為181bp的DNA片段，用SEQ.ID.No5和SEQ.ID.No6代表的P2和HC引物從PCR反應擴增得到長度為284bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板和HL及HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應後，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體I34V。用限制性酶EcoRI和ApaI消化I34V突變體可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體(它是將抗HBV前S1抗原的人源化抗體(Korea韓國專利申請號1998-49663)的重鏈基因克隆到Invitrogen公司的pcDNA2的EcoRI-NotI位點上而得到的表達載體)的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-I34V(圖3)。對人源化抗體的重鏈可變區I34V突變體的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區I34V突變體正確插入上述重組表達載體。1-1-2天冬醯胺取代第35位胺基酸殘基上的穀氨醯胺的突變體的構建為了構建天冬醯胺取代第35位胺基酸殘基上的穀氨醯胺的突變體Q35N，在該位置上小鼠和人HCDR1抗體之間的胺基酸殘基不同並且該位置不認為是抗原的直接結合表位，在如實施例1-1-1的相同條件下進行PCR。
具體地說，用SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No7代表的HL和P3引物擴增得到大小為187bp的DNA片段，用SEQ.ID.No6和SEQ.ID.No8代表的HC和P4引物擴增得到大小為278bp的DNA片段。通過將這兩個片段連接起來而得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區突變體Q35N。用限制性酶EcoRI和ApaI消化Q35N突變體可變區的兩個末端後，本發明通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Q35N。對人源化抗體重鏈可變區Q35N突變體的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體重鏈可變區Q35N突變體正確插入上述重組表達載體。1-2HCDR2突變體的構建為了將SEQ.ID.NO39代表的人源化抗體HZII-H67的HCDR2區上的鼠源胺基酸殘基取代為人源化胺基酸，本發明人將小鼠HCDR1抗體的胺基酸序列與人抗體HCDR1區的胺基酸序列進行了比較。結果發現，鼠CDR2與SEQ.ID.NO40代表的種系人抗體的重鏈DP-15片段上的HCDR2區的胺基酸序列高度同源。因此，本發明人通過取代看起來不直接涉及抗原結合的胺基酸殘基而構建了HCDR2突變體。1-2-1蛋氨酸取代第51位胺基酸殘基上的異亮氨酸的突變體的構建為了構建HCDR2突變體，用SEQ.ID.No9和SEQ.ID.No10代表的P5和P6引物而不是實施例1-1-1相同方法中的P1和P2引物進行PCR。用HL和P5引物擴增得到大小為236bp的DNA片段，用HC和P4引物得到大小為230bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區突變體I51M。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體I51M可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-I51M。對人源化抗體的重鏈可變區的I51M突變體的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區I51M突變體正確插入上述重組表達載體。1-2-2絲氨酸取代第54位胺基酸殘基上的蘇氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No11和SEQ.ID.No12代表的P7和P8引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P7引物擴增得到大小為249bp的DNA片段，用HC和P8引物擴增得到大小為218bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區突變體T54S。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體T54S可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體T54S的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區T54S突變體正確插入上述重組表達載體。1-2-絲氨酸取代第65位胺基酸殘基上的甘氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No13和SEQ.ID.No14代表的P9和P10引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P9引物擴增得到大小為278bp的DNA片段，用HC和P10引物擴增得到大小為185bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體S65G。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S65G可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-S65G。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體S65G的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區S65G突變體正確插入上述重組表達載體。1-3HCDR3突變體的構建為了將SEQ.ID.NO41代表的人源化抗體HZII-H67的HCDR3上的鼠源胺基酸殘基取代為人源化胺基酸，本發明人將小鼠HCDR3抗體的胺基酸序列與人抗體HCDR3區的胺基酸序列進行了比較。之後，本發明人通過取代小鼠HCDR3序列中看起來不直接涉及抗原結合的胺基酸殘基而構建了HCDR3突變體。1-3-1丙氨酸取代第95位胺基酸殘基上的天冬醯胺的突變體的構建用SEQ.ID.No15和SEQ.ID.No16代表的P11和P12引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P11引物擴增得到大小為381bp的DNA片段，用HC和P12引物擴增得到大小為88bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體N95A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體N95A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-N95A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體N95A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區N95A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-2丙氨酸取代第96位胺基酸殘基上的酪氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No17和SEQ.ID.No18代表的P13和P14引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P13引物擴增得到大小為380bp的DNA片段，用HC和P14引物擴增得到大小為85bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體Y96A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體Y96A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Y96A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體Y96A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區Y96A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-3丙氨酸取代第97位胺基酸殘基上的甘氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No19和SEQ.ID.No20代表的P15和P16引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P15引物擴增得到大小為383bp的DNA片段，用HC和P14引物擴增得到大小為82bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體G97A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體G97A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-G97A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體G97A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區G97A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-4丙氨酸取代第98位胺基酸殘基上的酪氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No21和SEQ.ID.No22代表的P17和P18引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P17引物擴增得到大小為386bp的DNA片段，用HC和P18引物擴增得到大小為78bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體Y98A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體Y98A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Y98A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體Y98A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區Y98A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-5丙氨酸取代第99位胺基酸殘基上的天冬氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No23和SEQ.ID.No24代表的P19和P20引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P19引物擴增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P20引物擴增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體D99A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體D99A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-D99A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體D99A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區D99A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-6丙氨酸取代第100位胺基酸殘基上的穀氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No25和SEQ.ID.No26代表的P21和P22引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P21引物擴增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P22引物擴增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體E100A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體E100A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-E100A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體E100A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區E100A突變體正確插入上述重組表達載體。1-3-7丙氨酸取代第100a位胺基酸殘基上的絲氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No27和SEQ.ID.No28代表的P23和P24引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P23引物擴增得到大小為395bp的DNA片段，用HC和P24引物擴增得到大小為67bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體S100aA。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S100aA可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-S100aA。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體S100aA的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區S100aA突變體正確插入上述重組表達載體。實施例2具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的表達為了在細胞中直接表達具有人源化重鏈突變體的人源化抗體，將本發明的表達載體轉染到動物細胞系中。
具體地說，將COS7細胞在附加10％胎牛血清的DMEM培養基(GIBCO)中在37℃，5％CO2的培養箱中傳代培養。將細胞以1×106個細胞/m的濃度接種到100mm培養皿中，37℃培養過夜。之後，用OPTI-MEMI(GIBCO)清洗3次。同時，將實施例1構建的包括人源化重鏈突變體I34V，Q35N，I51M，T54S，S65G，N95A，Y96A，G97A，Y98A，D99A，E100A或S100aA的重組表達載體和人源化抗體HZII的輕鍊表達載體pKC-dhfr-HZIIS(KCTC 0490BP)各5μg用800μl OPTI-MEM I稀釋，將50μlLipofectamine(GIBCO)也用800μl OPTI-MEM I稀釋。將上述稀釋液在15ml試管中混合得到DNA-lipofectamine複合物，然後在室溫下保溫至少15分鐘。將6.4ml OPTI-MEM I加入各DNA-Lipofectamine複合物，然後將它們與清洗後的COS7細胞均勻混合而轉染COS7細胞。在37℃，5％CO2培養箱中溫育DNA-Lipofectamine複合物處理的細胞48小時而進行轉染。然後，收集上清液，用夾層ELISA法測定抗體濃度。為了進行夾層ELISA，用抗-人IgG(Sigma Co.)作為捕獲抗體，用與辣根過氧化物酶(Sigma Co.)混合的抗-人抗體(Fc特異性)作為第二抗體。實施例3具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗表面抗原S的抗原結合能力的測定將250ng HBV的表面抗原S(Greencross Co.)加到微平板的各個孔中，塗覆孔。將用上述實施例2得到的DNA-lipofectamine複合物轉染的各培養基加入平板，使基於實施例2測定的抗體濃度的各抗體濃度為分別為0，0.2，0.4，0.8，1.8，3.5和7ng。通過向上述平板的孔中加入與辣根過氧化物酶組合的抗-人抗體作為第二抗體進行間接ELISA之後，在492nm測定光密度。作為對照，用HZII-H67 pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)和pKC-dhfr-HZIIS分別作為重鏈和輕鍊表達載體進行同樣試驗。結果在圖4中顯示。
如圖4所示，在HCDR1突變體中，I34V的抗HBV表面抗原S的結合能力幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈的相同。對於HCDR2突變體，T54S和S65G表現幾乎與野生型抗體相同程度的抗原結合能力。另一方面，對於HCDR3突變體，E100A表現比野生型抗體略微較低的抗原結合能力，說明HCDR3突變體的穀氨酸殘基(E100)在與HBV表面抗原S結合中不重要。實施例4HCDR2突變體的構建本發明人在上述實施例3中證實小鼠HCDR3序列的第100位胺基酸穀氨酸在與HBV表面抗原S結合中不重要。因此，我們將它與資料庫中的人抗體CDR3的胺基酸序列相比較，以便取代將上述胺基酸殘基取代為人抗體的胺基酸殘基。
結果發現，在與小鼠HCDR3序列顯示高度同源性的人抗體序列中，HCDR3的第100和101位胺基酸殘基上的絲氨酸和甘氨酸是共有胺基酸殘基。因此本發明人構建了分別用絲氨酸或甘氨酸取代第100和101位胺基酸殘基上的穀氨酸或丙氨酸的突變體，並測定了它們的抗原結合能力。4-1絲氨酸取代第100位胺基酸殘基上的穀氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No29和SEQ.ID.No30代表的P25和P26引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P25引物擴增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P26引物擴增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體E100A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體E100A可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-E100A。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體E100A的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區E100A突變體正確插入上述重組表達載體。4-2甘氨酸取代第101位胺基酸殘基上的丙氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No31和SEQ.ID.No32代表的P27和P28引物而不是實施1-1-1相同方法中使用的P1和P2引物進行PCR。用HL和P27引物擴增得到大小為396bp的DNA片段，用HC和P28引物擴增得到大小為68bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進行連接這兩個片段的重組PCR反應，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區突變體A101G S100aA。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體A101G可變區的兩個末端後，本發明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點而構建了重組表達載體，並將它命名為pcDdA-HzSIIIh-A101G。對人源化抗體的重鏈可變區的突變體A101G的核苷酸序列進行分析後，本發明人發現人源化抗體的重鏈可變區A101G突變體正確插入上述重組表達載體。4-3抗表面抗原S的抗原結合能力的測定將上述實施例4-1和4-2構建的2個重組表達載體用實施例2和3的相同方法轉染到COS細胞中後，本發明人用間接ELISA法測定了選擇轉化體的抗原結合能力。結果，E100S的抗原結合能力類似於野生型的抗原結合能力，而A101G表現略微降低的抗原結合能力。
從實施例3和4-3的結果，本發明確信在人源化重鏈突變體中，I34V，T54S，S65G和E100S的抗原結合能力類似於野生型的。因此，我們構建了同時含有所有這四種突變的重組突變體。實施例5人源化重鏈基因的重組突變體5-1重組突變體T54S+I34V的構建為了構建含有T54S和I34V突變的重組突變體，用前面實施例1-2-1的重鏈基因表達載體pcDdA-HzSIIIh-T54S作為模板，用實施例1-1-1的相同方法進行PCR和亞克隆。從中構建的表達載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V。5-2重組突變體T54S+I34V+E100S的構建為了構建含有T54S，I34V和E100S突變的重組突變體，用前面實施例5-1的重鏈基因表達載體p pcDdA-HzSIIIh-I34V作為模板，用實施例1-1-1的相同方法進行PCR和亞克隆。從中構建的表達載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S。5-3重組突變體T54S+I34V+E100S+S65G的構建為了構建含有T54S，I34V，E100S和S65G突變的重組突變體，用前面實施例5-2的重鏈基因表達載體pcDdA-HzSIIIh-E100s作為模板，用實施例1-1-1的相同方法進行PCR和亞克隆。結果構建了包含T54S，I34V，E100S和S65G所有突變的重組表達載體pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G，將它命名為pcDdA-HzSIIIh。實施例6具有人源化重鏈重組突變體的人源化抗體的抗原結合能力的測定將250ng HBV的表面抗原S(Greencross Co.)加入到微平板的各孔中，進行塗覆後，用各重組表達載體或上述實施例4-1到4-3構建的pKC-dhfr-HZIIS載體用實施例2中的相同方法轉染COS7細胞。將含有上述轉染細胞的各培養基加入平板，使各抗體的濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10和20ng。然後，用實施例2的相同方法測定光密度。作為對照，用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS分別作為HZII-H67的重鏈和輕鍊表達載體進行同樣的試驗。結果如圖5所示。
如圖5所示，分別含有I34V+T54S，I34V+T54S+E100S和I34V+T54S+E100S+S65G的重組突變體的各人源化重鏈，其中同時存在幾種突變，顯示與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈幾乎相同的針對表面抗原S的結合能力。針對HBV表面抗原S表現抗原結合能力的表達重鏈重組突變體的表達載體pcDdA-HzSIIIh已經於2000年9月22日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10083BP。對從表達載體pcDdA-HzSIIIh表達出的人源化抗體HzS-III的胺基酸進行分析後，本發明人發現它由包括SEQ.ID.No43代表的可變區胺基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VH組成。實施例7人源化輕鏈基因的突變對於人源化輕鏈，人源化抗體HZII-H67的LCDR1和LCDR2已經具有來自人抗體的胺基酸殘基。因此，本發明人試圖改變LCDR3中的胺基酸殘基。具體地說，為了將人源化抗體HZII-H67的LCDR3區中的鼠源胺基酸殘基改變為人抗體的胺基酸殘基，本發明人將人源化輕鏈的胺基酸序列和與其具有高度同源性的人源化B1抗體的輕鏈的LCDR3胺基酸序列進行比較。從中，本發明人推測鼠源LCDR3的第89和91位胺基酸殘基上的穀氨醯胺和蘇氨酸不直接涉及抗原結合。因此，我們用人B1抗體上的相應輕鏈殘基的亮氨酸和絲氨酸取代它們。7-1亮氨酸取代第89位胺基酸殘基上的穀氨醯胺的突變體的構建為了構建人抗體的亮氨酸殘基取代鼠源LCDR3的第89位胺基酸殘基上的穀氨醯胺的突變體，用SEQ.ID.No33和SEQ.ID.No36代表的引物、用人源化抗體HZII-H67的輕鍊表達載體pKC-dhkr-HzIIS作為模板進行PCR和重組PCR(圖6和圖7)。
具體地說，用Taq DNA聚合酶進行25次PCR循環，94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。用SEQ.ID.No33和SEQ.ID.No36代表的LL和P29引物通過PCR擴增大小為336bp的DNA片段，用SEQ.ID.No35和SEQ.ID.No36代表的P30和LC引物通過PCR擴增大小為273bp的DNA片段。用上述兩個DNA片段作為模板、LL和P29作為引物對，連接這兩個片段而進行重組PCR反應，得到大小為743bp的人源化抗體的輕鏈可變區突變體Q89L。用限制性酶HindIII和SalI消化上述突變體Q89L可變區的兩個末端後，本發明人通過將它們克隆到pBluescript KS+(StrataGen)而構建了重組質粒pBlue-HzSIIIk-Q89L。對人源化抗體輕鏈可變區G89L突變體的核苷酸序列分析後，本發明人發現Q89L正確插入上述表達載體。在用限制性酶HindIII和ApaI消化上述pBlue-HzSIIIk-Q89L DNA後得到人源化輕鏈突變體片段，本發明人通過將上述片段重新克隆到pCMV-dhfr表達載體的HindIII-ApaI位點，而構建了重組表達載體(圖7)，並將它命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L(圖8)。7-2絲氨酸取代第91位胺基酸殘基上的蘇氨酸的突變體的構建用SEQ.ID.No33，SEQ.ID.No36，SEQ.ID.No37和SEQ.ID.No38代表的引物，在實施例7-1相同的反應條件下進行PCR。用LL和P31引物通過pCR擴增大小為369bp的DNA片段，用P32和LC引物通過PCR擴增大小為391bp的DNA片段。用上述兩個DNA片段作為模板、LL和LC作為引物對，連接這兩個片段而進行重組PCR反應，得到大小為743bp的人源化抗體的輕鏈可變區突變體T91S。用限制性酶HindIII和SalI消化上述突變體T91S可變區的兩個末端後，本發明人通過將它們克隆到pBluescriptKS+而構建了重組質粒。對人源化抗體輕鏈可變區T91S突變體的核苷酸序列分析後，本發明人發現T91S正確插入上述重組表達載體。
在用限制性酶HindIII和ApaI消化上述pBlue-HzSIIIk-T89S DNA後得到人源化輕鏈突變體片段，本發明人通過將上述片段重新克隆到pCMV-dhfr表達載體的HindIII-ApaI位點，而構建了重組表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S，並將它命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S。實施例8具有人源化輕鏈突變體的人源化抗體的抗HBV表面抗原S的結合能力的測定用實施例7-1和7-2得到的表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L或pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S，和pRc/CMV-HC-HZIIS載體作為人源化抗體HZII-H67的重鍊表達載體，按照實施例2的相同方法轉染COS7細胞後，對選擇的轉化體溫育48小時。然後，通過夾層ELISA法測定上清液中的抗體濃度。按照實施例3的相同方法將抗體加到平板中，使各抗體的濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.8，3.5和7ng。作為對照，用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS分別作為HZII-H67的重鏈和輕鍊表達載體，進行相同試驗。結果如圖9所示。
如圖9所示，含有絲氨酸取代第91位胺基酸殘基上的蘇氨酸的T91S突變體的人源化輕鍊表現與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈相同程度的抗表面抗原S的結合能力。表達表現抗HBV表面抗原S的抗原結合能力的突變體T91S的表達載體pcDdA-HzSIIIk已經於2000年9月22日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10084BP。對從表達載體pcDdA-HzSIIIk表達出來的人源化抗體HzS-IIId的胺基酸序列分析後，本發明人發現它由包括SEQ.ID.No42代表的可變區胺基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VL組成。實施例9具有人源化重鏈和輕鏈重組突變體的人源化抗體(HzS-III)的抗原結合能力的測定用實施例5-2得到的人源化重鍊表達載體pCDdA-HzSIIIh和實施例7-2得到的人源化輕鍊表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk，按照實施例2的同樣方法轉染COS7細胞後，通過保溫選擇得到的轉化體48小時而表達出同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III。為了確定從培養基得到的上清液中存在人源化抗體HzS-III，用辣根過氧化物酶(Sigma Co.)與抗-人抗體(Fc特異性)結合而得到的第二抗體進行Western印跡分析。結果如圖10所示，檢測到大小約55kDa的人源化重鏈和大小約27kDa的人源化氫鏈。因此，本發明人發現本發明的人源化抗體被正確表達並從轉化體中分泌出來。
通過夾層ELISA法測定了上清液中的分泌抗體的濃度後，用實施例3的同樣方法將抗體加入塗覆有HBV表面抗原S的平板中，使各抗體的濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10和20ng。作為對照，分別用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS作為HZII-H67的重鏈和輕鍊表達載體進行相同試驗。結果如圖11所示。
如圖11所示，同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III表現幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67(H/K)相同程度的抗表面抗原S的結合能力。實施例10人源化抗體HzS-III的抗原結合親和性的測定用比較ELISA法測定人源化抗體HzS-III的抗原結合親和性(競爭性ELISA，Ryu等，J.Med.Virol.，52，226，1997)。將5ng從實施例8的COS7細胞產生的人源化抗體HzS-III和表面抗原S(from 1×10-7M到1×10-12M)在37℃預先保溫3小時後，將混合物加入預先塗覆有表面抗原S的96孔平板中。使孔平板在37℃反應3小時後，用實施例3的相同方法通過ELISA測定光密度(圖12)。作為的對照，使用人源化抗體HZII-H67。
結果發現本發明的人源化抗體HzS-III的抗原結合親和性約為4×109M-1，它與對照HZII-H67(3.2×109M-1)並沒有很大差異。實施例11結合MHCII類分子的肽序列從人源化抗體HzS-III中去除的人源化抗體HzS-IV的構建本發明人用Stumiolo’s法(TEPITOPE)(Sturniolo等，NatureBiotechnology，17，555-561，1999)考察上述人源化抗體HzS-III中是否存在結合MHC II類分子的肽序列。另外，本發明人從與上述人源化抗體表現高度同源性的人種系DP-25蛋白中檢索序列，然後將它排除考慮。
結果發現人源化重鏈上有2段肽序列結合MHC II類分子。第一段肽具有SEQ.ID.No44代表的胺基酸序列，發現它結合51個MHC II類分子中的22個。第二個肽具有SEQ.ID.No45代表的胺基酸序列，並發現它結合14個MHC II類分子(表1)。
表1人源化重鏈HzSIIIh的TEPITOPE分析結果
為了減弱肽與MHC II分子的結合親和性，本發明人用蘇氨酸取代SEQ.ID.No44代表的胺基酸序列P9位上的絲氨酸，用天冬氨酸取代SEQ.ID.No45代表的胺基酸序列P6位上的蘇氨酸。結果，對於SEQ.ID.No44，可以結合肽的MHC II類分子的數目降低到11個(55％)。對於SEQ.ID.No45，在51個MHC II類分子中僅有1個分子可以結合肽。
因此，為了生產針對MHC II類分子結合親和性減弱的人源化重鏈，構建了具有S44T和T68D突變的S44T/T68D突變體，其中蘇氨酸取代第44位上的絲氨酸(用SEQ.ID.No46和47代表的引物對)以及天冬氨酸取代第68位上的蘇氨酸(用SEQ.ID.No48和49代表的引物對)。
用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S44T/T68D的可變區的兩個末端後，本發明人將上述片段克隆到pcDdA-HC表達載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點，而構建了重組表達載體。該表達載體已經於200年9月26日保藏於韓國生命科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物收藏中心，保藏號為KCTC 10080BP。
將人源化重鍊表達載體pcDdA-HzSIVh和人源化輕鍊表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉染到動物細胞系後，將上述轉化體溫育48小時而從中表達人源化抗體HzS-IV。測定得到的上清液中存在的人源化抗體HzS-IV的抗原結合親和性，發現本發明的人源化抗體HzS-IV顯示與人源化抗體HzS-III幾乎相同程度的結合親和性(參見圖12)。實施例12人源化抗體HzS-III和HzS-IV的胺基酸序列比較將人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈/輕鏈可變區的胺基酸序列與野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的胺基酸序列作比較。
結果如圖13和圖14所示，本發明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV預期可能產生較低的HAMA應答，因為人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈/輕鏈可變區的胺基酸序列在重鏈的HCDR1，HCDR2，HCDR3或輕鏈的LCDR1，LCDR2，LCDR3上比小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的相應部位含有較少的鼠源胺基酸殘基，並且HzS-IV比HzS-IH含有較少的能夠結合MHC II類分子的胺基酸序列。因此，本發明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV能夠成為預防B肝病毒的優秀候選，因為它們比現有技術的人源化抗體誘導較低的HAMA應答。
工業實用性如上所述，通過用重鏈HCDR1，HCDR2，HCDR3和輕鏈LCDR1，LCDR2，LCDR3上的人源化胺基酸殘基取代鼠源胺基酸殘基而使本發明的抗HBV表面抗原S的人源化抗體比現有技術的人源化抗體更加人源化。而且，通過減少FR區中可能結合MHC II類分子的胺基酸序列而顯著降低在人體中的免疫原性可能性，並表現優秀的抗原結合親和性。因此，本發明的人源化抗體能夠用於預防B肝病毒感染。
序列表序列表110韓國生命工學研究院所120抗B肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其製備方法130lfpo-09-05150KR10-2000-00578911512000-10-02150KR10-2001-00609661512001-09-2916049170KopatentIn 1.5521012115212PRT213小鼠4001Asp Tyr Asn Ile Gln1 521022115212PRT213人4002Asp Tyr Asn Val Asp1 5210321126212DNA213人工序列220223HL4003gagaattcac attcacgatg tacttg210421123212DNA213人工序列220223P14004cccactgaac gttgtagtca gtg23210521125212DNA213人工序列220223P24005ctacaacgtt cagtgggtgc gcaag 25210621120212DNA213人工序列220223HC4006gatgggccct tggtggaggc20210721127212DNA213人工序列220223P34007cgcacccagt taatgttgta gtcagtg27210821127212DNA213人工序列220223P44008caacattaac tgggtgcgcc aggcccc 27210921130212DNA213人工序列220223P54009gtaaggatac atatatccca tccactcaag 302101021127212DNA213人工序列220223P640010gggatatatg tatccttaca ctggtgg 272101121130212DNA213人工序列220223P740011cagtaccacc actgtaagga taaatatatc 302101221126212DNA213人工序列220223P840012ccttacagtg gtggtactgg ctacag 262101321124212DNA213人工序列220223P940013gtgactctgc cctggaactt ctgg242101421123212DNA213人工序列220223P1040014ccagggcaga gtcacattga ctg 232101521130212DNA213人工序列220223P1140015gtaaccatag gctcttgcac agtaatagac 302101621128212DNA213人工序列220223P1240016gtgcaagagc ctatggttac gacgagtc282101721128212DNA213人工序列220223P1340017gtaaccggcg tttcttgcac agtaatag282101821127212DNA213人工序列220223P1440018caagaaacgc cggttacgac gagtctg 272101921125212DNA213人工序列220223P1540019gtcgtaggca tagtttcttg cacag 252102021129212DNA213人工序列220223P1640020gaaactatgc ctacgacgag tctgcctac 292102121126212DNA213人工序列220223P1740021ctcgtcggca ccatagtttc ttgcac 262102221124212DNA213人工序列220223P1840022ctatggtgcc gagtctgctt actg242102321127212DNA213人工序列220223P1940023cagactcggc gtaaccatag tttcttg 272102421126212DNA213人工序列220223P2040024ggttacggcg agtctgctta ctgggg 262102521124212DNA213人工序列220223P2140025cagaggcgtc gtaaccatag tttc 242102621127212DNA213人工序列220223P2240026ggttacgacg cctctgctta ctggggc272102721125212DNA213人工序列220223P2340027gtaagcggcc tcgtcgtaac catgg 252102821126212DNA213人工序列220223P2440028gacgaggccg cttactgggg ccaagg 262102921125212DNA213人工序列220223P2540029gtaagcagac gagtcgtaac catag 252103021126212DNA213人工序列220223P2640030cgactcgtct gcttactggg gccaag 262103121124212DNA213人工序列220223P2740031ccagtaacca gactcgtcgt aacc 242103221125212DNA213人工序列220223P2840032cgagtctggt tactggggcc aaggg 252103321126212DNA213人工序列220223LL40033caaagcttgg aagcaagatg gaatca 262103421130212DNA213人工序列220223P2940034ccttagtttg cagacagaaa taatttgcag 302103521125212DNA213人工序列220223P3040035ctgtctgcaa actaaggcgg ttccg 252103621127212DNA213人工序列220223LC40036gaagtcgacc taacactctc ccctgtt272103721130212DNA213人工序列220223P3140037cctccttact ttgctgacag aaataatttg 302103821128212DNA213人工序列220223P3240038gtcagcaaag taaggaggtt ccgtacac 282103921117212PRT213小鼠40039Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Ser2104021117212PRT213人40040Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly210412118212PRT213小鼠40041Asn Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala1 521042211112212PRT213人HzS-III-VL40042Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asn Tyr20 25 30Gly Ile Asn Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Lys Gly Thr Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn65 70 75 80Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys85 90 95Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 10511021043211118212PRT213人HzS-III-VH40043Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Asn Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Tyr Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105110Leu Val Thr Val Ser Ser115210442119212PRT213人工序列220223結合到MHCII類分子的肽序列40044Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser1 5210452119212PRT213人工序列220223結合到MHCII類分子的肽序列40045Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val
1 52104621123212DNA213人工序列220223P3340046ggaaagaccc ttgagtggat ggg232104721122212DNA213人工序列220223P3440047ctcaagggtc tttccggggg cc 222104821128212DNA213人工序列220223P3540048gcagagtcga tttgactgta gacaattc 282104921126212DNA213人工序列220223P3640049cagtcaaatc gactctgccc tggaac 2權利要求
1.特異性結合B肝病毒表面抗原S的人源化重鏈突變體，其中人源重鏈HCDRs中的所有或部分胺基酸殘基取代了選自鼠源重鏈HCDR1，HCDR2和HCDR3的所有或部分胺基酸殘基。
2.按照權利要求1的人源化重鏈突變體，其中纈氨酸取代了HCDR1第34位胺基酸殘基上的異亮氨酸。
3.按照權利要求1的人源化重鏈突變體，其中絲氨酸取代了HCDR2第54位胺基酸上的蘇氨酸。
4.按照權利要求1的人源化重鏈突變體，其中甘氨酸取代了HCDR2第65位胺基酸上的絲氨酸。
5.按照權利要求1的人源化重鏈突變體，其中絲氨酸取代了HCDR3第100位胺基酸上的穀氨酸。
6.按照權利要求1的人源化重鏈突變體，其中它含有權利要求2到5的所有突變。
7.包含權利要求6的人源化重鏈突變體的表達載體pcDdA-HzSIIIh(保藏號KCTC 10083BP)。
8.特異性結合B肝病毒表面抗原S的人源化重鏈突變體，其中人源重鏈HCDRs中的所有或部分胺基酸殘基取代了選自鼠源重鏈HCDR1，HCDR2和HCDR3的所有或部分胺基酸殘基，並且去除了結合MHC II類分子的肽序列。
9.按照權利要求8的人源化重鏈突變體，其中結合MHC II類分子的肽序列由SEQ.ID.No44或SEQ.ID.No45代表。
10.按照權利要求8的人源化重鏈突變體，其中蘇氨酸取代了SEQ.ID.No44代表的序列P9位上的絲氨酸。
11.按照權利要求8的人源化重鏈突變體，其中天冬氨酸取代了SEQ.ID.No45代表的序列P6位上的蘇氨酸。
12.按照權利要求8的人源化重鏈突變體，其中它含有權利要求10到11的所有突變。
13.含有權利要求12的人源化重鏈突變體的表達載體pcDdA-HzSIVh(保藏號KCTC 10080BP)。
14.特異性結合B肝病毒表面抗原S的人源化輕鏈突變體，其中人源輕鏈LCDRs中的全部或部分胺基酸殘基取代了選自鼠源輕鏈LCDR1，LCDR2和LCDR3的全部或部分胺基酸殘基。
15.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中絲氨酸取代了LCDR1的第27位胺基酸上的天冬氨酸。
16.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中精氨酸取代了LCDR1的第31位胺基酸上的絲氨酸。
17.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中異亮氨酸取代了LCDR1的第33位胺基酸上的蛋氨酸。
18.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中賴氨酸取代了LCDR2的第54位胺基酸上的穀氨醯胺。
19.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中蘇氨酸取代了LCDR2的第56位胺基酸上的絲氨酸。
20.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中絲氨酸取代了LCDR3的第91位胺基酸上的蘇氨酸。
21.按照權利要求14的人源化輕鏈突變體，其中它含有權利要求15到20的所有突變。
22.含有權利要求21的人源化輕鏈突變體的表達載體pCMV-dhfr-HzSIIIk(保藏號KCTC 10084BP)。
23.同時用權利要求7或權利要求13的人源化重鍊表達載體和權利要求22的人源化輕鍊表達載體轉染的轉化體。
24.從權利要求23的轉化體表達得到的抗B肝病毒表面抗原S的人源化抗體。
25.製備人源化抗體的方法，它是比較小鼠和人抗體之間的CDR序列，選擇同源性最高的人CDR序列，和用人抗體CDR中的胺基酸殘基取代小鼠抗體CDR中的胺基酸殘基，其中小鼠CDR中的胺基酸殘基不影響抗原結合。
全文摘要
本發明涉及抗B肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其製備方法。具體地說，它涉及這樣的人源化抗體，即包含在它們可變區的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來源於人抗體的胺基酸序列的重鏈和輕鏈，還涉及含有上述人源化抗體的各重鏈和輕鏈基因的表達載體，以及通過用重鏈和輕鍊表達載體轉染的能夠生產人源化抗體的轉化體，及其製備方法。本發明的一種人源化抗體比現有技術的人源化抗體更加人源化。因此，它最小化了在人體中的免疫應答可能性並且具有良好的抗原結合能力，使它成為預防和治療B肝病毒感染的優秀候選物。
文檔編號A61P31/20GK1395617SQ01802990
公開日2003年2月5日 申請日期2001年10月4日 優先權日2000年10月2日
發明者洪孝貞, 金根洙 申請人:韓國生命工學研究院