重組誘發劑寡核鹼基校正肝細胞遺傳損害的體內應用的製作方法

2023-06-13 08:17:31

專利名稱：重組誘發劑寡核鹼基校正肝細胞遺傳損害的體內應用的製作方法
本申請要求1997年4月30日申請的美國專利申請系列第60/045,288號、1997年8月5日申請的第60/054,837號、1997年11月10日申請的第60/064,996號的優先權，這些專利中的每個通過引用整個結合到本文中。
1.發明領域本發明涉及使用重組誘發劑寡核鹼基(oligonucleobase)體內校正致病的遺傳缺陷的方法和組合物。本發明特別適用於治療該類型的遺傳缺陷，其中受治療者肝細胞中的所述遺傳缺陷的校正將減輕該疾病。
2.發明背景2.1使用嵌合突變載體來實現培養細胞中的遺傳改變該小節中包括出版物和專利申請，不是承認所述申請的出版物或或者發明(如果有的話)出現在本發明之前，或得自本發明人以外的人的概念。
公開的重組誘發劑寡核鹼基的實例稱為嵌合突變載體(CMV)或嵌合整復體(chimeraplast)，因為它們含有2』-O-修飾的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。
Kmiec，E.B.等，1994年11月，Mol.and Cell.Biol.14，7163-7172中描述了一種寡核鹼基，它具有互補的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，並含有與噬菌體M13mp19片段同源的序列。所述寡核鹼基具有單一的核糖核苷酸的連續區段。Kmiec等表明，所述寡核鹼基是得自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的REC2同源配對酶的底物。
於1995年6月14日公布的專利公布WO 95/15972和對應的美國專利第5,563,350號(』350專利)，描述了用於將遺傳改變引入真核細胞的雙鏈CMV。報導了在玉蜀黍黑粉菌基因中和鼠類ras基因中的實施例。後一實施例設計用以將轉化突變引入ras基因中，使得NIH 3T3細胞中ras基因的成功突變可以引起細胞集落的生長(「轉化」)。』350專利報導，NIH 3T3的最大轉化率低於0.1％，即每106暴露於ras雙鏈CMV的細胞約100個轉化子。在玉蜀黍黑粉菌系統中，轉化率為約600/106。在Kmiec，E.B.，1996年2月，Seminars in Oncology，23，188中描述了一種設計用以將突變引入人類bcl-2基因的嵌合載體。
在Kmiec，E.B.，1995年12月，Advanced Drug Delivery Reviews 17，333-40中，描述了一種設計用於修復K-ras的密碼子12中突變的雙鏈CMV。在得自人類胰腺癌的細胞系Capan 2中測試了該雙鏈CMV，採用LIPOFECTINTM將該雙鏈CMV引入Capan 2細胞中。引入雙鏈CMV後24小時，收穫細胞，並提取基因組DNA；通過PCR擴增含K-ras的密碼子12的片段，通過與等位基因特異性探針雜交，估計轉化率。報導修復率為約18％。
在Yoon，K.等，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci.93，2071中，公開了一種設計以修復編碼肝/骨/腎類型鹼性磷酸酶的基因中突變的雙鏈CMV。該鹼性磷酸酶基因通過質粒瞬時引入CHO細胞中。6小時後，引入雙鏈CMV。引入雙鏈CMV後24小時，回收質粒並進行分析。結果表明，約30-38％的鹼性磷酸酶基因被雙鏈CMV修復。
E.B.Kmiec，A.Cole-Strauss和L.Yoon的WO 97/41411以及出版物Cole-Strauss，A.等，1996年9月，SCIENCE 273，1386，公開了用於治療造血細胞遺傳病(例如鐮狀細胞病、地中海貧血症和戈謝病)的雙鏈CMV。E.B.Kmiec的WO 97/48714和對應的美國專利第5,731,181號描述了具有非天然核苷酸的雙鏈CMV，用於特異性的定點誘變。在所述申請和Kmiec及其同事的某些出版物中所述的雙鏈CMV，含有一段DNADNA同雙鏈體中心區段和RNADNA異雙鏈體或2』-OMe-RNADNA異雙鏈體的側翼區段。Kren等，1997，Hepatology 25，1462-1468報導了在非複製型初級肝細胞中成功使用CMV。Kren等，1998年3月，Nature Medicine 4，285報導了，使用CMV在體內將編碼凝血因子IX的基因中的遺傳缺陷引入大鼠中。
Kmiec及其同事的工作涉及在暴露於CMV時有絲分裂活性的(即增殖)細胞。Kmiec及其同事使用CMV/脂質體大分子載體複合物，其中CMV與預形成的脂質體或脂小泡混合。在這種複合物中，人們認為CMV附著於脂質體表面。
2.2使用聚乙烯亞胺大分子載體進行體內和體外轉染支鏈的聚乙烯亞胺已經用作載體，以在體內和體外將核酸引入真核細胞中。Boussif，O.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92，7279；Abdallah，B.等，1996，Human Gene Therapy 7，1947.Boletta，A.等，1997，8，1243-1251。Zanta等，1997年10月1日，Biocoiugate Chemistry 8，839-844報導了體外使用半乳糖基聚乙烯亞胺將DNA引入培養的HepG2肝癌細胞系中。在Kircheis，R.等，1997，Gene Therapy 4，409-418中，描述了將蛋白配體運鐵蛋白偶聯至聚乙烯亞胺及其利用運鐵蛋白受體將測試基因引入培養細胞中的應用。支鏈的聚乙烯亞胺含有仲氨基和叔氨基，其pK值範圍廣泛，因此在聚賴氨酸幾乎沒有或沒有緩衝能力的pH下，即在低於約8的pH下，這些聚乙烯亞胺具有相當大的緩衝能力。Tang，M.K.和Szoka，F.C.，1997，Gene Therapy 4，823-832。
Ferrari，S.等，1997，Gene Therapy 4，1100-1106報導了在體內和體外成功地使用線性聚乙烯亞胺轉染一種基因。
2.3使用脂質體載體進行體內轉染已經描述了使用脂質體或脂小泡將編碼外源蛋白的DNA引入細胞中。最常用的技術是使DNA附著於帶正電的脂質體表面上，而不是將DNA包入囊中，儘管已知包囊DNA技術。美國專利第4,235,871和4,394,448號是相關的。Smith，J.G.等，1993，Biochim.Biophy.Acta1154，327-340和Saubinger，R.M.等，1987，Methods in Enzymology 185，512綜述了該領域。在Fabrega，A.J.等，1996，Transplantation 62，1866-1871中，描述使用脂質體中的陽離子脂質DOTAP體內轉染肝細胞。在Zhu，N.等，1993，Science 261，209中，描述了使用含陽離子脂質的脂質體轉染多種成體小鼠細胞。在Fraley，R.等，1981，Biochemistry 20，6978-87中，描述了使用含磷脂醯絲氨酸的脂質形成用於轉染的DNA包囊脂質體。
2.4使用脫唾液酸糖蛋白受體進行肝細胞特異性轉染美國專利第5,166,320號和第5,635,383號公開了通過形成DNA、聚陽離子大分子載體和脫唾液酸糖蛋白受體的配體的複合物，轉染肝細胞。在一個實施方案中，該大分子載體是聚賴氨酸。Nandi，P.K.等，1986，J.Biol.Chem.261，16722-16722描述了使用含乳糖苷腦苷脂的脂質體體內轉染肝細胞。在Hara等，1995，Gene Therapy 2，764-788中，描述了使用脫唾液酸胎球蛋白標記的脂質體與報導質粒一起轉染肝細胞。
3.發明概述本發明涉及包含重組誘發劑寡核鹼基的組合物以及用該組合物將特定的遺傳改變引入受治療者個體細胞的DNA中的方法，該方法稱為「衍變(transmutation)」。重組誘發劑寡核鹼基是一種核鹼基(nucleobase)聚合物，它含有少於60個鹼基、為衍變靶的基因序列。本發明可以與現在已知或待開發的重組誘發劑寡核鹼基一起使用。在一個實施方案中，該重組誘發劑核鹼基是一種嵌合突變載體(CMV)，採用CMV實現衍變的方法稱為「嵌合整復術(chimeraplasty)」。與現有的這類組合物和方法相比，本發明的組合物和方法可以給予受治療者個體，以實現體內遺傳改變。本發明部分依賴於意外的發現，即CMV有效地使非增殖(即非有絲分裂)細胞衍變。本發明還依賴於意外的發現與一種大分子載體複合的CMV適用於嵌合整復術，其中通過披網格蛋白小窩內化入內體中的一種細胞表面受體(「披網格蛋白小窩受體」)的配體連接至所述大分子載體。
在具體實施方案中，本發明提供一種組合物，它包含一種CMV和一種選自以下的大分子載體直徑為25-400nm的水性核心脂小泡，其中該水性核心含有該CMV；直徑為25-400nm、具有脂質核心的脂質纖球體，其中該脂質核心含有該CMV的親脂鹽；和該CMV的聚陽離子鹽。用於這類鹽的聚陽離子的實例包括聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和組蛋白H1。在一個實施方案中，該聚陽離子是一種支鏈的聚乙烯亞胺(PEI)鹽，其質均分子量大於500道爾頓且低於1.3Md。
該載體可以可任選地用通過披網格蛋白小窩內化入內體的細胞受體的配體取代。在一個實施方案中，該配體為乳糖基部分，而該受體是肝細胞的脫唾液酸糖蛋白受體。其它受體包括運鐵蛋白、胰島素、胰高血糖素、EGF和低密度脂蛋白(LDL)的受體，而該配體可以是結合該受體的天然配體的片段。或者，該配體可以是特異性地結合於該受體的任何化合物，無論它是否與天然存在的配體相關。當給予受治療者個體時，所述CMV/大分子載體/配體的組合物還包含藥用可接受的水性載體，諸如緩衝鹽溶液。當給予細胞培養物時，該組合物還包含細胞培養基，該培養基可以補充有血清。
本發明的再一實施方案包括將上述複合物給予具有致病遺傳病的人類受治療者。該複合物可以胃腸外給予，在一個優選實施方案中，該複合物直接給予受該致病遺傳病影響的器官。在又一實施方案中，本發明包括在受治療者個體中和在細胞培養物中將CMV/大分子載體/配體複合物用於嵌合整復術。4.定義按照以下定義理解本發明。
寡核鹼基是一種核鹼基聚合物，該聚合物可以通過Watson-Crick鹼基配對，與具有互補序列的DNA雜交。
核鹼基包含鹼基，該鹼基為一種嘌呤、嘧啶或其衍生物或類似物。核鹼基包括肽核鹼基(肽核酸亞單位)和嗎啉核鹼基以及核苷和核苷酸。核苷是含有一種戊糖呋喃糖基部分的核鹼基，例如可任選取代的核糖核苷或2』-脫氧核糖核苷。核苷可以通過幾個連接部分中的一個連接，它可以含有或不含有磷。通過未取代的磷酸二酯鍵連接的核苷稱為核苷酸。
寡核鹼基鏈具有單一的5』端和3』端，它們是該聚合物最後的核鹼基。一個特定的寡核鹼基鏈可以含有所有類型的核鹼基。核鹼基化合物是包含一條或多條互補的或通過Watson-Crick鹼基配對雜交的寡核鹼基鏈的化合物。核鹼基或者是脫氧核糖型或者為核糖型。核糖型核鹼基是含有戊糖呋喃糖基的核鹼基，其中2』碳是用羥基、烷氧基或滷素取代的亞甲基。脫氧核糖型核鹼基是非核糖型核鹼基的核鹼基，包括不含有戊糖呋喃糖基部分的所有核鹼基。
寡核鹼基鏈從種屬上說包括核鹼基鏈和寡核鹼基鏈的區段和區域。寡核鹼基鏈具有一個3』端和一個5』端。當寡核鹼基鏈與一條鏈共同延伸時，所述寡核鹼基鏈的3』端和5』端也是該條鏈的3』端和5』端。
區域是寡核鹼基的一部分，該部分的序列得自某些特定的來源，例如具有至少15個核苷酸、具有人β-珠蛋白基因片段的序列的CMV。給定的區段或給定的區域可以含有2』-脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。然而，核糖型區段或2』脫氧核糖型區段僅分別含有核糖型和2』-脫氧核糖型核鹼基。5.發明詳述在以下5.2節以及下列等等中，應該理解，關於CMV的內容也適用於重組誘發劑寡核鹼基。
5.1嵌合突變載體的結構嵌合突變載體(CMV)由嘌呤和嘧啶的聚合物組成，所述載體與具有合適序列的DNA雜交，即形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick鹼基配對。每種CMV均分為相互互補的第一鏈和第二鏈，每條鏈至少有15個鹼基，這兩條鏈可以(但不需要)共價連接。寡核鹼基聚合物的亞單位稱為核鹼基。核鹼基含有一個鹼基，它或者為嘌呤，或者為嘧啶，或者為其類似物或衍生物。有兩種類型的核鹼基。核糖型核鹼基是具有2』-羥基、取代的羥基或2』-滷素取代的核糖的核糖核苷。所有非核糖型核鹼基的核鹼基均為脫氧核糖型核鹼基。
第一鏈和第二鏈的序列由至少兩個與靶基因同源的區和一個或多個不同於靶基因、且將遺傳改變引入靶基因的區(「增變區」)組成。增變區直接在3』方向和5』方向上與同源區相鄰。在本發明的一個優選實施方案中，每個增變區在3』和5』方向上與至少3個鹼基的同源區相鄰。在本發明的一個優選實施方案中，每個增變區在3』和5』方向的側翼為至少3個鹼基的核糖型寡核鹼基區段，這些區段不需要與增變區相鄰。側翼核糖型核鹼基區段不需要直接與增變區相鄰，即可以間插包含脫氧核糖型核鹼基的同源區的一部分。所有同源區的總長度優選為至少16個鹼基，長度更優選為約20個核苷酸至約60個核苷酸。如果該CMV含有被一個增變區分開的兩個同源區，則所述同源區可以更優選每個長8-15個鹼基，更優選長10個鹼基。
第一鏈的至少兩個同源區由至少3個相鄰的核糖型核鹼基組成，它們與第二鏈的脫氧核糖型核鹼基進行Watson-Crick鹼基配對。在一個優選實施方案中，第一鏈有9-25個核糖型核鹼基，更優選為20個核糖型核鹼基，這些核鹼基與第二鏈的脫氧核糖型核鹼基進行Watson-Crick鹼基配對。在一個實施方案中，第二鏈中沒有核糖型核鹼基。在一個實施方案中，第一鏈的增變區由脫氧核糖型核鹼基組成，其側翼為脫氧核糖型核鹼基。或者，該增變區可以第一鏈的核糖型核鹼基和第二鏈的脫氧核糖型核鹼基組成。
該增變區優選由20個或20個以下的鹼基組成，更優選由6個或6個以下的鹼基組成，最優選由3個或3個以下的鹼基組成。該增變區的長度可以不同於將與CMV同源區同源的靶基因區域分開的序列的長度，使得產生靶基因的插入或缺失。當CMV用以將缺失引入靶基因時，沒有可鑑別在增變區內的鹼基。相反，通過將靶基因中分離的兩個同源區並列，實現突變。對本發明來說，認為將缺失引入靶基因的CMV增變區的長度為缺失的長度。在一個實施方案中，該增變區缺失6-1個鹼基，更優選缺失3-1個鹼基。可以由單一的CMV引入多個分離的突變，在這種情況下，在同一個CMV中有多個增變區。或者，可以同時使用多個CMV，以將多個遺傳改變引入單個基因中，或者以將遺傳改變引入同一細胞的多個基因中。在此，該增變區也稱為異源區。
在一個實施方案中，該CMV是20-200個核鹼基的單一的寡核鹼基鏈，最好有40-400個核鹼基。在一個可選擇的實施方案中，該CMV包含第一和第二寡核鹼基鏈，每條鏈有20-100個鹼基；其中所述第一鏈包含所述第一鏈，而所述第二鏈包含所述第二鏈。所述第一和第二鏈不由核鹼基共價連接，或者可以僅通過Watson-Crick鹼基配對連接。可以用諸如聚乙二醇、聚1，3-丙二醇或聚1，4-丁二醇的寡烷二醇製備所述第一鏈和第二鏈的共價連接。
在一個可選擇的實施方案中，可以採用包含脫氧核苷酸或脫氧核苷和2』-O取代的核糖核苷酸或核糖核苷的CMV實施本發明。合適的取代基包括Kmiec的申請中指出的取代基-C1-6鏈烷。可選擇的取代基包括美國專利第5,334,711號(Sproat)指出的取代基和專利公告EP629 387和EP 679657(全為Martin的申請)指出的取代基，這些文獻通過引用結合到本文中。本文所用的、如Martin的申請或Sproat中所述的具有取代的2』-O的核糖核苷酸或核糖核苷的2』氟、氯或溴衍生物，稱為「2』-取代的核糖核苷酸」。特別優選的2』-取代的核糖核苷酸的實施方案是2』-氟、2』-甲氧基、2』-丙氧基、2』-烯丙氧基、2』-羥基乙氧基、2』-甲氧基乙氧基、2』-氟丙氧基和2』-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在更優選的實施方案中，2』-取代的核糖核苷酸為2』-氟、2』-甲氧基、2』-甲氧基乙氧基和2』-烯丙氧基取代的核糖核苷酸。
2』-取代的核糖核苷的定義類似。2』-取代的核糖核苷的特別優選的實施方案是2』-氟、2』-甲氧基、2』-丙氧基、2』-烯丙氧基、2』-羥基乙氧基、2』-甲氧基乙氧基、2』-氟丙氧基和2』-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在更優選的實施方案中，2』-取代的核糖核苷為2』-氟、2』-甲氧基、2』-甲氧基乙氧基和2』-烯丙氧基取代的核糖核苷酸。
術語「核酸酶抗性核糖核苷」包括2』-取代的核糖核苷，包括2』-取代的核糖核苷酸，也包括非核糖核苷酸的所有2』-羥基核糖核苷。在一個優選實施方案中，該CMV最好包括至少3個、更優選6個核酸酶抗性核糖核苷。在一個優選實施方案中，該CMV不含有核酸酶敏感性核糖核苷。在一個可選擇的優選實施方案中，每個其它的核糖核苷均為核酸酶抗性。可以容易地合成嘌呤和嘧啶的某些2』-封閉基團。在該CMV的一個實施方案中，僅所述核糖核苷嘌呤或僅核糖核苷嘧啶是核酸酶抗性的。
該CMV的又一特徵在於，含有至少3個核酸酶抗性的核糖型核鹼基。在一個優選實施方案中，所有核糖型核鹼基均為核酸酶抗性。
5.2適用於體內應用的製劑CMV和大分子載體的現有技術製劑在體內應用方面具有有限的用途，因為它們的CMV的容量低，並且因為沒有保護該CMV抵抗胞外酶。本發明提供三種可選擇的大分子載體，克服了現有技術的限制。所述載體是聚乙烯亞胺(PEI)水性核心脂小泡，它們也稱為單室脂質體(unilamellelar liposome)和脂質纖球體(nanosphere)。
可以進一步為每種所述載體提供與靶細胞表面蛋白互補的配體。這類配體可用來提高CMV攝入靶細胞的量和特異性。在本發明的一個實施方案中，該靶細胞為肝細胞，而該配體為結合至脫唾液酸糖蛋白受體的半乳糖或乳糖二糖。
5.2.1聚陽離子載體可以採用體外給予細胞或體內給予受治療者時無毒的任何聚陽離子實施本發明。合適的實例包括聚鹼性胺基酸(諸如聚賴氨酸、聚精氨酸)、鹼性蛋白(諸如組蛋白H1)和合成聚合物(諸如支鏈的聚乙烯亞胺)(-NHCH2CH2-)x[-N(CH2CH2NH2)CH2CH2-lγ。
可以用支鏈的聚乙烯亞胺(PEI)實施本發明，所述聚乙烯亞胺的平均分子量大於約500道爾頓，優選大於約10Kd，更優選大於約25Kd(通過光散射測定的質均分子量)。適用性的上限根據該PEI的毒性和溶解性確定。分子量大於約1.3Md的毒性和溶解性，使得這種PEI材料的適用性較差。在Boussif，O等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92，7297中，描述高分子量PEI作為載體以用DNA轉染細胞的用途，該文獻通過引用結合到本文中。可以按照Boussif等的方法，製備PEI溶液。
通過將CMV水溶液和PEI的中性水溶液以每個CMV磷酸酯9-4個氮的比率混合，形成CMV載體複合物。在一個優選實施方案中，該比率為6。例如，通過將0.15M NaCl中的10mM pH 7.0的PEI溶液與CMV混合，形成CMV終濃度為100-50nM，可以形成該複合物。
另外，披網格蛋白小窩受體的配體可以連接至該聚陽離子上，或連接至該聚陽離子的一部分上。在一個實施方案中，該配體是結合至脫唾液酸糖蛋白受體的糖或二糖，諸如乳糖、半乳糖或N-乙醯半乳糖胺。可以使用任何技術連接該配體。通過螢光標記該CMV，並將螢光CMV/分子載體/配體複合物直接注射入目的組織，並按照Kren等，1997，Hepatology 25，1462-1468的方法測定螢光攝入的程度，可以確定配體與聚乙烯亞單位的最佳比率。
用比率為每個氮0.4-0.8個乳糖基部分的乳糖基PEI和未修飾的PEI的1∶1混合物，可以獲得良好的結果。該混合物以每個CMV磷酸酯4-9個PEI氮的比率使用。寡核苷酸磷酸酯與氮的優選比率為1∶6。用質均分子量為25Kd和800Kd的PEI可以獲得良好的結果，所述PEI可購自Aldrich Chemical Co.，產品目錄號分別為40,872-7和18，197-8。
在一個可選擇的實施方案中，該聚陽離子載體可以是諸如組蛋白H1的鹼性蛋白，它們可以用披網格蛋白小窩受體的配體取代。可以使用組蛋白和CMV的1∶1(w/w)混合物實施本發明。
5.2.2可用於載體中的脂質加入本發明脂小泡和脂質纖球體載體的脂質的選擇不是關鍵。採用半純化的脂質生物製劑，例如豆油(Sigma Chem.Co.)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)(Avanti Polar Lipids)，可以構建脂質纖球體。可用於脂質纖球體和/或脂小泡製備的其它脂質包括中性脂質(例如二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)和二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE))、陰離子脂質(例如二油醯磷脂醯絲氨酸(DOPS))和陽離子脂質(例如二油醯三甲基銨丙烷(DOTAP)、二-十八基二醯氨基甘氨醯精胺(DOGS)、二油醯三甲基銨(DOTMA)和DOSPER(1，3-二-油醯氧基-2-(6-羥基-spermyl)-丙基-醯胺四乙酸鹽，可購自Boehringer-Mannheim)。在Gao，X.和Huany，L，1995，GeneTherapy 2，710中可以發現可用於本發明的脂質的其它實例。糖配體可以以糖腦苷脂的形式(例如乳糖基腦苷脂或半乳糖腦苷脂(Avanti PolarLipids)加入。
脂質的具體選擇不是關鍵。氫化EPC或溶血卵磷脂可以用來替代EPC。可以摻入DPPC(二棕櫚醯磷脂醯膽鹼)以提高所述傳遞系統的效能和/或穩定性。
5.2.3脂質纖球體載體的構建可以通過以下方法構建脂質纖球體。將一種磷脂的甲醇或氯仿甲醇溶液加入小試管中，通過氮氣流去除溶劑，留下脂質膜。通過將CMV的鹽水溶液與一種陽離子脂質的乙醇溶液混合，形成CMV親脂鹽。當所述陽離子種類相對於CMV陰離子(磷酸鹽)過量4倍摩爾濃度時，可以獲得良好的結果。將親脂CMV鹽溶液加至脂質膜，輕輕地渦旋混合，然後加入與所述磷脂等重量量的中性脂質。CMV的濃度可以高至約脂質總量的3％(w/w)。
加入中性脂質後，該乳液於4℃超聲處理1小時，直至形成乳狀懸浮液，而沒有明顯的分離跡象。將懸浮液通過聚碳酸酯濾膜擠出，直至達到最終的直徑為約50nm。當靶細胞為網狀內皮細胞時，脂質纖球體的優選直徑為約100-200nm。然後，可以洗滌攜帶CMV的脂質纖球體，並將其置於藥用可接受的載體或組織培養基中。脂質纖球體的容量為約2.5mg CMV/500μl纖球體懸浮液。
5.2.4脂小泡的構建通過將脂質的氯仿甲醇溶液置於一個試管中，通過氮氣流去除溶劑，形成脂質膜。加入CMV的鹽水溶液，使得CMV的量為最終混合物中脂質量的20％-50％(w/w)，而水性溶劑量為脂質量的約80％。輕輕渦旋混合後，迫使含脂質體液體通過連續的較細的聚碳酸酯濾膜，直至達到最終的直徑為約50nm。通過連續的較細的聚碳酸酯濾膜，導致多層脂質體轉化為單室脂質體，即小泡。當靶細胞為網狀內皮細胞時，所述脂質纖球體的優選直徑為約100-200nm。然後可以洗滌攜帶CMV的脂質纖球體，並將其置於藥用可接受的載體或組織培養基中。
將所述CMV包入所述小泡的水性核心中。包入約50％加入的CMV。
基本方法的變化包括形成含比率為每個CMV磷酸鹽約4個PEI亞胺的PEI/CMV濃縮物的水溶液。當所述脂質體帶正電時，即當所述脂小泡含有的陽離子脂質(諸如DOTAP、DOTMA或DOSPER)的陽離子濃度大於陰離子脂質(諸如DOPS)的陰離子濃度時，所述濃縮物特別有用。脂小泡的容量為約每500μl脂小泡懸浮液150μg CMV。
在一個優選實施方案中，所述脂小泡含有陰離子磷脂DOPS和中性脂質(諸如DOPE或DOPC)的混合物。或者，可以用以製備脂小泡的帶負電磷脂包括二油醯磷脂酸(DOPA)和二油醯磷脂醯甘油(DOPG)。在一個更優選的實施方案中，所述中性脂質為DOPC，而DOPS∶DOPC的比率在2∶1和1∶2之間，最好為1約1∶1。帶負電脂質與中性脂質的比率應該大於1∶9，因為低於10％的帶電荷脂質由於小泡融合而導致脂小泡不穩定性。
通過採用特定的脂小泡製劑和長度約5.0kb的質粒一起轉染靶細胞，可以測定該製劑，其中所述質粒在轉染的靶細胞中表達某些容易檢測到的產物。如果該質粒與PEI以亞胺∶磷酸鹽約9-4∶1的比率濃縮，則可以用脂小泡和該質粒一起轉染細胞。該脂小泡製劑與質粒一起轉染細胞的能力，是該製劑將CMV引入細胞並實現衍生的能力的指標。
某些脂質，特別是聚陽離子脂質，可能對某些細胞系和原代細胞培養物有毒性。應該調節所述脂小泡製劑，以避免這類有毒的脂質。
可以通過多種方法，將披網格蛋白小窩受體的配體引入所述脂小泡中。可以將諸如乳糖腦苷脂或半乳糖腦苷脂的腦苷脂類引入脂質混合物中，並摻入脂小泡中，以產生脫唾液酸糖蛋白受體的配體。
在一個可選擇的實施方案中，所述脂小泡還包含一個完整的膜蛋白，該蛋白本身插入所述脂小泡的脂質雙層中。在一個具體實施方案中，該蛋白為融合性的(fusigenic)(F-蛋白)，來自或者稱為仙臺病毒或日本血凝病毒(HVJ)的病毒。已經報導了含F-蛋白的脂小泡的製備和使用其將DNA引入肝細胞、心肌細胞和內皮細胞。參見例如美國專利第5,683,866號、國際申請PCT JP97/00612(公布為WO 97/31656)。也參見Ramani，K.等，1996，FEBS Letters 404，164-168；Kaneda，Y.等，1989，J.Biol.Chem.264，121126-12129；Kenada，Y.等，1989，Science243，375；Dzau，V.J.等，Proc.Natl. Acad.Sci.93，11421-11425；Aoki，M.等，1997，J.Mol.Cardiol.29，949-959。
5.3疾病和疾病特異性CMV本發明用來校正任何致病的突變，其中該突變導致一個或多個核苷酸改變、或插入或缺失1至約30個核苷酸。在一個優選實施方案中，缺失或插入1至約6個核苷酸。通過給予含與該突變基因座同源的野生型基因序列的CMV，校正所述致病突變。構建該CMV，使得有多個與異源區側翼的突變DNA序列同源的區，即含有該突變體不存在的野生型序列的部分的CMV區。當該突變由插入組成時，該CMV的異源區被認為是與插入位點同源的點。因此，該CMV異源區的長度被認為是突變序列中插入的長度。請注意，通過突變位置確定CMV的序列，然而，該突變的序列並不重要。相反，CMV的序列通常是野生型基因序列或所需的相關序列。在以下每個序列中，在異源區下劃線。
本發明的第一個實施方案，是可以用來校正引起威勒布蘭特病的突變的CMV。校正該突變的CMV含有序列5』-CTC GGA GAGCCCCCTC GCA-3』(SEQ ID No.1)或其互補序列，所述序列是混合的核糖-脫氧核糖寡核鹼基的序列，具有相同的鹼基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。需要校正威勒布蘭特因子基因的組織是血管內皮。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起血友病B的突變的CMV，所述突變為人凝血因子IX基因的nt 1234的A→T的置換。校正該突變的CMV含有序列5』-CAA GGA GATAGT GGG GGA C-3』(SEQ ID No.2)或其互補序列，所述序列是混合的核糖-脫氧核糖寡核鹼基的序列，具有相同的鹼基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。本發明可以用來校正人類凝血因子IX基因中的其它突變，該基因的序列在Kurachi，K.等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79，6461-6464中給出，該文獻通過引用結合到本文中。需要校正因子IX基因的組織是肝臟肝細胞。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起α1-抗胰蛋白酶缺陷的Z-突變的CMV。Z-突變為人類α1-抗胰蛋白酶基因的nt 1145的G→A的置換。校正該突變的CMV含有序列5』-ACC ATC GACGAGAAA GGG A-3』(SEQ ID No.3)或其互補序列，所述序列是混合的核糖-脫氧核糖寡核鹼基的序列，具有相同的鹼基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。本發明用來校正人類α1-抗胰蛋白酶基因中的其它突變，該基因的序列在Long，G.L.等，1984，Biochemistry 23，4828-4837中給出，該文獻通過引用結合到本文中。需要校正α1-抗胰蛋白酶基因的組織是肝臟肝細胞。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起家族性血膽固醇過多(FH)的低密度脂蛋白受體(LDLR)突變的CMV。沒有引起大多數FH病例的單一突變。在Hobbs，H.H.等，1992，Hum.Mutat.1，445-466和Leren，T.P.等，Hum.Genet.95，671-676中，可以發現對引起FH的超過105個點突變或25nt或更少的插入或缺失的調查，所述文獻通過引用結合到本文中。人類LDLR cDNA的完整序列公開於Yamamoto，T.等，1984，CELL 39，27-38中。需要校正LDLR以減輕FH的組織是肝臟肝細胞。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起戈謝病的葡萄糖腦苷脂酶基因突變的CMV。可以用來校正戈謝病突變的CMV的結構，可以在共同特許的美國申請序列第08/640,517號中發現。可以校正葡萄糖腦苷脂酶突變以獲得減輕戈謝病的組織是肝臟網狀內皮(Kupffer細胞)。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起1型胰高血糖素儲存病(GSD)的葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)基因突變的CMV。在Lei，K.-J.等，SCIENCE 262，580中給出所述人類G-6-P的完整序列，該文獻通過引用結合到本文中。引起1型GSD的兩種最常見的突變為nt 326的C→T、nt 1118的C→T、和於nt 459插入TA，如Lei，J.-J.等，J.Clin.Investigation 95，234-240中所述，該文獻通過引用結合到本文中。校正這兩種最常見突變的CMV含有序列5』-TTT GGA CAGCGTCCA TAC T-3』(SEQ ID No.4)或5』TGC CTC GCCCAG GTC CTG G-3』(SEQ ID No.5)或它們的互補序列，所述序列是混合的核糖-脫氧核糖寡核鹼基的序列，具有相同的鹼基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正鳥氨酸轉氨甲醯酶(OTC)基因突變的CMV，OTC基因是一種X連鎖基因，該酶催化鳥氨酸和氨甲醯磷酸縮合產生瓜氨酸和磷酸。在Horwich，A.L.等，1984，Science224，1068中給出了人類OTC cDNA的完整序列，該文獻通過引用結合到本文中。在Tuchman，M.，1992，Human Mutation 2，174中綜述了OTC基因的結構和所鑑定的突變體結構的綜述。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起克-奈症候群的人類UDP-葡糖醛酸基轉移酶基因突變的CMV。在Bosma，P.J.等，1992，Hepatology，15，941-7中給出了人類UDP-葡糖醛酸基轉移酶基因的序列，該文獻通過引用結合到本文中。可以校正UDP-葡糖醛酸基轉移酶基因以減輕克-奈症候群的組織是肝臟肝細胞。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正引起半乳糖血的半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶基因突變的CMV。在Flack，J.E.等，1990 Mol.Biol.Med.7,365中描述了人類半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶基因的序列，而在Reichert，J.K.V.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2633-37和Reichert，J.K.V.等，1991，Am.J.Hum.Gen.49，860中描述了半乳糖血的分子生物學和群體遺傳學，這些文獻通過引用結合到本文中。引起半乳糖血的最常見的突變是胺基酸188的Q→R。校正該突變的CMV含有序列5』-CC CAC TGC CAG GTA TGG GC-3』(SEQ ID No.6)或其互補序列，所述序列是混合的核糖-脫氧核糖寡核鹼基的序列，具有相同的鹼基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。
本發明的再一實施方案，是可以用來校正苯丙氨酸羥化酶(PAH，苯丙氨酸-4-單加氧酶，EC 1.14.16.1)突變的CMV，該突變引起苯丙酮酸尿(PKU)或血苯丙氨酸過多。在Woo，SLC，1989，Biochemistry28，1-7中描述了苯丙酮酸尿的分子遺傳學和群體遺傳學，在Kowk，S.C.M.等，1985，Biochemistry 28，556-561中描述了人類PAH的序列，所述文獻通過引用結合到本文中。引起PKU的突變的其它實例可以在Sworniczak，B.等，1992，Hum Mutat.1，138-146中發現。
本領域技術人員會認識到，本發明可以用來在「正常」基因中製造有益的改變，其中已經鑑定出這種有益改變的身份。例如，3,000個人中有多達1人的血清膽固醇水平為100mg/dl或更低，因為這類個體是截短的脂蛋白apo B基因雜合的。Kane，J.P.和Havel，R.J.THEMETABOLIC BASIS OF INHERITED DISEASE，第II卷(1995，McGraw Hill，New York)第1866頁。本文所用的「致病突變」包括諸如apo B基因的實例，其中「正常」基因與疾病相關，即動脈硬化症，而雜合形式的稀有等位基因保護抵抗該疾病。因此，在這些情況下，統計學上最普遍的基因應該被認為「致病基因」，而具有有益改變的基因應該被認為是「野生型基因」。5.4所述製劑的體內應用本發明的CMV可以以50-250μg/gm的劑量直接胃腸外給予靶器官。當靶器官為肝肌或腎時，該CMV/大分子載體複合物可以直接注射入器官中。當靶器官為肝臟時，可以使用靜脈內注射入肝臟的肝靜脈或門靜脈，所述靜脈的循環已暫時阻塞。或者，CMV/大分子複合物可以還包含肝導向配體，諸如乳糖基糖或半乳糖基糖，該配體允許將所述CMV/大分子複合物靜脈內給予進入體循環。
當靶器官是肺或其組織時，例如為細支氣管上皮時，可以通過氣溶膠給予CMV/大分子複合物。在Schwarz L.A.等，1996，Human GeneTherapy 7，731-741中，描述了脂質體/DNA複合物的小顆粒氣溶膠傳遞。
當靶器官為血管內皮時，例如在威勒布蘭特病中，可以將CMV/大分子複合物直接傳遞入體循環中。利用提供有配體的脂質體可以導向其它器官，所述配體使得脂質體能夠通過循環系統內皮細胞外滲。
對於酶缺陷，通過校正1％的受影響組織的細胞，可以獲得治療效果。在實質細胞具有較長壽命的組織中，例如在肝臟中，可以重複進行用CMV的治療，以獲得增強的治療效果。
6.實施例6.1CMV/大分子載體複合物6.1.1脂質纖球體材料卵磷脂醯膽鹼(EPC)、DOTAP和半乳糖腦苷脂(Gc)(Avanti PolarLipids)；豆油(Sigma Chemical Co.)；二-十八基二醯氨基甘氨醯精胺(DOGS)(Promega)。方法將EPC、DOTAP和Gc以限定濃度預先溶於氯仿和無水甲醇中，並於20℃貯存於乾燥容器中的小玻璃瓶中直至使用。將EPC(40-45mg)、DOTAP(200μg)和Gc(43μg)的溶液等份裝入小的10×75mm硼矽酸鹽試管中，在氮氣流下去除溶劑。CMV在0.15M NaCl(～80-125μg/250-300μl)中稀釋；DOGS(作為乙醇中的10mg/ml溶液)以3-5倍於加入的CMV的重量在250-300μl 0.15M NaCl中稀釋。將兩種溶液溫和渦旋混合，以混合內容物，然後將CMV溶液緩慢加入DOGS溶液中。通過輕敲並倒轉試管數次，混合內容物。將DOGS複合物溶液加至乾燥的脂質，然後加入豆油(40-45mg)，將該混合物渦旋高速混合數秒，在控制4℃溫度的房間，在FS-15(Fisher Scientific)中浴式超聲波儀(bath sonicator)中浴式超聲處理～1小時。不時從浴式超聲波儀中取出試管並進行渦旋混合。當看起來均勻時，形成乳狀懸浮液(沒有明顯的油滴分離)，將其通過一系列聚碳酸酯膜擠出至孔徑為50nm。製劑貯存於4℃待用，並在使用前進行渦旋混合。
6.1.2帶負電定向脂小泡材料二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯磷脂醯絲氨酸(DOPS)、半乳糖腦苷脂(Gc)或乳糖基腦苷脂(Avanti Polar Lipids)。方法將DOPS、DOPC和Gc以1∶1∶0.16(500μg總脂質)的摩爾比溶於氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然後在氮氣流下乾燥，獲得均勻的脂質膜。將CMV在500μl0.15M NaCl(約100-250μg/500μl)中稀釋。於室溫下將該溶液加至脂質膜。通過交替的溫和渦旋混合和加溫(在37-42℃水浴中)將脂質完全分散。在均勻的乳狀懸浮液形成後，用Liposofast小擠出機，將其通過一系列聚碳酸酯膜(孔徑為0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)擠出。通過每種孔徑擠出5-7次。製備後，脂小泡貯存於4℃待用。在這些條件下，所述脂小泡穩定至少1個月。可以將終產物凍幹。
6.1.3中性定向脂小泡材料二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、半乳糖腦苷脂(Gc)或乳糖基腦苷脂(Avanti Polar Lipids)。方法將DOPC、DOPE和Gc(1∶1∶0.16摩爾比)或DOPC∶Gc(1∶0.08)溶於氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然後在氮氣流下乾燥，獲得均勻的脂質膜。將所述寡核苷酸(或嵌合分子)在500μl 0.15M NaCl(約100-250μg/500μl)中稀釋。於室溫下將該溶液加至脂質膜。通過交替的溫和渦旋混合和加溫(在37-42℃水浴中)將脂質完全分散。在均勻的乳狀懸浮液形成後，用Liposofast小擠出機，將其通過一系列聚碳酸酯膜(孔徑為0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)擠出。通過每種孔徑擠出5-7次。製備後，脂小泡貯存於4℃待用。所述製劑的脂小泡的大小穩定約5天。
6.1.4帶正電定向脂小泡材料二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯三甲基銨丙烷(DOTAP)、半乳糖腦苷脂(Gc)或乳糖基腦苷脂(Avanti Polar Lipids)、聚乙烯亞胺(PEI)(M.W.800Kd)，Fluka Chemicals。方法將DOPC、DOTAP和Gc(6∶1∶0.56摩爾比)(500μg總脂質)溶於氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然後在氮氣流下乾燥，獲得均勻的脂質膜。將PEI用水稀釋至45mg/100ml的濃度。用HCl將該溶液的pH調至～7.6。每次新製備該PEI母液，該母液等於約50nmol胺/μl。將CMV在0.15M NaCl中稀釋，濃度為250μl中～250μg。將PEI進一步稀釋到250μl0.15M NaCl中，使得每摩爾寡核苷酸/嵌合磷酸酯存在約4摩爾PEI胺。將PEI溶液滴加至CMV溶液(均在室溫下)，並渦旋混合5-10分鐘。然後將PEI-複合物溶液加至脂質膜，如上所述分散脂質。在均勻的乳狀懸浮液形成後，用Liposofast小擠出機，將其通過一系列聚碳酸酯膜(孔徑為0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)擠出。通過每種孔徑擠出5-7次。製備後，脂小泡貯存於4℃待用。在這些條件下，所述脂小泡穩定至少1個月。為了穩定更長時間和提高穩定性，可以將該終產物凍幹。
6.1.5乳糖基-PEI/PEI複合物PEI(25 kDa)購自Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)。PEI(800kDa)購自Fluka Chemicals(Ronkokoma，NY，USA)。通過先前描述的將寡糖與蛋白綴合的方法的修改方法，進行PEI的乳糖基化。簡而言之，將3-5ml PEI(0.1-1.2M單體)的乙酸銨(0.2M)或Tris緩衝液(0.2M)(pH7.6)溶液與7-8mg氰基硼氫鈉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和約30mg乳糖單水合物(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)一起溫育。在蓋緊的聚丙烯試管中於37℃振蕩水浴中進行反應。10天後，將反應混合物對蒸餾水(500ml)透析48小時，更換1-2次水。將純化的複合物通過0.2μm濾膜除菌過濾，並貯存於4℃。通過苯酚-硫酸法測定與PEI結合的糖(作為半乳糖)量。
如下測定乳糖基PEI中游離胺(伯胺+仲胺)的摩爾數用0.02MPEI母液建立標準曲線；用去離子水在玻璃試管中將數等份母液稀釋至1ml，然後將50μl茚三酮試劑(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)加入每個試管中，並劇烈渦旋混合10秒。讓其於室溫下顯色10-12分鐘，然後在Beckman DU-64分光光度計上讀出485nm下的O.D.(在4分鐘內)。如上處理20-50μl等份的L-PEI樣品，並根據標準曲線測定游離胺的摩爾數。如下製備乳糖基-PEI(L-PEI)複合物將每mmolRNA/DNA磷酸酯3mmol作為L-PEI的胺和3mmol作為PEI的胺的相當物一起混合，並在0.15M NaCl中根據需要稀釋；將混合物滴加至嵌合溶液中，並渦旋混合5分鐘。
為了證實嵌合寡核苷酸與PEI或L-PEI的完全結合，進行未複合和複合的嵌合物的凝膠分析(4％LMP瓊脂糖)。為了測定由所述嵌合物的複合提供的抵抗核酸酶降低的保護作用的程度，將樣品用RNA酶和DNA酶處理。氯仿苯酚抽提後，用肝素(50單位/μg核酸)將複合物解離，在4％LMP瓊脂糖凝膠上分析產物。6.2PEI/CMV介導的大鼠和人類因子IX改變的證明材料.胎牛血清得自Atlanta Biologicals，Inc.(Atlanta，GA)。末端轉移酶、螢光素-12-dUTP、ExpandTM高保真度PCR系統、dNTP和高純度PCR模板製備試劑盒得自Boehringer Mannheim Corp.(Indianapolis，IN)。ReflectionTMNEF-496放射自顯影膜和ReflectionTMNEF-491增感屏來自DuPont NENResearch Products(Boston，MA)。聚乙烯亞胺(PEI)800 kDa得自Fluka Chemical Corp.(Ronkonkoma，NY)。[γ-32P]ATP獲自ICN Biochemicals Inc.(Costa Mesa，CA)。pCRTM2.1獲自Invitrogen(San Diego，CA)。OPTIMENTM、Dulbecco修改的Eagle培養基、William E培養基和寡核苷酸365-A和365-C來自Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)。為30,000molwt截留值的離心膜購自Millipore Corp.(Bedfor，MA)。Dil和SlowFadeTM抗褪色封固劑獲自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)。T4多核苷酸激酶購自New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。MSI MagnaGraph膜購自Micron Separations，Inc.(Westboro，MA)。用於PCR擴增的引物獲自Oligos Etc.，Inc.(Wilsonville，OR)。氯化四甲基銨購自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)。所有其它化學藥品均是分子生物學級或試劑級，購自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)、CurtinMatheson Scientific，Inc.(Eden Prairie，MN)和Fisher Scientific(Itasca，IL)。
寡核苷酸合成，合成嵌合的RNA/DNA寡核苷酸HIXF、RIXF和RIXR。用DNA和2』-O-甲基RNA磷醯胺核苷單體，在ABI 394合成儀上製備該CMV。用苯甲醯(腺苷和胞苷)和異丁醯(鳥苷)保護DNA磷醯胺外向環胺基團。在2』-O-甲基RNA磷醯胺上的保護基團對於腺苷為苯氧基乙醯，對於胞苷為異丁醯，而對於鳥苷為二甲基甲醯胺。在合成後，通過在乙醇/濃氫氧化銨中於55℃加熱20小時，去除鹼基保護基團。將粗製寡核苷酸在含有7M尿素的15％聚丙烯醯胺凝膠上電泳，用UV shadowing使DNA顯現。從凝膠條上洗脫出所述嵌合分子，通過沉澱濃縮，並用G-25離心柱脫鹽。大於95％的純化的寡核苷酸是全長的。
野生型和「突變型」大鼠因子IX的序列為(SEQ ID No.7) 365wt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GAT AGT GGG GGA CCC CAT GTTLys Asp Ser Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val(SEQ ID No.8)(SEQ ID No.9)mt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GATCGT GGG GGA CCC CAT GTTArgRIXR、RIXF和HIXRCMV的結構如下RIXR (SEQ ID No.10)TGCGCG-ccccagggggTGCTAgaggaaguguTTTTTTCGCGC GGGGTCCCCCACGATCTCCTTCACAT3′ 5′RIXRc(SEQ ID No. 11)TGCGCG-acacuuccucTAGCAcccccuggggTTTTTTCGCGC TGTGAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT3′ 5′RIXF (SEQ ID No. 12)TGCGCG-acacuuccucTAGCAcccccuggggTTTTTTCGCGC TGTGAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT3′5′HIXF (SEQ ID No. 13)TGCGCG-acaguuccucTAGCAcccccuggggTT TT TTCGCGC TGTCAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT3′ 5′大寫字母是脫氧核糖核苷酸，小寫字母是2』OMe-核糖核苷酸。在異源區的核苷酸下劃線。
細胞培養、轉染和肝細胞分離。在潮溼的CO2氖圍中，HuH-7細胞於37℃在含有10％(體積/體積)熱滅活胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養基中維持。轉染前24小時，每個35mm培養皿平板接種1×105細胞。在轉染時，細胞用OPTIMEMTM培養基衝中洗2次，在1ml相同培養基中進行轉染。轉染後18小時，將2ml含20％(體積/體積)熱滅活胎牛血清的Dubecco改進的Eagle培養基，加至每個35mm培養皿，再將細胞維持30小時，然後收穫用於DNA分離。製備PEI(800kDa)10mM pH 7.0的母液。簡而言之，將嵌合寡核苷酸與10mM PEI以每個嵌合磷酸酯9個PEI氮相當物一起，在100μl 0.15M NaCl中以150nM(4μg)、300nM(8μg)和450nM(12μg)的任一個終濃度轉染。18小時後，再加入2ml培養基，並將嵌合物濃度分別減至50nM、100nM和150nM，進行其餘30小時的培養。HuH-7載體對照轉染利用與HulXF轉染中所用的等量的PEI，但用等體積的10mMTris-HCl pH 7.6替代所述寡核苷酸。
通過先前描述的兩步膠原酶灌注(Fan等，Oncogene 121909-1919，1996，該文獻通過引用結合到本文中)，從250g雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)中分離大鼠初級肝細胞，並在PrimariaTM板上以每35mm培養皿4×105細胞的密度平板接種。培養物在William E培養基中維持，該培養基補充了10％熱滅活FBS、26mM碳酸氫鈉、23mM HEPES、0.01U/ml胰島素、2mML-谷醯胺、10mM地塞米松、5.5mM葡萄糖、100U/ml青黴素和100U/ml鏈黴素。平板接種後24小時，用相同培養基洗滌肝細胞兩次，加入1ml新鮮培養基，用PEI/嵌合寡核苷酸複合物，以HuH-7細胞的相同濃度轉染細胞。18小時後，再加入2ml培養基，6小時或30小時後收穫細胞。
將嵌合寡核苷酸直接注射入肝臟將雄性Sprague-Dawley大鼠(約175g)維持在標準的12小時光/黑暗周期，並隨意餵食標準實驗室食物。將大鼠麻醉，施行中線切口，暴露肝臟。當它們進入尾狀葉時，將夾子夾於肝靜脈和門靜脈上，將終體積為250-300μl的75μg 1∶9嵌合物/PEI複合物直接注射入尾狀葉。將尾狀葉保持結紮15分鐘，除去夾子恢復血液流動。縫合切口後，讓動物從麻醉中甦醒，隨意給予食物和水。用等體積Tris-HCl pH 7.6替代嵌合寡核苷酸，進行載體對照。注射後24小時和48小時，處死動物，取出尾狀葉，解剖注射部位周圍的組織用於DNA分離。分離DNA，通過PCR擴增大鼠因子IX基因的末端外顯子。
嵌合分子的核攝入按照生產商的建議，用末端轉移酶和螢光素-12-dUTP對嵌合雙鏈體進行3』末端標記，然後將其與未標記的寡核苷酸以2∶3的比率混合。如上所述進行轉染，24小時後，將細胞在含有4％低聚甲醛(重量/體積)的磷酸緩衝鹽水pH 7.4中於室溫下固定10分鐘。固定後，按照生產商的建議，細胞用Dil在0.32M蔗糖中的5μM溶液復染10分鐘。用0.32M蔗糖洗滌，然後用磷酸緩衝鹽水pH 7.4洗滌後，細胞用磷酸緩衝鹽水中的SlowFadeTM抗褪色封固劑蓋上蓋玻片，用MRC1000聚焦顯微鏡(BioRad，Inc.，Hercules，CA)檢查。如上所述用螢光標記的嵌合物原位注射肝臟尾狀葉，注射後24小時收穫。將尾狀葉縱向對切，用OCT包埋並冷凍。將冷凍切片切為約10μm厚，於室溫下用含有4％低聚甲醛(重量/體積)的磷酸緩衝鹽水pH 7.4固定10分鐘。固定後，按照生產商的建議，細胞用Dil在0.32M蔗糖中的5μM溶液復染10分鐘。用0.32M蔗糖洗滌，然後用磷酸緩衝鹽水pH 7.4洗滌後，切片用SlowFadeTM抗褪色封固劑蓋上蓋玻片，用MRC1000聚焦顯微鏡(BioRad，Inc.)檢查。以1μM的跨距製備固定細胞和切片組織的標本系列，以確立在核中存在該嵌合物。
DNA分離和克隆。轉染後24小時和48小時，通過刮取收穫細胞。用高純度PCR模板製備試劑盒，按照生產商的建議，分離大於100-150鹼基對的基因組DNA。用500ng分離的DNA，進行人類肝IX基因中第8個外顯子的317-nt片段的PCR擴增。所用的引物是分別對應於人類因子IX cDNA的核苷酸1008-1032和1300-1324的5』-CATTGCTGACAAGGAATACACGAAC-3』(SEQ ID No.14)和5』-ATTTGCCTTTCATTGCACACTCTTC-3』(SEQ ID No.15)。將引物於58℃退火20秒，於72℃延伸45秒，並於94℃進行變性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶，將樣品擴增30個循環。用500ng從或者初級肝細胞或者肝尾狀葉中分離的DNA，進行大鼠因子IX基因的374-nt片段的PCR擴增。所用的引物是分別對應於大鼠因子IX cDNA的核苷酸443-457和782-806的 5』-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAC-3』(SEQ ID No.16)和5』-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3』(SEQ ID No.17)。將引物於59℃退火20秒，於72℃延伸45秒，並於94℃進行變性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶，將樣品擴增30個循環。按照生產商的建議，將來自人類和大鼠因子IX基因的PCR擴增產物，亞克隆入TA克隆載體pCRTM2.1中，並用連接的材料轉化冷凍的感受態大腸桿菌。
菌落雜交和序。平板接種18-20小時後，將菌落影印至MSIMagnaGraph尼龍濾膜上，複製並按照生產商的建議處理，以用於雜交。濾膜與17mer寡核苷酸探針365-A(5』-AAGGAGATAGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.18)或365-C(5』-AAGGAGATCGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.19)雜交24小時，其中下劃線的核苷酸是誘變的靶。用[γ-32]ATP(＞7,000 Ci/mmol)和T4多核苷酸激酶，按照生產商的建議，32P末端標記所述探針。於37℃，在含1％SDS的2X氯化鈉檸檬酸鈉、5X Denhardt’s和200μg/ml變性超聲處理的魚精DNA中進行雜交。雜交後，濾膜在1X氯化鈉磷酸鹽EDTA、0.5％SDS中衝洗，然後於54℃在含3M氯化四甲基銨、2mM EDTA pH 8.0、0.1％SDS的50mM Tris-HCl pH 8.0中洗滌1小時。用NENReflection膜，採用增感屏於-70℃進行放射自顯影。用Qiagen小量製備試劑盒(Chatsworth，CA)，從鑑定為與365-A或365-C雜交的菌落製備質粒DNA，並用mp13反相引物，在ABI 370A測序儀(Perkin-Elmer，Corp.，Foster City，CA)上對質粒DNA進行自動測序。體內結果將嵌合寡核苷酸進行螢光素標記，並用來測定直接注射入肝臟的尾狀葉是否可行。結果表明，在尾狀葉內注射位點鄰近的肝細胞，與在分離的初級肝細胞和HuH-7細胞中觀察到的相似，顯示出攝入螢光標記的嵌合分子。儘管在胞質中存在某些點狀物質，但主要在核中檢測到標記物質。事實上，在距注射位點最遠的肝細胞中僅觀察到核的標記。用相同的方案，將未標記的PEI/RIXF嵌合複合物和載體對照，直接注射入尾狀葉中，注射後24小時和48小時後處死動物。按方法中所述，分離肝臟DNA，對該DNA進行PCR擴增跨越定向nt交換位點的374nt的序列。亞克隆和用PCR擴增物質轉化大腸桿菌後，將轉化菌落的雙份濾膜影印。如在方法中所述，濾膜與對或者365-A(野生型)或365-C(因子IX突變)特異性的32P標記的17mer寡核苷酸探針雜交，並在雜交後處理。接受直接肝注射RIXF嵌合分子的大鼠，於24小時和48小時時，表現出的A→C的轉化率為約1％。相反，載體對照沒有表現出與365-C探針雜交。培養來自RIXF處理動物、與365-C探針雜交的菌落，分離質粒DNA，並進行測序以證實A→C的轉化。擴增的374-nt片段的末端與引物準確地相對應，觀察到的唯一核苷酸變化是靶交換位點的A→C。6.3乳糖基-PEI/CMV介導的大鼠因子IX改變的證實6.3.1結果如以上6.1.5小節中所述，用RIXR寡核苷酸製備與乳糖基-PEI和PEI的混合物複合的CMV。也構建導向因子IX同一區互補鏈的CMV(RIXRc)。嵌合寡核苷酸於Ser365的定向核苷酸轉化螢光素標記的嵌合分子的核定位顯示在分離的大鼠肝細胞中的有效轉染。然後用800kDa PEI作為載體，用濃度相當的未標記的嵌合分子因子RIXRc和RIXR，轉染培養的肝細胞。另外，同時進行載體對照轉染。轉染後48小時，收穫細胞，分離DNA並加工，以按6.1.5小節中所述進行雜交。通過PCR擴增和克隆的因子IX基因外顯子8的374-nt的序列(Sarkar，B.，Koeberl，D.D.和Somer，S.S.，「對6個物種的因子IX基因的活化肽和催化域的直接測序」，Genomics，6，133-143，1990)雙份菌落影印物的雜交，檢測於Ser365的A→C定向核苷酸轉化。用來區別野生型365-A(5』-AAGGAGATAGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.20)或轉化的365-C(5』-AAGGAGATCGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.21)的17mer寡核苷酸探針對應於該cDNA序列的核苷酸710至762。
通過將與365-C寡核苷酸雜交的克隆數除以與兩種寡核苷酸探針雜交的克隆數，計算定向核苷酸的總轉化率。表1總結了RIXRc的結果。在用RIXR或RIXRc轉染的初級肝細胞中，僅觀察到於Ser365的A→C的轉化。在用RIXR或RIXRc轉染的肝細胞中，觀察到相似的轉化率。在載體轉染細胞或用其它嵌合寡核苷酸轉染的細胞中，均未產生任何與365-C寡核苷酸探針雜交的克隆(未發表的觀察)。另外，沒有觀察到365-C寡核苷酸探針與下述DNA的克隆雜交，所述DNA從未處理肝細胞中分離、並在0.5-1.5μg所述寡核苷酸存在下PCR擴增。採用6.1.5小節中所述的乳糖基PEI衍生物，分離肝細胞中的A→C轉化率也是劑量依賴性的，高達19％。從用乳糖基EPI平行轉染的培養細胞中分離的RNA的RT-PCR和雜交分析，證明A→C的轉化率範圍為11.9-22.3％。通過嵌合寡核苷酸在完整的肝臟中的定點核苷酸交換螢光素標記的寡核苷酸也用來檢測直接注射入肝臟的尾狀葉後，所述嵌合分子的細胞攝入。結果表明，尾狀葉中注射位點鄰近的肝細胞表現出攝入螢光素標記的嵌合物，與在分離的大鼠肝細胞中觀察到的相似。儘管在所述肝細胞胞質中存在某些點狀物質，但標記物質主要存在於核中。事實上，在距注射位點最遠的那些區域中僅觀察到核標記。然後，通過尾靜脈注射25kDa PEI，體內給予未標記的RIXR嵌合寡核苷酸和載體對照，注射後5天收穫肝臟組織。分離肝臟DNA，並採用與初級肝細胞所用的那些引物，PCR擴增跨越定向核苷酸交換位點的374-nt序列。亞克隆和用PCR擴增物質轉化大腸桿菌後，進行轉化菌落的雙份濾膜影印。所述濾膜與相同的32P標記的、對或者365-A(野生型)或者365-C(突變型)特異性的17mer寡核苷酸雜交，並進行雜交後處理。用100μg RIXR嵌合寡核苷酸處理的大鼠，表現出A→C的轉化率範圍為13.9％-18.9％，而接受兩次注射總共350μg的那些大鼠，表現出40％轉化。相反，載體對照沒有表現出與365-C探針雜交。分離的RNA的RT-PCR雜交表明，在接受高劑量的肝臟中A→C的轉化頻率為26.4％-28.4％。載體處理的大鼠的APTT範圍為對照值的89.7％-181.9％(131.84％±32.89％)，而所述寡核苷酸處理的動物的APTT範圍為48.9％-61.7％(53.8％±4.8％)。
測定正常(n＝9)和注射兩次的動物(n＝3)的大鼠測試血漿在Hepes緩衝液(50mM Hepes/100mM NaCl/0.02％NaN3，pH 7.4)中的1/10稀釋液的APTT時間。根據由12隻6-8周齡雄性大鼠合併的血漿的稀釋液(1∶10至1∶80)APTT結果構建的log-log標準曲線，測定雙份樣品的因子IX活性。正常大鼠的APTT結果的範圍為對照值的89.7％-181.9％(平均值＝131.84％±32.89％)，而注射兩次的動物的APTT結果的範圍為49.0％-61.7％(平均值＝53.8％±5.8％)。正常大鼠的APTT凝固時間以秒計的範圍為60.9秒至81.6秒(平均值＝71.3±7.3秒)，而兩次感染的大鼠的APTT時間範圍為92.3秒至98.6秒(平均值＝96.3±2.9秒)。分離的肝細胞和完整肝臟中突變的因子IX基因的序列分析對野生型和突變型基因進行直接測序，以證實得自體外和體內研究中濾膜雜交的結果。分析了至少10個來自完整肝臟或分離的肝細胞、與或者365-A或者365-C雜交的獨立的克隆。測序結果表明，與365-A雜交的菌落(圖6，頂部圖板)表現出野生型IX序列，即於報導的cDNA序列的Ser365為A。相反，得自因子RIXRc轉染的初級肝細胞、與365-C寡核苷酸探針雜交的那些菌落，轉化為Ser365的C。在得自轉染的大鼠肝臟、與17mer 365-C寡核苷酸探針雜交的克隆中，觀察到於Ser365的相同的A→C轉化。對所有克隆的因子IX基因的完整的374-nt PCR擴增區進行測序，沒有檢測到非Ser365的指定變化的改變。最後，得自初級肝細胞和完整的肝臟的374-nt PCR擴增的基因組DNA的起點和終點，準確地對應於用於擴增方法的引物的起點和終點，表明所克隆和測序的DNA得自基因組DNA，而不是非降解的嵌合寡核苷酸。表1 通過菌落影印物雜交測定的大鼠因子IX基因組DNA於Ser365的A→C轉化的百分率PEI傳遞傳統 365-C克隆總克隆 A→C(％)PEI800kDa1濃度體外 150nM 24 572 4.230031 367 8.545063 501 12.5Lac-PEI800kDa體外 90 18 337 5.318034 300 11.327047 253 18.6Lac-PEI25kDa體外 90 28 527 5.318053 417 12.727060 305 19.7Lac-PEI25kDa2劑量體內×1 100μg24 166 14.571 386 18450 360 13.9Lac-PEI 25 kDa體內×2 350μg237 601 39.4228 563 40.5271 678 40.01所顯示的初級肝細胞轉染的數據代表兩個試驗的平均值。2以300μl 5％葡萄糖，通過尾靜脈注射給予體內嵌合物/PEI複合物。單獨顯示每個劑量的3隻動物的結果。6.3.2材料和方法嵌合寡核苷酸的體內傳遞。將雄性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague-Dawley，Inc.)(～50g)維持在標準的12小時光/黑暗周期，隨意餵食標準實驗室食物。300μl 5％葡萄糖中的載體對照和比率為每個嵌合磷酸酯6個PEI氮相當物的乳糖基化的25 kDa PEI(Abdallah，B.等，「將基因體內轉移入成年哺乳動物腦中的有效的非病毒載體聚乙烯亞胺」，Human Gene Theapy，7，1947-1954，1996)。通過尾靜脈注射，或者以100μg的單一劑量，或者以連續數天150μg和200μg的分割劑量，給予等份樣品。注射後5天，取出肝臟組織，用於DNA和RNA分離。按先前描述的方法(Kren，B.T.，Trembley，J.H.和Steer，C.J.，「在大鼠肝臟再生期間mRNA穩定性的改變」，Am.J.Physiol.，270，G763-G777，1996)分離DNA，用於PCR擴增大鼠因子IX基因的外顯子8。分離RNA，用RNAexol和RNAmate(Intermoutian Scientific Corp.，Kaysville，UT)，按照生產商的方案，用於RT-PCR擴增與基因組DNA相同的區域。
因子IX的活性測定。第二次尾靜脈注射0.1倍體積0.105M檸檬酸鈉/檸檬酸後20天，收集載體(n＝9)和寡核苷酸處理(n＝3)的大鼠的血液樣品。以2,500xg離心，然後以15,000×g離心後，將所得的血漿貯存於-70℃。根據活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT)測定，測定因子IX活性。簡而言之，50μl APTT試劑(DADE，Miami，FL)、50μl人類因子IX缺陷的血漿(George King Biomedical，Overland，KS)和50μl大鼠測試血漿在Hepes緩衝液(50mM Hepes/100mMNaCl/0.02％NaN3，pH 7.4)的1/10稀釋液，在ST4血凝度計(AmericanBioproducts，Parsippany，NJ)中於37℃溫育3分鐘。通過加入50μl 33mM CaCl2的Hepes緩衝液，起始凝固。根據由正常雄性大鼠(n＝12)的合併血漿稀釋液(1∶10至1∶80)APTT結果構建的log-log標準曲線，確定雙份樣品的因子IX活性。
DNA/RNA分離和克隆。在轉染後48小時，通過刮取收穫細胞。用高純度PCR模板製備試劑盒(Boehringer Mannheim，Corp.，indianapolis，N)，分離大於100-150鹼基對的基因組DNA。採用RNAzolTMB(Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX)，按照生產商的方案分RNA。用或者從初級肝細胞或者從肝臟組織中分離的DNA 300ng，進行大鼠因子IX基因的374-nt片段的PCR擴增。將引物設計為分別對應於大鼠因子IX cDNA的核苷酸433-457和782-806的5』-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAAC-3』(SEQ ID No.22)和5』-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3』(SEQ ID No.23)(Oligos Etc.，Wilsonville，OR)。引物於59℃退火20秒，於72℃延伸45秒，並於94℃進行變性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶(BoehringerMannheim，Corp.)，將樣品擴增30個循環。將來自肝細胞和完整的肝臟的因子IX基因的PCR擴增產物，亞克隆入TA克隆載體pCRTM2.1(Invitrogen，SanDiego，CA)中，並用連接的材料轉化冷凍的感受態大腸桿菌。為了根除PCR人造產物，將300ng對照DNA與0.1、1.0和1.5μg該寡核苷酸一起溫育，然後進行PCR擴增反應。另外，將1.0μg單獨的該嵌合物用作PCR擴增的模板。
用一種試管RT-PCR系統TitianTM(Boehringer Mannheim，Corp.)進行RT-PCR擴增。按照生產商的方案，採用用於DNA PCR擴增的相同引物。為了根除DNA汙染，RNA樣品用RQ1無RNA酶的DNA酶(Promega Corp.，Madison，WI)處理，RNA酶處理的RNA樣品的RT-PCR陰性對照與RT-PCR反應平行進行。將每種PCR反應物連接入相同的TA克隆載體中，並轉化入冷凍的感受態大腸桿菌中。
菌落雜交和測序。平板接種18-20小時後，將菌落影印至MSIMagnaGraph尼龍濾膜上，複製並處理，以按照生產商的建議進行雜交。濾膜與17mer寡核苷酸探針365-A(5』-AAGGAGATAGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.24)或365-C(5』-AAGGAGATCGTGGGGGA-3』)(SEQ ID No.25)(Life technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)雜交24小時，其中下劃線的核苷酸是誘變的靶。用[γ-32P]ATP(＞7,000 Ci/mmol)和T4多核苷酸激酶(New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly MA)，32P末端標記所述探針。於37℃，在含1％SDS的2X氯化鈉檸檬酸鈉、5X Denhardt’s和200μg/ml變性超聲處理的魚精DNA中進行雜交。雜交後，濾膜在1X氯化鈉磷酸鈉EDTA、0.5％SDS中衝洗，然後於54℃在含3M氯化四甲基銨、2mM EDTApH 8.0、0.1％SDS的50mM Tris-HCl pH 8.0中洗滌(Melchior，W.B.和VonHippel，P.H.「DNA中dA.dT和dG.dC鹼基對相對穩定性的改變」，Proc Natl. Acad.Sci.USA，70，298-302，1973)。用NENReflection膜，採用增感屏於-70℃進行放射自顯影。用Qiagen小量製備試劑盒(Chatsworth，CA)，從鑑定為與365-A或365-C雜交的菌落製備質粒DNA，並用mp13正向和反向引物以及基因特異性引物5』GTTGACCGAGCCACATGCCTTAG-3』(SEQ ID No.26)，用ABI370A測序儀(Perkin-Elmer，Corp.，Foster City，CA)，對質粒DNA進行自動測序，其中所述基因特異性引物對應於大鼠因子IX cDNA的核苷酸616-638。6.4在Chapel Hill狗中血友病B突變的校正Chapel Hill品系的狗具有一個在動物導致血友病的(C→A)147突變，將該品系的狗用來獲得原代培養的肝細胞。以下給出了設計以校正該突變的CMV。DIX1 (SEQ ID No.28)TGCGCG au uca aag aaT TGA CCC TAA Taa ucg acc cc TT TT TTCG CGC TA AGT TTC TTA ACT GGG ATT ATT AGC TGG GGT3′5′。
所述肝細胞用360nM在含或者25kDa Lac-PEI或者半乳糖腦苷脂的水性核心中複合的DIX1處理，所述DIX1是帶負電的脂小泡(Gc-NLV)。以下表II中給出了結果。
於因子IX基因的核苷酸1477處A向G轉化的頻率(原代肝細胞，來自Chapel Hill品系血友病B狗)載體 轉染次數 濃度 G克隆/總克隆 頻率(％)Gc-NLV一次360nM30/19515.4430/21813.76兩次 30/11825.4Lac-PEI 一次*360nM20/14114.225kDa 48/34813.3兩次21/107 19.6*對平行轉染的培養物進行的RT-PCR給出A向G轉化的頻率為11.1％6.5 Gunn大鼠中克-奈樣突變的校正患有高膽紅素血症的突變大鼠稱為Gunn大鼠，它們在編碼膽紅素-尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基轉移酶(UGTlAl)的基因中有單個核苷酸缺失。Roy Chowdhury，J.等，1991，J.Biol.Chem.266，18294。患有克-奈症候群I型的病人也具有UGTlAl基因的突變，導致終身高膽紅素血症和隨之發生的腦損害。Bosma，P.J.等，1992，FASEB J.6，2859；Jansen，P.L.M.等，Progress In Liver Diseases，XIII，Boyer，J.L.和Ockner，R.K.編輯(W.B.Saunders，Phil.1995)，第125-150頁。以下給出設計用於校正Gunn大鼠突變的一種CMV-CN3的結構。CN3(mut→WT) (SEQ ID No.27)T GCGCG gg gac uua caG GAC CTT TAC uga ctt cua TTTTTT CGCGC CC CTG AAT GTC CTG GAA ATG ACT GCC GAT T3′5 ′按照以上方案，用150nM CN3處理Gunn大鼠的原代培養的肝細胞，只是該載體或者為6.2.2小節的帶負電糖基化脂小泡，或者為乳糖基-PEI載體，其寡核苷酸磷酸酯與亞胺的比率為1∶4。用帶負電脂質體的結果為轉化8.5％，而用乳糖基-PEI載體的轉化為3.6％。
給Gunn大鼠注射1mg/Kg與上述或者25kDa Lac-PEI複合或者與帶負電Gc脂小泡複合的CN3。通過按照所述用於因子IX的方法進行克隆和雜交，測定基因的轉化率。以下所示的結果表明，UGTlAl基因的約15％-25％拷貝被轉化。UGT-1基因的核苷酸1239處插入G的頻率(在Gunn大鼠中)載體 劑量 G克隆/總克隆 頻率(％)Gc-NLV 1mg112/81515.4208/76127.3185/97418.939/273 14.6178/403 19.3225kDa PEI. 1mg188/83822.4(乳糖基化)254/1150 22.1245/99724.61測定的原始轉化頻率。270％部分肝切除後7天測定的轉化頻率。
連續5天給Gunn大鼠注射1mg/Kg與上述25 kDaLac-PEI複合的CN3。最後一次注射後25天，血清膽紅素從6.2mg/dl降至3.5mg/ml，在隨後的25天內維持在該水平。序列表(1)一般資料(i)申請人(A)收信人Steer，Clifford J.
Kren，Betsy T.
Bandyopadhyay，Paramita T.(ii)發明名稱重組誘發劑寡核鹼基校正肝細胞遺傳損害的體內應用(iii)序列數28(iv)通信地址(A)收信人Kimeragen，Inc.
(B)街道300 Pheasant Run(C)城市Newtown(D)州PA(E)國家美國(F)郵政編碼18940(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)作業系統DOS(D)軟體FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)當前申請數據(A)申請號(B)提交日期(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號(B)提交日期(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Hansburg，Daniel
(B)註冊號36156(C)參考/檔案號7991-015-228(ix)電訊資料(A)電話215-504-4444(B)傳真215-504-4545(C)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO1CTCGGAGAGC CCCCTCGCA 19(2)SEQ ID NO2的信息(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO2CAAGGAGATA GTGGGGGAC 19(2)SEQ ID NO3的信息
(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO3ACCATCGACG AGAAAGGGA 19(2)SEQ ID NO4的信息(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO4TTTGGACAGC GTCCATACT 19(2)SEQ ID NO5的信息(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它
(xi)順序描述SEQ ID NO5TGCCTCGCCC AGGTCCTGG 19(2)SEQ ID NO6的信息(i)順序特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO6CCCACTGCCA GGTATGGGC 19(2)SEQ ID NO7的信息(i)順序特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO7AAAGATTCAT GTGAAGGAGA TAGTGGGGGA CCCCATGTT39(2)SEQ ID NO8的信息(i)順序特徵(A)長度13個胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)順序描述SEQ ID NO8Lys Asp Ser Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val1 5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)順序特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO9AAAGATTCAT GTGAAGGAGA TCGTGGGGGA CCCCATGTT 39(2)SEQ ID NO10的信息(i)順序特徵(A)長度68個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO10GGGGTCCCCC ACGATCTCCT TCACATTTTU GUGAAGGAGA TCGTGGGGGA CCCCGCGCGT 60TTTCGCGC68(2)SEQ ID NO11的信息(i)順序特徵(A)長度68個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO11TGTGAAGGAG ATCGTGGGGG ACCCCTTTTG GGGUCCCCCA CGATCUCCUU CACAGCGCGT 60TTTCGCGC68(2)SEQ ID NO12的信息(i)順序特徵(A)長度68個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO12TGTGAAGGAG ATCGTGGGGG ACCCCTTTTG GGGUCCCCCA CGATCUCCUU CACAGCGCGT 60TTTCGCGC68(2)SEQ ID NO13的信息(i)順序特徵(A)長度68個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO13TGTCAAGGAG ATCGTGGGGG ACCCCTTTTG GGGUCCCCCA CGATCUCCUU GACAGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO14的信息(i)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO14CATTGCTGAC AAGGAATACA CGAAC 25(2)SEQ ID NO15的信息(i)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO15ATTTGCCTTT CATTGCACAC TCTTC25(2)SEQ ID NO16的信息(i)順序特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO16ATTGCCTTGC TGGAACTGGA TAAC 24(2)SEQ ID NO17的信息(i)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO17TTGCCTTTCA TTGCACATTC TTCAC25(2)SEQ ID NO18的信息(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO18AAGGAGATAG TGGGGGA17(2)SEQ ID NO19的信息(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO19AAGGAGATCG TGGGGGA17(2)SEQ ID NO20的信息(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO20AAGGAGATAG TGGGGGA17(2)SEQ ID NO21的信息
(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO21AAGGAGATCG TGGGGGA 17(2)SEQ ID NO22的信息(i)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO22ATTGCCTTGC TGGAACTGGA TAAAC 25(2)SEQ ID NO23的信息(i)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO23TTGCCTTTCA TTGCACATTC TTCAC25(2)SEQ ID NO24的信息(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO24AAGGAGATAG TGGGGGA 17(2)SEQ ID NO25的信息(i)順序特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO25AAGGAGATCG TGGGGGA 17(2)SEQ ID NO26的信息(i)順序特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO26GTTGACCGAG CCACATGCCT TAG23(2)SEQ ID NO27的信息(i)順序特徵(A)長度76個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO27CCCTGAATGT CCTGGAAATG ACTGCCGATT TTTAUCTTCA GUCATTTCCA GGACAUUCAG 60GGGCGCGTTT TCGCGC 76(2)SEQ ID NO28的信息(i)順序特徵(A)長度80個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它(xi)順序描述SEQ ID NO28TAAGTTTCTT AACTGGGATT ATTAGCTGGG GTTTTCCCCA GCUAATAATC CCAGTTAAGA 60AACUUAGCGC GTTTTCGCGC
權利要求
1.一種組合物，包含a)一種重組誘發劑寡核鹼基；b)一種水性載體；和c)選自以下的一種大分子載體(i)一種水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡核鹼基，(ii)一種脂質纖球體，它包含所述寡核鹼基的親脂鹽，和(iii)一種聚陽離子，其平均分子量在500道爾頓和1.3Md之間，其中所述聚陽離子與所述寡核鹼基形成鹽。
2.權利要求1的組合物，它還包含一種披網格蛋白小窩受體的配體，所述受體連接至所述大分子載體。
3.權利要求2的組合物，其中所述大分子載體是帶負電的水性核心脂小泡。
4.權利要求3的組合物，其中所述水性核心脂小泡包含二油醯磷脂醯膽鹼和二油醯磷脂醯絲氨酸。
5.權利要求4的組合物，其中所述水性核心脂小泡還包含一種腦苷脂。
6.權利要求2的組合物，其中所述大分子載體是支鏈的聚乙烯亞胺。
7.權利要求2的組合物，其中所述大分子載體是包含融合F-蛋白的水性核心脂小泡。
8.權利要求2的組合物，其中所述寡核鹼基包含(i)第一同源區和第二同源區，它們一起的長度至少為16個核鹼基，且不多於60個核鹼基，所述區與哺乳動物的靶基因同源；和(ii)配置於第一同源區和第二同源區之間的一個異源區，至少長1個核鹼基，且不多於20個核鹼基，所述異源區與所述靶基因異源，並含有所述改變。
9.權利要求8的組合物，其中所述重組誘發劑寡核鹼基包含至少15個與2』-取代的核糖核苷酸進行Watson-Crick鹼基配對的脫氧核糖核苷酸。
10.權利要求9的組合物，其中所述2』-取代的核糖核苷酸獨立地選自2』-甲氧基-核糖核苷酸、2』-烯丙氧基-核糖核苷酸、2』-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2』-氟-核糖核苷酸。
11.權利要求8的組合物，其中所述配體是選自運鐵蛋白受體、煙酸受體、肉鹼受體、胰島素受體和胰島素樣生長因子-1受體的受體的配體。
12.權利要求8的組合物，其中所述披網格蛋白小窩受體是脫唾液酸糖蛋白受體。
13.權利要求12的組合物，其中所述配體包含選自以下的一個部分乳糖、半乳糖和N-乙醯半乳糖胺，並且其中所述寡核鹼基的序列包含編碼選自以下一種產物的人類基因的連續16個核苷酸片段的序列或其互補序列α1-抗胰蛋白酶、凝血因子IX、尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基轉移酶、葡萄糖腦苷脂酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、鳥氨酸轉氨甲醯酶和苯丙氨酸羥化酶。
14.改變受治療哺乳動物組織中靶基因的方法，所述方法包括給予所述受治療的哺乳動物一種方法，所述方法包含一種水性藥用可接受的載體和一種重組誘發劑寡核鹼基，所述寡核鹼基包含a)一種重組誘發劑寡核鹼基；b)一種水性載體；和c)選自以下的一種大分子載體(i)一種水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡核鹼基，(ii)一種脂質纖球體，它包含所述寡核鹼基的親脂鹽，和(iii)一種聚陽離子，其平均分子量在500道爾頓和1.3Md之間，其中所述聚陽離子與所述寡核鹼基形成鹽，其中披網格蛋白小窩受體的配體共價連接至所述大分子載體。
15.權利要求14的方法，其中所述組織是肝臟。
16.權利要求14的方法，其中所述大分子載體是帶負電水性核心脂小泡。
17.權利要求16的方法，其中所述水性核心脂小泡包含二油醯磷脂醯膽鹼和二油醯磷脂醯絲氨酸。
18.權利要求17的方法，其中所述水性核心脂小泡還包含一種腦苷脂。
19.權利要求14的方法，其中所述大分子載體是一種支鏈的聚乙烯亞胺。
20.權利要求14的方法，其中所述大分子載體是線性聚乙烯亞胺或線性聚陽離子多肽。
21.權利要求14的方法，其中所述寡核鹼基包含(a)第一同源區和第二同源區，它們一起的長度至少為16個核鹼基，且不多於60個核鹼基，所述區與哺乳動物的靶基因同源；和(b)配置於第一同源區和第二同源區之間的一個異源區，至少長1個核鹼基，且不多於20個核鹼基，所述異源區與所述靶基因異源，並含有所述改變。
22.權利要求21的方法，其中所述重組誘發劑寡核鹼基包含至少15個與2』-取代的核糖核苷酸進行Watson-Crick鹼基配對的脫氧核糖核苷酸。
23.權利要求22的方法，其中所述2』-取代的核糖核苷酸獨立地選自2』-甲氧基-核糖核苷酸、2』-烯丙氧基-核糖核苷酸、2』-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2』-氟-核糖核苷酸。
24.權利要求22的方法，其中所述披網格蛋白小窩受體是一種脫唾液酸糖蛋白受體，而所述大分子載體是聚乙烯亞胺或帶負電的水性核心脂小泡。
25.將有益改變引入人類受治療者細胞的靶基因致病序列中的方法，所述方法包括給予所述受治療者一定量的組合物，所述組合物包含一種水性藥用可接受的載體和一種具有核糖型和脫氧核糖型核鹼基的寡核鹼基，所述寡核鹼基包含a)一種重組誘發劑寡核鹼基；b)一種水性載體；和c)選自以下的一種大分子載體(i)一種水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡核鹼基，(ii)一種脂質纖球體，它包含所述寡核鹼基的親脂鹽，和(iii)一種聚陽離子，其平均分子量在500道爾頓和1.3Md之間，其中所述聚陽離子與所述寡核鹼基形成鹽，其中披網格蛋白小窩受體的配體共價連接至所述大分子載體，並且所述量有效地減輕由所述序列引起的疾病。
26.權利要求25的方法，其中所述細胞是肝細胞。
27.權利要求25的方法，其中所述大分子載體是帶負電的水性核心脂小泡。
28.權利要求27的方法，其中所述水性核心脂小泡包含二油醯磷脂醯膽鹼和二油醯磷脂醯絲氨酸。
29.權利要求28的方法，其中所述水性核心脂小泡還包含一種腦苷脂。
30.權利要求25的方法，其中所述大分子載體是支鏈的聚乙烯亞胺。
31.權利要求25的方法，其中所述大分子載體是線性聚乙烯亞胺或線性聚陽離子多肽。
32.權利要求25的方法，其中所述寡核鹼基包含(a)第一同源區和第二同源區，它們一起的長度至少為16個核鹼基，且不多於60個核鹼基，所述區與哺乳動物的靶基因同源；和(b)配置於第一同源區和第二同源區之間的一個異源區，至少長1個核鹼基，且不多於20個核鹼基，所述異源區與所述靶基因異源，並含有所述改變。
33.權利要求32的方法，其中所述重組誘發劑寡核鹼基包含至少15個與2』-取代的核糖核苷酸進行Watson-Crick鹼基配對的脫氧核糖核苷酸。
34.權利要求33的方法，其中所述2』-取代的核糖核苷酸獨立地選自2』-甲氧基-核糖核苷酸、2』-烯丙氧基-核糖核苷酸、2』-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2』-氟-核糖核苷酸。
35.權利要求33的方法，其中所述披網格蛋白小窩受體是一種脫唾液酸糖蛋白受體，而所述大分子載體是聚乙烯亞胺或帶負電的水性核心脂小泡。
36.權利要求35的方法，其中所述配體包含選自以下的一個部分乳糖、半乳糖和N-乙醯半乳糖胺，並且其中所述寡核鹼基的序列包含編碼選自以下一種產物的人類基因的連續16個核苷酸片段的序列或其互補序列α1-抗胰蛋白酶、凝血因子IX、尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基轉移酶、葡萄糖腦苷脂酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、鳥氨酸轉氨甲醯酶和苯丙氨酸羥化酶。
全文摘要
本發明涉及將特定基因改變引入動物細胞的內源基因中的組合物和方法。由寡核鹼基或寡核鹼基的衍生物和類似物實現所述基因改變,所述寡核鹼基或寡核鹼基的衍生物和類似物的長度一般小於約100個核鹼基。本發明提供大分子載體,可任選地加入披網格蛋白小窩受體的配體。在一個實施方案中,所述配體是乳糖或半乳糖,而在肝細胞中製造所述基因改變。通過本發明,已經在體外改變了靶基因最高達40%的拷貝。觀察到具有克－奈樣表型和血友病B表型的突變基因的修復。
文檔編號A61P7/04GK1268186SQ98806642
公開日2000年9月27日 申請日期1998年4月30日 優先權日1997年4月30日
發明者C·J·斯特爾, B·T·克倫, P·T·班迪奧帕迪亞雅 申請人:明尼蘇達大學評議會