對澱粉聚合物具有增強的活性的變體α澱粉酶的製作方法

2023-06-13 18:25:56

對澱粉聚合物具有增強的活性的變體α澱粉酶的製作方法
【專利摘要】本發明描述了用於諸如澱粉液化的工業過程的α-澱粉酶的變體。所述α-澱粉酶變體具有增強的比活性，從而允許在液化過程中更快地降低峰值粘度。所述α-澱粉酶通過向親本家族13α-澱粉酶多肽的胺基酸序列在澱粉結合槽中的胺基酸殘基處引入突變而改性；其中所述澱粉結合槽通過A結構域中在第一條β-鏈之前的α-螺旋中的胺基酸殘基、A結構域中第六個α-螺旋與第七條β-鏈之間的環、A結構域中第七個α-螺旋與第八條β-鏈之間的環，以及連接A結構域和C結構域的環形成；並且其中與所述親本α澱粉酶多肽相比所述突變改變澱粉與所述變體α澱粉酶多肽的結合。
【專利說明】對澱粉聚合物具有增強的活性的變體a澱粉酶
[000。優先權
[0002] 本專利申請要求於2012年6月8日提交的美國臨時專利申請No. 61/657,501的 優先權，該專利申請全文據此W引用的方式併入。

【技術領域】
[0003] 本發明描述了涉及用於諸如澱粉液化的工業過程的變體a-澱粉酶的組合物和 方法。所述a-澱粉酶變體具有增強的比活性，從而允許在液化過程中更快地降低峰值粘 度。

【背景技術】
[0004]a-澱粉酶用於多種工業和商業過程，包括澱粉液化、紡織物退漿、食品製造、衣物 清潔和盤碟洗塗。在此類應用中，a-澱粉酶可分解澱粉而釋放出較小的碳水化合物。然 而，澱粉束可耐a-澱粉酶水解，因為組織化的澱粉聚合物將酶排除在外。因此，使用具有 增強的比活性的a-澱粉酶只能略微地改善澱粉水解，因為它並未解決可及性的問題。需 要更有效地觸及澱粉束中的澱粉聚合物的a-澱粉酶。


【發明內容】

[0005] 本發明組合物和方法涉及變體a-澱粉酶多膚及其使用方法。本發明的組合物和 方法的多個方面和實施例匯總在W下單獨編號的段落中，並包括其使用方法。
[0006] 1.在一個方面，提供了一種產生變體a-澱粉酶多膚的方法，包括：向親本家族 13a-澱粉酶多膚的胺基酸序列在澱粉結合槽中的胺基酸殘基處引入突變；其中澱粉結合 槽通過A結構域中在第一條目-鏈之前的a-螺旋中的胺基酸殘基、A結構域中第六個 a-螺旋與第走條目-鏈之間的環、A結構域中第走個a-螺旋與第八條目-鏈之間的環， W及連接A結構域和C結構域的環形成；並且其中與親本a-澱粉酶多膚相比所述突變改 變澱粉與變體a-澱粉酶多膚的結合。
[0007] 2.在第1段的方法的一些實施例中，澱粉結合槽對應於胺基酸殘基1-6、36、38、 91-97、224-226、249-257、278-282、309-320、354-359、391、和 395-402，有關編號參見569 IDN0:2 ;胺基酸殘基 1-6、37、39、92-98、227-229、252-260、281-285、312-323、357-362、 391、和 395-402,有關編號參見SEQIDN0:3;或胺基酸殘基 1-4、36、38、91-97、226-228、 251-259、280-284、311-322、356-361、363、391、和 395-402，有關編號參見569 10側:4。
[0008] 3.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，突變在對應於胺基酸殘基92、251、 254、256、317、318、320、或321的胺基酸殘基中，有關編號參見569 10^:4。
[0009] 4.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，突變是在對應於R251或K256的位 置將野生型殘基用不同的胺基酸殘基置換，有關編號參見SEQIDN0:4。
[0010] 5.在前述段落1-3任一段的方法的一些實施例中，突變是在對應於SEQIDN0:4 中的位置92的位置將野生型殘基用L置換，在對應於SEQIDNO:4中的位置251的位置將 野生型殘基用A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、Q、S、T或W置換，在對應於SEQIDN0:4中的位置 254的位置將野生型殘基用H、K、W或Y置換，在對應於SEQIDNO:4中的位置256的位置 將野生型殘基用A、E、T或V置換，在對應於SEQIDNO: 4中的位置317的位置將野生型殘 基用C或R置換，在對應於SEQIDNO:4中的位置318的位置將野生型殘基用A、F、H、K、Q 或R置換，在對應於SEQIDNO: 4中的位置320的位置將野生型殘基用A、H、M、N或P置換， 或者在對應於SEQIDNO:4中的位置321的位置將野生型殘基用D、G、I或T置換。
[0011] 6.在前述段落1-3任一段的方法的一些實施例中，突變對應於S92L、R251A、 R251C、R251D、R251E、R251F、R251G、R251H、R251L、R251M、R251N、R251Q、R251S、R251T、或 R251W、T254H、T254K、T254W、或T254Y、K256A、K256E、K256T、或K256V、S317C或S317R、N318A N318F、N318H、N318K、N318Q、或N318R、T320A、T320H、T320M、T320N、或T320P、和/或K321D、 K321G、K321I、或K321T，有關編號參見SEQIDN0:4。
[0012] 7.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，變體還包含在對應於N88、A252、 A253、N308、A316、S357、T400、R402、和D403的一個或多個位置的野生型胺基酸殘基，有關 編號參見SEQIDN0:4。
[0013] 8.在前述段落1-7任一段的方法的一些實施例中，變體還包含在對應於SEQID NO: 4 中的M、G5、T38、N93、G94、195、Q96、V97、Y230、G255、V315、P319、A322、L354、T355、 R356、G359、Y396、A397、Y398、G399、和Q401的一個或多個位置的野生型胺基酸殘基，有關 編號參見SEQIDN0:4。
[0014] 9.在前述段落1-8任一段的方法的一些實施例中，變體還包含在位置88的N、在 位置252的A、在位置253的A、在位置308的N、在位置316的A、在位置357的S、在位置 400的T、在位置402的R、或在位置403的D，有關編號參見SEQIDNO:4。
[0015] 10.在前述段落1-9任一段的方法的一些實施例中，變體還包含在位置4的N、在 位置5的G、在位置38的T、在位置93的N、在位置94的G、在位置95的I、在位置96的Q、 在位置97的V、在位置230的Y、在位置255的G、在位置315的V、在位置319的P、在位置 322的A、在位置354的L、在位置355的T、在位置356的R、在位置359的G、在位置396的 Y、在位置397的A、在位置398的Y、在位置399的G、和在位置401的Q，有關編號參見SEQ IDN0:4。
[0016] 11.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，使用環糊精測定相對澱粉結合。
[0017] 12.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，變體具有與SEQIDNO: 1、2、3、4、 或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
[0018] 13.在前述權利要求中任一項的方法的一些實施例中，親本具有與SEQIDNO: 1、 2、3、4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
[0019] 14.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，變體與親本相比表現出改善的澱 粉液化、澱粉糖化、或清潔性能。
[0020] 15.在前述段落任一段的方法的一些實施例中，變體與親本相比表現出對直鏈澱 粉底物增強的水解活性。
[0021] 16.在另一方面，提供了通過前述權利要求所述的方法產生的變體a-澱粉酶多 膚。
[0022] 17.在另一方面，提供了親本家族13a-澱粉酶多膚的變體，其在澱粉結合槽中包 含突變；其中澱粉結合槽通過A結構域中在第一條目-鏈之前的a-螺旋中的胺基酸殘基、A結構域中第六個a-螺旋與第走條目-鏈之間的環、A結構域中第走個a-螺旋與第八條 目-鏈之間的環，W及連接A結構域和C結構域的環形成；其中與親本a-澱粉酶多膚相比 所述突變改變澱粉與變體a-澱粉酶多膚的結合。
[0023] 18.在第17段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，澱粉結合槽對應於氨基 酸殘基 1-6、36、38、91-97、224-226、249-257、278-282、309-320、354-359、391、和 395-402， 有關編號參見SEQIDN0:2;胺基酸殘基 1-6、37、39、92-98、227-229、252-260、281-285、 312-323、357-362、391、和 395-402，有關編號參見569 10側:3;或胺基酸殘基1-4、36、38、 91-97、226-228、251-259、280-284、311-322、356-361、363、391、和 395-402，有關編號參見 沈QIDNO:4。
[0024] 19.在前述權利要求17或18的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，突變在對 應於胺基酸殘基92、251、254、256、317、318、320、或321的胺基酸殘基中，有關編號參見569 IDN0:4。
[00巧]20.在前述權利要求17-19中任一項的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，突 變是在對應於R251或K256的位置將野生型殘基用不同的胺基酸殘基置換，有關編號參見 沈QIDNO:4。
[0026]21.在前述段落17-19任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，突變是在對 應於SEQ ID N0:4中的位置92的位置將野生型殘基用L置換，在對應於SEQ ID N0:4中的 位置251的位置將野生型殘基用A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、Q、S、T或W置換，在對應於SEQ ID NO:4中的位置254的位置將野生型殘基用H、K、W或Y置換，在對應於SEQ ID NO:4中 的位置256的位置將野生型殘基用A、E、T或V置換，在對應於SEQ ID NO:4中的位置317 的位置將野生型殘基用C或R置換，在對應於SEQ ID NO:4中的位置318的位置將野生型 殘基用A、F、H、K、Q或R置換，在對應於SEQ ID N0:4中的位置320的位置將野生型殘基用 A、H、M、N或P置換，或者在對應於SEQ ID N0:4中的位置321的位置將野生型殘基用D、G、 I或T置換。
[0027] 22.在前述段落17-19任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，突變對應於 S92L、R251A、R251C、R251D、R251E、R251F、R251G、R251H、R251L、R251M、R251N、R251Q、R251S、 R251T、或R251W、T254H、T254K、T254W、或T254Y、K256A、K256E、K256T、或K256V、S317C或 S317R、N318AN318F、N318H、N318K、N318Q、或N318R、T320A、T320H、T320M、T320N、或T320P、 或 1(3210、1(3216、1(3211、或1(3211'，有關編號參見569 10^:4。
[0028] 23.在前述段落17-22任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，變體還包含 在對應於N88、A252、A253、N308、A316、S357、T400、R402、和/或D403 的一個或多個位置的 野生型胺基酸殘基，有關編號參見SEQIDN0:4。
[0029] 24.在前述段落17-23任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，變體還包含 在對應於沈QIDN0:4 中的M、G5、T38、N93、G94、195、Q96、V97、Y230、G255、V315、P319、 A322、L354、T355、R356、G359、Y396、A397、Y398、G399、和 / 或Q401 的一個或多個位置的野 生型胺基酸殘基，有關編號參見SEQIDN0:4。
[0030]25.在前述段落17-24任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，變體還包 含在位置88的N、在位置252的A、在位置253的A、在位置308的N、在位置316的A、在位 置357的S、在位置400的T、在位置402的R、和/或在位置403的D，有關編號參見SEQIDN0:4。
[0031] 26.在前述段落17-25任一段的變體a-澱粉酶多膚的一些實施例中，變體還包含 在位置4的N、在位置5的G、在位置38的T、在位置93的N、在位置94的G、在位置95的 1、在位置96的Q、在位置97的V、在位置230的Y、在位置255的G、在位置315的V、在位置 319的P、在位置322的A、在位置354的L、在位置355的T、在位置356的R、在位置359的 G、在位置396的Y、在位置397的A、在位置398的Y、在位置399的G、和/或在位置401的 Q，有關編號參見SEQIDN0:4。
[003引 27.在前述段落17-26任一段的變體的一些實施例中，變體具有與SEQ ID NO: 1、 2、 3、4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
[003引 28.在前述段落17-27任一段的變體的一些實施例中，親本具有與SEQ ID NO: 1、 2、3、4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
[0034] 29.在前述段落17-28任一段的變體的一些實施例中，變體與親本相比表現出改 善的澱粉液化、澱粉糖化、或清潔性能。
[00巧]30.在前述段落17-29任一段的變體的一些實施例中，變體與親本相比表現出對 直鏈澱粉底物增強的水解活性。
[0036] 31.在又一個方面，提供了一種包含前述段落17-30任一段的變體a -澱粉酶多膚 和至少一種配製劑的組合物。
[0037] 通過本發明的描述和附圖，本發明的組合物和方法的該些方面和其他方面W及實 施例將顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1是衍生自沃氏火球菌（Pyrococcuswoesei)的工程改造澱粉酶的帶狀模型， 示出了結合的環糊精的位置。
[0039] 圖2顯示了在工程改造沃氏火球菌（P.woesei)澱粉酶中的胺基酸序列和二級結 構特徵的位置。
[0040] 圖3是使用ClustalWW默認參數進行的若干家族13a-澱粉酶[嗜熱脂 肪地芽抱桿菌（GeobacillusStearothermo地iIus) (W前稱為嗜熱脂肪芽抱桿菌 炬acillusStearothermo地ilus))a-澱粉酶、地衣芽抱桿菌炬acillusIicheniformis) a-澱粉酶（LAT)a-澱粉酶和瞻纖維菌屬物種似to地agaSP. )a-澱粉酶 (AAF00561. 1，GI#6006681)]的比對。
[0041] 圖4是嗜熱脂肪芽抱桿菌炬.StearothermophiIis)澱粉酶（Amy巧的棒狀結構， 示出了W加粗棒狀物突出顯示的位於分子左側的槽殘基。底物結合區（即，活性位點裂隙） 位於分子右側。
[0042] 圖5是向下觀察槽時嗜熱脂肪芽抱桿菌澱粉酶（Amy巧的棒狀結構，其中形成殘基 的槽W加粗棒狀物突出顯示。
[0043] 圖6是柱狀圖，示出了表達PI〉0. 3的所有沈L變體的活性值的PI分布。
[0044] 圖7是柱狀圖，顯示了只在槽位置中具有置換並且表達PI〉0. 3的沈L變體的活性 值的PI分布。
[0045] 圖8A和SB是表格，顯示了使用直鏈澱粉底物篩選從沈L文庫獲得的單獨變體的 結果。
[0046] 圖9A和9B是表格，顯示了使用支鏈澱粉底物篩選從沈L文庫獲得的單獨變體的 結果。
[0047] 序列的簡要說明
[0048]SEQIDNO:1示出了沃氏火球菌澱粉酶的成熟形式的胺基酸序列。
[0049] SEQ ID NO:2示出了地衣芽抱桿菌a -澱粉酶（LAT) a-澱粉酶的成熟形式的氨基 酸序列。
[0050]SEQIDNO:3 不出了嗜熱脂肪地芽抱桿菌（Geobacillusstearothermophilus) (W前稱為嗜熱脂肪芽抱桿菌炬acillusStearothermo地ilus))a-澱粉酶的成熟形式的 胺基酸序列。
[0051]SEQIDN0:4示出了瞻纖維菌屬物種a-澱粉酶（AAF00561. 1，GI#6006681)的成 熟形式的胺基酸序列。
[005引SEQIDNO:5示出了變體沃氏火球菌澱粉酶UPWA的成熟形式的胺基酸序列。

【具體實施方式】
[00巧]1.引言
[0054] 本發明的組合物和方法涉及變體a-澱粉酶多膚，其在位於與底物結合位點相 對的分子位點上的新發現的澱粉結合槽中包含突變。所述澱粉結合槽中的突變改變變體a-澱粉酶多膚與澱粉束的結合，從而改變分子在例如活性、熱穩定性、抑穩定性、洗塗劑 穩定性、巧依賴性等方面的性能。
[00巧]所述組合物和方法的該些及其他方面在下文詳細描述。
[0056] 2.定父巧縮寫
[0057] 根據此詳細描述，應用下面的縮寫和定義。注意，除非上下文另有明確指明，否則 單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括多個指代物。因此，例如，提及"酶"包括多個此種 酶，而提及"劑量"，包括提及一個或多個劑量W及本領域技術人員已知的其等同物，等等。
[0058] 本文檔被組織成多個章節，W便於閱讀；然而，讀者將會認識到，在一個章節中進 行的陳述可W應用到其他章節。因此，本公開不同章節使用的標題不應理解為限制性的。
[0059] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通 常所理解的含義。為了清楚起見，定義W下縮寫和/或術語：
[0060] 2. 1縮寫/首字母縮略詞
[0061] 如下縮寫/首字母縮略詞具有如下含義，除非另外規定：
[0062]cDNA 互補DNA
[006引DNA 脫氧核糖核酸
[0064] EC 酶學委員會
[006引邸TA 己二胺四己酸
[006引 GA 葡糖澱粉酶
[0067]IPTG 異丙基目-D-硫代半乳糖巧
[0068]kDa 千道爾頓
[0069]LAT 地衣芽抱桿菌澱粉酶
[0070] MW 分子量
[0071 ] MWU 改良的伍格母單位；1. 6XlO-s-VMWU=活性單位
[0072] NOBS 壬醜基氧基苯賴酸鹽
[007引NTA 次氮基己酸
[0074] 陽G 聚己二醇
[007引Pl 等電點
[007引PVA 聚（己帰醇）
[0077] PVP 聚（己帰化咯焼麗）
[007引RNA 核糖核酸
[0079]SAS 焼基賴酸鹽
[0080]SDS-PAGE十二焼基硫酸軸聚丙帰醜胺凝膠電泳
[00引]sp. 物種
[008引 w/v 重量/體積
[0083] w/w 重量/重量
[0084] v/v 體積/體積
[0085] Wt% 重量 ％
[008引C 攝氏度
[0087] &0 水
[0088] 地2〇或DI去離子水
[0089]dIH^OMilli-Q過濾的去離子水
[0090] g或卵克
[0091] Ug 微克
[0092] mg 毫克
[0093]kg 千克
[0094]JiL和y1 微升
[0095] 血和ml暈升
[0096]mm 毫米
[0097]A 埃
[0098] Um 微米
[0099]M 摩爾
[0100]ml 毫摩爾
[0101] UM 微摩爾
[0102] U 單位
[0103]sec 砂
[0104]min 分鐘
[010引 hr 小時
[0106] 牛頓釐米
[0107] 化OH 己醇
[010Weq. 當量
[0109]N 當量濃度
[0110]ds或DS幹固體含量
[0111] UPWA 源自沃氏火球菌的變體a -澱粉酶
[0112] PWA 來自沃氏火球菌的a -澱粉酶
[011引 MWCO 分子量篩截
[0114]SSI^L 斯坦福同步加速器福射光源（StanfordSync虹OtronRadiation Lightsource)
[0115] PDB 蛋白質資料庫
[0116] CA巧 碳水化合物活性酶資料庫
[0117] Tris-HCl立（輕甲基）氨基甲焼鹽酸鹽
[0118] 肥陽S 4-(2-輕己基）-1-脈嗦己賴酸 。。引2. 2定父
[0120] 術語"澱粉酶"或"澱粉分解酶"是指除其他方面外還能夠催化澱粉的降解的 酶。a-澱粉酶為裂解澱粉中的a-D-(l- 4)0-糖巧鍵的水解酶。一般來講，a-澱粉 酶巧C3. 2. 1. 1 ;a-D-(l- 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）定義為W隨機方式裂解澱粉分 子內的a-D-(l- 4)0-糖巧鍵從而生成含有H個或更多個（l-4)-a-連接的D-葡萄 糖單元的多糖的內切作用酶。相反地，外切作用澱粉分解酶如目-澱粉酶巧C3.2. 1.2; a-D-(1 - 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶）和一些產物特異性澱粉酶如生麥芽糖a-澱粉酶巧C 3. 2. 1. 133)從底物的非還原端裂解多糖分子。目-澱粉酶、a-葡萄糖巧酶巧C3. 2. 1. 20 ; U-D-葡糖巧葡萄糖水解酶）、葡萄糖澱粉酶巧C3. 2. 1.3 ;a-D-(l- 4)-葡聚糖葡聚糖水 解酶）和產物特異性澱粉酶如麥芽四糖巧酶巧C3. 2. 1. 60)和麥芽六糖巧酶巧C3. 2. 1. 98) 可產生特定長度的麥芽低聚糖。一些細菌a-澱粉酶主要從澱粉和相關的a-1,4-葡聚糖 產生麥芽四糖佑4)、麥芽五糖（G5)或麥芽六糖佑6)，而大多數a-澱粉酶進一步將它們轉 化為葡萄糖和/或麥芽糖作為最終產物。出於本發明的組合物和方法的目的，在真實的內 切作用a-澱粉酶與G4、G5、G6和類似澱粉酶之間不作區別。
[0121] 表述"家族13樣澱粉酶"是指與SEQIDNO: 1-5具有至少60%胺基酸序列同一 性的歸類為CA巧家族13澱粉酶和/或迄今為止稱為"Termamyl樣"的任何澱粉酶。表述 "家族13澱粉酶"是指歸類為CA巧家族13澱粉酶的任何澱粉酶。
[0122] 表述"具有芽抱桿菌屬物種炬acillusSP.)澱粉酶的摺疊的澱粉酶"是指具有基 本上重疊在SEQIDN0:2或3上的結構的任何澱粉酶。
[012引表述"Termamyl樣"用在多種已公布的專利申請和專利中。
[0124]如本文所用，術語"澱粉"指由植物的複雜多糖碳水化合物構成的任何材料，由具 有式（CeHwOg)X(其中X可W是任何數字）的直鏈澱粉和支鏈澱粉構成。所述術語包括植物 基材料，如穀物、草、塊莖和根，並且更具體地講是從小麥、大麥、玉米、裸麥、水稻、高梁、慷、 木墓（cassava)、小米、馬鈴墓、甘墓和木墓（tapioca)獲得的材料。
[0125] 術語"澱粉束"是指澱粉的一種形式，其中各個澱粉聚合物例如通過糊化然後回生 而排列，使得它們耐a-澱粉酶的酶促水解。在一些情況下，澱粉束中的聚合物是平行的 (即，對齊的），從而使得酶無法觸及。
[0126] 術語"直鏈澱粉"是指由a-1，4鍵合中的葡萄糖殘基組成的非支化澱粉底物。
[0127] 術語"支鏈澱粉"是指由a-1，6鍵合和a-1，4鍵合組成的支化澱粉底物。
[0128] 關於多膚的術語"野生型"、"親本"或"參考"是指不在一個或多個胺基酸位置處 包括人為製造的置換、插入或缺失的天然存在的多膚。類似地，關於多核巧酸的術語"野生 型"、"親本"或"參考"是指不包括人為製造的核巧改變的天然存在的多核巧酸。然而，應注 意，編碼野生型多膚、親本多膚或參考多膚的多核巧酸不局限於天然存在的多核巧酸，而涵 蓋編碼野生型多膚、親本多膚或參考多膚的任何多核巧酸。置換、插入或缺失可通過"改組" 而產生。
[0129] 表述"一個或若干個"意指少於10個。
[0130] 關於多膚的術語"變體"是指不同於特定野生型多膚、親本多膚或參考多膚的多 膚，因為其在一個或多個胺基酸位置處包括人為製造的置換、插入或缺失。類似地，關於多 核巧酸的術語"變體"是指核巧酸序列不同於指定的野生型多核巧酸、親本多核巧酸或參考 多核巧酸的多核巧酸。野生型、親本或參考多膚或多核巧酸的身份從上下文來看將是顯而 易見的。變體可通過"改組"而製備。
[0131]當關於對象細胞、核酸、蛋白質或載體而使用時，術語"重組"表明對象已通過引入 異源核酸或蛋白質、或者變更天然的核酸或蛋白質而得到修飾，或者細胞衍生自已經過此 類修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達未在天然（非重組）形式的細胞中存在的基因， 或者W不同於自然界中存在的水平或條件表達天然基因。
[0132] 術語"回收的"、"分離的"和"分開的"是指從如天然存在的那樣與其天然相關的 至少一種其他物質或組分中移除的化合物、蛋白質（多膚）、細胞、核酸、胺基酸或其他指定 的物質或組分。
[0133] 如本文所用，術語"純化的"是指處於相對純的狀態的物質（如，分離的多膚或多 核巧酸），所述相對純的狀態如純度至少約90%、純度至少約95%、純度至少約98 %或純度 甚至至少約99%。
[0134] 在氧化環境、馨合劑的存在下、洗塗劑的存在下、暴露於高溫、和/或暴露於抑極 值的上下文中，術語"增強的穩定性"或"提高的穩定性"是指與另一種（即，參考）澱粉酶 相比，對象澱粉酶隨時間推移保持較高的澱粉分解活性。
[0135] 關於酶的術語"熱穩定的"和"熱穩定性"是指酶在暴露於高溫後保持活性的能力。 酶（如澱粉酶）的熱穩定性是由其半衰期（ti/2)度量的，所述半衰期W分鐘、小時或天為單 位給出，在此期間酶活性在限定的條件下損失一半。半衰期可通過測量暴露於（即，經受） 高溫後殘餘的澱粉酶活性來計算。
[0136] 關於酶的"pH範圍"是指酶在其下顯示出催化活性的抑值範圍。
[0137] 如本文所用，關於酶的術語"抑穩定的"和"抑穩定性"涉及在預定的時間段（如， 15分鐘、30分鐘、1小時）內、酶在寬泛的抑值範圍內保持活性的能力。
[013引如本文所用，術語"胺基酸序列"與術語"多膚"、"蛋白質"和"膚"是同義詞，並且 可互換使用。在此類胺基酸序列表現出活性的情況下，它們可被稱為"酶"。使用常規的氨基 酸殘基的單字母或H字母代碼，其中胺基酸序列W標準的氨基端至駿基端取向（即，N-C) 提供。
[0139]術語"核酸"涵蓋DNA、RNA、異源雙鏈體和能夠編碼多膚的合成分子。核酸可為單 鏈或雙鏈的，而且可為化學修飾物。術語"核酸"與"多核巧酸"可互換使用。由於遺傳密 碼具有簡併性，故可W使用不止一個密碼子來編碼特定胺基酸，並且本發明組合物和方法 涵蓋編碼特定胺基酸序列的核巧酸序列。除非另作說明，否則核酸序列是W5'至3'取向 給出。
[0140] 術語"同源物"是指與對象胺基酸序列和對象核巧酸序列具有指定程度的同一性 的實體。同源序列被認為包括與對象序列至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至 少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至 少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99% 相同的胺基酸序列，序列比對使用Clustal!(ThompsonJ.D.etal. (1994)NucleicAcids Res. 22:4673-4680(ThompsonJ.D.等人，1994 年，《核酸研究》，第 22 卷，第 4673-4680 頁）） WW下默認參數進行，即；
[0141]

【權利要求】
1. 一種用於產生變體a-澱粉酶多肽的方法，包括： 向親本家族13 a -澱粉酶多肽的胺基酸序列在澱粉結合槽中的胺基酸殘基處引入突 變； 其中所述澱粉結合槽通過A結構域中在第一條鏈之前的a-螺旋中的胺基酸殘 基、A結構域中第六個a-螺旋與第七條鏈之間的環、A結構域中第七個a-螺旋與第 八條鏈之間的環，以及連接A結構域和C結構域的環形成；以及 其中與所述親本a-澱粉酶多肽相比所述突變改變澱粉與所述變體a-澱粉酶多肽的 結合。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述澱粉結合槽對應於胺基酸殘基1_6、36、38、 91-97、224-226、249-257、278-282、309-320、354-359、391、和 395-402，有關編號參見5￡0 IDN0:2 ;胺基酸殘基 1-6、37、39、92-98、227-229、252-260、281-285、312-323、357-362、 391、和 395-402,有關編號參見SEQIDN0:3;或胺基酸殘基 1-4、36、38、91-97、226-228、 251-259、280-284、311-322、356-361、363、391、和 395-402，有關編號參見5￡0 1〇勵：4。
3. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述突變在對應於胺基酸殘基92、 251、254、256、317、318、320、或321的胺基酸殘基中，有關編號參見5￡0 1〇勵:4。
4. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述突變是在對應於R251或K256的 位置將野生型殘基用不同的胺基酸殘基置換，有關編號參見SEQIDN0:4。
5. 根據前述權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述突變是在對應於SEQID NO: 4中的位置92的位置將野生型殘基用L置換，在對應於SEQIDNO: 4中的位置251的位 置將野生型殘基用八、(：、03、？、6、11、1^、隊〇、5、1'或1置換，在對應於5￡〇10勵 :4中的 位置254的位置將野生型殘基用H、K、W或Y置換，在對應於SEQIDNO: 4中的位置256的 位置將野生型殘基用A、E、T或V置換，在對應於SEQIDN0:4中的位置317的位置將野生 型殘基用C或R置換，在對應於SEQIDNO:4中的位置318的位置將野生型殘基用A、F、H、 K、Q或R置換，在對應於SEQIDNO:4中的位置320的位置將野生型殘基用A、H、M、N或P 置換，或者在對應於SEQIDN0:4中的位置321的位置將野生型殘基用D、G、I或T置換。
6. 根據前述權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述突變對應於S92L、R251A、 R251C、R251D、R251E、R251F、R251G、R251H、R251L、R251M、R251N、R251Q、R251S、R251T、或 R251W、T254H、T254K、T254W、*T254Y、K256A、K256E、K256T、*K256V、S317C*S317R、N318A N318F、N318H、N318K、N318Q、*N318R、T320A、T320H、T320M、T320N、*T320PJP/*K321D、 K321G、K321I、或K321T，有關編號參見SEQIDN0:4。
7. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述變體還包含在對應於N88、A252、 A253、N308、A316、S357、T400、R402、和D403的一個或多個位置的野生型胺基酸殘基，有關 編號參見SEQIDN0:4。
8. 根據前述權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述變體還包含在對應於SEQID NO: 4 中的N4、G5、T38、N93、G94、195、Q96、V97、Y230、G255、V315、P319、A322、L354、T355、 R356、G359、Y396、A397、Y398、G399、和Q401的一個或多個位置的野生型胺基酸殘基，有關 編號參見SEQIDN0:4。
9. 根據前述權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述變體還包含在位置88的N、 在位置252的A、在位置253的A、在位置308的N、在位置316的A、在位置357的S、在位置 400的T、在位置402的R、或在位置403的D，有關編號參見SEQIDNO:4。
10. 根據前述權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述變體還包含在位置4的N、 在位置5的G、在位置38的T、在位置93的N、在位置94的G、在位置95的I、在位置96的 Q、在位置97的V、在位置230的Y、在位置255的G、在位置315的V、在位置319的P、在位 置322的A、在位置354的L、在位置355的T、在位置356的R、在位置359的G、在位置396 的Y、在位置397的A、在位置398的Y、在位置399的G、和在位置401的Q，有關編號參見 SEQIDN0:4。
11. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使用環糊精測定相對澱粉結合。
12. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述變體具有與SEQIDNO: 1、2、3、 4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
13. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述親本具有與SEQIDN0:l、2、3、 4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
14. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述變體與所述親本相比表現出改 善的澱粉液化、澱粉糖化、或清潔性能。
15. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述變體與所述親本相比表現出對 直鏈澱粉底物增強的水解活性。
16. -種通過前述權利要求的方法產生的變體a-澱粉酶多肽。
17. -種親本家族13 a -澱粉酶多肽的變體，在澱粉結合槽中包含突變； 其中所述澱粉結合槽通過A結構域中在第一條鏈之前的a-螺旋中的胺基酸殘 基、A結構域中第六個a-螺旋與第七條鏈之間的環、A結構域中第七個a-螺旋與第 八條0 -鏈之間的環，以及連接A結構域和C結構域的環形成； 其中與所述親本a-澱粉酶多肽相比所述突變改變澱粉與所述變體a-澱粉酶多肽的 結合。
18. 根據權利要求17所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述澱粉結合槽對應於氨基 酸殘基 1-6、36、38、91-97、224-226、249-257、278-282、309-320、354-359、391、和 395-402， 有關編號參見SEQIDN0:2;胺基酸殘基 1-6、37、39、92-98、227-229、252-260、281-285、 312-323、357-362、391、和 395-402，有關編號參見5￡0 1〇勵:3;或胺基酸殘基1-4、36、38、 91-97、226-228、251-259、280-284、311-322、356-361、363、391、和 395-402，有關編號參見 SEQIDN0:4。
19. 根據前述權利要求17或18所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述突變在對應於 胺基酸殘基92、251、254、256、317、318、320、或321的胺基酸殘基中，有關編號參見5￡0 1〇 N0:4。
20. 根據前述權利要求17-19中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述突變是在 對應於R251或K256的位置將野生型殘基用不同的胺基酸殘基置換，有關編號參見SEQID N0:4。
21. 根據前述權利要求17-19中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述突變是 在對應於SEQIDNO:4中的位置92的位置將野生型殘基用L置換，在對應於SEQIDNO:4 中的位置251的位置將野生型殘基用八、(：、03、？、6、11、1^、隊〇、5、1'或1置換，在對應於 5￡〇10勵:4中的位置254的位置將野生型殘基用11、1(、1或￥置換，在對應於3￡〇10勵 :4 中的位置256的位置將野生型殘基用A、E、T或V置換，在對應於SEQIDNO: 4中的位置317 的位置將野生型殘基用C或R置換，在對應於SEQIDN0:4中的位置318的位置將野生型 殘基用A、F、H、K、Q或R置換，在對應於SEQIDN0:4中的位置320的位置將野生型殘基用 A、H、M、N或P置換，或者在對應於SEQIDN0:4中的位置321的位置將野生型殘基用D、G、 I或T置換。
22. 根據前述權利要求17-19中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述突變對 應於S92L、R251A、R251C、R251D、R251E、R251F、R251G、R251H、R251L、R251M、R251N、R251Q、 R251S、R251T、或R251W、T254H、T254K、T254W、或T254Y、K256A、K256E、K256T、或K256V、 S317C或S317R、N318AN318F、N318H、N318K、N318Q、或N318R、T320A、T320H、T320M、T320N、 或T320P、或 1(3210、1(3216、1(3211、或1(3211'，有關編號參見5￡〇10勵:4。
23. 根據前述權利要求17-22中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述變體還包 含在對應於胳8、42523253、吧08、4316、5357、1400、1?402、和/或0403的一個或多個位置 的野生型胺基酸殘基，有關編號參見SEQIDN0:4。
24. 根據前述權利要求17-23中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述變體還包 含在對應於SEQIDN0:4 中的N4、G5、T38、N93、G94、I95、Q96、V97、Y230、G255、V315、P319、 A322、L354、T355、R356、G359、Y396、A397、Y398、G399、和 / 或Q401 的一個或多個位置的野 生型胺基酸殘基，有關編號參見SEQIDN0:4。
25. 根據前述權利要求17-24中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述變體還 包含在位置88的N、在位置252的A、在位置253的A、在位置308的N、在位置316的A、在 位置357的S、在位置400的T、在位置402的R、和/或在位置403的D，有關編號參見SEQ IDN0:4。
26. 根據前述權利要求17-25中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽，其中所述變體還 包含在位置4的N、在位置5的G、在位置38的T、在位置93的N、在位置94的G、在位置95 的I、在位置96的Q、在位置97的V、在位置230的Y、在位置255的G、在位置315的V、在 位置319的P、在位置322的A、在位置354的L、在位置355的T、在位置356的R、在位置 359的G、在位置396的Y、在位置397的A、在位置398的Y、在位置399的G、和/或在位置 401的Q，有關編號參見SEQIDN0:4。
27. 根據前述權利要求17-26中任一項所述的變體，其中所述變體具有與SEQID NO: 1、2、3、4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
28. 根據前述權利要求17-27中任一項所述的變體，其中所述親本具有與SEQID NO: 1、2、3、4、或5至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的胺基酸序列同一性。
29. 根據前述權利要求17-28中任一項所述的變體，其中所述變體與親本相比表現出 改善的澱粉液化、澱粉糖化、或清潔性能。
30. 根據前述權利要求17-29中任一項所述的變體，其中所述變體與所述親本相比表 現出對直鏈澱粉底物增強的水解活性。
31. -種組合物，包含前述權利要求17-30中任一項所述的變體a-澱粉酶多肽和至少 一種配製劑。
【文檔編號】C12N9/26GK104379737SQ201380029784
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年5月24日 優先權日:2012年6月8日
【發明者】R·R·博特, L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特爾, M·科爾克曼, D·E·維爾德斯 申請人:丹尼斯科美國公司