血吸蟲病疫苗組合物及其使用方法

2023-06-21 12:44:31

專利名稱：血吸蟲病疫苗組合物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及針對曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)的DNA和蛋白質疫苗製劑。 更具體地，本發明涉及用於控制人類寄生蟲疾病-血吸蟲病的組合物和方法。
背景技術：
在不限制所公開的組合物和方法的範圍的前提下，結合針對曼氏血吸蟲 (Schistosoma mansoni)的新的基於Sm_p80的疫苗製劑描述背景。曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)是扁形蟲寄生蟲，其棲息於人類的門腔靜脈-腸繫膜循環中。據估計全世界有兩億零七百萬人遭受幾種血吸蟲的折磨，導致相當高的發病率和致死率。還有七億七千九百萬人有遭受此感染的風險。血吸蟲病的殘疾調整生命年數(disability-adjusted life years)按照計算大約是一百七十萬到四百五十萬年之間。血吸蟲病在74個發展中國家中流行。曼氏血吸蟲的感染周期涉及在蝸牛中間宿主中的無性繁殖，隨後是對人類宿主的感染。從蝸牛中間宿主中離開的幼蟲階段，尾蚴通過穿透人類皮膚感染人類。這些幼年的血吸蟲發育成熟成為童蟲，經歷通過宿主的肺和肝臟的複雜遷移，並且發育成為性成熟的產卵成蟲。性成熟的雄性和雌性血吸蟲在腸小靜脈中開始生命周期的產卵階段。大量卵的連續產生使得一些卵與糞便物質一起排出，以及在嚴重的感染中，卵在內臟器官中的停留導致了針對其的宿主肉芽瘤免疫應答。此卵誘導的器官損傷導致了如肝臟纖維化、門靜脈高血壓和食管靜脈曲張等併發症，所述的併發症導致了慢性感染的宿主的死亡。由於針對積累的含胚卵的肉芽瘤反應，這一使人虛弱的疾病的慢性性質導致了對肝臟、脾臟和結腸的累積性的損傷。感染導致了循環的抗血吸蟲抗體的產生。免疫應答是無規律的，但其不產生無蟲免疫。除此之外，成年的寄生蟲通過複雜的以及多因子的機制逃避免疫清除。在血吸蟲病的治療中，強調將化學療法被作為優選方法。然而，基於化學療法的控制方案由於快速和頻繁的重複感染以及困難，以及長期維持這些項目所涉及的費用而複雜化。連續的藥物治療和重新感染周期不能充分地減少總體卵的產量，從而顯著地降低該疾病在流行地區的傳播。除此之外，有觀點認為寄生蟲可以產生抗藥性。對於開發控制該疾病的替代方法還有著迫切的需要。不存在對血吸蟲病有效的疫苗。儘管可以使用抗寄生蟲藥物和其他的控制手段， 包括公共保健和蝸牛控制，有效的疫苗的出現仍然是控制此疾病的潛在地最有效的方式。 在幼齡時對個體進行接種是在不伴隨著卵誘導的病症的情況下引發免疫系統的最有效方法。疫苗還能夠預防嚴重的感染，並因此減少卵的傳播，並且幫助抑制曼氏血吸蟲感染的周期。可以在暴露於感染性的尾蚴後，對已接種的個體進行針對血吸蟲的加強免疫接種。有幾種成蟲的曼氏血吸蟲蛋白質被認為是潛在的疫苗候選者。理想地，最為有希望的疫苗候選者可以是暴露在表面的，並且對於該寄生蟲在人類宿主中的存活是必不可少的那些。阻礙了血吸蟲病疫苗研究和開發的主要問題涉及由寄生蟲所編碼的潛在的保護性抗原的鑑定和選擇。在過去的二十年間，多個實驗室嘗試識別出誘導部分保護性免疫應答的血吸蟲抗原。已經識別出了 100個以上的這種抗原，其中約25%提供不同程度的保護。 然而在這些候選者抗原中沒有一個誘導的免疫應答的水平接近使用經輻照的血吸蟲幼蟲進行接種後所觀察到的免疫水平( 80% )。通過標準比較性的世界衛生組織所描述的規程對六種「優先抗原」(副肌球蛋白、穀胱甘肽S-轉移酶、14kDa的脂肪酸結合蛋白、IrV-5、 丙糖磷酸異構酶和Sm23)進行的獨立研究給出的結果是沒有哪個抗原達到規定的40%或更高的保護的目標。血吸蟲與其宿主密切地相互作用，實現如免疫逃避、營養物攝取以及附著等功能。 承擔該關鍵功能的，暴露於宿主的血吸蟲蛋白質是血吸蟲病疫苗的有效靶。該蛋白的一種是鈣蛋白酶的大亞基(Sm-p80)，鈣蛋白酶在血吸蟲的表面膜更新中起到重要的作用，所述的表面膜更新是在血液寄生蟲(blood-dwelling helminths)逃避宿主免疫所採取的免疫逃避機制。Sm-p80暴露在宿主和寄生蟲的接觸面上，並且是天然地免疫原性的。儘管此分子的天然免疫原性在自然感染的條件下不能提供保護，但有可能以誘導強有力的免疫力的方式將鈣蛋白酶呈現到免疫系統。UNDP/World Bank/WHO-TDR專門小組將Sm_p80指定為「具有確定的背景，需要進一步開發」的優先抗原之一，並且現在本領域的國際專家認為Sm-p80 是「一線候選者」之一。有效的血吸蟲病疫苗應該對當前的疾病控制規劃帶來突出的貢獻，尤其是當其提供針對該疾病強有力的、長效的免疫力時。這樣的疫苗能夠極大地降低對於後勤困難以及昂貴的基於藥物的方案的需求，所述的基於藥物的方案通常需要政治上的保證和資金充足的公共健康系統才能進行。即使是針對尾蚴提供部分保護，也是顯著的進步，因為減少蟲負荷的疫苗能減輕疾病的病況並且能降低該疾病的傳播速率。這是由於血吸蟲不像其他的感染性有機體，不在其最終宿主中進行繁殖。因此，血吸蟲病中可以不要求無蟲免疫。世界衛生組織(WHO)的血吸蟲病科學工作組確定，減少成蟲蟲負荷50%的疫苗在降低總體的發病率和死亡率中是有效的。大多數血吸蟲疫苗候選者在小鼠模型系統中產生30-50%的保護。因此，迫切需要識別新的抗原、佐劑載體和雞尾酒疫苗製劑，從而誘導以輻照減毒的疫苗計70%到80%範圍內的保護。本發明提出了基於血吸蟲蛋白質，鈣蛋白酶的新的疫苗製劑，所述的鈣蛋白酶最初確定為涉及血吸蟲表面膜生物合成中。鈣蛋白酶具有兩個亞基，其中較大的亞基，Sm-p80 顯示出作為相關疫苗抗原的巨大潛力，所述的疫苗抗原用於降低與曼氏血吸蟲及日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)有關的發病率。發明簡述因此，本發明提供了用於控制人類寄生蟲疾病，血吸蟲病的組合物和方法。疫苗由Sm-p80，血吸蟲蛋白質的各種製劑及遞送方法組成。這是針對曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)的首個有效的疫苗製劑。當前的控制策略僅得到有限的成功，所述的策略包括旨在通過改進教育和公共衛生來限制血吸蟲病的整合的控制方案，用於減少蝸牛中間宿主的種群的軟體動物殺滅劑治療方案，以及化學療法。因此，仍然迫切需要開發控制該疾病的替代方法，例如疫苗。總而言之，本發明公開了用於新型的基於Sm_p80的針對曼氏血吸蟲(S. mansoni)的DNA疫苗製劑的組合物和方法。附圖簡要說明為了更完整地理解本發明的特徵和優點，在此參考本發明的詳述以及其所附的圖，其中

圖1是對DNA構建體的描述，其中將Sm-p80編碼序列克隆到VR1020中，從而成為根據本發明公開內容的實施方案的DNA疫苗製劑之一；圖2是對DNA構建體的描述，其中將Sm_p80編碼序列克隆到pcDNA 3. 1中，在 Sm-p80序列的各個末端上具有側翼的CpG基序，從而構成了根據本發明公開內容的實施方案的另一種DNA疫苗製劑；圖3是對構建根據本發明公開內容的實施方案的VR1020/Sm_p80和pcDNA3/ Sm-p80的第一種方法的描述；圖4是對構建根據本發明公開內容的實施方案的pcDNA3/Sm-p80和VRlO 12/ Sm-p80的第二種方法的描述；圖5是對用對照質粒VR1020 (n = 10)和用Sm-p80_VR1020 (η = 10)免疫的各組小鼠蟲負荷分布的描述。在經接種的動物中，蟲負荷的減少在統計上更低(P <0.001)；圖6是對在經免疫的小鼠中的抗-Sm-p80總IgG的抗體滴度的描述。將收集自各自的組(VR1020和Sm-p80-VR1020)中的各個小鼠(每兩周地)的等體積的血清混合得到血清池，用所述的血清池進行ELISA。數值代表了三次試驗的平均值士標準偏差。與VR1020 組進行比較的統計上的顯著性(P ( 0. 05)通過(*)表示；圖7是對在經免疫的小鼠中的抗-Sm-p80總IgM的抗體滴度的描述。將收集自各自的組(VR1020和Sm-p80-VR1020)中的各個小鼠(每兩周地)的等體積的血清混合得到血清池，用所述的血清池進行ELISA。數值代表了三次試驗的平均值士標準偏差。與VR1020 組進行比較的統計上的顯著性(P ( 0. 05)通過(*)表示；圖8是對在經免疫的小鼠中的抗-Sm-p80 IgGh的抗體滴度的描述。將收集自各自的組(VR1020和Sm-p80-VR1020)中的各個小鼠(每兩周地)的等體積的血清混合得到血清池，用所述的血清池進行ELISA。數值代表了三次試驗的平均值士標準偏差。與VR1020 組進行比較的統計上的顯著性(P ( 0. 05)通過(*)表示；圖9是對在經免疫的小鼠中的抗-Sm-p80 IgG2b的抗體滴度的描述。將收集自各自的組(VR1020和Sm-p80-VR1020)中的各個小鼠(每兩周地)的等體積的血清混合得到血清池，用所述的血清池進行ELISA。數值代表了三次試驗的平均值士標準偏差。與VR1020 組進行比較的統計上的顯著性(P ( 0. 05)通過(*)表示；圖10描述了在體外培養48小時之後，與伴刀豆球蛋白A(Concanavalin Α)所誘導的刺激相比，重組的Sm-p80誘導的脾細胞增殖；圖11描述了在體外培養48小時之後，重組的Sm-p80誘導的脾細胞增殖；圖12描述了在使用重組的Sm-p80在體外刺激48小時之後脾細胞產生的細胞因子水平。各組小鼠使用VR1020和VR1020-Sm-p80進行接種。數據表示為平均值士標準偏差。使用獨立樣本檢驗與VR1020組進行比較的統計上的顯著性(P ( 0. 05)通過(*)表示；圖13A描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素6)。M = IOObp標記物；1
5=IL-6 (VR1020 組)；2 = IL-6 (VR1020_Sm-p80 組)；圖1 描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素6)。M = IOObp標記物；1 =IL-6(VR1020 組)；2 = IL-6 (VR1020_Sm-p80 組)；圖13C描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素6)。M = IOObp標記物；1 =IL-6(VR1020 組)；2 = IL-6 (VR1020_Sm-p80 組)；圖14A描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(甘油醛_3_磷酸脫氫酶)。M = IOObp 標記物；1 = GAPDH(VR1020 組)；2 = GAPDH(VR1020_Sm-p80 組)；圖14B描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(甘油醛_3_磷酸脫氫酶)。M = IOObp 標記物；1 = GAPDH(VR1020 組)；2 = GAPDH(VR1020_Sm-p80 組)；圖15描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(甘油醛_3_磷酸脫氫酶和白細胞介素 la)。M= IOObp 標記物；1 = GAPDH (VR1020 組)；2 = GAPDH (VR1020_Sm-p80 組)；3 = IL-I α (VR1020 組)；4 = IL-I α (VR1020_Sm-p80 組)；圖16描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素1 α )。M = IOObp標記物； 1 = IL-I α (VR1020 組)；2 = IL-1 α (VR1020_Sm-p80 組)；圖17描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(幹擾素Y )。M = IOObp標記物；1 = IFN- y (VR1020 組)；2 = IFN- y (VR1020_Sm-p80 組)；圖18描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素4)。M = IOObp標記物；1 = IL-4(VR1020 組)；2 = IL-4 (VR1020_Sm-p80 組)；圖19描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素5)。M = IOObp標記物；1 = IL-5 (VR1020 組)；2 = IL-5 (VR1020_Sm-p80 組)；圖20描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素17)。M = IOObp標記物；1 =IL-17(VR1020 組)；2 = IL-17 (VR1020_Sm-p80 組)；圖21描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素2)。M = IOObp標記物；2 = IL-2 (VR1020-Sm-p80 組)；1 = IL-2 (VR1020 組)；圖22描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(腫瘤壞死因子α )。M = IOObp標記物； 1 = TNF-α (VR1020 組)；2 = TNF-α (VR1020_Sm-p80 組)；圖23描述了 RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠(白細胞介素1 β )。M = IOObp標記物； 1 = IL-I β (VR1020 組)；2 = IL-1 β (VR1020_Sm-p80 組)；圖M描述了在VR1020組和VR1020_Sm-p80組中，RT-PCR之後的瓊脂糖凝膠 (GAPDH、IL-I α、IL-1 β、IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 和 TNF- α )；圖25描述了對於使用對照質粒VR1020 (n = 6)和使用VR1020_Sm-p80 (η = 6)進行免疫的狒狒的組中，在狒狒的個體中每克的肝臟和腸中的卵的負載。在經接種的動物中， 卵數量的減少統計上較低(P < 0. 05)；圖沈描述了對於使用對照質粒VR1020(n = 6)和使用VR1020_Sm-p80 (η = 6) 進行免疫的狒狒的組中蟲負荷分布。在經接種的動物中，蟲負荷的減少統計上較低(P < 0. 05)；發明詳述在此公開了用於針對曼氏血吸蟲的基於Sm-p80的疫苗製劑的組合物和方法。本發明的多種創新性的教導將具體參考幾個實施方案(其以舉例而非限制的形式)進行描述。首先參考圖1，VR1020/Sm_p80構建體的示意圖。圖1，兩種構建體的第一種，描繪了通過將血吸蟲Sm-p80編碼序列克隆到VR1020中所產生的DNA構建體。現參考圖2，pcDNA3. l/Sm-p80構建體的示意圖。圖2，兩種構建體的第二種，描繪了通過將血吸蟲Sm-p80編碼序列克隆到pcDNA3. 1中所產生的DNA構建體，所述的DNA構建體在Sm-p80序列的各個末端上具有側翼的CpG基序。本領域普通技術人員能依賴圖2 構建該DNA疫苗。現參考圖3，舉例說明了構建VR1020/Sm-p80和pcDNA3/Sm-p80的第一種方法的示意圖。現參考圖4，舉例說明了構建VR1020/Sm-p80和pcDNA3/Sm-p80的第二種方法的示意圖。本領域普通技術人員能夠依靠圖1與圖3或者圖4的結合，構建DNA疫苗。在圖1和圖2中描述的兩種構建體都用於不同的疫苗製劑中(單獨的DNA和初免加強(prime boost))，所述的疫苗製劑遞送到小鼠和狒狒中。這是血吸蟲病的狒狒模型中基於Sm-p80的疫苗製劑的首次使用。表1總結了 1.基於Sm-p80的疫苗製劑[(a)單獨的 DNA疫苗，(b)在構建體中插入了兩個未甲基化的CpG基序的DNA疫苗，由於其作為免疫刺激劑起作用，(c)重組的Sm-p80蛋白質在含有CpG基序的寡脫氧核苷酸(ODN)的存在下引入，激活宿主的防禦機制，導致先天性的和獲得性的免疫應答)2.疫苗遞送途徑和3.所得到的結果。在鼠科動物以及非人類的靈長類動物模型中，Sm-p80抗生殖和抗蟲效果的實驗數據清楚地表明此抗原作為用於減少與血吸蟲感染相關的發病率的重要疫苗候選者，具有重大的潛力。總之，基於Sm-80的疫苗製劑具有三種保護性的效果(減少蟲，抗生殖效果和針對急性血吸蟲病進行保護)。這是顯示了這三種保護性效果的、對抗血吸蟲的經確定的疫
苗製劑的首次報導。
權利要求
I.一種用於預防血吸蟲病的方法，所述的方法包括以下步驟1.給予疫苗，所述的疫苗包含克隆到表達載體中的曼氏血吸蟲鈣蛋白酶(Sm-p80)的大亞基的全長cDNA，其中劑量是足以在宿主中產生蟲減少、抗生殖力效果或者針對急性血吸蟲病提供保護的量。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的載體是pcDNA3.1。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的載體是VR1020。
4.權利要求1、2或者3所述的方法，其中在第0周給予所述的疫苗進行初免，在第4周進行第一次加強，並且在第8周進行第二次加強。
5.權利要求2或者3所述的方法，其中在第0周給予所述的疫苗進行初免，在第4周的第一次加強包含在CpG寡核苷酸存在下的重組Sm-p80，並且在第8周的第二次加強也包含在CpG寡核苷酸存在下的重組Sm-p80。
6.權利要求4所述的方法，其中使用了Thl應答增強佐劑。
7.權利要求6所述的方法，其中所述的佐劑是CpG寡核苷酸。
8.權利要求6所述的方法，其中所述的佐劑是免疫調節劑瑞喹莫德(R848)。
9.一種血吸蟲病疫苗，其包含克隆到載體中的曼氏血吸蟲鈣蛋白酶(Sm-p80)的大亞基的全長cDNA。
10.權利要求9所述的疫苗，其中所述的載體是pcDNA3.1。
11.權利要求9所述的疫苗，其中所述的載體是VR1020。
12.權利要求9、10或者11所述的疫苗，其中所述的疫苗還包含Thl應答增強佐劑。
13.權利要求12所述的疫苗，其中所述的佐劑是CpG寡核苷酸。
14.權利要求12所述的疫苗，其中所述的佐劑是免疫調節劑瑞喹莫德(R848)。
全文摘要
不存在對於毀滅性的血吸蟲病有效的疫苗。本發明集中在Sm-p80，其是在血吸蟲免疫逃避過程中起到關鍵作用的、功能上重要的曼氏血吸蟲抗原。當用於新的疫苗製劑中時，Sm-p80顯示了一致的免疫原性、保護潛能以及抗生殖效果。出於免疫的目的，製備了兩種新型的DNA構建體。將Sm-p80編碼序列克隆到VR1020中。另外，將Sm-p80編碼序列克隆到在Sm-p80序列的各個末端上具有側翼的CpG基序的pcDNA3.1中。當用於不同的疫苗製劑中時兩種構建體均顯示了Sm-p80的優越的抗生殖性和抗蟲效果，其作為減少與血吸蟲感染有關的發病率的重要疫苗候選者具有極大的潛力。
文檔編號A61K38/20GK102596226SQ201080035900
公開日2012年7月18日 申請日期2010年6月23日 優先權日2009年6月23日
發明者A·A·席迪圭, G·阿哈默德, 張衛東 申請人:德克薩斯技術大學聯合體