Hla-b基因分型用微陣列晶片的製備及其用法的製作方法
2023-06-17 23:28:11 2
專利名稱：Hla-b基因分型用微陣列晶片的製備及其用法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及採用DNA微陣列晶片技術和雙溫度雜交方法，該試劑盒能夠高通量、高效率、高特異性對HLA-B基因進行分型。
背景技術：
HLA(Human leukocyte antigen，人類白細胞抗原)是人類主要組織相容性系統。組織相容性是指不同個體間進行組織或器官移植時，供者和受者雙方接受的程度。供受者組織不相容引起的反應，被證實是一種免疫反應，它是由細胞表面同種異型抗原誘導的，這個代表個體特異性的抗原稱移植抗原或組織相容性抗原，其中起主要作用的抗原稱主要組織相容性系統(MHS)，HLA(人類白細胞抗原)就是人類的主要組織相容性系統。HLA基因複合體位於人類第6號染色體6p21.3區域，具有高度單核苷酸多態性(SNPs)。HLA存在多個基因座位，其中HLA-B座位是影響移植排斥反應的主要座位之一。SNPs是決定組織相容性的本質因素，個體之間的SNPs差異程度決定著相容性程度。HLA-B基因座位的SNPs主要集中在第二外顯子長度約300bp的片段上。根據SNPs的差異特點，可以進行基因分型，將HLA-B基因座位分成不同的型別和亞型，型別和亞型相同者，SNPs差異較小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技術廣泛應用於造血幹細胞移植、器官移植、疾病關聯研究。
HLA-B基因分型方法是從90年代開始發展起來的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特異性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特異性寡核苷酸探針法)、SBT(測序法)、FCM(流式法)方法。這些方法目前被西方國家的少數企業壟斷，我國處於空白狀態，完全依賴進口。同時，這些方法也存在一些技術問題，比如引物過多造成檢測錯誤、探針雜交單一溫度造成特異性降低、檢測通量過小等等。
DNA微陣列法是近幾年發展起來的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集約化、低成本、高準確性等特點，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業化前景。由於用該技術可以將極其大量的探針同時固定於支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術複雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少、低通量等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序(Sequencing by hybridization，SBH)等，為「後基因組計劃」時期基因功能研究及現代醫學科學、醫學診斷學的發展提供了強有力的工具。
發明內容
鑑於現有HLA-B基因分型方法的不足，本發明將DNA微陣列技術應用於HLA-B基因分型，開發了一種新型的基因分型試劑盒。
本發明所採用的技術方案是針對HLA-B基因座位的第二、三外顯子，設計二套特異性寡核苷酸探針(附表1)，採用自動點樣機器人，將二套探針印製在兩張玻片的特定區域，每張玻片印製16個微陣列矩陣，這樣就製成高密度DNA微陣列，二張晶片可以檢測16個樣本，再配以其它必要的組份，包括PCR引物(表2)組成完整的試劑盒。實際檢測時，取16份人基因組DNA溶液，採用CY3標記引物和不對稱PCR方法，擴增出人基因組HLA-B基因的第二、三外顯子單鏈CY3標記片段。取DNA微陣列玻片一對，在第一張玻片的16個雜交區域，分別加入16種PCR產物2ul和雜交液8ul；在第二張玻片的對應區域，加入同樣的成分。將一對玻片放在自動雜交洗滌儀的兩個雜交槽內，分別將第一、二張玻片的雜交溫度設定為52℃和45℃，雜交時間30分鐘，自動洗滌吹乾。取出玻片，放入GenePix 4100A掃描儀進行掃描，使用分析軟體對掃描圖像信號進行圖像數據轉換處理，並分析產生樣本基因型別結果。
本試劑盒採用高密度DNA微陣列技術，可以大大提高檢測通量，每二張玻片可以製備用於檢測16個樣本的DNA微陣列，一般是現有檢測技術的10倍以上；同時，由於採用了雙片雙溫度雜交的特殊方法，避免了現有產品因為雜交溫度不適造成的探針雜交結果假陽性和假陰性問題，大大提高了產品的特異性。
本發明針對HLA-B第2、3外顯子基因序列的多態性，設計63種分型用寡核苷酸探針，探針分為兩組，見表1，第一組45種探針，雜交溫度為52℃；第二組18種探針，雜交溫度45℃。
表1HLA-B基因分型寡核苷酸探針
表2引物序列
本發明用下列實施例進行解釋，目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發明。
以下結合
本發明的具體實施。
圖1為HLA-B基因分型DNA微陣列雜交區和探針微陣列示意圖 1、2晶片外觀 3雜交區及探針矩陣 實施例一 方法1HLA-B基因分型DNA微陣列PCR引物和寡核苷酸探針的設計和合成 為了採用特異性PCR擴增HLA-B基因座位的第2、3外顯子，分別在第1內含子末端至第2外顯子的始端位置，以及第2內含子末段至第3外顯子始段設計特異性5』端引物Pb1、Pb2，以及在第2外顯子末端和第3外顯子末端位置設計3』端引物Pb3、Pb4。合成、CY3標記、純化。引物序列見表2。
針對HLA-B基因第2、3外顯子基因序列的多態性，設計63種分型探針，序列見表1，合成、修飾、純化。
方法2HLA-B基因分型DNA微陣列的製備 採用基因晶片自動點樣儀，將63種分型探針和兩種對照探針點制到玻片的特定區域，製成DNA微陣列。
(1)點樣探針溶液將探針稀釋到5×SSC、0.05％SDS溶液中，終濃度為30uM； (2)點樣矩陣(如圖1)將探針分成二組，第一組45種分型探針，2種對照探針。第一組探針點制在第一張玻片上，分成16個雜交區，雜交區按照2列8行排列。在每個雜交區內，探針的排列方式是每種探針重複2點，每行5種探針，10點，共10行，第10行只有2種對照探針，4點。
第二組18種分型探針，2種對照探針。排列方式同上，共4行。
實施例二採用HLA-B基因分型用DNA微陣列檢測臨床樣本HLA-B基因型別 取16份已知基因型別的DNA樣本，採用CY3標記的PCR引物，上下遊引物1∶30(分子數比)不對稱PCR方法，PCR循環參數為94℃5』；94℃30」，58℃30」，72℃30」，40循環；72℃5』。
取一對微陣列玻片，分別取16種PCR產物各2ul加到第一片的16孔和第二片的16孔，再在各孔加入雜交液(5XSSC)8ul，玻片放到自動雜交洗滌儀的2個槽內，設定雜交溫度第一片的52℃，第二片45℃。雜交時間40分鐘。雜交後自動洗滌和風乾。
採用GnenPix4100A掃描儀，掃描雜交信號，得到雜交結果掃描圖，並將圖像轉換成數據。
採用分析軟體，將以上數據自動分析轉換成為各個樣本的基因型別，檢測結果與樣本原基因型別完全相符。見表3。
實施例說明了本發明產品在檢測通量方面的優勢(一次檢測16個樣本)和檢測準確性方面的可靠性(檢測結果與原樣本結果完全相符)。
表3本次檢測結果與樣本原有基因型別的比較
序列表
中山大學達安基因股份有限公司
HLA-B基因分型用微陣列晶片試劑盒
67
1
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
1
CCT TCA TGT TCC GTG TC
2
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
2
CTT GTA CTT CTG TGT CT
3
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
3
CCG GGA CAT GGC GGT G
4
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
4
GCG GCT CCT TCC TCG GA
5
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
5
GCC CAC GGT GAT GAA G
6
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
6
CGG GGC GCC ATC CTC GGA
7
19
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
7
CGC CCG GGG CTC CGT CCT
8
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
8
TTC TCT ATC CAC GGC GCC
9
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
9
GTG TCT CCC GGT CCC AA
10
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
10
GTG CCT GGG CCT TGT AG
11
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
11
GTG CCT TGG CCT TGC AG
12
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
12
CGG GAC ACG GAG GTG T
13
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
13
GGC GGT GTC GAA ATA C
14
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
14
CTC TCG GTC AGT CTG T
15
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
15
ACG AAC TGC GTG TCG T
16
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
16
CTG GGT GCC GTC CAC
17
15
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
17
TGG TCT TGA AGA TCT GT
18
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
18
CCC AAT ATT CCG GCC C
19
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
19
CTG CTC CAC CCA CGG C
20
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
20
CGG GAC ATA GCG GTG T
21
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
21
TTG CGC TGG GAG ATC TG
22
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
22
CAG CCA TAC ATA TTC TG
23
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
23
GCC ATA CAT CAC CTG GA
24
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
24
AGC CAT ACA TCG TCT G
25
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
25
CGC CCG TCG GGC CCC AG
26
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
26
TCC AGG TAG GCT CTG TC
24
27
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
27
AAC TGG TTA TAC CCG C
28
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
28
CCA CGC ACG TGC CCT CC
29
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
29
CAC GCA CAG GCC CTC CA
30
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
30
CTC CAG GTG TCT GCG G
31
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
31
CGC TCC AGC TTG TCC T
32
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
32
CGC TCC AGC GTG TCC T
33
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
33
ATG TAA TCT TTG CCG T
34
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
34
GCG TCC TGG TGG TAC CC
35
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
35
TCG TAG GCT AAC TGG T
36
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
36
GCG GAG CGC GGT GCG CA
37
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
37
CAT CCT CTG CCA AGT G
38
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
38
TCC TCT GGA TGG TGT G
39
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
39
GTA CAT GCT CTG GAG G
40
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
40
TTG GTC TTG GAG ATC TG
41
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
41
CCC ACT GCA ATG AAG C
42
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
42
TTG GTC TTG CAG ATC TG
43
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
43
GTC ATA CCC GCG GAG G
44
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
44
GAA GCG CGA TCC GCA GGT
45
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
45
AGG CGT ACT GGT TAT GC
46
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
46
GTA GGC GGA CTG GTC A
47
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
47
AGC CGT ACA TCC TCT G
48
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
48
GTG TCC GCC GCG GTC C
49
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
49
TGC GGA GCG ACT CCA CG
50
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
50
TGA GCC GCG GTG TCC G
51
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
51
TAG GCT CTC CAC TGC T
52
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
52
GTT GGT CTT GTA GAT CT
53
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
53
GCC CGT CCA CGC ACA G
54
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
54
CGC AGG TTC CGC AGG CT
55
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
55
CTG TGT GTT CCG GTC CC
56
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
56
GCC CAC TGC GAT GAA G
57
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
57
ACT CCA CGC ACT CGC CC
58
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
58
CTG GAG GGT GTG AGA C
59
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
59
TGC GCT GGG TGA TCT G
60
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
60
CTC TCG GTA AGT CTG T
61
18
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
61
GTA GTA GCG GAG CAG GGT
62
17
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
62
GCT CCA GCG TCT CCT TC
63
16
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作晶片雜交反應探針。
63
GAA CTG GGT GTC GTC C
64
20
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR引物。
64
CGG AGG AGC GAG GGG ACC GCT
65
20
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR引物。
65
CTC CTC GCT CTG GTT GTA GT
66
21
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR引物。
66
ATG GCC GGG GCC AGG GTC TC
67
20
DNA
人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR引物。
67
TCG GCC ATC CCC GGC GAC CT
權利要求
1、一種基因分型檢測試劑盒，採用DNA微陣列晶片以及雙溫度雜交，對HLA-B基因進行檢測和分型，其特徵在於所說的試劑盒將兩組寡核苷酸探針，點制在兩張玻片上，製成一對高密度DNA微陣列玻片，配以4種引物以及其它組分。
2、根據權利要求1所述的DNA微陣列晶片，其特徵還在於兩張DNA微陣列玻片的兩個雜交區，採用兩種不同的雜交溫度。
3、根據權利要求1所述的DNA微陣列晶片，其特徵還在於DNA微陣列在每張玻片上的矩陣都為2列8行。
4、根據權利要求1所述的基因分型檢測試劑盒，其特徵還在於所使用擴增HLA-B第二、三外顯子的4種引物，分別為
Pb1 CGGAGGAGCGAGGGGACCGC
Pb2 CTCCTCGCTCTGGTTGTAGT
Pb3 ATGGCCGGGGCCAGGGTCTC
Pb4 TCGGCCATCCCCGGCGACCT。
5、根據權利要求1所述的基因分型檢測試劑盒，其特徵還在於所使用的63種寡核苷酸探針分別為
B1-1 CCTTCATGTTCCGTGTC
B2-1 CTTGTACTTCTGTGTCT
B3-1 CCGGGACATGGCGGTG
B4-1 GCGGCTCCTTCCTCGGA
B5-1 GCCCACGGTGATGAAG
B6-1 CGGGGCGCCATCCTCGGA
B7-1 CGCCCGGGGCTCCGTCCT
B8-1 TTCTCTATCCACGGCGCC
B9-1 GTGTCTCCCGGTCCCAA
B10-1 GTGCCTGGGCCTTGTAG
B11-1 GTGCCTTGGCCTTGCAG
B12-1 CGGGACACGGAGGTGT
B13-1 GGCGGTGTCGAAATAC
B14-1 CTCTCGGTCAGTCTGT
B15-1 ACGAACTGCGTGTCGT
B16-1 CTGGGTGCCGTCCAC
B17-1 TGGTCTTGAAGATCTGT
B18-1 CCCAATATTCCGGCCC
B19-1 CTGCTCCACCCACGGC
B20-1 CGGGACATAGCGGTGT
B21-1 TTGCGCTGGGAGATCTG
B22-1 CAGCCATACATATTCTG
B23-1 GCCATACATCACCTGGA
B24-1 AGCCATACATCGTCTG
B25-1 CGCCCGTCGGGCCCCAG
B26-1 TCCAGGTAGGCTCTGTC
B27-1 AACTGGTTATACCCGC
B28-1 CCACGCACGTGCCCTCC
B29-1 CACGCACAGGCCCTCCA
B30-1 CTCCAGGTGTCTGCGG
B31-1 CGCTCCAGCTTGTCCT
B32-1 CGCTCCAGCGTGTCCT
B33-1 ATGTAATCTTTGCCGT
B34-1 GCGTCCTGGTGGTACCC
B35-1 TCGTAGGCTAACTGGT
B36-1 GCGGAGCGCGGTGCGCA
B37-1 CATCCTCTGCCAAGTG
B38-1 TCCTCTGGATGGTGTG
B39-1 GTACATGCTCTGGAGG
B40-1 TTGGTCTTGGAGATCTG
B41-1 CCCACTGCAATGAAGC
B42-1 TTGGTCTTGCAGATCTG
B43-1 GTCATACCCGCGGAGG
B44-1 GAAGCGCGATCCGCAGGT
B45-1 AGGCGTACTGGTTATGC
B1-2 GTAGGCGGACTGGTCA
B2-2 AGCCGTACATCCTCTG
B3-2 GTGTCCGCCGCGGTCC
B4-2 TGCGGAGCGACTCCACG
B5-2 TGAGCCGCGGTGTCCG
B6-2 TAGGCTCTCCACTGCT
B7-2 GTTGGTCTTGTAGATCT
B8-2 GCCCGTCCACGCACAG
B9-2 CGCAGGTTCCGCAGGCT
B10-2 CTGTGTGTTCCGGTCCC
B11-2 GCCCACTGCGATGAAG
B12-2 ACTCCACGCACTCGCCC
B13-2 CTGGAGGGTGTGAGAC
B14-2 TGCGCTGGGTGATCTG
B15-2 CTCTCGGTAAGTCTGT
B16-2 GTAGTAGCGGAGCAGGGT
B17-2 GCTCCAGCGTCTCCTTC
B18-2 GAACTGGGTGTCGTCC 。
6、根據權利要求1所述的基因分型檢測試劑盒，其特徵還在於用於臨床移植配型和造血幹細胞庫建立HLA-B基因分型檢測。
全文摘要
本發明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及HLA-B基因分型用微陣列晶片的製備及其用法。採用DNA微陣列晶片技術和雙溫度雜交方法，該試劑盒能夠高通量、高效率、高特異性對HLA-B基因進行分型。
文檔編號C12Q1/68GK101353692SQ20071002930
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月24日 優先權日2007年7月24日
發明者胡守旺, 帆 張, 順 胥, 敏 王, 明 李, 鋼 程, 何蘊韶 申請人:中山大學達安基因股份有限公司