萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法
2023-06-18 05:15:01 3
專利名稱：萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法
技術領域：
本發明涉及穀胱甘肽萃取技術領域，具體涉及一種萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法。
背景技術：
穀胱甘肽(Glutathion，簡稱GSH)是由穀氨酸半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而 成的三肽化合物，是一種用途廣泛的活性短肽。穀胱甘肽具有抗氧化、清除自由基、解毒、增 強免疫力、延緩衰老、抗癌、抗放射線危害等功能，是重要的功能因子，在食品工業、醫藥工 業中應用非常廣泛。由於穀胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得穀胱甘肽具有重要的保 肝護肝作用。臨床上應用還原型穀胱甘肽作為保肝的重要藥物成分。自1938年發表了由 酵母備制穀胱甘肽的最早專利以來，還原型穀胱甘肽在臨床上有著廣泛的應用，它能夠防 止皮膚色素沉積、改善皮膚光澤，是治療肝病、重金屬中毒、放射性損傷、腫瘤、白內障等疾 病的有效藥物，最近還發現穀胱甘肽可能具有抗愛滋病毒的功效。穀胱甘肽現在已廣泛運 用於食品加工的各個領域，在日本穀胱甘肽被認為是21世紀最有希望的保健食品之一。谷 胱甘肽作為一種重要的胺基酸類生化藥物，隨著人們在食品添加劑、臨床醫學和運動營養 學上對它的興趣日益增長，市場需求量不斷增加。隨著近年來分離技術在生命科學、天然藥物提純及各類抗生素藥物等方面應用的 迅速發展，各種萃取技術應運而生。對於生物物質來說，分離的對象複雜，既包括可溶物，如 蛋白質和核酸，也包括懸浮的小顆粒，如細胞器和整個細胞；由於生物物質極易變性和失 活，給分離帶來很大的難度。並且，發酵液黏度高，菌液分離困難；發酵液成分複雜，提取純 化成本高。目前適合高黏發酵液除菌的方法有高速離心法、絮凝法和微孔濾膜法等。絮凝 法成本過高，且除雜不徹底；由於穀胱甘肽分子大小與菌體較為接近，微孔濾膜法較難有效 實現穀胱甘肽與菌體的分離，並膜汙染嚴重、清洗困難等問題；高速離心較難分離菌液雜蛋 白，並且成本高、能耗大，難以應用於工業化生產。
發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明的目的在於提供一種操作簡單、(常溫)條件溫 和、選擇性高、收率高、能耗較小、有機溶劑殘留少，能實現快速分離、易於進行連續化操作 的萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法。為實現上述目的，本發明提供了如下技術方案一種萃取酵母菌中的穀胱甘肽的 方法，其特徵在於用雙水相溶液萃取從酵母菌液中萃取穀胱甘肽，所述的雙水相溶液為 PEG/Na2C03雙水相溶液，所述的PEG/Na2C03雙水相溶液的PEG質量濃度為20%_60%，Na2CO3 濃度為0. 3mol/L-l. 5mol/L，萃取溫度為20°C _40°C，萃取pH值為6-10。本發明進一步設置為所述的PEG/Na2C03雙水相溶液PEG濃度39%，Na2CO3濃度為 0. 6mol/L，萃取pH值為9，溫度32°C。本發明PEG分子量為600或1000或2000或4000或6000。
本發明萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法包括以下步驟
1)、將冰凍狀態下的酵母菌液在常溫下解凍，破碎，將酵母菌懸液於4000r/min，離心 20min，沉澱，取上清液；
2)、將步驟1)的上清夜加入至PEG/Na2C03雙水相溶液，並且加入Na2HPO4與NaH2PO4溶 液調整萃取PH值；
3)、將步驟2)的溶液充分混合後，靜置，得到上下相穀胱甘肽萃取溶液。本發明萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法具有操作簡單、(常溫)條件溫和、選擇性 高、收率高、能耗較小、有機溶劑殘留少，能實現快速分離、易於進行連續化操作等一系列 優點。
圖1為本發明標準曲線的製備線性圖； 圖2為PEG分子量對萃取率的影響曲線圖； 圖3為PEG濃度對萃取率的影響曲線圖； 圖4為Na2CO3濃度對萃取率的影響曲線圖； 圖5為溫度對萃取率的影響曲線圖6為pH對萃取率的影響曲線圖； 圖7為Y=f(X1,X2)的響應面曲面圖； 圖8為Y=f(X1,X3)的響應面曲面圖； 圖9為Y=f(X2，X3)的響應面曲面圖。
具體實施例方式萃取率計算方式
分配係數K=Ci/CA 相比R=vyvA 萃取率 Y=RXK/1+RXK
式中Ci為上相濃度，Cb為下相濃度，Vi為上相體積，\為下相體積。穀胱甘肽濃度的測定
標準曲線的製備(採用ALLOXAN試劑法測定GSH): GSH質量稱取，分別取lmg，0. 9 mg, 0.8 mg,0. 7 mg,0. 6 mg,0. 5 mg,0. 4 mg,0. 3 mg,0. 2 mg，0.1 mg，分別加入0ml，0. 1 ml，0.2 ml,0. 3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml 的水，配製成 1 X 1(T3，0. 9 X 1(T3， 0. 8X 1(Γ3，0· 7X 1(Γ3，0· 6X 1(Γ3，0· 5X 1(Γ3，0· 4X 1(Γ3，0· 3X 1(Γ3，0· 2X 1(Γ3，0· IX 1(T3， OX lO—W /L的GSH溶液。然後依次加入0. 24 mol /L、ρΗ7· 6的磷酸緩衝液，0. Imol /L 的甘氨酸溶液，及ALLOXAN試劑，反映20分鐘後測吸光度，此吸光度再減去ALLOXAN試劑的 校正值後作GSH標準曲線如圖1。如圖1所示，穀胱甘肽標準溶液濃度在0-1 X 10-3mol/L之間，吸光度測定值與濃度 之間呈良好的線性關係，穀胱甘肽濃度的標準曲線方程為γ=1. 4884X+0. 0016。R^=O. 9999。 從圖中可看出線性回歸係數為0.9999，線性顯著，所以可以作為吸光度來求穀胱甘肽濃度。酵母菌液的製備固體培養基成分蛋白腖5 g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂5 g/ L。調整pH為7，配製成1L。再分裝成10瓶，加塞，包紮。在高壓蒸汽鍋裡滅菌。然後在無 菌操作臺中將酵母菌種接到已配好的培養基中。再將酵母菌種轉移到液體培養基中，放入 冰箱冷凍保藏。從冰箱中取出酵母菌液常溫下解凍，破碎，將酵母菌懸液於4000r/min，離心 20min，沉澱，取上清液。雙水相萃取工藝
採取PEG/Na2C03系統，分別稱取PEG和Na2CO3固體，溶解，充分混合，置於5支試管中， 得到總體積為9mL的雙水相體系，並依次編號1、2、3、4、5，振動，靜置15min，分層後，分別量 取上下相體積，並記錄。取已製備好的酵母菌液lmL，加入雙水相系統中，並且加入Na2HPO4 與NaH2PO4溶液調整萃取pH值，混合，搖勻，靜置15min，分別取上下相於比色皿中，測吸光 度，再根據穀胱甘肽的標準工作曲線計算出穀胱甘肽的濃度。
單因素實驗
1、PEG分子量對萃取率的影響 PEG 濃度 40%、Na2C03 濃度為 1. 5mol/L、溫度 20°C、pH9. 0，PEG 分子量分別取 600、1000、 2000、4000、6000進行上述雙水相萃取工藝操作。如圖2所示，PEG2000到PEG6000之間萃取率相差不大，這說明PEG分子量的大小 對萃取率的影響不大，五種PEG分子量不同的試驗數據中，萃取率先減小後增大最後趨於 穩定，但PEG相對分子量越小，成相所需的PEG濃度和Na2CO3濃度越高，成本也就越高。當 PEG分子量取6000時，萃取率最大。2、PEG濃度對萃取率的影響
PEG 分子量 6000、Na2C03 濃度為 1. 5mol/L、溫度 20°C、pH9. 0，PEG 濃度分別取 20%、30%、 40%、50%、60%進行上述雙水相萃取工藝操作。如圖3所示，隨著PEG6000濃度的增加，上相體積也逐漸增大，當PEG濃度取30% 時，上相體積最大，但下相穀胱甘肽濃度含量過高，造成萃取率不高，而且也不利於回收，給 後期處理工作造成負擔，在濃度逐漸增加的過程中，萃取率先增大後緩慢下降，當PEG濃度 為40%時萃取率最高。3、Na2CO3濃度對萃取率的影響
PEG 分子量 6000、PEG濃度 40%、溫度 20°C、pH9. 0，Na2CO3 濃度分別取 0. 3mol/L、0. 6mol/ L、0. 9mol/L、l. 2mol/L、l. 5mol/L進行上述雙水相萃取工藝操作。如圖4所示，Na2CO3濃度對萃取率的大小有很大的影響。當Na2CO3濃度取0. mol/ L-0. 9mol/L時，萃取率先減小後增大並在0. 9mol/L時取得最大值，當質量繼續加大時，相 比逐漸減小，萃取率也迅速減小繼而緩慢增加趨於平衡，當Na2CO3濃度少於0. 3mol/L,濃度 太低時容易與水和空氣反應生成碳酸氫鈉。4、溫度對萃取率的影響
PEG 分子量 6000、PEG濃度 40%，Na2CO3 濃度為 0. 9mol/L、pH9. 0，溫度分別取 20°C、25°C、 30°C、35°C、40°C進行上述雙水相萃取工藝 操作。如圖5所示，溫度的變化對萃取率的大小有很大的影響。萃取率在溫度20_25°C之間迅速減少，在溫度25-30°C又逐漸增加，在溫度30-35°C減小繼而隨著溫度的增加而增 加，若溫度低於20°C或溫度高於40°C，Na2CO3容易結晶成塊且不易溶解，當溫度為20°C時， 體系分相比最大有助於相的分離，萃取率最高。5、pH對萃取率的影響
PEG 分子量 6000、PEG 濃度 40%、Na2CO3 濃度為 0. 9mol/L、溫度 20°C，pH 分別取 6、7、8、 9,10進行上述雙水相萃取工藝操作。如圖6所示，體系的pH值對穀胱甘肽的分配有很大的影響，這是由於體系的PH值 變化能明顯的改變兩相的電位差。而且穀胱甘肽分子中含有羧基和氨基，PH會影響其電荷 作用而導致對其的分配影響。當PH濃度小於7時，萃取率隨著pH的增加而減小，而且下相 保持較高的穀胱甘肽濃度，會增加後序工序的處理負擔，當PH繼續逐漸升高時，萃取率迅 速增大後減小然後趨於穩定，且在PH=S時達到最大萃取率。正交分析試驗
影響雙水相萃取酵母菌中穀胱甘肽的因素主要有PEG分子量，PEG濃度，Na2CO3濃度， PH，濃度等，在單因素試驗的基礎上，針對這些因素的影響規律，確定提取穀胱甘肽的正交 實驗的提取水平，如表1，按L9(34)正交法設計試驗。每組加入1 mL的酵母菌液。以穀胱 甘肽萃取率為指標，確立穀胱甘肽萃取的最佳條件。
表1雙水相萃取酵母菌中的穀胱甘Ikft四因索E個水平
權利要求
一種萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於用雙水相溶液萃取酵母菌液中的穀胱甘肽，所述的雙水相溶液為PEG/Na2CO3雙水相溶液，所述的PEG/Na2CO3雙水相溶液的PEG質量濃度為20% 60%，Na2CO3 濃度為0.3mol/L 1.5mol/L，萃取溫度為20℃ 40℃，萃取pH值為6 10。
2.根據權利要求1所述的萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於所述的PEG/ Na2CO3雙水相溶液的PEG濃度39%，Na2CO3濃度為0. 6mol/L,萃取pH值為9，溫度32°C。
3.根據權利要求1或2所述的萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於所述的 PEG分子量為600或1000或2000或4000或6000。
4.根據權利要求3所述的萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於所述的PEG 分子量為6000。
5.根據權利要求1或2或4所述的萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於包 括以下步驟1)、將冰凍狀態下的酵母菌液在常溫下解凍，破碎，將酵母菌懸液於4000r/min，離心 20min，沉澱，取上清液；2)、將步驟1)的上清液加入至PEG/Na2C03雙水相溶液，並且加入Na2HPO4與NaH2PO4溶 液調整萃取PH值；3)、將步驟2)的溶液充分混合後，靜置，得到上下相穀胱甘肽萃取溶液。
全文摘要
本發明涉及一種萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法，其特徵在於用雙水相溶液萃取酵母菌液中的穀胱甘肽，所述的雙水相溶液為PEG/Na2CO3雙水相溶液，所述的PEG/Na2CO3雙水相溶液的PEG質量濃度為20%-60%，Na2CO3濃度為0.3mol/L-1.5mol/L，萃取溫度為20℃-40℃，萃取pH值為6-10。本發明萃取酵母菌中的穀胱甘肽的方法具有操作簡單、(常溫)條件溫和、選擇性高、收率高、能耗較小、有機溶劑殘留少,能實現快速分離、易於進行連續化操作等一系列優點。
文檔編號C07K1/14GK101955509SQ20101052986
公開日2011年1月26日 申請日期2010年11月3日 優先權日2010年11月3日
發明者吳祥庭 申請人:溫州大學