基於泛蛋白修飾的α螺旋區的人工結合蛋白的製作方法

2023-06-25 20:12:51 2

專利名稱：基於泛蛋白修飾的α螺旋區的人工結合蛋白的製作方法
基於泛蛋白修飾的a螺旋區的人工結合蛋白
本發明涉及源自泛蛋白樣蛋白的蛋白質超家族、在其a螺旋區具有修 飾的結合蛋白。本發明還涉及用於產生這些蛋白的方法以及可通過所述方 法獲得的蛋白。此外，本發明提供蛋白質用於特異性識別、結合和中和前 述靶分子，用於檢測、定量測定、分開和/或用於分離相應的結合配偶體的 用途，和本發明蛋白質用於診斷、預防和治療直接或間接涉及相應的結合 配偶體的疾病的用途。
背景技術：
泛蛋白是小單體胞質蛋白，其序列高度保守，並存在於從原生動物到 脊椎動物的所有已知的真核細胞中。在生物體中，它在調節細胞蛋白的受 控降解中起關鍵作用。為了該目的，指定用於降解的蛋白在它們經過酶級 聯過程中與泛蛋白或多泛蛋白鏈共價連接，並由於該標記被選擇性降解。 根據近期的結果，泛蛋白或由泛蛋白標記蛋白，也分別在其他細胞過程諸 如引入若干蛋白或其基因調節中起重要作用(Marx, 2002)。
除澄清其生理功能外，泛蛋白是研究的目標，主要是因為其結構和蛋 白質化學特性。泛蛋白的多肽鏈由以特別緊湊的a/p結構方式摺疊的76 個胺基酸組成(Vijay-Kumar, 1987):幾乎87%的多肽鏈通過氫鍵的方式參 與二級結構元件的形成。明顯地，二級結構可以涉及三個半a-螺旋轉角以 及一個由四條鏈組成的反向平行(3-摺疊。這些元件的特有排列——反向平 行|3摺疊暴露於這樣的蛋白質表面，在所述蛋白質表面的背面上堆積垂直 位於其上部的a螺旋——通常被視為所謂的泛蛋白-樣摺疊基序。因此， 泛蛋白是分別關於各種蛋白質超家族("泛蛋白-樣蛋白")或蛋白質家族 ("泛蛋白-相關蛋白")給出的名稱(Murzin等，1995)，其包括攜帶這種 基序以及在其一級序列中與泛蛋白高度同一的蛋白質諸如例如SUMO-l (Miiller等，2001)、 FAU (Michiels等，1993)、 NEDD-8 (Kumar等，1993)、UBL-1 (Jones和Candino, 1993)、和GDX (Filippi等，1990)。
人泛蛋白是——如上所述一76個胺基酸長的多肽(

圖1)。它是7,5 kDa 的、具有突出的C-端的小的球狀蛋白。泛蛋白的主要結構性質顯示在圖1 中。來自所述摺疊和來自所述螺旋的疏水性殘基裝配所述蛋白的疏水性核 心並穩定所述螺旋的方向(圖2)。所述蛋白質核心的高度密集的疏水性堆 積通過其優秀的熱力學穩定性反映，這應該使所述蛋白成為作為蛋白質工 程方法支架使用其的理想候選者。
由於它的小尺寸，泛蛋白的人工製備可以通過化學合成和通過生物技 術的方法進行。由於有利的摺疊特性，泛蛋白可以通過使用微生物諸如大 腸桿菌(Escherichia coli)的遺傳工程以相對大的量在細胞質或者在壁膜 間隙中產生。由於在周質中主要為氧化條件，通常將後一方案留作用於產 生分泌蛋白。由於簡單和有效的細菌製備，泛蛋白可以用作其它要被製備 的其生產有難度的外源蛋白的融合配偶體。通過與泛蛋白融合的方法，可 以獲得提高的溶解性和因此提高的產量。本發明中實施的用於提供泛蛋白 作為通用的人工結合蛋白的方法容許其蛋白質化學特性的完全新穎性的 利用。
在診斷學和製藥學中使用其天然功能的那些蛋白質中，免疫球蛋白起 主要作用。它們與廣泛範圍的不同底物的特異性、非-共價結合能力使它們 成為用於生物科學應用的最重要工具。近年來開發的用於在大腸桿菌中功 能生物合成抗體片段的方法進一步擴展了使用免疫球蛋白的可能性，但同 時證明了它們的局限性。
除可以主要可以通過常規方法獲得的Fab-和Fv-片段外(Skerra和 Pltickthim, 1988)，通過蛋白質工程方法可以開發不同的人工構建體。通過 免疫球蛋白的模塊結構的幫助(在Diibel和Kontermann, 2001中綜述)， 可以特別地生成單鏈Fv片段(scFv) (Bird等，1988)、 二硫鍵Fv片段(dsFv) (Brinkmann等，1993)以及二價(Carter等，1992)和雙特異性抗體片段(例 如，雙抗體,Holliger等，1993)。為了診斷和在治療中使用，可以通過重組 Ig片段與效應子模塊的遺傳融合獲得雙功能蛋白。因此，特別地，可以使 用與鹼性磷酸酶(Mmier等，1999)和綠色螢光蛋白(GFP; Gri印等，1999)的 融合。抗體片段與放射性同位素或細胞毒性物質的融合對癌症治療具有巨
7大的潛在重要性(免疫毒素；Reiter和Pastan, 1998)。在該情形中，各種Ig 片段與腫瘤細胞上的特異性表面蛋白的選擇性結合用於治療學的位點-特 異性應用(腫瘤耙向)。
然而，用於在大腸桿菌中製備抗體片段的方法不僅容許其以充足的質 量和數量提供用於診斷和治療，而且用於它們的蛋白質-和免疫化學特性的 簡單快捷修飾。對細菌宿主方便的處理允許通過標準分子-生物學方法的方 式直接改變外源蛋白的載體-編碼基因。因此，通過靶向抗體工程的方式 (Kontermann和Diibe1,2001)，可以最優化抗體片段，例如針對它們的結合 親和性或它們的宿主相容性。而且，特異性抗體或其片段分別可以人工制 備，即由免疫系統製備，它們針對最不同的靶物質，諸如例如低分子量結 構或蛋白。通過所述進化的方法，通過引入隨機突變製成抗體片段的合成 文庫，所述隨機突變在其範圍內可以接近人所有組成成分(Knappik等, 2000)。通過合適的選擇策略，諸如噬菌體展示或核糖體展示的方式(Winter, 1998, Hoogenboom等，1998; Hanes等，2000)，成功分離具有理想結合特性 的功能性Ig片段。以這種方式，還可能例如獲得針對所述抗原的結合蛋白， 所述抗原在經典免疫化過程中應該引起毒性作用或僅引起弱免疫應答。
儘管通過抗體工程提供了上述成就和可能性，但是某些缺點可以限制 抗體的實際應用。因此，以充足量提供它們是個難題。
功能性抗體的生產主要在真核細胞培養系統中進行，這是成本特別高 的方法。此外，抗體分子分別由於其尺寸和其在血清中的長存留時間(緩 慢血液清除)造成的低組織滲透性妨礙許多治療應用。儘管較小的抗體片 段，諸如scFv或Fab片段(見上)可以在細菌中並因此基本上以較低成 本製備，然而，由於其不利的摺疊特性和需要形成若干二硫鍵，該重組生 產的產率低於理想水平。而且，當與親本抗體相比時，重組抗體片段經常 顯示出降低的熱力學穩定性、較低的結合活性和較高的聚集傾向。
為了避開所述限制，已經嘗試透露抗體結合——即通過位於保守的蛋 白支架上的超變表面-暴露區域一 一結合於其他蛋白質的原理(Skerra， 2000)。這意味著基本可變環是多樣的，從而產生人工結合特性。為了該目 的，通常天然結合蛋白諸如例如脂籠蛋白(Beste等，1999)或纖連蛋白III型 結構域(Koide等，1998)被用作起始點，關於所述起始點以類似於來自靈活"環"結構的抗體的方式形成結合位點，所述靈活"環"結構的修飾允許 配體的誘導契合識別。
WO2004/106368涉及"泛蛋白-樣蛋白"超家族的修飾的蛋白，"泛蛋 白-樣蛋白"即具有泛蛋白-樣摺疊的蛋白。作為所述修飾的結果，該蛋白 具有先前不存在的關於預先確定的結合配偶體的結合親和性。該發明還涉 及用於生產和使用所述蛋白質的方法。按照WO2004/106368,提供選自由 "泛蛋白-樣蛋白"蛋白超家族的蛋白組成的組，其中由於P摺疊區|3折 疊鏈中胺基酸的一種或多種修飾，該蛋白質顯示出改進的結合親和性。因 此，從位置Q2, F4， K6, Q62, K63， E64， S65和T66處的新胺基酸取代裝配 人泛蛋白的從頭結合位點(圖6, 7)。
不幸地，由於所述從頭結合位點與蛋白質N-端的緊密接近，新引入氨 基酸的密碼子組成導致蛋白質變體的不均一表達率，並嚴重妨礙變體的隨 後的N-端遺傳融合或翻譯後N-端標記。最後，使用凸起的(3摺疊拓撲結 構作為互補位形成高親和性結合多肽依賴於耙分子凹形結構的存在。
發明概述
因此，本發明的一個目的是在不表現出上述缺點的條件下，提供具有 先前不存在的(與野生型蛋白相比)針對所選擇的結合配偶體或靶分子的 新型和/或提高的結合親和性的修飾蛋白，即其也可以用於除具有凹形結構 那些以外的其他靶分子。本發明的另一個目的是構建抗體的替代分子，然 而，所述替代分子不表現出抗體的上述缺點。
此外，本發明的一個目的是提供各種用於製備上述基於泛蛋白的修飾 蛋白的方法，和這些修飾蛋白的用途。
以上目的是通過獨立權利要求的主題實現的。優選的實施方案記述在 從屬權利要求中。
為了克服基於卩摺疊文庫策略的局限性，使用一種新方法在泛蛋白表 面上生成備選的結合位點。在該球狀蛋白幾乎凸起的拓撲結構中，野生型 泛蛋白的a螺旋異常地表現出約750入2的溶劑暴露的平面拓撲結構，其乍 一看似乎更不適合生成新的結合位點。然而，意外地證實了所述螺旋可以 作為生成具有與預先確定的結合配偶體的結合親和性的新的修飾的泛蛋白分子的優秀的基礎。
本方法基於這樣的假設，即可以在不擾亂穩定疏水性核心和——甚至 更重要地——泛蛋白摺疊途徑的條件下，誘變泛蛋白a螺旋。這完全與這 樣的事實的形成對比，所述事實是泛蛋白的螺旋在蛋白質的摺疊-途徑中起 主要作用。在翻譯泛蛋白的過程中，泛蛋白最初的兩條鏈從核糖體開始延
伸並迅速摺疊為二-鏈摺疊，其本身是穩定的結構(Bofill和Searle 2005)。 理論上，該小摺疊然後作為螺旋的主鏈模板。所述摺疊和所述螺旋在蛋白 質摺疊途徑過程中形成蛋白質的過渡狀態(Crespo， Simpson等2006; Jackson 2006; Pandit, Jha等2006)。其餘的多肽鏈隨後通過與該複合物碰 撞進行摺疊。
因此，泛蛋白過渡狀態複合物中的突變應該嚴重影響蛋白質的摺疊途 徑。可以預料到突變的蛋白質的溶解性、穩定性和總結構完整性受到所述 方法的嚴格限制。
在本發明中，舉例說明示範性結果，其非常令人吃驚地顯示高親和性 泛蛋白-來源的、單體結合變體可以通過利用泛蛋白a螺旋作為核心結構 的突變方法產生。而且，通過該方法，蛋白質的N-端保持沒有突變，這允 許序列異源變體通過最初的19個胺基酸的密碼子-最優化DNA序列的均 一的表達產率。此外，N-端遺傳融合以及隨後的標記方法成為可能的。
發明詳述
本發明在主要方面涉及用於生成蛋白的方法，所述蛋白選自由"泛蛋 白-樣蛋白"蛋白超家族的蛋白，即具有泛蛋白-樣摺疊基序的蛋白及其各 自具有泛蛋白-樣摺疊基序的片段或融合蛋白組成的組，其中所述蛋白由於 在ct螺旋區中的一個或多個胺基酸修飾顯示出關於抗原的提高的結合親和 性，所述結合親和性在未修飾的蛋白質中不存在或不以該程度存在。
此外，本發明提供這樣的蛋白，所述蛋白選自由各自具有泛蛋白-樣折 疊基序的"泛蛋白-樣蛋白"蛋白超家族的蛋白、及其各自具有泛蛋白-樣
摺疊基序和下列特徵的片段或融合蛋白組成的組，所述特徵為
一 所述蛋白由於對形成蛋白a螺旋區的那些胺基酸的修飾具有
關於預先確定的結合配偶體(試劑)的新的或增強的結合親和性；
一 所述結合親和性在未修飾的蛋白質中不存在或不以該程度存 在；和
一 a螺旋或相鄰區域內至少4個表面-暴露的胺基酸被修飾。
因此，本發明提供分別通過修飾分別具有如本發明定義的泛蛋白-樣折 疊基序的蛋白質或多肽製備的蛋白質或多肽。這些包括"泛蛋白-樣-蛋白" 蛋白超家族的蛋白，具有泛蛋白-樣摺疊基序的所有蛋白，以及這些蛋白的 片段或融合蛋白，條件是它們也具有泛蛋白-樣摺疊基序。分別從這些蛋白 質或多肽開始，原始蛋白質或多肽的a螺旋區中的至少四個表面-暴露的 胺基酸分別被修飾。這些修飾具體包括胺基酸的取代，和一個或多個氨基 酸的插入和缺失以及胺基酸的化學修飾。
注意到術語"a螺旋區"用於本文時，意指包括泛蛋白-樣摺疊中的三 個a-螺旋轉角。關於人泛蛋白，位置T22-D32屬於泛蛋白的螺旋核心區。 然而，該術語還包括位於a螺旋外的胺基酸16-21 (螺旋的上遊位置)和 38-55 (螺旋的下遊位置)。或換言之，用於本文時，術語"a-螺旋區"等 價於表述"a螺旋或相鄰區"。
所述a螺旋區中至少4個胺基酸的修飾意味著所述胺基酸應該位於結 合配偶體或配體分別易於接近的蛋白質表面，能夠以可以確定的親和性與 修飾的蛋白結合。
因此，按照本發明，所述a螺旋或相鄰區域內的至少4個表面-暴露的 胺基酸被修飾。證實可以提高與預先確定的結合配偶體的新的和/或提高的 結合親和性的可能性，條件是在a螺旋或相鄰區域內的至少4個表面-暴 露的胺基酸被修飾。
注意到為了形成非-瞬時蛋白質-蛋白質相互作用，需要充足的表面-暴 露面積，其是由當然參與所述相互作用的胺基酸殘基裝配的。假定4個表 面-暴露的胺基酸是產生所述相互作用的絕對最少量。為了更有效地形成這 種相互作用，優選地，表面-暴露的胺基酸數量是至少6個，更優選地，至 少8個。進一步優選地，在a螺旋或相鄰區域內暴露的胺基酸提供至少 400A2,更優選地600人2的溶劑可及表面積。關於那些表面可及表面積的 實例顯示在表1中
ii胺基酸胺基酸位置A2
4T22,E24，N25,A28266.814
6T22, E24,N25,A28，Q31'D32473.884
8D21,T22' E24,N25,A28,Q31JD32，P38544.976
10S20,D2,T22, E24,N25,A28,K29,Q31 ,D32'P38711.029
12S20,D21，T22， E24,N25，A28,K29,Q31 ,D32,P38,D52，G53847.595
4S20，D21,T22，E24,N25,A28,K29，Q31,D32,P38,D52,G53,R54,T551010.998
16El6,El8,S20,D21 ,T22， E24,N25,A28,K29,Q31 ,D32,P38'D52,G53，1239.035
R54，T55
E16，E18,S20，D21，T22,
18E24,N25，線K29,Q31,K33,D32，P38,D39,D52,G53'R54，T551484.749
表h通過PyMOL版本0.98的方式計算泛蛋白(PDB 1UBQ)的SASA (表面可及表面積)。
關於其他信息，參考Fletcher， S.和A. D. Hamilton (2005)."蛋白質表面 識別和蛋白模擬物蛋白表面結構和功能的模仿"("Protein surface recognition and proteomimetics: mimics of protein surface structure and flmction.")當前化學和生物學觀點(Curr Opin ChemBiol) 9(6): 632-8。
注意到本發明的蛋白質優選地僅在其a-螺旋區攜帶關於野生型(wt) 蛋白的修飾。然而，按照本發明，包括位於以上定義範圍外的修飾，其另 外可以為總體穩定性、摺疊效率、溶解性、靶點-特異性或親和性作出貢獻。
這進一步涉及通過隨機誘變(例如，傾向差錯的PCR)，通過位點定 向的重新隨機化預先選擇的結合盒中的位置，通過靶向的單胺基酸修飾或 通過化學修飾成熟化泛蛋白結合變體的其他策略。本領域中的那些技術人 員可以使用本身已知的用於修飾一個或多個胺基酸的不同技術。這些會在 下文中更詳細的記述。另外，參考Ausuebel等，1994,以及Sambrook等， 1989的公開文獻。
已知泛蛋白的非-表面-暴露核心區的胺基酸的修飾(Finucane等，生物 化學(Biochemistry),巻38， No. 36, 1999或Lazar等，蛋白質科學(Protein Science) (1997)， 6: 1167-1178)。其中作出的改變針對不參與結合的位置，這歸因於它們在疏水性核心中的定位是溶劑或可能的結合配偶體不可及 的。
在下文中，術語"未修飾蛋白中不存在或不以該程度存在的結合親和 性"和從頭形成的人工結合位點的意思分別在本發明上下文中得到解釋。 這些術語意指修飾的蛋白先前對預先確定的結合配偶體不顯示或幾乎不 顯示結合親和性。在本發明的另一個實施方案中，選擇要進行修飾的蛋白 以對所述預先確定的結合配偶體沒有結合親和性。結合配偶體，也可以定 義為配體，對按照本發明修飾的蛋白具有可測量的親和性。作為存在可計 量的結合特徵的最小值，即配偶體結合的親和性，按照本發明可以被認為 是形成的複合物的平衡常數KD = 10-5 M或更小。10—5 M以下的值可以被認 為是可計量的結合親和性。根據應用，1(^M-10^M的值是優選的，更優 選地，對於例如層析應用為10義10'" M，或對於例如診斷或治療應用為 10久10"2 M。更優選的結合親和力是在10'8到10'1G M，優選地到10'11 M 範圍內。用於確定結合親和性的方法本身已知，並在下文中進一步描述。 術語"修飾"按照本發明意指胺基酸的取代、插入、缺失或化學修飾。 可以使用"泛蛋白-樣蛋白"超家族的蛋白作為要按照本發明修飾的蛋 白。按照本發明，該超家族包括Murzin等(1995)中列出的子集。這些包 括例如下列蛋白家族:"泛蛋白-相關蛋白"、"UBX結構域"、"GABARAP-樣"、"RAS-結合結構域"等。優選地，使用"泛蛋白-相關蛋白"蛋白家 族的蛋白。按照本發明，還包括那些具有泛蛋白-樣摺疊基序的蛋白。這些 的實例是SUMO-l， FAU， NEDD-8, UBL-1，和GDX以及Rubl, APG8, ISG15， URM1， HUB1，伸蛋白B, PLIC2 (N-端結構域)，人帕金蛋白(N-端 結構域)。
已對按照本發明可以使用的來自泛蛋白-樣蛋白超家族的蛋白表徵到 很高的程度。因此，將泛蛋白-樣蛋白家族定義為泛蛋白-相關蛋白家族屬 於其中的超家族。因此，泛蛋白-樣蛋白成員的特徵是暴露於蛋白一個表面 的反向平行(3摺疊，所述蛋白表面的背側堆積垂直位於其上部的oc螺旋。 該泛蛋白-樣摺疊基序是按照本發明可以使用和修飾的蛋白的特徵，且明確 地將所述家族的成員與其他蛋白相區分。由於該定義，本發明還包括 PLIC-2的泛蛋白-樣N端結構域和帕金蛋白的泛蛋白-樣結構域。本領域中的那些技術人員可以關於序列比較，即所謂的對比，或通過 結構考慮因素，初步判斷蛋白質是否是泛蛋白-樣蛋白的蛋白超家族的成
員。自然地，最後的證據總是由結構分析，例如通過x-射線結晶學或多維
核磁共振光譜法的結構分析提供。近期，利用遺傳運算法則的結構分析可 以提供良好的預測。
上述家族和超家族的蛋白通常是高度保守的。按照現在的知識，例如， 在所有哺乳動物中泛蛋白具有相同的胺基酸序列。酵母的泛蛋白僅以3個 胺基酸不同於該序列。人泛蛋白或哺乳動物泛蛋白分別由76個胺基酸組 成並具有開始所述的結構。
下列實施方案涉及本發明的方法方面和蛋白質方面
按照本發明，所述修飾的蛋白在其胺基酸序列上應該與修飾的起始蛋
白，例如與人泛蛋白具有至少30%,優選地至少40%或50%,進一步優選 地至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,或至少95%的同一性，其 中所述蛋白在任何情形中具有如以上詳細定義的泛蛋白-樣摺疊基序。
按照本發明，還包括所述的蛋白質片段，條件是它們包括上述泛蛋白 -樣摺疊基序，以及包括所述蛋白與其他蛋白的融合。在所述片段和融合蛋 白的情形中，本發明框架中提到的胺基酸位置指人泛蛋白中的各個位置。 融合配偶體的實例是(受體)酶、毒素、蛋白酶、延長或縮短構建體或其 他結合蛋白的半衰期的蛋白等。此外，可以進行與例如低分子量物質諸如 生物素、洋地黃毒苷、螢光和/或發光物質等的化學偶聯。
按照更優選的實施方案，蛋白質以位點-特異性和共價方式與相同或不 同特異性的蛋白質相連接，並由此分別顯示二價或雙特異性結合特性。
在生成融合蛋白的情形中，按照本發明可以修飾所述構建體的片段或 全部融合配偶體。然而，本發明還包括片段融合，隨後進行修飾方法，這 可以包括翻譯後修飾，親和性、穩定性或溶解性成熟或進一步選擇與一級 靶標或對比二級靶分子的結合。在各種情形中，這可以按照本領域中那些 技術人員已知的方法進行。
關於如何生成和使用包括本發明修飾的蛋白的融合蛋白或綴合物的 更詳細信息可以在WO 2006/040129中找到，將其引入本文作為參考。注 意到本發明還包括本發明蛋白的同源二聚體或異源二聚體的產生。按照本發明，選擇用於製備修飾的蛋白的蛋白優選地是人泛蛋白或其 他來源的泛蛋白，例如另一種哺乳動物的泛蛋白。因此，在下文中利用特 殊的人泛蛋白作為實例描述本發明。關於若干實例描述人泛蛋白的修飾， 以獲得還可以稱為突變蛋白並且關於預先確定的結合配偶體顯示出先前 不存在的結合親和性的蛋白。作為哺乳動物的泛蛋白，可以具體使用哺乳 動物領域中齧齒動物、家畜和農畜的泛蛋白。如果按照本發明製備的蛋白 質的使用領域是已知的，即如果修飾的蛋白應該例如用作用於治療人中疾 病的藥物組合物，則人蛋白可以優選地用作待修飾的起始蛋白；也將其應 用於相應的使用領域。應該指出的是，下文中給出的解釋僅作為實例基於 人泛蛋白。在該詳細說明和提到的實例的基礎上，本領域中那些技術人員 按照本發明修飾其他具有泛蛋白-特異性摺疊基序的蛋白應該是可能的。因 此，本發明不限於人泛蛋白或普通的泛蛋白。該方面中的指示和解釋應該 被認為是本發明的示範性實施方案，然而，其是特別優選地。
下文是關於選擇和修飾待修飾胺基酸的簡略概述。
在相應的結構數據諸如例如可在蛋白質資料庫TM (Protein Data Bank ) (Berman等，2000; http:〃www.rcsb.org/pdb)中免費獲得的那些的基 礎上，可以通過計算機化分析定位那些胺基酸在起始蛋白質中，例如在泛 蛋白蛋白支架中的位置，所述起始蛋白的側鏈是表面-暴露的，即朝向溶劑 或潛在的結合配偶體(Fratemali和Cavallo 2002)。此外，可以通過計算機 化分析鑑定起始蛋白質中，例如泛蛋白中的那些胺基酸，其隨機取代可能 將對蛋白質支架沒有或僅有微小的消極作用。該信息可以提供關於每個單 胺基酸作為結合位點元件適合性的第一指示，並然後需要進一步實驗驗 證。通過分析的區域中的隨機胺基酸取代("隨機化")，由此可以——以 類似於抗體的抗原結合位點的方式_—在泛蛋白另外完整蛋白結構上生 成超變表面-暴露區。
按照優選的實施方案——起始自可獲得的人泛蛋白(PDB 1UBQ)結構 數據——首先選擇待生成的結合位點區域內的10根胺基酸位置。通過位 點特異性隨機誘變一級序列和隨後的特異性選擇，獲得那些變化，其顯示 出關於預先確定的結合配偶體的理想結合活性。儘管對以該方式獲得的修 飾的蛋白賦予從頭結合特性，但是它們與起始蛋白保持高度一致的結構和
15蛋白質化學特性。它們提供優點諸如例如小尺寸、高穩定性、成本-高效制 備以及容易修飾和針對先前定義的配體的高親和性和特異性。在這個方 面，不能預期泛蛋白作為生成人工結合蛋白的支架結構的適合性，因為l) 由於泛蛋白的小尺寸，不能預期所述支架對廣泛胺基酸取代的耐受性，和 2)涉及被認為是剛性不靈活的螺旋核心結構的人工結合位點的功能性似 乎不可能預見。
按照本發明，抗原應該指由抗體結合的物質。術語抗原包括半抗原、
肽、蛋白質、糖、DNA等。由Roche Lexikon Medizin (第4版； http:〃www.gesundheit.de/roche)，可以獲得下列抗原和半抗原定義，其也用
於本發明
抗原(AG):由免疫系統識別為外源("非自身")的任何物質的名稱。)和特應性(atopy)("特應原(at叩igen)")的情形中，該免疫反 應分別是過大的。AG誘導體液(抗原-抗體反應)和/或細胞防禦反應(見 下述免疫性)。如果AG受到免疫系統的耐受(免疫耐受)，則其也稱為"耐 受原"。作為抗原有效的主要是具有負責免疫應答的化學可識別功能性(決 定簇)的複合物和較高分子量的物質(蛋白體、多糖、核苷酸和許多合成 的化合物)。分類為l)完全AG，主要是較高分子量和能夠通過自身引起 免疫反應的，.2)作為低分子量的半抗原(=半個抗原)，其僅在與較大的 載體分子偶聯後起免疫原的作用。參考例如異種、同種異型、或同基因的、 自體AG;自體、異源、移植、抗-腫瘤病毒AG。
半抗原:與完全AG相反，分別負責抗原(AG)的特異性或由於其結 構(決定簇)能夠特異結合抗體但不能產生過敏的簡單、低分子量化學化 合物。其在結合稱為載體的蛋白體後成為完全抗原(抗原)。
應該指出，利用本發明，還可能產生泛蛋白的變化，其具有關於作為 結合配偶體的非-免疫原性物質，諸如腫瘤標記的結合特性。
在本發明的優選實施方案中，至少部分地在一級序列中直接相鄰的兩 個或更多胺基酸處進行修飾，優選地進行取代，其中在三級結構中彼此直 接相鄰的胺基酸還優選地至少部分位於蛋白的螺旋內。 一般地，蛋白質中 胺基酸的每個取代都伴隨著該蛋白質穩定性的潛在降低。通常可以耐受單一取代，因為對相鄰胺基酸沒有廣泛的不穩定性影響。然而，如果改變整 個區域，即例如由若干相鄰胺基酸組成的結構實體，則不再能預期由於直 接相鄰的胺基酸產生的穩定化作用。
具體地，在相對小的泛蛋白的情形中，直接相鄰的胺基酸的修飾還具 有這樣的優勢，即與彼此不直接相鄰的胺基酸的情形相比，通過遺傳工程 更容易製備這種類型的修飾。因此，按照該實施方案，可以在蛋白質和在 DNA水平提供大量修飾的蛋白質的簡單產生。
優選地，直接相鄰胺基酸取代的數量是一級序列中彼此直接相鄰的
2-10個，更優選地，2-8個胺基酸，進一步優選地， 一級序列中彼此直接 相鄰的3-7個或4- 6個或2- 4個胺基酸。
在進一步優選的實施方案中，5個或更多直接相鄰的胺基酸被修飾， 優選地被取代，其中2個或更多，優選地2或3個直接相鄰的胺基酸形成 a螺旋區的開始或終止端。在該情形中，優選地，8、 9或10個胺基酸， 特別優選地，8個胺基酸可以認作為直接相鄰的修飾胺基酸總數的上限。
在本發明優選的實施方案中，修飾那些胺基酸，從而產生具有新結合 特性的區域，所述區域在蛋白質表面上形成鄰接區域。以這種方式，可以 產生具有先前不存在的結合特性的鄰接區域。按照本發明"鄰接區域"意 指如下由於電荷，它們側鏈胺基酸的空間結構和疏水性/親水性以相應的 方式與它們的環境相互作用。所述環境可以是溶劑，通常是水，或其他分 子，例如空間上靠近的胺基酸。通過關於蛋白質的結構信息以及各種軟體， 可以表徵蛋白質的表面。例如，可以以這種方式顯現蛋白質和溶劑的原子 之間的界面區，其包括關於如何構建該界面區，溶劑可及哪些表面積或電 荷如何分布在表面上的信息。例如，可以通過利用合適的軟體顯現這種類 型而揭示鄰接區域。所述方法是本領域中那些技術人員已知的。按照本發 明，基本上還可以使用整個表面-暴露區域作為待修飾表面上的鄰接區域， 從而產生新結合特性。
為了誘變a螺旋結構，優選地，在蛋白中選擇與表面接近的那些區域。 可以關於可獲得的X-射線結晶結構鑑定表面-暴露的胺基酸(Vijay-Kumar， Bugg等1987)。如果晶體結構不可用，則可以通過計算機分析的方式進行 嘗試，從而預測表面-暴露的|3摺疊區域和各個胺基酸位置關於可用一級結構的可及性(www.embl heidelberg.de/predictprotein/ predictprotein.html)或從 而建模3d蛋白結構(www.expasv.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html)和從而
以這種方式獲得關於潛在表面-暴露胺基酸的信息。
然而，還可能在a螺旋中進行誘變，對此可以省略對待誘變的胺基酸 位置的耗時預選擇。將那些編碼a螺旋結構的DNA區域從它們的DNA 環境中分離出來，對其進行隨機誘變，並然後重新-整合到編碼先前從其中 去除它們的蛋白的DNA中。隨後進行關於具有理想結合特性的突變體的 選擇過程。
由從親本蛋白和從彼此從頭產生的人工結合位點的區域中的胺基酸 取代引起區別的泛蛋白蛋白支架的變化可以通過各自序列片段的靶向誘 變產生。在這種情形中，具有某些特性諸如極性、電荷、溶解性、疏水性 或親水性的胺基酸可以分別被具有各種其他特性的胺基酸替換或取代。除 取代外，術語"誘變"還包括插入和缺失。在蛋白質水平上，修飾還可以 通過按照本領域中那些技術人員已知的方法化學改變胺基酸側鏈進行。
例如泛蛋白-樣蛋白的cDNA可以起誘變各自序列片段的起始點的作 用，其可以通過本領域中那些技術人員已知的方法製備、改變、和擴增。 對於一級序列相對小區域內的泛蛋白位點-特異性改變(約1-3個胺基酸)， 可商購的試劑和方法是現成的("快速改變"("QuickChange") ， Stratagene; "誘變劑噬菌粒體外誘變試劑盒"("Mutagene Phagemid Z" *o Mutagenesis Kit") , Biorad)。為了較大區域的位點定向誘變，例如聚合酶 鏈反應(PCR)的特異性實施方案是本領域中那些技術人員可以使用的。 為了該目的，在理想位置處具有簡併鹼基對組成的合成的寡脫氧核苷酸的 混合物可以用於例如引入突變。這還可以通過使用基因組DNA中天然不 存在的鹼基對類似物，諸如例如肌苷實現。
誘變a螺旋區的起始點可以是例如泛蛋白-樣蛋白的cDNA或還可以 是基因組DNA。此外，編碼所述蛋白質的基因也可以合成地製備。
不同本身已知的方法可用於誘變，所述方法是用於位點-特異性誘變的 方法、用於隨機誘變的方法、利用PCR的誘變或相似方法。
在本發明的優選實施方案中，預先確定待誘變的胺基酸位置。對待修 飾的胺基酸的選擇根據待修飾的蛋白和/或根據選擇的結合配偶體進行。在每種情形中，通常構建不同突變體的文庫，利用本身已知的方法對其進行 篩選。自然地，如果可獲得關於待修飾蛋白充足的結構信息，則可以特別 容易地進行待修飾胺基酸的預選擇。然而，在沒有所述結構信息的條件下， 利用使用隨機誘變和隨後選擇的方法也可能改變具有泛蛋白-樣摺疊基序 的蛋白，從而接受分別關於預先確定的抗原或結合配偶體的結合親和性。 可以形成基於例如8， 10, 14或18個胺基酸位置的文庫(見實施例章
節)。優選的文庫坐標是E16, E18, S20, D21, T22, E24, N25， A28， K29， Q31, D32， K33， P38, D39, D52， G53, R54， T55。
用於例如通過PCR，通過化學誘變或利用細菌增變株進行的耙向誘變 以及較長序列片段誘變的方法也屬於現有技術並可以按照本發明使用。
在本發明的一個實施方案中，誘變通過裝配攜帶密碼子三聯體化學計 量(stochiometry) NNK的DNA寡核苷酸進行。然而，應該理解，還可 以使用其他密碼子化學計量，優選地NNB和NWB基序。
在本發明的另一個實施方案中，使用編碼至少2或3個胺基酸，優選 地4,5，6，7,8,10，12，13，14,15,16,17,18或19個胺基酸的密碼子三聯體化學計
以維持二級結構的方式進行突變。包括一級結構中相對小的區域(約 3-5個胺基酸)的位點-特異性誘變可以使用可商購的Stratagene (快速變化 (QuickChange))或Bio-Rad (誘變劑噬菌粒體外誘變試劑盒(Mutagene phagemid v!'rro mutagenesis kit))試劑盒產生(參考US-A-5,789,166; US-A-4,873,192)。
如果對更廣闊的區域進行位點-特異性誘變，則必須製備DNA盒，其 中待誘變的區域通過裝配包含突變的和未改變的位置的寡核苷酸獲得 (Nord等，1997; McConell和Hoess, 1995)。隨機誘變可以通過增變株中的 DNA增殖或通過PCR擴增(傾向差錯的PCR)引入(例如Pannekoek等， 1993)。為了該目的，使用具有增高差錯率的聚合酶。為了分別提高引入的 誘變的程度或為了組合不同的突變，可以通過DNA改組組合PCR片段中 的突變(Stemmer， 1994)。這些關於酶的誘變策略綜述提供在Kuchner和 Arnold (1997)的綜述中。為了在選擇的DNA區域內進行這種隨機誘變， 也必須構建用於誘變的DNA盒。
19按照本發明優選的實施方案，僅修飾不屬於這樣的區域的胺基酸位 置，以產生新結合特性，所述區域在未修飾的泛蛋白中不參與與泛蛋白的 天然結合配偶體的連接。這確保不僅是改變已經存在的泛蛋白結合特性。
用於修飾的區域可以基本關於它們是否能夠被可能的結合配偶體接 近和蛋白質的總結構是否推定表現出針對修飾的耐受性而選擇。
按照本發明，在蛋白質，優選地來自哺乳動物的泛蛋白中，a螺旋區 中存在的至少15%的胺基酸，優選至少20%，更優選至少25%可以被修飾， 優選被取代，從而形成先前不存在的結合特性。作為最大量，優選a螺旋 區中存在的約40%的胺基酸，更優選最多約35%和甚至更優選約30%被修 飾，優選被取代。
按照優選的實施方案，所述修飾包括5-10個胺基酸，優選6-8個氨基 酸的鄰接區域，其中優選其2-4個胺基酸位於a螺旋的表面-暴露區內。
在按照本發明的蛋白質中，a螺旋鏈的胺基酸被修飾，且任選另外地， 位於a螺旋外的螺旋上遊位置或螺旋下遊位置中的胺基酸被修飾。如上述， 在高度優選的實施方案中，a螺旋鏈的胺基酸22-32被修飾，且任選另外 地(在哺乳動物的泛蛋白胺基酸中)，位於a螺旋外的胺基酸區域16-21 (螺旋上遊位置)或38-55 (螺旋下遊位置)被修飾。優選地，在本發明 的蛋白質中，修飾的蛋白是取代的、缺失的、插入的和/或化學修飾的，優 選地在位置16, 18, 20， 21, 22， 24, 25， 28， 29， 31， 32, 33, 38， 39, 52, 53, 54, 和/或55中的4個或更多位置取代的人泛蛋白。
在本發明的蛋白質中，優選地， 一級序列中彼此直接相鄰的一部分修 飾的胺基酸處於a螺旋區的開始或終止區域，其中該部分具有2個或更多 胺基酸，優選2或3個胺基酸的長度。
在另一個實施方案中，本發明的蛋白是人泛蛋白或其同源蛋白，其中 泛蛋白中螺旋的至少4個胺基酸被修飾，優選被取代，以使這些修飾的氨 基酸包括對結合配偶體具有結合親和性的區域。
如上所述，本發明在主要方面涉及用於生成蛋白的方法，所述蛋白選 自由"泛蛋白-樣蛋白"蛋白超家族的蛋白，即具有泛蛋白-樣摺疊基序的 蛋白及其各自具有泛蛋白-樣摺疊基序的片段或融合蛋白組成的組，其中所 述蛋白由於在a螺旋區中的一個或多個胺基酸修飾顯示出關於試劑的提高的結合親和性，所述結合親和性在未修飾的蛋白質中不存在或不以該程度 存在，所述方法具有下列步驟
a) 選擇"泛蛋白-樣蛋白"超家族的未修飾蛋白；
b) 提供所述未修飾蛋白對其具有低的或不具有結合親和性的試劑；
c) 在包括a螺旋區的蛋白質表面-暴露區中選擇胺基酸；
d) 優選地通過取代、插入、缺失和/或化學修飾修飾選擇的胺基酸， 其中所述a螺旋或相鄰區域中至少4個表面-暴露胺基酸被修飾；
e) 使所述修飾的蛋白與步驟b)中提供的試劑相接觸；
f) 檢測具有關於步驟b)中提供的試劑的新或增高的結合親和性的蛋 白，和任選地
g) 在合適的原核、真核、體外蛋白質表達系統中或通過化學合成生 成所述修飾的蛋白；
h) 在生成後通過合適的純化方法分離所述蛋白；和進一步任選地
i) 通過重複步驟d-h)進行所述修飾蛋白的熟化。 在優選的實施方案中，步驟d)通過化學合成所述修飾的蛋白執行，
或備選地，步驟d)中的修飾通過遺傳工程執行，從而改變屬於相應的修 飾蛋白的DNA。
如上所述，在步驟d)中，基因庫優選通過隨機誘變，或進行所選擇 的胺基酸的隨機取代形成。
在步驟e)中，與預先確定的結合配偶體的接觸優選通過合適的選擇 方法，優選地噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、CIS展示或細胞表 面展示方法、酵母表面展示、細菌表面展示，特別優選通過噬菌體展示方 法進行。
在步驟f)中，檢測具有針對預先確定的結合配偶體的結合親和性的 蛋白優選通過一種或多種下列方法進行ELISA、胞質基因表面共振光譜 法、共振模式(resonance profiling)、珠技術、螢光光譜法、FACS、等溫 滴定熱量測定或分析超速離心法。
在一個實施方案中，利用本身已知的方法，針對其結合親和性、其結 合特異性和/或其他蛋白質化學特性諸如穩定性、溶解性、或產量熟化所述 蛋白質。此外，本發明的蛋白以位點-特異性或隨機-樣方式與至少一種相同或 不同特異性的蛋白共價連接，並由此分別顯示出二價或多價或雙特異性結 合特性。
本發明還提供通過上文中公開的方法能夠獲得的蛋白質。 本發明還涉及編碼所述蛋白質的核酸。
一般地，術語"核酸"用於本
文時，包括RNA和DNA，所述DNA包括cDNA、基因組DNA、和合成 的(例如化學合成的)DNA。
修飾選擇的胺基酸的步驟按照本發明，優選地通過在遺傳水平上通過 隨機誘變，即隨機取代選擇的胺基酸引起的誘變進行。優選地，步驟d) 中的修飾通過改變屬於各自蛋白質的DNA的遺傳工程方法進行。優選地， 然後，所述蛋白質的表達在原核或真核生物體中進行。
按照本發明，修飾的蛋白可以進一步優選通過化學合成製備。在該實 施方案中，第二實施方案的步驟c) -d)於是以一步進行。
下文分別舉例說明選擇和確定具有針對預先確定的結合配偶體，本文 中也簡稱為"試劑"的結合親和性的胺基酸
通過修飾選擇的胺基酸形成蛋白質文庫後，按照本發明使修飾的蛋白 質與預先確定的結合配偶體相接觸，從而任選地允許所述配偶體彼此結 合，條件是如果結合親和性確實存在。
按照本發明的接觸優選通過合適呈遞和選擇方法諸如噬菌體展示、核 糖體展示、mRNA展示或細胞表面展示、酵母表面展示或細菌表面展示方 法，優選地通過噬菌體展示方法進行。對於完全的公開，還參考下列參考 文獻Hoess,當前結構生物學觀點(Curr. Opin. Struct. Biol.) 3 (1993), 572-579; Wells和Lowmann,當前結構生物學觀點(Curr. Opin. Struct. Biol.) 2 (1992), 597-604; Kay等，肽和蛋白質的噬菌體展示一一實驗室手冊 (Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual) (1996)，學 術出版社(Academic Press)。上文提到的方法是本領域中那些技術人員已 知的，且包括其改進可以按照本發明使用。
確定修飾的蛋白是否具有針對預先確定的結合配偶體的可計量的結 合親和性可以按照本發明，優選地通過下列方法中的一種或多種進行 ELISA、胞質基因表面共振光譜法、螢光光譜法、FACS、等溫滴定熱量測定或分析超速離心法。
適合於這種應用的一種噬菌體展示程序類型記述在下列各項中，作為 按照本發明針對顯示結合特性的泛蛋白變體的選擇程序的實例。以相同的
方式，可以應用例如用於在細菌(潘慮表厫展^Daugherty等，1998)或酵母 細胞(^母表面展示；Kieke等，1997)或無細胞選擇系統諸如提薪沐展示 (Hanes和Pliickthun， 1997; He和Taussig, 1997)或展示(Odegrip等， 2003)或mRNA展示上呈遞的方法。在後者情形中，基因型和表型的瞬間 物理連鎖通過將蛋白質變異通過核糖體偶聯於合適的mRNA而實現。
在本文中所述的噬菌體展示程序中，泛蛋白的重組變異存在於絲狀噬 菌體上，而存在的變異的編碼DNA同時以單鏈形式堆積在噬菌體包膜中。 因此在親和性富集的框架中，具有某些特性的變異可以選自文庫，並且它 們的遺傳信息可以分別通過感染合適的細菌而擴增或加入到另一富集周 期中。突變泛蛋白在噬菌體表面上的呈遞通過與氨基端單信號序列——優 選地，PdB信號序列——和噬菌體的衣殼或表面蛋白——遺傳融合——優 選是羧基端融合於所述衣殼蛋白pIII或其片段——實現的。此外，編碼的 融合蛋白可以包含其他功能性元件，諸如例如用於在親合富集期間通過親 合層析法或關於融合蛋白特異性切割的蛋白酶識別序列進行檢測和/或純 化的親合標記物或抗體表位。此外，琥珀終止密碼子可以存在於例如關於 泛蛋白變異的基因和噬菌體衣殼蛋白或其片段的編碼區域之間，部分由於 引入一個胺基酸，其在合適的抑制菌株中的翻譯過程中不被識別。
在分離具有對預先確定的半抗原或抗原的結合特性的泛蛋白變體的 情形中適用於選擇程序和向其中插入關於所述融合蛋白的基因盒的細菌 載體稱為噬粒。其中，它包含絲狀噬菌體(例如M13或fl)的基因間區域 或其一部分，其在通過輔助噬菌體諸如例如M13K07超感染攜帶噬菌粒的 細菌細胞的情形中導致噬粒DNA閉合鏈包裝到噬菌體衣殼中。以這種方 式產生的噬菌粒通過細菌分泌並呈現各種編碼的泛蛋白變異——這歸因 於它與衣殼蛋白pIII或其片段——在它們表面上的融合。天然pIII衣殼蛋 白存在於噬菌粒中，以便保持其重新-感染合適細菌菌株的能力和因此擴增 相應DNA的可能性。因此，確保泛蛋白變異的表型——即其潛在的結合 特性——和其基因型之間的物理連鎖。可以通過本領域中那些技術人員已知的方法，針對其上存在的泛蛋白 變異與預先確定的半抗原或抗原的結合選擇所獲得的噬粒。為了該目的， 存在的泛蛋白變異可以瞬間固定在結合在例如微滴定板上的靶物質，並可 以在己經分離非-結合變異後特異性洗脫。洗脫優選通過鹼性溶液諸如例如 100mM三乙胺進行。備選地，洗脫可以在酸性條件下，通過蛋白質水解 或直接添加感染的細菌進行。以這種方式獲得的噬菌粒可以通過對具有與 預先確定的半抗原或抗原的結合特性的泛蛋白變異的連續選擇和擴增周 期重新-擴增和富集。
以這種方式獲得的泛蛋白變異的其他表徵可以以噬菌粒，即與噬菌體 融合，或在將相應的基因盒克隆到處於可溶性蛋白質形式的合適表達載體 中後進行。合適的方法是本領域中那些技術人員已知的或記述在本文獻
中。所述表徵可以包括例如確定DNA序列和由此確定分離的變異的一級
序列。此外，分離的變異的親和性和特異性可以例如通過免疫學標準方法
諸如ELISA或胞質基因表面共振光譜法、螢光光譜法、FACS、等溫滴定 熱量測定或分析超速離心法檢測。考慮到穩定性分析，例如與化學或物理 解摺疊有關的光譜法是本領域中那些技術人員已知的。
在還使用的/,凝沐^^^^呈序中，泛蛋白變異通過無細胞轉錄/翻譯系統 製備並作為與相應mRNA以及核糖體的複合物存在。為了該目的，使用 如上所述的DNA文庫作為基礎，其中變異的基因以與關於表達和蛋白質 生物合成的相應調節序列融合的形式存在。由於基因文庫的3'末端終止密 碼子的缺失以及合適的實驗條件(低溫，高Mg^濃度)，在體外轉錄/翻譯 過程中維持由新生蛋白、mRNA和核糖體組成的三元複合物。
這些複合物可以針對存在於其上的泛蛋白變異與預先確定的半抗原 或抗原的結合，通過本領域中那些技術人員已知的方法進行選擇。為了該 目的，核糖體複合物上存在的泛蛋白變異分別可以瞬間固定於結合在例如 微滴定板上的靶物質，或可以在溶液中結合後與磁性粒子結合。分離非-結合的變體後，具有結合活性的變體的遺傳信息可以通過破壞核糖體複合 物，以mRNA的形式特異性洗脫。所述洗脫優選使用50 mM EDTA進行。 以這種方式獲得的mRNA可以分離並利用合適的方法(反轉錄酶反應) 反轉錄成DNA，以這種方式獲得的DNA可以重新-擴增。
24通過連續的體外轉錄/翻譯、選擇和擴增周期，可以富集具有關於預先 確定半抗原或抗原的結合特性的泛蛋白變異。
以這種方式獲得的泛蛋白變異的其他表徵可以以如上所述的可溶性 蛋白形式，在將相應的基因盒克隆到合適載體後進行。合適的方法是本領 域中那些技術人員己知的或記述在參考文獻中。
表達按照本發明修飾的具有泛蛋白4羊摺疊基序的蛋白後，可以通過本 身己知的方法進一步對這些進行純化和富集。選擇的方法依賴於若干本身 對本領域中那些技術人員已知的因素，例如使用的表達載體、宿主生物體、 目的使用領域、蛋白質的尺寸和其他因素。為了簡化的純化，可將按照本 發明修飾的蛋白融合於具有對分離物質增高的親和性的其他肽序列上。優 選地，選擇這樣的融合，即其對泛蛋白功能性不具有決定作用或由於引入 特異性蛋白酶切割位點可以在純化後分離。所述方法本身也是本領域中那 些技術人員已知的。
按照本發明和特別地按照以上剛剛描述的程序， 一般可以分離具有針 對預先確定的結合配偶體諸如例如半抗原或抗原的結合親和性的泛蛋白 變異。注意到術語"預先確定的結合配偶體"對應於術語"試劑"。同樣 地，"對其不存在或不以該程度存在結合親和性的預先確定的結合配偶 體"對應於"未修飾蛋白對其具有低的或無結合親和性的試劑"。
作為按照本發明提供的修飾的蛋白的結合配偶體(試劑)，可以使用 所有生物學和醫學活性和相關分子。可能的結合配偶體將通過實施例的方 式記述如下。然而，應該注意到，許多其他可能的配體可以加入到該列表 中。類似於抗體和抗原之間的關係，潛在的結合配偶體的列表可以通過其 他潛在的配體完善。
優選地，所述結合配偶體是生物學受體，優選G蛋白-偶聯受體(GPCR;
例如人GLP-1受體、人PTH受體、人andrenergic受體)、或EGF受體、 IGF1R、 HER2、 HER3、 VEGF/Rl-4、 Ep-CAM、或其配體或結構域、腫 瘤標記(前列腺特異性膜抗原(PSMA))、細胞因子(腫瘤壞死因子a (TNF-a)、腫瘤壞死因子P (TNF-fi)、白細胞介素(例如IL-2, IL-6, IL-8, IL-11,IL-12，IL-13)、生長因子(例如NGF(神經生長因子)及其前體-形式 (pro畫form)、 ProNGF、 BMPs、 EGF、 MIA、 MIA-2、 FGFs、血管內皮生長因子(VEGF)、 PDGF、 P1GF、 IGFs)、激酶、整聯蛋白(例如，糖蛋白受 體1Ib/IIIa (GPIIb/IIIa))、 HSA(人血清清蛋白)、F4絲束蛋白、T和B細胞 抗原，優選地CD4、 CDll、 CD14、 CD16、 CD20、 CD22、 CD25、 CD34、 CD47、 CD56、 CD83、 CD154、 CTLA-4、免疫球蛋白或其部分，例如全抗 體、(例如免疫球蛋白G,E,M)、例如人免疫球蛋白M的Fc部分或抗原結 合位點區域中的抗體片段、或糖(Lewis Y, Lewis X)、或毒素，例如真菌毒 素、或激素，例如皮質醇。
此外，本發明的蛋白質可以用於檢測和用於定量測定以及用於分開和 分離各種結合配偶體。
另一種應用是用在各種結合配偶體參與其中的疾病的診斷和治療中。
如已經提到地，本發明還涉及位於從頭生成的人工結合位點外的各個 氮基酸位置的靶向改變。以這種方式，例如由負責天然泛蛋白生物學功能 的胺基酸佔據的位置可以被其他胺基酸佔據。以這種方式，獲得這樣的泛 蛋白蛋白支架，即，所述泛蛋白蛋白支架，針對其生物學功能諸如例如針 對與遍在蛋白化級聯的酶的相互作用是失活的，但是針對其結構和蛋白質 化學特性在很大程度上與起始蛋白一致。
因此，對於按照本發明修飾和選擇的蛋白質，可用於廣譜的可能的應 用。它們可以不僅用在醫-藥領域，還用在分析學、營養和食品工業、營養 增補劑、化妝品、醫學和非-醫學診斷和分析等領域中。自然地，使用領域 依賴於選擇的結合配偶體的類型。
在人和獸醫治療和預防領域中，藥物有效藥物可以通過本身已知的方 法製備。根據草藥製劑，這些組合物可以靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、 經皮、或通過其他應用方法施用。藥物製劑的類型依賴於待治療的疾病的 類型、疾病的嚴重性、待治療的患者和醫學領域中那些技術人員已知的其 他因素。施藥可以通過注射或灌輸、吸入、全身、口服、直腸或通過其他 常規使用的方法腸胃外進行。
使所述組合物適合包含治療有效劑量。待施用劑量的量依賴於待治療 的生物體、疾病的類型、患者的年齡和體重和其他本身已知的因素。
所述組合物可以包含本身已知的輔劑。這些包括例如穩定劑、表面-活性劑、鹽、緩衝劑、著色劑等。所述藥物組合物可以處於用於局部施用的液體製劑、霜劑、洗劑形式， 氣霧劑，處於粉劑、粒劑、片劑、栓劑、或膠囊的形式，處於乳劑或脂質 體製劑的形式。所述組合物優選地是無菌的、非-致熱性的和等滲的，其包 括本身己知的藥物常規和藥用添加劑。另外，參考美國藥典的規章。
提供下列實施例進一步舉例說明本發明。本發明特別利用關於泛蛋白 的修飾作為實例進行示範。然而，本發明不僅限於此，且下列實施例僅顯 示本發明在以上說明書基礎上的可行性。為了完全公開本發明，還參考本 申請中和附件中引用的文獻，將其完整引入本申請作為參考。
在下文中，將關於實施例和附圖更詳細地描述本發明，其中圖解下列 各項
圖l:人野生型泛蛋白的帶狀結構圖(Ribbon diagram)。 (PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98)
圖2:人野生型泛蛋白的帶狀結構圖。(PDB1D3Z)。將裝配蛋白質疏 水性核心的胺基酸繪成綠色球體。(Pymol,版本0.98)。
圖3:人野生型泛蛋白的帶狀結構圖。(PDB 1D3Z)胺基酸T22, E24， N25, A28， K29， Q31，D32禾B K33屬於螺旋(紅色)。螺旋-上遊位置E16, E18, S20, D21繪成綠色。螺旋下遊位置P38, D39， D52, G53, R54， T55繪成橙色。 文庫中主要部分是螺旋。(Pymol,版本0.98)
圖4:人野生型泛蛋白的表面圖(surface presentation)。 (PDB 1D3Z)氨 基酸T22, E24, N25, A28, K29， Q31， D32和K33屬於螺旋(紅色)。螺旋-上遊位置E16， E18, S20, D21繪成綠色。螺旋下遊位置P38， D39, D52, G53, R54，T55繪成橙色。文庫中主要部分是螺旋。(Pymol，版本0.98)
圖5:人野生型泛蛋白的表面圖。(PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98)。將 最大結合位點1485 V染成紅色。
圖6:人野生型泛蛋白的帶狀結構圖。(PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98) 將裝配基於摺疊的文庫的胺基酸位置染成藍色。
圖7:人野生型泛蛋白的表面圖。(PDB lD3Z;Pymo1,版本0.98)將裝 配基於摺疊的文庫的胺基酸染成藍色。
圖8:核糖體展示構建體SPAIO。將引物繪成藍色箭頭。使用引物forw. MunRD和R3MunEco為文庫片段和間隔片段後來的限制性連接產生EcoRI和MunI限制性位點。引物RDRT用於反轉錄。引物對F1/RDRT和 F1A/RDRT用於在核糖體展示選擇程序中的PCR擴增。紅叉標記引物 SPAF2、 SPAF3和SPAR2，其引入位點定向的突變，從而產生所述文庫。
圖9:示範性擊中-ELISA，顯示SPA10文庫的變體相對TNFa (紅色) 和作為背景的BSA(藍色)。
圖10:結合TNFa的泛蛋白變體2E11的胺基酸序列。IO個取代的氮 基酸位置標記為黃色。位置K33變為E (紅色)。
圖lh純化泛蛋白變體2E11過程中的SEC(Superdex 75, 1.6 x 60, GE 衛生保健(GE Healthcare))層析模式圖。級分B5用於進一步的結合研究。
圖12:顯示SPA14變體2E11的TNFa濃度-依賴性結合特徵的ELISA。 實心圓變體2E11相對TNFa。空心圓變體2E11相對BSA。通過非線 性S形曲線擬合，確定表觀親和性為400 nM (R = 0,99)。擬合通過cj圖(版 本6.10)創建。
實施例
在下文中，存在這樣的數據，其描述如何利用螺旋作為中心二級結構 基序構建泛蛋白文庫。通過核糖體展示選擇技術的一些實施方案選擇相對 TNFa的結合活性變體。在大腸桿菌中作為可溶性蛋白重組生成結合劑。 顯示TNFa結合活性的變體通過ELISA擊中-篩選程序鑑定。通過濃度依 賴性ELISA，這些針對TNFa的"第一代"結合劑的表觀親和性確定為 400nM。
泛蛋白文庫及其不同實施方案的文庫坐標
胺基酸T22, E24, N25， A28, K29, Q31， D32和K33屬於人泛蛋白的a 螺旋並代表文庫的核心-位置(圖3)。螺旋上遊-位置E16， E18， S20， D21 和螺旋下遊位置P38, D39， D52, G53, R54, T55另外將表面可及面積擴大到 最大值1485 A2 (圖4、 5)。這些周圍的位置屬於泛蛋白的連接轉角環。位 置F45突變為W，以增高消光係數，從而促進光譜分析(Khomsanizadeh, Peters等，1993)。隨機化總共最多11個殘基。構建螺旋文庫的不同實施 方案。在第一實施方案中，生成SPA10文庫，其中利用NNK密碼子化學
28計量，在DNA水平上隨機化10個胺基酸位置(S20， T22， E24, N25, A28, Q31,P38,G53,R54,T55)。 SPA10文庫應該形成750 A2的表面。在第二種 方法中，隨機化14個位置(SPA14 : S20， D21, T22, E24, N25， A28, K29, Q31, D32,P38D52,G53,R54，T55)，從而形成擴大的表面1011 A2。最後的方法 是SPA18文庫，通過所述文庫誘變18個殘基，從而形成最大表面1485 A2 (E16, E18, S20, D21, T22, E24, N25, A28, K29， Q31, D32， K33, P38, D39, D52, G53，R54, T55)。
在下文中描述了實施例，是TNFa結合泛蛋白變體，其選自SPA10文庫。
實施例l:
描述基於PCR合成SPA10文庫
在重疊延伸連接PCR中，裝配5個寡核苷酸，從而合成DNA片段文 庫(圖8)。將三種合成引物SPAF2、 SPAF3和SPAR2合成為序列特異性 隨機化寡核苷酸，其編碼SPA10螺旋文庫。
進行第一合成-步驟如下100inl的PCR體積，其包括0，2 mM dNTPs (lOmM儲液，dNTP混合物，羅氏(ROCHE) ); 5單位PWO聚合酶(250 單位儲液， 羅氏)； 1 pM 引物 SPAF1 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAGATTTTTGTGAAAA CCC-3'; 0,25 pM引物SPAF2 5'畫CACTCTGGAAGTGGAGCCCNNKGA CNNKATC麗K麗KGTGAAGNNKAAGATCNNKGACAAGGAGGGCAT CCCG-3'; 0，25引物SPAF3 5'- CTGGGCGGGTAAACAGCTCGAA GACNNKNNKKNKCTGAGCGATTACAACATCCAGAAAGAAAGC-3'; 1 一弓|物 SPAR1 5'陽CGCAGACGCAGCACCAGATGCAGGGTGCTTT CTTTCTGGATGTTGTAATCGC隱3'; 0，25一 弓|物 SPAR2 5'-CGAGCTGTTTACCCGCCCAGATCAGACGCTGCTGATCMNNCGGGAT GCCCTCCTTGTC-3'; 0,25pM引物SPAR3 5'畫GGGCTCCACTTCCAG AGTGATGGTCTTGCCGGTCAGGGTTTTCACAAAAATCTGC畫3'。 PCR模 式如下(30秒94。C; 60秒55°C; 40秒72°C) x 30。
將PCR產物在1,5 %溴化乙錠-染色的瓊脂糖凝膠中分離。利用Qiagen凝膠提取試劑盒，按照供應商的使用說明，從凝膠中提取250bp處的目標 DNA-條帶。為了形成約10"個變體的文庫尺寸，將至少100ng第一合成 步驟的純化PCR產物轉移到下一個附加PCR (Add-on PCR)步驟中作為 模板。在該合成步驟中，通過末端引物重新擴增文庫片段，其附加調節序 列如RBS基因10基序(Fl引物)和用於隨後的限制性連接程序的EcoRI 限制性位點。所述PCR測定法組合100 )il的體積，其包括0,2 mM dNTPs (10 mM儲液，dNTP混合物，羅氏(ROCHE) ); 5單位PWO聚合酶(250 單位儲液，羅氏)；1 pM 弓|物Fl 5'-GGAGACCACAACG
ATG-3'禾卩1 ]LiM 弓|物 R3MunEco 5'-GAATTCACTACCTCCG CCGCCACGCAGACGC AGC ACCAGATGC-3'。
PCR模式如下(30秒94。C; 60秒65°C; 40秒72°C) x 30。 .再次將PCR產物在1,5 %溴化乙錠-染色的瓊脂糖凝膠中分離。如上所 述，從所述凝膠中分離305bp處的目標DNA條帶並進行純化。
將100ng來自步驟2的PCR產物轉移到最終合成PCR中作為模板。 PRC的設置如上所述，利用各1 的引物
F1A5 '-C ATACGAAATTAATACG ACTC ACTATAGGGAGACC AC AACGGT TTCCC-3'禾卩R3MunEco。正向引物F1A在DNA片段上遊引入T7啟動子 序列。PCR模式是(30秒94。C;60秒60。C;40秒72。C)x30。
再次從製備級溴化乙錠-染色的1,5 %瓊脂糖凝膠中分離333bp處的 PCR產物。如已在上文所述，純化PCR產物，所述PCR產物類似於編碼 SPA10的DNA片段。
按下述生成核糖體展示間隔。質粒pIVEX2.3MCSRD包含核糖體展示 間隔的DNA序列。該序列沒有天然存在的同族序列。其在mRNA3'-末端 不包含任何為了停止翻譯核糖體的終止密碼子。315bp的間隔序列是5'-
GGAGGTAGTCAATTGGCTGGCTCTGGAGCTGGTGCAGGCTCTGGTGCTGGCGCAGGTTCT
GGCGCTGGTGCTGGTTCTGGCACTGGTGCTTCTCCGGCAGCTGTTCCGGCAGCGGTTCCA
GCAGCGGTGCCGGCAGCAGTTCCTGCTGCGGTGGGCGAAGGAGAAGGAGAAGGCGAGG
GAGAGGGCGAAGGATACCCGTACGACGTACCGGACTACGCCGAAGGTGGTGGTGGCTCC
GAGCAGAAGCTCATCTCCGAAGAAGACCTGGAGGGTGGTGGTGGCTCCACAGACTACAA
GGACGACGACGACAAATCC -3'。PCR設置包括處在lOOpl體積中的下列各項0，2mMdNTPs(10mM 儲液，dNTP混合物，羅氏(ROCHE) ); 5單位PWO聚合酶(250單位儲 液，羅氏)；5ng質粒DNA pIVEX2.3MCSRD。使用各1 pM的引物 forw.MunRD
5 '-GGCGGCGGAGGTAGTGAATTCGCTGGCTCTGGAGCTGGT-3' 和 RDRT
5 '匿GGATTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGGAGCCACCACC-3'。 正向引物forw.MunRD引入用於隨後的核糖體展示間隔與文庫DNA
片段的限制性連接步驟的Muni限制性位點。
PCR模式是(30秒94°C; 60秒50°C; 40秒72。C) x 30。
在製備級1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳進行完整PCR測定。由EtBr染色所
述凝膠，並從該凝膠中分離220bp。如已在上文所述地純化DNA。
利用限制性連接步驟將螺旋文庫與核糖體展示間隔相連接。在該合成
步驟中，將文庫DNA片段連接於核糖體展示間隔DNA片段，從而產生完
全功能的核糖體展示構建體。
該反應包含10單位(l pi) Muni (Cat.No. R0589S, NEB), 10單位(l EcoRI (Cat.No.: R0101S， NEB), 5 |il 10x緩衝液NEB4， 1,25 mM ATP溶液 (25 mM儲液，Fermentas)， 2,000單位(2.5 pi) T4 DNA連接酶(NEB濃度)1 pg提取的文庫片段和1 )ig展示間隔，各處在19pl溶液中。在室溫下過夜 培養後，在製備級瓊脂糖凝膠中電泳進行完整的測定。從該凝膠中分離 633bp處的反應產物，並利用Qiagen凝膠提取試劑盒，按照供應商的使用 說明進行提取。最後，利用Qiagen小洗脫試劑盒(Qiagen Mindute kit), 按照供應商的使用說明，將50pl洗出液濃縮5倍。
在鏈黴抗生物素蛋白和抗生物素蛋白-包被的MTP板中固定靶分子
用通用綴合緩衝液(Conjugate Buffer Universal)(羅氏)清洗一反應 體積(RV)的MTP孔三次。將0,1 生物素化的人TNFa溶解在100 pi 綴合緩衝液中，並填入預製的MTP的孔中。將生物素化的配體固定在鏈 黴抗生物素蛋白-(羅氏)或抗生物素蛋白-包被的(PIERCE) MT-板的孔中。 室溫下，在500rpm搖動下，將配體-溶液在MT-板中溫育30分鐘。其他MTP-孔僅用lOOnl省略所述配體的封閉試劑(處在綴合緩衝液中的5% BSA)包被。隨後，使用這些孔預溫育核糖體展示混合物10分鐘，從而 耗盡非特異性結合的三元複合物。所有孔用3RV封閉試劑清洗。在4。C 和200rpm下，在各孔中溫育300^1封閉試劑。在應用終止的翻譯-混合物 前，用3 RV的冰冷緩衝液WB (50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 50 mM乙酸鎂; 150mMNaCl; 33mMKCl;0,1 %吐溫20; 5 % BSA)清洗孔。將板保存在冰 上。在選擇周期過程中，所述板交替用於耗盡背景-結合的變體。
相對於人TNFa的具有SPA10文庫的核糖體展示
按照供應商的使用說明組合100^1 RTS 100大腸桿菌HY混合物(羅 氏)。向所述混合物增補40單位(l pl) RNAsin+ (溫度穩定的RNA酶抑制 齊廿，普洛麥格(Promega))和10 pl核糖體展示DNA模板。在30 。C， 550 rpm 搖動下，在乾淨的1.5ml反應管中進行轉錄和翻譯40分鐘中。
使用500pl冰冷緩衝液SB(50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 50 mM乙酸鎂; 150 mM NaCl; 33 mM KC1; O，l %吐溫20; 5 % BSA; 5嗎tRNA (大腸桿菌); 4mMGSSG;25 |iM氯黴素)，立即終止反應。在2。C，以> 10.000 g離心 該混合物IO分鐘。
將上清液轉移到新的冰冷的1.5ml反應管中。將250^1所述混合物轉 移到鏈黴抗生物素蛋白-包被的MTP的空預溫育-孔中，並在4°C， 300 rpm， 溫育10分鐘。然後將該混合物轉移到選擇孔中，其中固定了生物素化的 人TNFa。在4。C， 300rpm，培養該混合物30分鐘。
為了去除背景蛋白和弱結合三元複合物，用300jal冰冷緩衝液WB (50 mM Tris. pH 7，5 (4°C); 50 mM乙酸鎂；150 mM NaCl; 33 mM KC1; 0,1 % 吐溫20; 5 % BSA)清洗孔。用lOOpl冰冷緩衝液EB (50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 20 mM EDTA; 150 mM NaCl; 33 mM KC1; 0,1 %吐溫20; 5 % BSA)， 在4 °C和750 rpm進行洗脫10分鐘。
將100^1洗出液與350W來自Qiagen RNA Easy試劑盒的緩衝液RLT 混合。短暫渦旋該溶液。下列mRNA純化按照供應商的使用說明進行。 用50nl無RNA酶的水洗脫mRNA。洗出液再用於第二洗脫-步驟。
為了避免受到來自翻譯-步驟的DNA的汙染，利用Ambion無DNA試劑盒去除洗出液中剩餘的DNA-模板(DNA-消化)。向50W洗出液中增 補5.7 pi DNA酶I緩衝液和1.3 ^含有DNA酶的溶液。在37 °C溫育該 混合物30分鐘。加入6.5pl DNA酶I失活試劑。在消化-測定中，室溫下 溫育該懸浮液3分鐘，並隨後在11.000 g離心l分鐘。上清液用於反轉錄
為了mRNA的反轉錄，使用Transcriptor反轉錄酶(羅氏)。完整反應 體積是20|il : 12 |il mRNA洗出液；1 pM引物 RTRD 5 '隱GGATTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGGAGCCACCACC-3'; 4 Hi Transcriptor反應緩衝液5x, RNAsin+ 0.5 pi (20單位，普洛麥格 (Promega)) , 1 mM dNTP-混合物。小心離心沉澱該混合物。將反應管置於 65。C預-平衡的熱循環器中。在65。C5分鐘後，加入10單位(0.5|il)的 反轉錄酶。隨後將該混合物在65。C溫育45分鐘。
隨後，在100^1標準PWO-PCR中擴增cDNA，所述100jal標準 PWO-PCR包含12 轉錄混合物、5單位PWO DNA-聚合酶和引物RTRD 和F1。 PCR模式是:(30秒94。C,60秒65。C;40秒72。C)x25個循環。
將獲得的PCR產物在1，5 %瓊脂糖凝膠中電泳。利用Qiagen凝膠提取 試劑盒小洗脫試劑盒(Qiagen Gel Extraction Kit Minelute kit)，從溴化乙錠 -染色的凝膠中分離各個目標DNA-條帶。將PCR產物洗脫在lO)il EB緩 衝液(Qiagen)中。
在IOOW包含IOjlU洗出液、5單位PWO-DNA-聚合酶(熱起動)和引 物F1A和RDRT的PCR中再擴增PCR-產物。PCR模式(30秒94°C, 60 秒60 。C; 40秒72 。C) x 30個循環。在製備級1.5%瓊脂糖凝膠中電泳進行 完全PCR測定，並通過溴化乙錠染色。利用Qiagen凝膠提取試劑盒，按 照供應商的使用說明，分離目標-條帶。將PCR產物洗脫到50|iil EB緩衝 液中。該樣品用於接下來的核糖體展示循環。
核糖體展示程序重複6次。在第三、第四和第五展示循環中選擇的其 他實施方案中，除半胱氨酸外，將各2mM的所有必需的胺基酸分別增補 到RTS100HY系統。因此，在選擇過程中消除包含半胱氨酸的變體。在選 擇程序的其他實施方案中，利用鏈黴抗生物素蛋白-包被的磁珠，如在溶液 中選擇和如在溶液中競爭地進行選擇步驟。按下述製備所述珠20(il所述珠溶液(Invitrogen， M270 Dynabeads) 在300 plNaH2PO4緩衝液，pH8中清洗5次。然後，所述珠在300 )il緩衝 液WB中清洗5次，並在4°C保存在20 pi緩衝液WB中。
在第四展示循環中，進行在溶液中的選擇。將100ng生物素化的人 TNFa在終止的核糖體展示翻譯混合物中在4 °C溫育1小時。在第五循環 中，實行溶液中的競爭。100ng生物素化的人TNFa與lO嗎非-生物素化 的TNFa—起在終止的核糖體展示反應混合物中溫育。在這兩個循環中， 然後，將1(^1預製的珠溶液吸移到該混合物中，並在4 。C溫育30分鐘， 從而從該混合物中捕獲生物素化的TNFa以及重疊結合的三元複合物。隨 後的過程步驟保持不變。通過在緩衝液EB中培養所述珠，從三元複合物 中洗脫mRNA。
最後，將從第五輪選擇中獲得的DNA集合通過限制性位點Ndel和 Xhol亞克隆到載體pET20b(+)中。因此，在100|il包含5單位PWO DNA-聚合酶和引物 SPAF1 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAG ATATACATATGCAGATTTTTGTGAAAACCC-3'; 和 WubiFlagXhoIrv 5'-CCATTCCACCTCGAGACCTTTATCATCATCATCTTTGTAATCGCCGC CACGCAGACGCAGC-3'的PCR中擴增來自第五輪選擇的第一核糖體展 示PCR循環的100ng線性模板DNA。通過使用該引物-對，編碼泛蛋白變 體的的DNA序列在C-端融合於FLAG-表位和六組氨酸序列。PCR模式為 (30秒94°C， 60秒65 °C; 40秒72 。C) x 30個循環。利用Qiagen PCR純化 試劑盒，按照供應商的使用說明，純化PCR產物。將純化的PCR產物利 用酶Ndel和Xhol進行限制性雙消化。40^1消化反應包含500ng處在10pl 10mM Tris緩衝液pH 8中的PCR產物，12單位NdeI(普洛麥格(Promega)); 12單位Xho1 (普洛麥格)，4 緩衝液D (普洛麥格)，O，l mg/ml BSA。在 37。C溫育該混合物12小時。如上所述，通過製備級瓊脂糖凝膠純化消化 的DNA片段。
在60^1反應中，消化載體DNA pet20b(+)。將l|ig處在30pl 10mM Tris 緩衝液PH 8中的質粒-DNA吸移到6pl緩衝液D(普洛麥格)，0，1 mg/ml BSA: 各24單位的Ndel和Xhol (普洛麥格)中。在37°C培養該混合物12小時。 如上所述，通過製備級瓊脂糖凝膠純化消化的DNA片段。利用快速連接試劑盒(Rapid Ligation Kit)(羅氏)，按照供應商的使用說明，進行連接 反應。利用Qiagen反應清理試劑盒(Qiagen Reaction Cleanup kit),按照 供應商的使用說明，純化連接反應。將純化的連接產物轉化到大腸桿菌電 感受態細胞中(Novablue, Novagen)。
將轉化體塗布在包含100 pg/ml氨苄青黴素的選擇性Luria-Bertanii培 養基瓊脂-板(Q-Tray)上。在37°C培養該板12小時。將單菌落分離到5個 包含250pl含有60 pg/ml氨苄青黴素的Luria-Bertanii培養基的MTP中。 在37°C培養該MTP 12小時。用60|til預製的培養物接種包含60嗎/ml氨 苄青黴素的i.5mi Luria-Bertanii培養基。將剩餘的培養物體積保存在-20 。C。在37 。C和700rpm劇烈搖動培養2小時後，在30 。C，由0,1 mM IPTG 誘導重組蛋白質生產4小時。在Heraeus多離心機(Heraeus Multifbge)3 L-R 中，利用轉子75006445 (Heraeus)，以3600 x g，在4 。C，離心深孔群 (blocks)。去除上清液，並在室溫下利用300 nl NPI0緩衝液(50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 1 mg/ml T4溶菌酶，10 pl/ml Bugbuster (Novagen); 4 mM MgCl2; 0,8 mM PMSF; 20單位/ 10ml Benzonase (VWR))裂解細胞沉 澱。
再在Heraeus多離心機3 L-R中，在4。C，以3600 x g離心細胞碎片 15分鐘。將上清液轉移到乾淨的MTP中。
擊中-Elisa鑑定泛蛋白結合變體
Nunc Medisorb ELISA板用300 pl PBST緩衝液(PBS pH 7,4; 0,1 %吐溫 20)清洗3次。將TNFa以1 pg/ml稀釋在PBS緩衝液中。在板的偶數欄中 室溫溫育50 pl該溶液1小時。
將BSA以10pg/ml稀釋到PBS緩衝液中，並且是50 PBS。在奇數 欄中室溫溫育50 ^該溶液1小時。用300 ]id PBST緩衝液清洗板。孔中充 入300 ^1封閉緩衝液(PBSpH7,4;3。/。BSA;0,5。/。吐溫20)，並在室溫下培 養4小時。用300 pl PBST緩衝液清洗板3次。將60pl各種離心的上清液 樣品應用到一個偶數TNFa包被的孔中，和應用到相鄰的奇數BSA-包被 的孔中，並在室溫下溫育1小時。用300 pi PBST緩衝液清洗板3次。將 50 |il抗-FLAG-POD綴合物M2 (西格瑪(Sigma))加入到孔中(在PBSTpH 7.4中1:2000稀釋)，並在室溫下溫育1小時。用300 jal PBST緩衝液 清洗板3次。將50 |ul TMB底物溶液(KEM-EN-Tec)吸移到孔中並溫育15 分鐘。由50 ^ 0,2 M H2S04終止該反應。利用TECAN日出ELISA-讀數器 (TECAN Sunrise ELISA-Reader)對ELISA板讀數。利用620 nm作為參 照，在450nm處進行吸光度測量(圖9)。
表達的泛蛋白變體的顯現
通過PAGE電泳分離10pl大腸桿菌上清液。對丙烯醯胺凝膠進行考馬 斯-染色，從而分析所述變體的可溶性蛋白質部分。
選擇在考馬斯-染色的凝膠中作為可溶性級分出現並在擊中-ELISA中 顯示出靶分子結合活性的克隆，以用於DNA測序過程。
生產和純化結合TNFa的泛蛋白變體2E11
為了詳細研究選擇的突變體的結合特性，純化泛蛋白變體2E11 (圖 10)。用質粒pET20b十/22E11轉化NovaBlue(Novagen)大腸桿菌細胞。所 述克隆通過用LB培養基/100昭/ml氨苄青黴素1:100稀釋預培養物和以 200 rpm搖動和37°C培養直到OD,達到0.5。通過加入IPTG (終濃度 1 mM)誘導表達。以30°C和200 rpm繼續培養過夜。通過以4 °C， 6 000 x g 離心20分鐘收穫細菌細胞。將細胞沉澱混懸在30ml包括DNA酶和10 mg/ml溶菌酶的NPI-20緩衝液中。在所有緩衝液系統中，用5 mM CHAPS 純化變體2E11。利用處於800-1000 PSIG的Gaulin壓碎器破碎細胞兩次。 以4°C和40000 x g離心細胞混懸液30分鐘後，獲得包含可溶性蛋白質的 上清液。
用5 CV的NPI-20平衡一個Ni-NTA-瓊脂糖(5 ml, GE衛生保健(GE Healthcare))柱。將包含可溶性蛋白的上清液應用於該柱，隨後用5 CV NPI-20洗滌。以20CV中達50 % NPI-500的線性梯度洗脫結合的蛋白。 級分分別以2ml洗脫，並通過SDS-PAGE針對其純度進行分析。匯集包含 目標蛋白的級分，並以流速lml/分鐘應用於用PBS(pH 7.4)平衡的凝膠過 濾柱(Superdex 75， 1.6 x 60, GE衛生保健(GE Healthcare))(圖11)。純化 的蛋白用於結合實驗。
36ELISA確定特異性結合
突變體2E11對人TNFa的特異性結合通過濃度依賴性ELISA測定。 將增加量的純化Affilin 2E11應用到用作為對照的BSA包被的 NUNC-medisorp板。使用50 (1 pg/ml)/孔在4°C進行抗原包被過夜。用 PBS， 0.1 %吐溫20 pH 7.4 (PBST)洗滌該板後，利用封閉溶液(PBS pH 7,4; 3 WBSA;0,5。/。吐溫20)在37。C封閉所述孔2小時。再用PBST洗滌孔。然 後，在所述孔中在37。C溫育50 pl不同濃度的2E11 l小時。用PBST洗 滌孔後，應用以1:2000稀釋在PBST中的抗-FLAG POD綴合物(西格瑪 (Sigma))。如在擊中-ELISA章節中所述地，進行底物反應和信號讀取。 圖12顯示變體2E11與人TNFa以400nM的表觀KD值特異性結合。
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權利要求
1.用於生成蛋白的方法，所述蛋白選自由「泛蛋白-樣蛋白」蛋白超家族的蛋白、及其各具有泛蛋白-樣摺疊基序的片段或融合蛋白組成的組，其中所述蛋白由於對在α螺旋區中的一個或多個胺基酸的修飾而顯示出關於試劑的提高的結合親和性，所述結合親和性在未修飾的蛋白質中不存在或不以該程度存在，所述方法具有下列步驟a)選擇「泛蛋白-樣蛋白」超家族的未修飾蛋白；b)提供所述未修飾蛋白對其具有低的或不具有結合親和性的試劑；c)選擇在包括α螺旋區的蛋白質表面-暴露區中的胺基酸；d)優選地通過取代、插入、缺失和/或化學修飾而修飾所選擇的胺基酸，其中所述α螺旋或相鄰區域中的至少4個表面-暴露的胺基酸被修飾；e)使所述修飾的蛋白與步驟b)中提供的試劑相接觸；f)檢測和分離關於步驟b)中提供的試劑具有新或增高的結合親和性的蛋白，和任選地進行下述步驟g)在合適的原核、真核或體外表達系統中或通過化學合成生成所述修飾的蛋白；h)在生成後通過合適的純化方法分離所述蛋白；和進一步任選地i)通過重複步驟d-h)進行所述修飾的蛋白的熟化。
2. 按照權利要求l的方法，其中步驟d)通過化學合成所述修飾的蛋 白而進行。
3. 按照權利要求l的方法，其中步驟d)中的修飾是通過遺傳工程從 而改變屬於相應的修飾蛋白的DNA進行的。
4. 按照權利要求l的方法，其中在步驟d)中構建基因文庫。
5. 按照權利要求l的方法，其中在步驟d)中通過隨機誘變進行所選 擇的胺基酸的隨機取代。
6. 按照權利要求l的方法，其中在步驟e)中，與所述試劑的所述接 觸通過合適的選擇方法，優選地，噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、 CIS展示或細胞表面展示方法、酵母表面展示、細菌表面展示，特別優選通過噬菌體展示方法進行。
7. 按照權利要求1的方法，其中在步驟f)中，針對所述試劑具有結 合親和性的蛋白的檢測通過下列方法中的一種或多種進行ELISA、胞質 基因表面共振光譜法、螢光光譜法、FACS、等溫滴定熱量測定或分析式 超速離心法。
8. 按照權利要求l的方法，其中利用本身已知的方法，針對其結合親 和性、其結合特異性和/或其他蛋白質化學特性諸如穩定性、溶解性、或產 量熟化所述蛋白質。
9. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白以位點-特 異性或隨機方式與至少一種相同或不同特異性的蛋白共價連接，由此獲得 二價、多價或雙特異性蛋白。
10. 按照權利要求1-9中一項或多項的方法，其中選擇用於修飾的蛋 白與人泛蛋白具有至少30%的胺基酸序列同一性，且具有泛蛋白-樣摺疊 基序，和/或屬於"泛蛋白-相關蛋白"蛋白家族。
11. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中選擇用於修飾的蛋 白具有泛蛋白-樣摺疊基序並優選選自由下列各項組成的的組SUMO-l、 FAU、 NEDD-8、 UBL-1、 Rubl、 APG8、 ISG15、 URM1、 HUB1、 GDX、 伸蛋白B、 PLIC2 (N-端結構域)，人帕金蛋白(N-端結構域)。
12. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白是人泛蛋 白或其他哺乳動物泛蛋白。
13. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述修飾包括5-10 個胺基酸，優選6-8個胺基酸的相鄰區域，其中優選地，其2-4個胺基酸 位於所述a螺旋的表面-暴露區。
14. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述a螺旋的氨基 酸被修飾，且任選另外地，在位於所述a螺旋外的螺旋上遊位置或螺旋下 遊位置中的胺基酸被修飾。
15. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中哺乳動物泛蛋白ct 螺旋胺基酸22-32被修飾，且任選另外地，在位於所述a螺旋外的區域16-21(螺旋上遊位置)或38-55 (螺旋下遊位置)的胺基酸被修飾。
16. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述修飾是至少部分在一級序列中直接相鄰或不直接相鄰的胺基酸處的取代、插入、缺失、 化學修飾或其組合，優選地是取代，其中優選地，所述在一級序列中彼此 不相鄰的修飾的胺基酸在二級結構中形成針對所述試劑的優選鄰接結合 區。
17. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中在所述一級序列中 彼此直接相鄰的胺基酸的修飾、優選取代的數目是2-8個直接相鄰的胺基酸，此外，優選地，3-7或4-6或2-4個直接相鄰胺基酸。
18. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述一級序列中彼 此直接相鄰的修飾的胺基酸的部分是在所述a螺旋區的起始或終止區，其 中該部分具有2個或更多個胺基酸，優選2或3個胺基酸的長度。
19. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中在所述蛋白中，所 述一級序列中彼此直接相鄰的5個或更多個胺基酸被修飾，優選被取代， 其中1、 2個或更多個，優選2或3個直接相鄰的胺基酸形成a螺旋鏈區 的起始或終止。
20. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中，任選地，不屬於 這樣的區域的那些位置的胺基酸被修飾，所述區域在按照權利要求1的未 修飾蛋白中參與與泛蛋白天然結合配偶體的結合。
21. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中在所述蛋白質，優 選泛蛋白的01螺旋區中存在的至少25%的胺基酸被修飾。
22. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述未修飾的蛋白 是人泛蛋白或其同源蛋白，且其中泛蛋白的至少8個表面-暴露的胺基酸被 修飾，優選被取代，以使這些修飾的胺基酸包括具有針對所述試劑的結合 親和性的區域。
23. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述修飾的蛋白是 在位置16, 18, 20, 21， 22, 24， 25, 28, 29, 31, 32, 33, 38, 39, 52, 53， 54,和/或 55中的至少4處或更多處被取代、缺失、插入和/或化學修飾，優選被取 代的人泛蛋白。
24. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述試劑是抗原或 半抗原。
25. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述修飾的蛋白與所述試劑的結合親和性，以KD表示，為10—5M-10—12M,此外優選地10'6 一 10-12M或10-9- 10-12M。
26. 按照以上權利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白以位點-特 異性或隨機樣方式與至少一種相同或不同特異性的蛋白共價連接，並由此 分別顯示出二價或多價或雙特異性結合特性。
27. 通過以上權利要求中一項或多項的方法獲得的蛋白質。
28. 編碼權利要求27的蛋白質的核酸。
29. 按照權利要求27的蛋白質用於特異性識別、結合和中和前述靶分 子以用於檢測、用於定量測定、用於通過本身已知的方法諸如層析法或吸 附技術分開和/或分離相應結合配偶體的用途。
30. 按照權利要求27的蛋白質用於診斷、預防和治療其中直接或間接涉及所述相應的結合配偶體的疾病的用途。
31. 按照權利要求27的蛋白質用於熟化方法以通過遺傳工程、化學修 飾或其組合提高所述親和性、穩定性、溶解性或特異性的用途。
32. 權利要求31的用途，通過所述用途，所述親和性、穩定性、溶解 性或特異性通過隨機誘變(例如傾向差錯PCR)，通過位點定向的重新隨 機化預先選擇的結合盒中的位置，通過靶向的單胺基酸取代或通過化學修 飾得到提高。
全文摘要
本發明涉及用於生成源自泛蛋白樣蛋白的蛋白超家族、在其α螺旋區具有修飾的結合蛋白的方法，以及通過所述方法可以獲得的蛋白。此外，本發明提供蛋白用於特異性識別、結合和中和前述靶分子，用於檢測、定量測定、分開和/或用於分離相應的結合配偶體的用途，和本發明蛋白用於診斷、預防和治療所述相應的結合配偶體直接或間接參與其中的疾病的用途。
文檔編號C07K14/47GK101563456SQ200780047132
公開日2009年10月21日 申請日期2007年11月15日 優先權日2006年11月15日
發明者埃裡克·菲德勒, 麥可·施雷爾姆 申請人:希爾蛋白質有限公司