含有hgf基因的藥物的製作方法

2023-07-04 07:20:31

專利名稱：含有hgf基因的藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於基因治療等的藥物。本發明尤其涉及含有肝細胞生長因子(HGF)基因的藥物以及含有HGF基因的脂質體。
HGF是一種具有多種藥理活性的生理活性肽。HGF的藥理學活性如JIKKEN-IGAKU(實驗醫學(Experimental Medicine))，第10卷，第3號(增刊)，330-339(1992)中所述。考慮到其藥理活性，HGF可望成為治療肝硬變或腎臟疾病的藥物；上皮細胞生長促進劑；抗癌劑；防止癌症治療中副作用的藥物；治療肺損害、胃腸道疾病或顱內神經紊亂的藥物；用於預防免疫抑制中副作用的藥物；膠原蛋白降解促進劑；治療軟骨疾病、動脈疾病、肺纖維變性、肝病、血液凝集疾病、血漿低蛋白疾病或損傷；改善神經紊亂的藥物；造血幹細胞增強劑；以及頭發生長促進劑(日本專利公開4-18028和4-49246，EP 492614，日本專利公開6-25010，WO 93/8821，日本專利公開6-172207、7-89869和6-409934，WO 94/2165，日本專利公開6-40935、6-56692和7-41429，WO 93/3061，日本專利公開5-213721，等)。
已在全世界廣泛研究和調查了腺苷脫氨酶缺陷、愛滋病、癌症、膿皰性纖維化和血友病等的基因治療。
但使用HGF基因的基因治療尚屬未知。這樣的基因治療是否能有效應用也不清楚。
HGF是已知的一種在血液中具有較短半衰期的藥物。因此，對HGF要求持續局部給藥。
考慮到HGF的多種藥理活性，HGF可期望發展成為一種能夠治療多種疾病的藥物。另一方面，當HGF全身給藥時，可能會因為多種藥理活性而引起副作用。另外，HGF本身靜脈給藥時，HGF有一缺點即大量HGF保留在肝中，減少到達靶器官的HGF的劑量。
本發明能夠解決上述難題。簡單地說，本發明涉及(1)含有HGF基因的藥物；(2)含有HGF基因的脂質體；(3)含有根據(2)的脂質體，即融合了副流感病毒的膜融合脂質體；(4)根據(2)或(3)的脂質體的藥物；(5)按照(1)或(4)的藥物，用於治療動脈疾病；(6)按照(1)或(4)的藥物，用於治療軟骨損傷。


圖1表明實驗實施例1中由日本血細胞凝集病毒(HVJ)-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞中HGF的表達。
圖2表明實驗實施例2中從HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞表達的HGF存在和缺失狀態下的細胞增長率。這裡「DSF」指一組由HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞，而「HGF」指一組在預定濃度的人類重組HGF存在下培養的細胞。圖2中的條帶表示實驗實施例2中HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞的細胞增長率，這裡「DSF」為一組由HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞，「HGF載體」為一組HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞。
圖3表示實驗實施例2中抗HGF抗體存在或缺失時HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞增長率，「對照」代表一組於IgG對照物中培養的HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞；「HGF」代表一組於IgG對照物中培養的HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞；「HGFab」代表了一組於兔抗人類HGF抗體中培養的HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞。細胞增長率(％)表達為當對照組增長率為100％時的相對百分比。
圖4表示實驗實施例3中從HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠血管平滑肌細胞(以下簡寫為VSMC)的培養物上清液對大鼠冠狀內皮細胞的細胞增長作用。「對照」代表加有由HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液的一組；「HGF」代表加有由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液的一組。
圖5表示實驗實施例3中由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液中HGF濃度通過抗人類HGF抗體測定的結果。圖中，「未處理」代表一組未致敏VSMC培養物上清液，「對照」代表由HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液，「HGF」代表由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液。
圖6表示實驗實施例3中由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液中HGF濃度通過抗鼠HGF抗體測定的結果。圖中，「未處理」代表一組未致敏VSMC培養物上清液，「對照」代表由HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液，「HGF」代表由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液。
圖7表示實驗實施例4中HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠冠狀內皮細胞培養物上清液對大鼠冠狀內皮細胞的細胞增長作用。其中，A、B、C分別代表加HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組、加HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組及未處理的動物。
圖8表示實驗實施例4中HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞在抗HGF抗體存在時對大鼠冠狀內皮細胞的細胞增長作用。圖中，A代表加有HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組，B代表加有HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組，C代表加入抗HGF抗體至由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組，D則代表加入對照抗體至由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的一組。
圖9表明實驗實施例5中當HVJ-脂質體-DNA致敏的人類VSMC和非致敏的人類內皮細胞共同培養時內皮細胞的增長率。圖中，「對照」代表與HVJ-脂質體-對照致敏的VSMC共同培養的一組，「HGF」代表加HVJ-脂質體-DNA致敏的VSMC培養物上清液的一組。
圖10表示實驗實施例6中當HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC和非致敏的鼠冠狀內皮細胞共同培養時內皮細胞的增長率。圖中，「對照」代表與HVJ-脂質體-對照致敏的VSMC共同培養的組，「HGF」代表了HVJ-脂質體-DNA致敏的VSMC培養物上清液的組。
圖11表明實驗實施例8中在鼠心肌直接注射HVJ-脂質體-DNA時小血管數量的增加。「HGF」代表鼠心肌直接注射HVJ-脂質體-DNA時小血管的數量，「對照」代表鼠心肌直接注射HVJ-脂質體-對照時小血管的數量。
圖12表明實驗實施例9中注射HVJ-脂質體-DNA至關節三周後軟骨樣細胞的發育，可觀察到甲苯胺藍染色的蛋白聚糖的合成。
圖13表明實驗實施例9中注射HVJ-脂質體-DNA至關節四周後軟骨樣細胞的發育，可觀察到甲苯胺藍染色的蛋白聚糖的合成。
圖14表明實驗實施例9中注射比較實施例2中製備的HVJ-脂質體-DNA(TGF-β)至關節四周後，在觀察甲苯胺藍染色的蛋白聚糖的合成時未發現軟骨樣細胞的發育。
圖15表明實驗實施例9中注射比較實施例1中製備的HVJ-脂質體-對照至關節四周後，在觀察甲苯胺藍染色的蛋白聚糖的合成葉未發現軟骨樣細胞的發育。
用於本發明的「HGF基因」是一種能表達HGF的基因。因此，只要表達的多肽具有與HGF基本同樣的作用，HGF基因可以有核酸序列的部分缺失、替代或插入，或者會有其他的核酸序列連接在其5』末端和/或3』末端上。這樣的HGF基因的典型實施例包括HGF基因如自然(Nature)，342，440(1989)、日本專利公開5-111383，生物化學和生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，163，967(1989)等所述的HGF基因。這些基因可用於本發明中。
將HGF基因導入一合適的載體，提供含HGF基因的載體供使用。例如，HGF基因可以如下文所述的含有HGF基因的病毒載體的形式或以含有HGF基因的合適的表達載體的形式使用。
用於本發明的「藥物組合物」指用於治療或預防人類疾病的藥物，這是基於HGF的藥理學活性。例如，用於治療或預防上文所示疾病的藥物。
按本發明所述，將HGF基因導入細胞，HGF在這些細胞表達後表現出藥理學活性。因此，本發明的藥物可有效地用於HGF本身有效的疾病的治療。
當HGF基因被導入(例如)細胞中，可促進血管內皮細胞的生長，但不促進不必要的血管平滑肌細胞生長，這一點在下文實施例中已得到證實。另外，如下文實施例中所證實的那樣，當HGF基因導入體內試驗用大鼠的心臟時，可觀察到血管生成。所以，HGF基因可有效地用於動脈疾病的治療和預防，特別是主要由血管平滑肌細胞非正常增殖紊亂引起的各種疾病(如，經皮透照冠狀血管成形術(PTCA)後的再狹窄，動脈硬化，外周循環機能不全，等)，可用於治療和預防諸如心肌梗塞、心肌病、外周血管狹窄、心肌機能不全，等。HGF本身也可用於治療或預防上述疾病，因為HGF能促進血管內皮細胞增殖但不促進血管平滑肌細胞的生長。HGF基因的藥理學效應都可歸於HGF本身的特點。
如下文實施例中闡明的那樣，HGF基因導入關節會促進關節軟骨細胞的修補，從而促進蛋白聚糖合成細胞的增殖。所以，HGF基因可有效地用於治療和預防各種軟骨損傷，如骨生成異常、關節變形、椎間盤變形、骨折修補和復位不全、由運動引起的創傷、key puncher’s疾病等。HGF本身可用於治療和預防上述疾病，因為HGF可促進軟骨細胞的修補和生長。HGF基因的作用正是基於HGF本身的特點。
「脂質體」是包被液體腔室於其中的脂質雙層密閉顆粒。已知脂質雙層結構和生物膜極其相似。為了製備本發明中的脂質體，使用了磷脂。磷脂的典型例子有磷脂醯膽鹼如卵磷脂、溶血卵磷脂等；酸性磷脂如磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂酸等；或將這些酸性磷脂中的醯基用月桂醯、肉豆寇醯、油醯等取代獲得的磷脂；以及神經鞘磷脂如磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂等。中性脂類如膽固醇也可加入到這些磷脂中。按照常規方法從天然物質如正常細胞膜中的脂類來製備脂質體。含有本發明HGF基因的脂質體的製備，如可通過將純化的磷脂薄層懸浮於含有HGF基因的溶液中，按照常規方法如超聲處理該懸浮液即可。
含有本發明HGF基因的脂質體可與病毒等融合形成膜融合脂質體。此時，優選通過紫外照射等使病毒失活。膜融合脂質體的特別優選的例子是與副流感病毒(日本的血細胞凝集病毒，HVJ)融合的膜融合脂質體。膜融合脂質體可通過下列方法製備，即NIKKEI Science，1994年4月，32-38頁；生物化學雜誌(J Biol.Chem.)，266(6)，3361-3364(1991)等所述。更詳細地講，HVJ-融合的脂質體(HVJ-脂質體)的製備通過將已經紫外照射等失活的純化的HVJ和含有HGF基因載體的脂質體懸浮液混合，輕輕攪動混合物，然後通過蔗糖密度梯度離心除去未結合的HVJ。脂質體可以和具有靶細胞親和性的物質結合，從而加強基因導入靶細胞的效率。具有靶細胞親和性的物質包括配體如抗體、受體等。
對於HGF基因導入細胞，可使用常規方法，可大致分類為通過病毒載體的和其它種類(NIKKEI Science，1994年4月，20-45頁；GEKKANYAKUJI，36(1)，23-48(1994)及其中所列文獻)。兩種方法都可用於本發明藥物的製備。
使用病毒載體的方法由下列步驟組成，將HGF基因導入例如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、新培斯病毒或其它RNA病毒。這些病毒中，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒優選用於基因引入。
其他方法的例子包括脂質體法、脂轉染法、微注射法、磷酸鈣方法、電穿孔法。這些方法中，優選使用脂質體法。
HGF基因作為藥物的實際應用中，將HGF直接導入機體(體內方法)是非常有利的方法。另外，從人類中收集某種細胞，將HGF基因導入體外細胞，再將導入HGF基因的細胞重新導入人體(離體方法)。這些方法在下列文獻中有所描述NIKKEI Science，1994年4月，20-45頁；GEKKAN YAKUJI，36(1)，23-48(1994)和其中所引的參考文獻。可依據待治療的疾病、靶器官等適當地選擇這些方法，並應用本發明的藥物組合物。
體內方法花費較少，較簡單，因此比離體方法更為方便，但後者提供了將HGF基因導入細胞的高效性。
當本發明藥物採用體內方法給藥時，藥物可根據待治療的疾病、靶器官等通過任何合適的途徑給藥。藥物可通過靜脈、動脈、皮下、肌肉等給藥或直接給藥至疾病的靶器官，如腎、肝、肺、腦、神經等。直接給藥至靶點可以有選擇地治療靶器官。例如，使用基因治療PTCA後的再狹窄時，可採用動脈注射方法(JIKKEN-IGAKU，12(號外15)，1298-1933(1994))。優選將本發明藥物置於PTCA氣囊的頂端，然後用該頂端摩擦血管，這樣藥物可直接導入血管內皮細胞和血管平滑肌細胞。
上面描述的離體方法可用於HGF基因的導入，人類細胞(如淋巴細胞或造血幹細胞)用常規方法收集後再用本發明藥物致敏以導入基因。然後將HGF生產細胞返回人體。
當用體內方法施用藥物時，該藥物可採用多種製劑方式，包括液體製劑形式。一般而言，藥物優選製成一含有HGF基因作為活性組份的注射液。如果必要，常規載體可加入到藥物組合物中。可通過常規方法製備注射液，如將HGF基因溶解在適當的溶劑裡(如無菌水，緩衝溶液，生理鹽水等)，通過濾器過濾等方法進行滅菌，將溶液裝入滅菌容器中。該藥物的製備中可用含HGF基因的病毒載體代替HGF基因本身。當使用含有包埋HGF基因(或HVJ-脂質體)的脂質體時，藥物可以是脂質體製劑的形式，如懸浮液、冷凍製劑、離心濃縮冷凍製劑等。
藥物中HGF基因的含量可隨待治療疾病、靶器官、病人的年齡和體重等的變化而改變。然而，在以HGF基因計算時，適宜劑量為0.0001mg到100mg，優選0.001mg到10mg。該劑量可分為幾天或幾個月服用。實施例下面本發明將參照實施例更詳細地描述。下列實施例中使用的材料和方法如下。材料和方法(1)HGF表達載體HGF表達載體通過插入人類HGF cDNA(2.2kb，生物化學生物物理學研究通訊，172，321-327(1990)；日本專利公開5-111383)於pUC-SRα表達載體(FEBS，333，61-66(1993))的EcoRI和NotI位點間而製得。在該質粒載體上，HGF cDNA的轉錄由SRα啟動子調控(自然，342，440-443(1989))。(2)細胞培養從8周齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠的酶消化心臟中通過密度梯度離心分離大鼠冠狀內皮細胞(移植(Transplantation)，57，1653-1660(1994))。大鼠主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)從12周的SD鼠中酶處理後得到(臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，93，355-360(1994))。將這些細胞置於加有10％(v/v)胎牛血清、青黴素(100U/ml)和鏈黴素(100μg/ml)的DMEM培養基中。於37℃95％溼潤空氣-5％CO2中培養。每隔2天更換一次培養基。免疫病理學和形態學觀察揭示了這些細胞分別為內皮細胞和平滑肌細胞。
人類主動脈內皮細胞(5代)和人類VSMC(5代)從Kurabo公司得到。這些內皮細胞類似於上述方法在補有5％胎牛血清、表皮生長因子(10ng/ml)、鹼性成纖細胞生長因子(2ng/ml)和地塞米松(1μM)的MCDB131培養基中培養。
固定相中內皮細胞的製備按照《臨床研究雜誌》，86，1690-1697(1990)，同上，94，824-829(1994)中所述方法。(3)體外HGF基因轉染HVJ-脂質體將用於致敏的內皮細胞或VSMC置於一6孔板上，細胞數量為106，增殖後達到80％匯合。細胞用一補加有2mM氯化鈣的平衡鹽溶液(137mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.6；以下簡寫為BSS)洗滌3次。向細胞中加入1ml下面實施例1中獲得的HVJ-脂質體-DNA溶液(含有2.5mg脂類和10mg包埋的DNA)或下面比較實施例1中獲得的1ml HVJ-脂質體-對照溶液。該混合物於4℃培養5分鐘和37℃培養30分鐘。洗滌細胞並在CO2孵箱中保持在含有10％牛血清的培養基中。(4)內皮細胞和VSMC中HGF濃度的測定由致敏內皮細胞和VSMC產生的HGF濃度可用ELISA測定。即將鼠或人類內皮細胞和VSMC接種在一6孔板(Corning製造)上，細胞密度為5×104細胞/cm2，然後培養24小時。致敏後再裝滿培養基24小時，繼續培養48小時。為了知道HGF是否已釋放，將致敏細胞(致敏後48小時)洗滌，並加入到1ml的含有5×10-7M胰島素、5μg/ml轉鐵蛋白和0.2mM抗壞血酸鹽的無血清培養基中。24小時後，收集培養液，於600g離心10分鐘，於-20℃保存。
培養基中HGF濃度通過使用抗鼠HGF抗體或抗人類HGF抗體酶免疫測定法測定(實驗細胞研究(Exp.Cell Res.)，210，326-335(1994)；日本癌症研究雜誌(Jpn.J.Cancer Res.)，83，1262-1266(1992))。兔抗鼠或抗人類HGF IgG於4℃塗於96孔板(Corning製造)上15小時。加入含有3％牛血清白蛋白的PBS(磷酸緩衝鹽水)封閉後，於25℃培養2小時。用含有0.025％吐溫的PBS(PBS-Tween)洗滌每個孔3次，向每個孔中加入生物素化的兔抗鼠HGF IgG或抗人類HGF IgG，然後於25℃培養2小時。用PBS-Tween洗滌後，每個孔與辣根過氧化物酶結合的鏈黴抗生物素-生物素複合物(PBS-Tween溶液)一起保溫。酶反應通過加入底物溶液(含有2.5mM鄰苯二胺、100mM磷酸鈉、50mM檸檬酸和0.015％過氧化氫)開始。酶反應通過加入1M硫酸至系統中而終止。於490nm處測定吸光度。抗人類HGF抗體僅與人類HGF而不與鼠HGF發生交叉反應。抗鼠HGF抗體僅與鼠HGF而不於人類HGF發生交叉反應。(5)HGF使用的人類和鼠重組HGF可通過從攜帶人類或鼠HGF cDNA的表達質粒轉染的CHO細胞或C-127細胞培養液中純化得到(細胞，77，261-271(1994)；臨床研究雜誌，93，355-360(1994))。(6)統計學分析所有操作至少重複3次。測定的數據表達為平均值±標準差，測定數據的統計學分析按照Duncan’s檢驗方法進行。(7)蘇木素-曙紅(HE)染色和Azan染色導入基因10天後，通過灌注肝素化生理鹽水殺死導入HGF基因的大鼠。用4％低聚甲醛PBS溶液固定過夜。固定後，用石蠟包埋該組織。製成玻片並按常規方法用HE和Azan染色。在顯微鏡下檢查玻片並對小血管計數。實施例1含有HGF表達載體的HVJ-脂質體的製備磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼和膽固醇於四氫呋喃中以重量比1∶4.8∶2混合。通過旋轉蒸發器蒸去四氫呋喃後，脂類混合物(10mg)沉澱在容器壁上。小牛胸腺中提純的96μg高遷移率小型非組蛋白(HMG)1核蛋白與質粒DNA(300μg)的BBS(200μl)溶液於20℃混合1小時後，將混合物加入上述脂類混合物中。該脂質體-DNA-HMG1複合物懸浮液在渦旋器中混合，超聲處理3秒鐘後攪動30分鐘。
使用前將純化了的HVJ(Z菌株)用UV射線(110erg/mm2sec)照射3分鐘使之失活。加入BBS，混合上述獲得的懸液(0.5ml，含10mg脂類)和HVJ(20,000血細胞凝集單位)並使總體積達到4ml。於4℃保溫該混合物10分鐘後，再於37℃輕輕攪動30分鐘。採用蔗糖密度梯度離心法從HVJ-脂質體中除去未反應的HVJ，收集蔗糖密度梯度的上層液，得到含HGF表達載體的HVJ-脂質體(含10μg/ml的HGF表達載體)。含HGF表達載體的HVJ-脂質體在下面通常作為HVJ-脂質體-DNA被提及。實施例2含有HGF表達載體的HVJ-脂質體用於大鼠含有HGF表達載體的HVJ-脂質體通過上述實施例中的方法製備，使用64μg的HMG1核蛋白和200μg的質粒DNA。加入BBS並與脂質體懸浮液(0.5ml，含10mg脂類)及HVJ(35,000血細胞凝集單位)混合使總體積達到2ml。
將SD大鼠(體重400-500g；購於日本Charles River)經內腹膜內注射戊巴比妥鈉(0.1mg/100mg)麻醉後，保暖並通過自動呼吸機保持呼吸。將大鼠於左邊切開胸廓。用30G注射器仔細注射HVJ-脂質體-DNA或HVJ-脂質體-對照(20ml)直接進入心臟頂部。比較實施例1不含HGF表達載體的HVJ-脂質體的製備用實施例1中同樣方法處理無HGF基因的載體來製備不含HGF表達載體的HVJ-脂質體。無HGF表達載體的HVJ-脂質體下面稱為HVJ-脂質體-對照。比較實施例2含有人類TGF-β表達載體的HVJ-脂質體的製備含有人類TGF-β表達載體的HVJ-脂質體的製備類似於實施例1，但使用人類TGF-β表達載體。
含有人類TGF-β表達載體的HVJ-脂質體下面稱為HVJ-脂質體-DNA(TGF-β)。實驗實施例1HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞中HGF的表達HVJ-脂質體-DNA(脂質體中HGF表達載體的濃度10μg/ml)致敏鼠冠狀內皮細胞(細胞數量106)。用ELISA測定HGF的產量。用HVJ-脂質體-對照進行相似實驗作為對照。還在未致敏的鼠冠狀內皮細胞(未處理組)中測定了HGF產量。結果示於圖1(n＝6)，其中「HGF」代表了由HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞組。
如圖1中所示，HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞高水平產生和分泌HGF。另一方面，無論在未處理組或HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞組中均未觀察到HGF得的產生。
試驗組中細胞計數表明HGF表達組表現細胞數量明顯增加。實驗實施例2致敏的HGF表達載體對內皮細胞增殖的影響人類內皮細胞用HVJ-脂質體-對照致敏。在外源重組人類HGF(1，10和100ng/ml)存在或缺失狀態下培養致敏細胞，測定細胞增長率(％)。結果示於圖2(線圖，n＝6)，其中「DSF」代表HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞組，「HGF」代表有固定濃度重組人類HGF存在的細胞組(*P＜0.05，**P＜0.01(DSF))。
圖2的(線)圖表明內皮細胞的生長可由外源性加入的HGF促進。
HVJ-脂質體-DNA(濃度10μg/ml)致敏的內皮細胞用類似方法培養後，對增加的細胞計數以測定細胞增長率(％)。以HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞作為對照，同樣方法計數增加的細胞測定細胞增長率(％)。結果示於圖2(條帶n＝6)，其中「DSF」代表HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞組，「HGF」代表HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞組(DSF，**P＜0.01，100ng/ml HGF，#P＜0.05)。
如圖2中條帶所示，結果表明HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞的細胞增長率明顯高於對照組，甚至明顯高於外源加入HGF的對照組。
將上述HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞在兔抗人類HGF抗體存在或缺失時培養。對增加的細胞計數測定細胞增長率。培養HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞作為對照，同樣方法對增加的細胞計數測定細胞增長率。通過日本癌症研究雜誌，83，1262-1266(1992)所述方法純化兔抗人類HGF抗體(10μg/ml)。該抗體能夠以10μg/ml的濃度中和10ng/ml的生物活性。抗人類HGF抗體僅與人類HGF交叉反應但不與鼠HGF交叉反應，而抗鼠HGF抗體則僅與鼠HGF反應而不與人類HGF發生反應。以正常的兔血清IgG(10μg/ml)作為對照。
結果見圖3(n＝6)，「對照」代表在IgG對照物存在時培養的HVJ-脂質體-對照致敏的內皮細胞；「HGF」代表在IgG對照物存在時培養的HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞；「HGFab」代表兔抗人類HGF抗體存在時培養的HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞。細胞增長率(％)表達為當對照組增長率為100時的相對％(對照組*P＜0.01，HGF#P＜0.05)。如圖3所示，HVJ-脂質體-DNA致敏的內皮細胞生長在抗人類HGF抗體存在時受到抑制，細胞增長率基本上與對照組完全相同。這些結果清楚表明了HGF是內皮細胞生長因子。實驗實施例3HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液對鼠冠狀內皮細胞的影響將HVJ-脂質體-DNA-致敏鼠VSMC培養物上清液加入固定相中的鼠冠狀內皮細胞培養體系(細胞數量105)中。培養3天後，檢查增加的內皮細胞數量。用上述類似方法處理HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液作為對照，同樣檢查增加的內皮細胞數量。結果示於圖4(n＝6)，其中「對照」代表加HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液的組；「HGF」代表加HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液的組。
如圖4所示，在加HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液的組中內皮細胞數量明顯增加。
HVJ-脂質體-DNA或HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液中HGF的濃度如上所述用抗人類HGF抗體和抗鼠HGF抗體的ELISA法加以測定。未致敏VSMC培養物上清液中HGF濃度以同樣方法測定(未處理組)。
使用抗人類HGF抗體和抗鼠HGF抗體獲得的結果分別如圖5和圖6所示(這兩個實驗中n＝6)。圖中，「對照」代表HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC培養物上清液組；「HGF」代表HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液組。
如圖5所示，在HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液中檢測到了HGF，HGF濃度明顯高於對照組。
圖6也表明鼠HGF可在HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC培養物上清液中檢測到，HGF濃度也明顯高於對照組。
如圖5和圖6所示，未處理組和對照組的培養物中通過ELISA沒有檢測到HGF。實驗實施例4HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液對鼠冠狀內皮細胞的影響將HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液加入到固定相中的冠狀內皮細胞培養體系(細胞數量105)中。培養3天後，檢查增加的內皮細胞數量。以同樣方法用HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液與內皮細胞培養作為對照，檢查增加的內皮細胞數量。結果示於圖7，其中A、B和C分別代表加HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的組(n＝8)，HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液(n＝8)以及未處理組(n＝15)。
如圖7所示，加入HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的組中內皮細胞數量明顯增加，而對照組中細胞數量幾乎與未處理組中相同(對照組0.017±0.002，A組0.148±0.03，P＜0.01)。
然後，將抗HGF抗體加入至HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液中。按上述方法檢查增加的內皮細胞數量。結果如圖8所示(n＝8)，其中A代表加入HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的組；B代表加入HVJ-脂質體-對照致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的組；C代表加入抗HGF抗體於HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液中的組；D代表加入對照抗體於HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的組。
如圖8A和C所示，通過加入抗HGF抗體，HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞培養物上清液的促進細胞生長活性完全消失。該結果表明HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠冠狀內皮細胞的培養物上清液中促進細胞生長活性完全歸功於HGF。實驗實施例5HVJ-脂質體-DNA致敏的人類VSMC對人類內皮細胞的影響將人類VSMC接種在細胞培養插入板(Coaster製造，孔直徑為0.45μm)上，在加入了3％牛血清的DMEM培養基中生長。另一方面， 將人類內皮細胞接種在一6孔板上並在含10％牛血清的DMEM培養基中培養。當VSMC增殖達到80％匯合時，VSMC與HVJ-脂質體-DNA(脂質體中DNA含量10μg)或與HVJ-脂質體-對照於4℃培養5分鐘，再於37℃培養30分鐘。致敏後，將含有致敏VSMC的插入板加到含有人類內皮細胞的固定相中每個孔中。VSMC和內皮細胞於加入0.5％牛血清的DMEM培養基中共同培養3天，然後用一WST細胞計數器(Wako公司製造)測定細胞數量。結果如圖9(n＝6)所示。圖中，「對照」代表與HVJ-脂質體-對照致敏的VSMC共同培養的組；「HGF」代表HVJ-脂質體-DNA致敏的VSMC培養物上清液組。
圖9的結果表明HVJ-脂質體-DNA致敏的人類VSMC明顯提高了固定相中未致敏人類內皮細胞的生長。實驗實施例6HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠VSMC對大鼠冠狀內皮細胞的影響在固定相中將HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠VSMC(細胞數量106)和大鼠冠狀內皮細胞(細胞數量105)共同培養3天。檢查增加的內皮細胞數量。用HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC以類似方法與內皮細胞共同培養後檢查增加的內皮細胞數量作為對照。結果如圖10(n＝6)所示，其中「對照」代表HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC組，「HGF」代表了HVJ-脂質體-對照致敏的鼠VSMC組。
如圖10所示，HVJ-脂質體-DNA致敏的鼠VSMC釋放的HGF刺激了內皮細胞的生長，可以觀察到增加的細胞數量(對照組0.126±0.006，HGF組0.156±0.01，P＜0.05)。實驗實施例7HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠VSMC的生長將HVJ-脂質體-DNA致敏的大鼠VSMC和HVJ-脂質體-對照致敏的大鼠VSMC分別加以培養，比較各自增加的細胞數量。HVJ-脂質體-DNA的致敏沒有影響細胞生長。結果表明HGF在VSMC上沒有促進細胞生長活性。實驗實施例8直接注射HVJ-脂質體-DNA於鼠心肌中誘導血管生成直接注射HVJ-脂質體-DNA的鼠心肌、直接注射HVJ-脂質體-對照的鼠心肌和未處理的鼠心肌用HE和Azan分別染色，於顯微鏡下計數小血管的數量。結果示於圖11，其中「HGF」代表直接注射HVJ-脂質體-DNA的鼠心肌中小血管的數量，「對照」則代表直接注射HVJ-脂質體-對照的鼠心肌中小血管的數量。
如圖11所示，與注射HVJ-脂質體-對照的鼠心肌中小血管的數量及未處理鼠心肌中小血管的數量相比，直接注射HVJ-脂質體-DNA的鼠心肌中小血管的數量明顯增加。這些結果表明具有內皮細胞生長活性的HGF顯示了體內血管生成活性。實驗實施例9直接導入HVJ-脂質體-DNA至關節修復關節軟骨用直徑1.8mm的Kirschner電線在10周齡Fischer大鼠的股骨內踝處軟骨下損傷。手術後一周，將實施例1中製備的HVJ-脂質體-DNA(100μl/膝)直接導入關節。作為對照，將比較實施例1中製備的HVJ-脂質體-對照和比較實施例2中製備的HVJ-脂質體-DNA(TGF-β)以同樣劑量直接導入關節。導入這些基因後1、3和4周後殺死大鼠，組織檢查可觀察到修復位點。
如圖12所示，結果表明在注射HVJ-脂質體-DNA於關節後3周可觀察到經甲苯胺藍染色的蛋白聚糖的合成，表現出軟骨樣細胞的發育。另外圖13中，注射HVJ-脂質體-DNA於關節後4周，可觀察到軟骨樣細胞出現的面積明顯擴大，在其中檢測到蛋白聚糖的合成。
如圖14所示，比較實施例2中製備的HVJ-脂質體-DNA(TGF-β)注射至關節，在注射4周後沒有觀察到軟骨樣細胞的發展。另外，圖15中，比較實施例1中製備的HVJ-脂質體-對照注射至關節，在注射4周後仍然沒有觀察到軟骨樣細胞的發育。工業應用本發明的藥物與HGF本身相比提供了持續治療效應。另外，本發明藥物可以局部應用於靶器官以得到選擇性效應，從而將HGF的副作用降低至最低限度。
權利要求
1.含有HGF基因的藥物。
2.含有HGF基因的脂質體。
3.按照權利要求2的脂質體，它是與副流感病毒融合的膜融合脂質體。
4.含權利要求2或3的脂質體的藥物。
5.按照權利要求1或4的藥物，它用於動脈疾病的治療。
6.按照權利要求1或4的藥物，它用於軟骨損傷的治療。
全文摘要
含有HGF基因的藥物通過脂質體的使用用於基因治療。與使用HGF本身相比,該藥物具有持續治療效應並且能選擇性地作用於受累部位,這樣可以減少HGF的副作用。
文檔編號A61K9/127GK1198675SQ96197349
公開日1998年11月11日 申請日期1996年8月22日 優先權日1995年8月29日
發明者森下龍一, 荻原俊男, 中村敏一, 富田哲也, 越智隆弘 申請人:住友製藥株式會社