顯示廣譜病原體抗性的轉基因植物的製作方法

2023-06-11 15:54:11 1

專利名稱：顯示廣譜病原體抗性的轉基因植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及經過遺傳工程改造的表達屬於殺菌肽-蜂毒素(mellitin)雜合體家族的一個或多個肽的植物。發明背景植物中的疾病
植物是各種感染性疾病(數以千計)的受體，這些疾病是由大量植物致病性真菌、細菌、病毒和線蟲引起的，這些病原體例如由於感染了生長中的植物和破壞已收穫的作物而導致世界範圍內莊稼損失慘重。為減少由這些病原體所引起的損失，應用最廣泛的方法包括利用能夠殺死或降低各個病原體作用的各種化學試劑。不幸的是，許多植物病原體具有了對這些化學品的抗性，並且，一些植物病原體(特別是病毒)對用化學方法控制是不敏感的。另外，利用的許多化學試劑是廣譜毒素，可以引起嚴重的環境破壞，和毒害人及動物。
為對付植物病原體已經利用了植物育種，並且最近還採用了遺傳工程技術。在某些情況中，育種家和分子生物學家已經在植物中成功地改造了對一些病原體的抗性。在過去的幾年中，已經從植物中分離了許多植物R(抗性)基因。當導入敏感作物中時，這些R基因產生對一些病原體的增強的抗性。例如，美國專利5,571,706公開了對菸草花葉病毒給予增強抗性的菸草N基因的分離。但是，雖然目前報導的常規育種和遺傳工程方法可以成功地在植物中增強病原體抗性，但這些途徑通常論述的只是一個靶病原體引起的問題，或少量密切相關的病原體引起的問題。結果是，當利用這些方法產生的作物對靶病原體可能已增強保護時，傳統的化學試劑仍然必須用於控制其它病原體。抗微生物的肽
在過去的二十年中，已經發現具有大範圍的抗微生物活性的大量天然多肽(「肽」)(綜述參見，Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998；Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994，和Nicholas和Mor，Ann.Rev.Microbiol.，49277-304，1995)。植物和動物的內源抗微生物肽通常由12-45個胺基酸組成，並且是在生理pH時具有靜正電荷(陽離子)的兩親性分子。雖然陽離子抗微生物肽(CAPs)在結構上是多種多樣的，但他們主要有兩大類結構螺旋肽，如殺菌肽和爪澹(蟲詹)抗菌肽，和分子內二硫鍵穩定的片層(摺疊)肽，如防衛素，protegrins，和tachyplesins。Hancock和Lehrer，TrendsBiotechnol.，1622-28，1998；Zasloff，Curr.Opin.Immunol.，43-7，1992；Cociancich等，Biochem.J.，300567-575，1994；和Piers和Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994。天然CAP在各自的生物活性範圍變化很大，包括殺死細菌(革蘭氏陽性和陰性)、真菌和原生動物，甚至病毒。CAP通常在0.25g/mL到4g/mL的濃度範圍內體外殺死敏感微生物(Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998)，面對常規抗生素效率下降的情況下，提供了令人激動的可能性。另外，在植物中表達CAP可以引入對植物致病性微生物廣譜抗性。Jaynes，Plant Science，8943-53，1993；和Misra和Zhang，Plant Physiol.，106977-981，1994。
昆蟲殺菌肽代表了在昆蟲免疫應答中形成重要組分的小的高度鹼性的□螺旋抗微生物肽的家族。Bohman和Hultmark，Annu.Rev.Microbiol.，41103-126，1987。從大的蠶蛾中分離的殺菌肽Hyalophoraceropia約含有具有兩親性N末端和親水的C末端的35個胺基酸殘基(van Hofsten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822240-2243，1985)。所有殺菌肽在體外是有潛力的抗菌劑，並且這一家族的幾個成員在體外抗許多植物致病性細菌特別強烈。Hultmark等，Eur.J.Biochem.127207-217，1982；Jaynes等，BioEssays，6263-270，1987；和Nordeen等，Plant Sci，82101-107，1992。
另一個抗菌肽蜂毒素(mellitin)含有26個胺基酸，是蜂毒的主要成分。與殺菌肽相反，蜂毒素具有明顯的有兩親性C末端的疏水N末端。Habermann，Science，177314-322，1972。雖然蜂毒素具有強有力的抗微生物活性，但它的強力溶血活性(Tosteson等，J.Membr.Biol.8735-44，1985)使它不適用於治療用途，可能不是好的轉基因學的候選物。
從上面可見，存在著對具有比普通病原體，包括細菌和真菌病原體更廣譜的增強抗性的植物需求。發明概要
本發明人已經發現，在轉基因植物中表達一些陽離子抗微生物肽(CAP)給予了對普通病原體更廣譜的抗性，包括對真菌和細菌病原體的增強的抗性。另外，本發明人已經發現這樣的CAP可以通過在N末端或C末端(末端延伸)添加胺基酸殘基來修飾，使CAP與植物生理更相容。實驗對象CAP是與屬於殺菌肽-蜂毒素(CEMA)的雜合體家族的小的帶正電的(陽離子)肽相關的，其含有部分天然存在的肽殺菌肽A和蜂毒素。Piers和Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994；和Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998。
本發明所述的轉基因植物可以用於常規的農業用途，如糧食作物。或者如下所述，可以收穫植物，並加工提取表達的CEMA，或與CEMA相關的肽，如ECEMA。在這些方法中，可以將分離的肽用於醫藥用途。另外，這些植物可以直接或間接用作食物添加的藥物植物，以對抗動物如人中的微生物感染。
所以，本發明包括表達至少一個CEMA和/或至少一個與CEMA相關肽的轉基因植物和生產這些植物的方法。這些植物的各部分，包括種子、果實、莖、葉和根通常可以用作食物來源，或用作CEMA和/或CEMA相關肽的來源。因為所有植物類型對一個或多個植物病原體是敏感的，本發明可以用於各種植物任意類型中產生廣譜抗性。所以，本發明可以用於單子葉、雙子葉和裸子植物，包括，但不限於玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、豆、油菜/卡諾拉(canola)、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、亞麻、花生和三葉草；蔬菜如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、土豆、胡蘿蔔、小蘿蔔、豌豆、小扁豆、甘藍、椰菜、花莖甘藍、湯菜和椒；樹果實如檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃；和花如蘭花、康乃馨和玫瑰；咖啡；可可豆；針葉樹如花旗松(Douglas fir)、雲杉和松；和木本落葉樹如白楊和榆木。
本發明的一個方面提供了表達一個或多個CEMA肽和/或一個或多個CEMA相關肽的轉基因植物。可以利用的CEMA肽的例子包括但不限於Hancock等，美國專利5,707,855所述的CEMA肽。
本發明的另一方面提供了修飾後含有其它胺基酸的CEMA相關肽，從而形式「融合」肽。轉基因植物中融合肽的表達可以提供比這些植物中CEMA的表達更有效的廣譜病原體抗性，或可以增強表達的CEMA相關肽的穩定性，以便提供更高的表達水平。所以，加強了從植物組織中純化該肽。在其它實施方案中，本發明提供了表達融合肽的轉基因植物，包括
(1)CEMA相關肽的第一個肽序列；和
(2)與第一個肽序列可操作連接的第二個肽序列。
第二個肽序列通常但不一定與第一個肽序列的氨基(N-)端連接。
在有些實施方案中，第二個肽序列含有陰離子(帶負電荷)「原區」(Pro-region)肽序列。這樣的原區序列的作用是中和CEMA或CEMA相關肽的陽離子特性，並因此可以在細胞環境中提供增強的穩定性，或降低CEMA或CEMA相關肽對宿主生物體的毒性。因此，原區通常包括大量的帶負電的胺基酸，如穀氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。例如，適當的原區通常是在天然存在的未加工的(全長)dermaseptin和temporin肽中發現的。也可以從其它肽，包括哺乳動物起源的肽中獲得陰離子原區，如羊cathelin蛋白質的原區。包括這樣的原區的融合肽可以表示為P-C。
原區肽可以直接與CEMA或CEMA相關肽的N末端連接。但是，原區和陽離子肽也可以用間隔肽連接。連接兩個肽區的間隔肽的用途是本領域熟知。適當的間隔肽通常是2到25個胺基酸長，並且提供了柔性鉸合部，連接第一個肽序列和第二個肽序列。已經用於提供連接兩個肽序列的柔性鉸合部的間隔序列包括文獻Chaudhary等，Nature，339394-397，1989所述的甘氨酸(4)-絲氨酸間隔區(GGGGSx3)。
本發明也提供含有N端延伸的CEMA相關肽。一個這樣的肽是ECEMA(SEQ ID NO4)。這樣的N端延伸的作用是降低或增加CEMA肽的抗微生物效果，所以使肽與植物生理更相容(指植物可以與它的非轉基因植物相對等的方式生長和繁茂)。N端延伸可能的作用是提供間隔肽功能。含有原區肽、間隔肽和CEMA肽的融合肽可以表示為P-S-C，其中S表示間隔肽。
間隔序列也可以包括切割位點，如蛋白酶識別和裂解的肽序列。切割位點使得在從植物組織純化CEMA肽後有助於從CEMA肽中除去原區。
最後，本發明也提供了保存期和儲藏期增長的植物。將本發明的轉基因植物和對照非轉化植物比較，可以觀察到保存期增長。對於水果和蔬菜的長期儲藏以及切花和藥用植物的保存，特別需要增長保存期。本發明的這些和其它方面在下面進一步詳細敘述。序列表
附加的序列表中列出的核酸和胺基酸序列是用標準的核苷酸鹼基的字母縮寫和胺基酸的三字母密碼表示的。每個核酸序列只表示了一條鏈，但應當理解，互補鏈通過參考所顯示的鏈也包括在內。
SEQ ID NO1是編碼CEMA的核酸序列。
SEQ ID N2是CEMA肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO3是編碼ECEMA肽的核酸序列。
SEQ ID NO4是ECEMA肽代表性的胺基酸序列。
SEQ ID NO5-7是各種N端延伸序列的各個胺基酸序列。
SEQ ID NO8是temporin G原區的胺基酸序列。
SEQ ID NO9和10是用於擴增ECEMA編碼序列各自的PCR核苷酸引物。
SEQ ID NO11是用於ECEMA肽的N端延伸序列。附圖的簡要說明


圖1A和1B表示了ECEMA的結構和表達構建體。
圖1A表示了陽離子肽CEMA和N端延伸版本ECEMA的胺基酸序列。
圖1B表示了ECEMA的pSAI4質粒表達載體。圖中的縮寫如下RB，Ti質粒的右邊的邊緣區，LB，Ti質粒左邊的邊緣區，NOS-pro，啟動子，和NOS-ter，胭脂鹼合酶基因的終止子；NPT II，新黴素磷酸轉移酶II；2×35S，雙倍增強子CaMV 35S啟動子；AMV，來自苜蓿花葉病毒RNA4的引導序列；ECEMA，ECEMA的蛋白質編碼序列。
圖2A-2D包括各個凝膠的數碼圖象，表示ECEMA基因整合和mRNA表達。圖2A表示了從對照(非轉化)和轉基因Russet Burbank土豆植物分離的總基因組DNA的PCR擴增的結果。PCR引物與pSAI4構建中利用的相同。道1，來自質粒pSAI4的PCR產物(陽性對照)；道2-4，從pSAI4轉化的Russet Burbank分離的基因組DNA得到的PCR產物；道5，從對照Russet Burbank分離的基因組DNA得到的PCR產物；道6，無模板的PCR(陰性對照)；道7，分子大小標準(□X174RFDNA/HaeIII)。圖2B表示了含有ECEMA mRNA表達產物的凝膠的數碼圖象，所述mRNA來自對照和轉基因Russet Burbank的總RNA通過RT-PCR測試。PCR的引物與pSAI4構建中利用的相同。道1，從對照Russet Burbank分離的RNA的PCR產物，沒有逆轉錄；道2-4，從轉基因Russet Burbank分離的RNA的PCR產物，沒有逆轉錄(質控)；道5，來自對照Russet Burbank的RT-PCR產物；道6-8，來自轉基因Russet Burbank的RT-PCR產物。圖2C表示了從對照(非轉化)和轉基因Desiree土豆植物分離的總基因組DNA徑PCR擴增的ECEMA編碼序列的數碼圖象。PCR引物與pSAI4構建中的相同。道1，無模板的PCR(陰性對照)；道2，從非轉化的Desiree分離的基因組DNA的PCR產物；道3，質粒pSAI4的PCR產物(陽性對照)；道4-11，從用pSAI4轉化的Desiree分離的基因組DNA的PCR產物；道12，代表100，200，300個鹼基的100鹼基梯度(Parmacia)帶。圖2D表示了從ECEMA mRNA表達試驗結果的數碼圖象。利用從對照和轉基因Desiree分離的總RNA的RT-PCR進行這些實驗。PCR的引物與pSAI4構建中利用的相同。道1，從對照Desiree分離的RNA的PCR產物，沒有逆轉錄；道2-5，從轉基因Desiree分離的RNA的PCR產物，沒有逆轉錄(質控)；道6，來自對照Desiree的RT-PCR產物；道7-10，來自轉基因Desiree的RT-PCR產物；道11，來自質粒pSAI4的PCR產物(陽性對照)；道12，代表100，200和300鹼基的100鹼基階梯(Parmacia)帶。
圖3A-3F包括數碼圖象，表示轉基因土豆植物和塊莖的形態學特徵。在轉移到溫室的土壤中後，將Desiree對照(圖3A)和ECEMA轉基因植物(圖3B)拍照。來自對照(圖3，CI)和轉基因(圖3，CII，III，IV，V)植物的塊莖在收穫後拍照。在轉移到土壤後，將RussetBurbank對照(圖3D)和ECEMA轉基因植物(圖3E)拍照。在收穫後，將來自對照(圖3，FI)和轉基因(圖3，FII，III，IV)的植物的塊莖拍照。
圖4A和圖4B表示轉基因土豆對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)的抗性。圖4A是表達ECEMA的轉基因Desiree土豆塊莖的軟腐抗性研究的結果。用胡蘿蔔軟腐歐文氏菌感染從對照(C)和轉基因植物ME1、ME2和ME3的塊莖中所製備的復盤。室溫6天後，從復盤中輕輕除去軟腐的組織，並將對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的敏感度/抗性表示為塊莖組織的重量損失。圖4B描述從離子交換層析得到的級分對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的殺菌效果。下面敘述了蛋白質分離技術。S加到柱上的過濾上清液；FT穿透E11-E13用0.2M NaCl洗脫得到的級分；E21-E23用0.3M NaCl洗脫得到的級分；E31-E33用0.5M NaCl洗脫得到的級分。各種級分中的蛋白用Tricine-SDS-聚丙烯醯胺凝膠分離並銀染。級分E22、E23和E31含有與對照相同的能遷移到凝膠中相對位置的帶(對照是200ng化學合成ECEMA蛋白質(3.8kDa))。正如預期，級分E22、E23和E31顯示了最高的殺菌活性水平。
圖5A-5C中的數碼圖象表示在用蔓延疫黴(Phytophthorainfestans)(US-8分離物)感染後的轉基因對照植物(2×35S GUS；圖5A)，對照非轉基因植物(圖5B)和表達ECEMA的植物(2×35SECEMA；圖5C)。
圖6A-6D是受到真菌病原體仙人掌疫黴(Phytophthora cactorum)攻擊的各個轉基因土豆植株的數碼圖象。在MS培養基上生根後，用真菌仙人掌疫黴對對照(圖6A)Russet Burbank植物和ECEMA轉基因(圖6B)Russet Burbank植物以及對照(圖6C)Desiree植物和ECEMA轉基因(圖6D)Desiree植物進行攻擊。感染後11天(圖6A和6B)或19天(圖6C和6D)拍照。對照植物嚴重感染，而轉基因植物仍然是綠色並生長。
圖7A-7D是受到真菌病原體茄病鐮孢(Fusarium solani)攻擊的各個轉基因土豆植株的數碼圖象。在MS培養基上生根後，用茄病鐮孢對對照(圖7A)Russet Burbank植物和ECEM轉基因(圖7B)RussetBurbank植物以及對照(圖7C)Desiree植物和ECEMA轉基因(圖7D)Desiree植物進行攻擊。感染後11天(圖7A和7B)或19天(圖7C和7D)拍照。對照植物嚴重感染，而轉基因植物仍然是綠色並生長。本發明的詳細說明I.定義
除非特別說明，根據常規用法使用技術術語。分子生物學中常見術語的定義可在下列工具書中找到Lewin，Genes VII，OxfordUniversity Press，1999(ISBN 0-19-879276-X)；Kendrew等，TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers(主編)，Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
「CEMA和CEMA-相關肽。」短語「CEMA和CEMA相關肽」指CEMA肽，其含有殺菌肽AN端的8個胺基酸和在C端修飾的蜂毒素序列(Hancock等，美國專利5,707,855)，以及指如上所述的CEMA肽的變體。CEMA肽的變體可以含有與CEMA胺基酸序列(SEQ IDNO1)可操作連接的其它胺基酸序列或CEMA胺基酸序列的片段。其它胺基酸序列可以是如下所述的原區、間隔序列、N端延伸或C端延伸。CEMA變體也可以含有如下所述的一個或多個保守胺基酸取代。然而，本發明所包含的CEMA和CEMA相關肽特徵是在植物各個肽表達後，至少部分給予疾病抗性的能力，而基本上不影響植物的生長和健康。如本文所述，當與非轉基因植物比較時，一些轉基因植物可能顯示了各種形態學上的差異。但是，這些植物將保持對廣譜病原體的抗性，並且能夠生長。
CEMA相關肽的例子是命名為「ECEMA」的肽(SEQ ID NO4)。ECEMA由34個胺基酸組成，包括來自殺菌肽A的8個胺基酸和來自蜂毒素的16個胺基酸，並在N端(6個殘基)和C端(4個殘基)有延伸。6個胺基酸的N端延伸含有序列MALEHM(SEQ ID NO11)。
除了利用如上所述的CEMA和CEMA相關肽外，本領域普通技術人員明白利用與天然存在的抗菌肽有些變化的肽可實施本發明，而在植物中表達時所述肽仍然給予增強的廣譜病原體抗性。
「CEMA和CEMA相關肽生物活性。」短語「CEMA和CEMA相關肽生物活性」指CEMA或CEMA相關肽如ECEMA抑制細菌生長和/或真菌生長的能力。利用下面給出的方案可以容易地確定CEMA和CEMA相關肽生物活性。
通過確定肽抑制果膠分解菌株如胡蘿蔔軟腐歐文氏菌或者甚至是大腸桿菌DH5的生長能力可以方便地評估給定的CEMA和/或CEMA相關肽的抗菌活性。用Luria-Bertaini(LB)培養基系列稀釋該肽，並將100-L所得效價的等份試樣加入到96孔的微滴平板的孔中可以測定給定肽的活性。然後使新鮮細菌培養物(～0.3A550)在LB培養基(1％w/v胰蛋白腖和0.5％w/v酵母粉)上生長，並且用LB稀釋到10-2，以表示約104-105菌落形成單位(CFU)mL-1。然後在含有肽的每個孔中接種10L細菌培養物，並將樣品在37C溫育4小時。然後用LB稀釋孔中的內容物，鋪在LB瓊脂板上，適當溫度下溫育過夜。每個平板上生長的細菌菌落數與CEMA和/或CEMA相關肽的各個稀釋液相對應(對照平板中沒有加入肽)。將菌落計數，通過比較對照平板測定受檢肽的抗菌活性。
如果在該試驗條件下，濃度7g/mL的肽至少能夠抑制10％(比較對照)的細菌生長(即在這一濃度下，細菌菌落數沒超過對照平板的90％)，則確定CEMA或CEMA相關肽具有生物活性。
利用真菌菌株仙人掌疫黴、蔓延疫黴和/或茄病鐮孢可以評估給定的CEMA或CEMA相關肽的抗真菌活性。將選定的真菌菌株在含有20gL-1的五穀嬰兒食品「速溶」麥片和8gL-1瓊脂的五穀瓊脂(FCA)培養基上生長(Terras等，Plant Cell 7573-588，1995)。室溫生長5天後，去除菌絲體孢塞並倒置於新鮮FCA平板的中央。然後在距離平板邊緣3釐米的孔中接入測試肽的無菌溶液(10∶1)，並在同一平板上建立含有無菌水的對照孔。在同一平板或其它平板上可以測試各種濃度的試驗肽。室溫溫育分析平板5天，然後測量各個孔周圍的生長抑制圈。
如果在該分析條件下，與對照比較，在高達10μg/mL的濃度下能夠抑制真菌生長(即在含有這一濃度肽的孔周圍具有明顯的抑制真菌生長圈)，則確定CEMA或CEMA相關肽具有生物活性。
「末端延伸。」如本文所用，術語「末端延伸」指在肽的N端或C端添加的序列，如SEQ ID NO5-7和11所示的那些。例如，序列MALEHM敘述了一個N端延伸(SEQ ID NO11)，它加在陽離子肽如CEMA(SEQ ID NO2)的N端。在下面的討論中，當提及的是N端延伸時，應該理解指的是N-或C-端延伸。
N端延伸的特徵是它們能夠調節陽離子肽的抗微生物活性，即增強或降低抗微生物的活性。本發明內容提供了能用於測試延伸的陽離子肽抗微生物活性的分析方法。如果與非延伸肽比較，N端延伸增強或降低肽的抗微生物活性，那麼就發現N端延伸調節陽離子肽的抗微生物活性。然而，例如通過改變給定肽的抗微生物活性，與肽的非延伸肽比較至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，將發現一些N端延伸基本上改變了抗微生物活性。
例如，利用下面所述的抗菌分析，CEMA(SEQ ID NO2)在4.5μg/mL時殺死了50％的細菌細胞(大腸桿菌)，而ECEMA(SEQ IDNO4)在36μg/mL時殺死了50％的細菌細胞(大腸桿菌)。所以，ECEMA(SEQ ID NO4)比CEMA(SEQ ID NO2)毒性小8-10倍。相類似，當對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌測試時，ECEMA比CEMA(SEQ IDNO2)毒性小15-20倍。
除了他們的活性特徵外，N端延伸的特徵是長度。通常N端延伸長度不超過25個胺基酸殘基，實際在許多情況下，N端延伸長度不超過20、15、10或5個胺基酸。特定延伸的長度將部分依賴於所需的抗微生物活性的水平，本文所述的抗真菌和抗細菌分析能用於分析N端延伸的陽離子肽。
「轉基因植物。」如本文所用，「轉基因植物」指含有同種野生型植物中通常未發現的重組遺傳物質(「轉基因」)的植物。所以，從藉助轉化導入重組DNA的植物細胞生長成的植物就是轉基因植物，含有導入轉基因植物的所有子代(不管是有性或無性產生的)同樣是轉基因植物。「轉基因植物」也指轉基因保留在質體中的植物，如葉綠體、造粉體、黃化質體、色質體等等。這樣的質體豐富且母系遺傳。
「陽離子肽。」術語「陽離子肽」指長度約5到約50個胺基酸，優選長度約15到約35個胺基酸的胺基酸序列。如果肽具有足夠的正電荷胺基酸，並且其pKa大於9.0，那麼這個肽就是「陽離子的」。通常，至少四個陽離子肽的胺基酸殘基可以是帶正電荷的，例如賴氨酸或精氨酸。「正電荷」是指pH7.0時具有淨正電荷的胺基酸殘基的側鏈。可以根據本發明重組產生的天然存在的陽離子肽的例子包括防衛素、爪澹抗菌素、melittin和殺菌肽、dermaseptins、temporins和其類似物。
「序列同一性。」將兩個核酸序列或兩個胺基酸序列間的相似性按照序列間共享的序列同一性水平來表示。序列同一性通常依據同一性百分數表示；百分數越高，兩個序列越相似。
為比較目的，序列比對的方法是本領域熟知的。各種程序和比對算法在下面的文獻中有敘述Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；Higgins和Sharp，Gene 73237-244，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5151-153，1989；Corpet等，Nucleic Acid Research 1610881-10890，1988；Huang等，Computer Application in the Biosciences 8155-165，1992；和Pearson等，Methods in Molecular Biology 24307-331，1994。文獻Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410，1990提呈了一個序列比對方法和同源性計算的詳細論述。
為了與序列分析程序BLASTP、BLSATN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX結合使用，可以從幾個來源，包括國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和網際網路獲得NCBI基本局部比對檢索工具(BLASTTM，Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410，1990)。BLASTTM可以在網際網路上存取。
為了比較大於約30個胺基酸的胺基酸序列，利用系統設定參數的默認BLOSUM62距陣，使用BLASTTM程序中的「Blast 2序列」函數，(間隙存在值(gap existence cost)11，每個殘基間隙值(gap cost)1)。當比對短肽時(少於約30個胺基酸)，應該利用Blast 2序列函數，利用系統設定參數的PAM30距陣進行比對(開放間隙9，延伸間隙1罰分(penalties))。甚至與參考序列具有更大相似性的蛋白質，當用這一方法評估時，將顯示增加的百分比同一性，如至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
「重組。」「重組」核酸是一個核酸，具有非天然存在的序列，或具有通過人工組合兩個分離的更短的序列而製成的序列。這種人工組合通常是通過化學合成，或更常見是通過人工操作分離的核酸區段，例如通過遺傳工程技術來完成的。
「寡核苷酸(「寡」)。」「寡核苷酸」是指長度多達約100個核苷酸鹼基的線性聚核苷酸序列。
「探針和引物。」核酸探針和引物可以容易地根據本發明提供的核酸序列來製備。「探針」包括附著在可檢測標記或報導分子上的分離的核酸序列。典型的標記包括放射性同位素、配體、化學螢光試劑和酶。標記的方法和選擇適於各種目的的標記的指南在下面文獻中有討論，例如，Sambrook等(主編)，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989；和Ausubel等(主編)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(with periodic updates)，1987。
「引物」是短核酸，優選DNA寡核苷酸長度為15個核苷酸或更多，其通過退火與互補靶DNA鏈核酸雜交形成引物和靶DNA鏈間的雜合體，然後藉助DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸。引物對例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)或本領域已知的其他核酸擴增方法能用於擴增核酸序列。
如提示，探針和引物長度優選為15個核苷酸或更多，但為增強特異性，可優選20或更多個核苷酸的探針和引物。
探針和引物製備和使用的方法在下列文獻中描述，例如Sambrook等(主編)，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausubel等(主編)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(with periodic updates)，1987；和Innis等，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic PressSan Diego，1990。PCR引物對例如可以利用針對此目的的電腦程式如PrimerTM(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)從已知序列中派生出來。本領域技術人員將意識到特定探針或引物的特異性隨著探針或引物的長度而增加。例如，含有20個連續核苷酸的引物退火至靶上將可以與比只有15個核苷酸的對應引物具有更高的特異性。所以，為了獲得更大的特異性，可以選擇含有例如10、20、25、30、35、40、50或更多的連續核苷酸的探針和引物。
「分離。」「分離」的生物組分(如核酸或蛋白質或細胞器)已經基本上與生物體細胞中的其它生物組分分離或純化，其中該組分是天然存在的，即其它染色體和染色體外的DNA和RNA，蛋白質和細胞器。已經「分離」的核酸和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質。該術語也包括在宿主細胞中通過重組表達製備的核酸和蛋白質，以及化學合成的核酸。
「載體。」「載體」是導入宿主細胞的核酸分子，從而產生轉化的宿主細胞。載體可以含有一個或多個核酸序列，如複製起點，允許載體在宿主細胞中複製。載體也可以含有一個或多個可選擇的標記基因和本領域已知的其它遺傳因子。
「可操作連接。」當第一個核酸序列與第二個核酸序列無論何時存在功能性關係，第一個核酸序列與第二個核酸序列「可操作連接」。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，啟動子即與編碼序列可操作連接。一般而言，可操作連接的DNA序列是相鄰的，並且如需要可在同一讀碼框中連接兩個蛋白質編碼區。兩個肽序列可以通過正常的肽鍵，或通過其它共價鍵可操作連接。
「轉化。」「轉化」細胞是已經通過分子生物學技術導入核酸分子的細胞。如本文所用，術語「轉化」包括可以將核酸分子導入這種細胞的所有技術，包括用病毒載體轉染、用質粒載體轉化、用葉綠體載體轉化進入葉綠體，和通過電穿孔、脂轉染、微注射和粒子槍加速導入裸DNA。選擇CEMA肽a.CEMA和/或CEMA相關肽
上面提供了舉例的CEMA和CEMA相關肽(ECEMA)的列表。通過簡單應用肽序列的遺傳密碼可以派生編碼CEMA和ECEMA肽的核酸分子。例如，在SEQ ID NO1中提供了CEMA肽的胺基酸序列，SEQ ID NO4中表示了編碼ECEMA的胺基酸序列。
本領域普通技術人員將意識到各種CEMA和ECEMA肽顯示不同程度的抗微生物活性，一些能夠比其他類別更有效地抵抗某些病原體。所以當選擇生產具有增強的病原體抗性的轉基因植物的肽時，選擇特定的CEMA相關肽將依賴於，在其他因子中，肽表達的植物類型以及常見的感染該植物類型的病原體類型。
在選擇了待表達所需的CEMA肽或CEMA相關肽後，可以通過標準分子生物學技術生產編碼該肽的核酸分子。因為CEMA和CEMA相關肽相對短，合成核酸分子的簡單方法是通過在購買的寡核苷酸合成儀上合成重疊的寡核苷酸。然後，將寡核苷酸在體外合成全長的編碼區。這一途徑也允許選擇編碼特定胺基酸殘基的密碼子，所述密碼子反映了待導入核酸分子的植物偏愛使用的密碼子，從而增強表達效率。利用這一途徑生產編碼序列的詳細實施例提供在下面的實施例中。b.加入其它肽序列
也可以在轉基因植物中以融合蛋白質的形式表達CEMA和CEMA相關肽。雖然，為了在植物中表達，可以將任何所需的肽與選定的CEMA和/或CEMA相關肽融合，但是含有陰離子原區肽與CEMA或CEMA相關肽的氨基端可操作連接的融合蛋白質的表達將是特別有利的。對於這一目的，可以利用任何陰離子原區肽，包括在天然存在的全長(即未加工)抗微生物肽中發現的陰離子原區。例如，可以將含有temporin G的胺基酸23-46(SEQ ID NO8中所示)用作原區。這樣的原區肽作用是中和抗微生物肽的陽離子特性，並因此可以在細胞環境中提供增強的穩定性。為達到此目的，這些原區通常包括大量的帶負電的胺基酸，如穀氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
其它本領域已知天然存在的原區肽的例子包括下面蛋白質的原區肽人嗜中性防衛素蛋白質(Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327-7331，1988)；小牛抗微生物cathelicidin蛋白質BMAP28(Skerlavaj等，J.Biol.Chem.，27128375-28381，1996)；羊抗微生物cathelin蛋白質家族(Mahoney等，FEBS Lett.，377519-522，1995)；小牛indolicidin(Del Sal等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，187467-472，1992)；豬抗微生物肽prophenin-2和PR-39(Zhao等，FEBS Lett.，367130-134，1995)和PMAP-37(Tossi等，Eur.J.Biochem.15941-946，1995)；人抗微生物脂多糖結合蛋白質CAP18(Larrick等，FEBS Lett.，398(1)74-80，1966)；和鼠蛋白質E3(Scott和Collins，Blood，882517-2530，1996)。
由於陰離子原區肽可以直接與陽離子肽的N端連接，備選的實施方案包括利用間隔肽序列將原區肽與CEMA和/或CEMA相關肽連接。利用間隔肽連接兩個肽區是本領域熟知的；這樣的間隔肽通常是2到25個胺基酸長度，並且提供將第一個肽序列與第二個肽序列連接的柔性鉸合部。已經用於提供連接兩個肽序列的柔性鉸合部的間隔序列包括文獻Chaudhary等，Nature 339394-397，1989中所述的甘氨酸(4)-絲氨酸間隔區(GGGGSx3)。或者，如下所述的N端肽延伸可以提供間隔肽功能。間隔序列肽也可以包括切割位點，如蛋白酶如Xa因子所識別和切割的肽序列。這樣的位點使得CEMA和/或CEMA相關肽從植物組織中純化後，有助於再從CEMA和/或CEMA相關肽中除去原區。利用陰離子原區肽和間隔肽在微生物系統中表達一些陽離子肽是本領域已知的，並且在Hancock的美國專利5,707,855中有敘述。
在一些實施方案中，可以在CEMA和/或CEMA相關肽上添加N端延伸肽序列。這些N端肽延伸的作用可能是提供對蛋白酶剪切增強的抗性、增強的轉錄水平和/或增強或降低肽的抗微生物活性，以致表達的肽在提供適當的抗微生物活性的同時與植物物種的特殊生理相容。儘管也可以利用更長的延伸，但通常這些N端延伸是2到25個胺基酸的長度。一些實施方案中所利用的N端延伸序列的例子包括SEQ ID NO5-7和11中所示的肽序列。在每種情況中，加入N端甲硫氨酸可以保證肽的適當表達。本領域普通技術人員將意識到可以容易地用本文所述的生物活性分析方法評估添加任何特定的N端延伸的效果。
d.變體CEMA和CEMA相關肽
可以將編碼CEMA或CEMA相關肽的核酸序列進行操作，從而使它編碼變體CEMA或CEMA相關肽。這可以通過各種方法進行，例如通過採用定向位點誘變或聚合酶鏈式反應(PCR)。或者，因為這些肽是相對短的分子，可以從頭簡單地合成變體肽的編碼區並導入適當的表達載體。
胺基酸序列最簡單的修飾包括用一個或多個胺基酸取代具有相似生物化學特性的胺基酸。這些所謂的「保守取代」似乎對得到的肽的活性影響最小。所以，本發明可以利用一個或多個保守胺基酸取代而有差異的肽來代替CEMA和CEMA相關肽，如ECEMA(SEQ IDNO4)。表1表示了在蛋白質中可以取代的各個原始胺基酸，並且被認作保守取代的胺基酸。
表1
通過選擇比表1更不保守的取代，即選擇對維持下列結構效果區別更明顯的殘基可以獲得主題肽的功能或任何各種其它特徵的更基本的變化(a)取代區域中多肽主鏈的結構，例如摺疊或螺旋構型，(b)靶位點分子的電荷或疏水性，或(c)大塊側鏈。一般而言，期望在蛋白質特性中產生最大變化的取代是(a)用親水殘基，例如絲氨醯或蘇氨醯取代疏水殘基，例如亮氨醯、異亮氨醯、苯丙氨醯、纈氨醯或丙氨醯，或後面的取代前面的；(b)用半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它殘基，或相反；(c)用具有正電的側鏈的殘基，例如賴氨醯、精氨醯或組氨醯取代負電的側鏈，例如穀氨醯或天冬氨醯，或相反；或(d)用具有大塊側鏈的殘基，例如苯丙氨酸取代不具有側鏈的殘基，例如甘氨酸，或相反。假如保留了CEMA的生物活性，那麼具有一個或多個更多基本變化的變體肽也可以用於本發明。
也可以將廣泛的胺基酸變化改造成變體CEMA或CEMA肽。但是，如上所述，這樣的變體肽的特徵通常為與各個天然存在的胺基酸序列在全長比對上具有至少40％的序列同一性，序列同一性的確定利用的是如上所述的任何比對程序。另外，這些變體肽將保留生物活性。
利用如上所述的任何分析系統可以證明變體CEMA肽具有生物活性。在證實了肽具有所需的活性後，利用標準分子生物學技術可以容易地生產編碼肽的核酸分子。如果合適，可讀框的選擇將考慮待表達肽的植物物種偏愛使用的密碼子。III.在植物中導入CEMA和CEMA相關肽
在已經生產編碼CEMA或CEMA相關肽如ECEMA的核酸序列後，為了給予對植物的病原體抗性，可以利用標準技術來表達轉基因植物中的序列。基本途徑是將核酸克隆進轉化載體，以使得核酸與植物細胞中指導核酸表達的控制序列(例如啟動子)可操作連接。然後，通過任何技術(例如電穿孔)在植物細胞中導入轉化載體。從細胞中產生了完整的植物，選擇含有導入核酸的子代植物。如願地，所有或部分轉化載體穩定地整合進了植物細胞的基因組或細胞器如線粒體和/或葉綠體的基因組中。整合進植物細胞並含有導入序列和控制表達的相關序列(導入「轉基因」)的轉化載體部分可以稱為重組表達盒。
根據改變的表型測定可以選擇含有導入轉基因的子代。這樣的表型可以直接從由導入序列給予的疾病抗性中產生或者由於在轉化載體中摻入了顯性可選擇的標記基因而明顯表現出對化學試劑(如抗生素)的增強的抗性。
用克隆的核酸序列轉化來修飾植物特徵的成功例子在技術和科學文獻中有很多。選擇的用於說明本技術領域知識的例子包括
美國專利5,571,706(「植物病毒抗性基因和方法」)
美國專利5,677,175(「植物病原體誘導的蛋白質」)
美國專利5,510,471(「用於轉化植物的嵌合基因」)
美國專利5,750,386(「病原體抗性轉基因植物」)
美國專利5,597,945(經遺傳增強疾病抗性的植物「)
美國專利5,589,615(「通過表達修飾的2S儲藏白蛋白生產營養價值增高的轉基因植物的方法」)
美國專利5,750,871(「白菜物種中的轉化和外源基因的表達」)
美國專利5,268,526(「轉基因植物中的光敏色素的過量表達」)
美國專利5,780,708(「可育轉基因玉米植物」)
美國專利5,538,880(「製備可育轉基因玉米植物的方法」)
美國專利5,773,269(「可育轉基因燕麥植物」)
美國專利5,736,369(「生產轉基因穀類植物的方法」)
美國專利5,610,042(「穩定轉化小麥的方法」)
美國專利5,576,198(「植物質體中的轉基因構建體的控制表達」)
這些例子包括轉化載體選擇、轉化技術和設計過量表達導入轉基因的構建體構建的說明。a.植物類型
各種病原體引起的疾病能夠影響許多植物種類。敏感植物包括單子葉、雙子葉和裸子植物。所以，例如CEMA和/或CEMA相關的肽可導入的植物物種包括但不限於玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、莢果、油菜/卡諾拉、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、菸草、亞麻、花生、三葉草、豇豆和葡萄；蔬菜如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、土豆、胡蘿蔔、小蘿蔔、豌豆、小扁豆、甘藍、椰菜、花莖甘藍、湯菜和椒；樹果實如檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃；樹如花旗松、火炬松木、白楊和榆木；花如蘭花、康乃馨和玫瑰百合；和可可豆、咖啡和橡膠。b.載體的構建和啟動子的選擇
已經敘述了適於穩定轉染植物細胞或適於建立轉基因植物的大量重組載體，包括下面文獻中敘述的那些Pouwels等，Cloning VectorALaboratory Manual，1987；Weissbach and Weissbach，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，5173-184，1989；和Gelvin等，PlantMolecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990。通常，植物轉化載體包括在5』和3』調節序列的轉錄控制下的一個或多個克隆序列以及包括顯性可選擇標記。這樣的植物轉化載體通常也含有啟動子調節區(例如，控制可誘導或構成的表達、環境調節的或發育調節的表達或細胞特異或組織特異表達的調節區)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。
可以用於表達轉基因的構成植物啟動子的例子包括椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，其能在大多數植物組織中給予構成的、高水平的表達(參見例如，Odel等，Nature 313810，1985；Dekeyser等，Plant Cell，2591，1990；Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220389，1990；和Benfey和Chua，Science 250959-966，1990)；胭脂鹼合酶啟動子(An等，Plant Physiol.88547，1998)；章魚氨酸合酶啟動子(Fromm等，Plant Cell 1977，1989)；具有翻譯增強子序列的2xCaMV/35S啟動子(Kay等，Science 2361299-1302，1987)；和葉綠體16S rRNA啟動子(Daniell等，Nat.Biotech.16345-348，1998)。
在對環境、激素、化學品和/或發育信號應答中調節的各類植物基因啟動子也可以用於植物細胞中轉基因的表達，這些啟動子包括由一種或多種下面的信號所調節的啟動子(a)熱(Callis等，Plant Physiol.88965，1988；Ainley等，Plant Mol.Biol.，2213-23，1993；和Gilmartin等，Plant Cell 4839-949，1992)；(b)光(例如豌豆rbcS-3A啟動子，Kuhlemeier等，Plant Cell 1471，1989和玉米rbcS啟動子，Schaffner和Sheen，Plant Cell 3997，1991)；(c)激素(例如抗壞血酸，Marcotte等，Plant Cell 1471，1989)；(d)創傷(例如土豆PinII啟動子，Keil等，Nucl.Acids.Res.145641-5650，1986；農桿菌mas啟動子，Langridge等，Bio/Technology 10305-308，1989；和葡萄酒vst1啟動子，Weise等，Plant Mol.Biol.26667-677，1994)；和(e)化學品(例如甲基茉莉酸或唾液酸，Gatz等，Plant Mol.Biol.4889-108，1997)。
或者可以將特異於組織(例如根、葉、花和種子)的啟動子(Carpenter等，Plant Cell 4557-571，1992；Denis等，Plant Physiol.1011295-1304，1993；Opperman等，Science 263221-223.1993Stockhause等，Plant Cell 9479-489，1997；Roshal等，EMBO J.61155，1987；Schemthaner等，EMBO J.71249，1988；Yamamoto等，PlantCell 3371-382，1990；和Bustos等，Plant Cell 1839-1989)與編碼序列融合以獲得在各個器官中特異表達。
植物轉化載體也可以包括RNA加工信號，例如內含子，其可以定位在轉基因中可讀框(ORF)序列的上遊或下遊。另外，表達載體也可以包括來自植物基因的3』未翻譯區的其它調節序列，例如可以增強mRNA穩定性的3』終止子區，如土豆的PI-II終止子區域或章魚氨酸或胭脂鹼合酶(NOS)3』終止子區。
最後，如上所述，植物轉化載體也可以包括顯性可選擇標記基因，從而使得容易地選擇轉化體。這樣的基因包括編碼抗生素抗性(例如對潮黴素、卡那黴素、博來黴素、G418、鏈黴素或壯觀黴素的抗性)和除草劑抗性(例如膦絲菌素醯基轉移酶)的那些基因。c.轉化和繁殖技術
單子葉和雙子葉植物細胞和細胞器的轉化和再生現在已經是常規技術，適當的轉化技術將由實驗者來確定。方法的選擇將根據待轉化的植物類型而變化；本領域技術人員將能夠識別對於給定植物類型特定方法的適宜性。適當的方法可以包括但不限於電穿孔植物原生質體；脂質體介導的轉化；聚乙二醇(PEG)介導的轉化；利用病毒的轉化；微注射植物細胞；微發射物轟擊植物細胞；真空滲透；農桿菌(AT)介導的轉化和葉綠體轉化。轉化和再生植物的常用方法敘述在本節開頭列出的專利文件中。d.選擇轉化植物
在用轉化載體轉化和再生植物後，通常利用摻入轉化載體的顯性可選擇標記選擇轉化植物。通常，這樣的標記將給予轉化植物的幼苗抗生素抗性，並且轉化體的選擇可以通過將幼苗與適當濃度的抗生素接觸來進行。
選擇也可以通過開發經轉基因給予植物的病原體抗性而完成。如下面實施例所述，這樣篩選可以在轉基因植物已經再生後完成，或(根據利用的轉基因方法)可以在植物再生之前的綠色轉基因愈傷組織上進行。IV.含有多個陽離子肽的編碼區的植物
在一些情況中，導入多個拷貝的單陽離子肽基因或編碼不同陽離子肽的幾個基因可以增強由單個拷貝編碼CEMA或CEMA相關肽的轉基因所給予的抗性水平。
通過利用遺傳工程，在單個載體中導入多個陽離子肽的編碼區是可能的。通常(雖然不是必需的)這樣的載體含有兩個或多個各自與其自身5』-和3』-調節序列可操作連接的CEMA和/或CEMA相關的可讀框(ORF)。當導入植物中時，這樣的載體可以導致多個陽離子肽種類的表達。
利用標準育種技術還能產生含有多個轉基因的植物。在第一個植物中可以導入編碼第一個陽離子肽的轉基因，並在第二個植物中可以導入編碼第二個陽離子肽的第二個轉基因。然後，將得到的這兩個轉基因植物雜交產生攜帶兩個轉基因的子代。V.生產和分離CEMA和CEMA相關肽
上述的組成和方法不僅可以用於生產顯示增強的廣譜病原體抗性的植物，而且為大範圍的其它應用可以用於大規模地生產CEMA和CEMA相關肽。例如，可以純化在植物中大量產生的CEMA和CEMA相關肽，並且用於醫藥用途。本發明的另一個方面提供生產CEMA和CEMA相關肽的植物，可以用作藥用植物而不需要進一步純化陽離子肽。這樣的植物可以用於治療或預防疾病，如感染性微生物疾病和/或動物如人中的癌症。
植物生產生物活性肽現在已經廣泛使用，大量的表達和純化方法是熟知的。在Goodman等的美國專利4,956,282中可以找到使植物生產生物活性蛋白質更簡便的構建體的例子。這些構建體通常含有啟動子區和編碼後來用於純化過程的胺基酸序列的其它核酸序列。用於使CEMA和/或CEMA相關肽分離簡化的胺基酸序列隨後可以切割並丟棄。
通過在細胞內細胞器如葉綠體中轉化和表達可以增強植物中生物活性肽的生產。在這些情況中，細胞器的作用可能是增強表達以及包含該肽，從而通過過量表達預防植物毒性。這些細胞器將是高度濃縮的CEMA或CEMA相關肽的來源，從中可以分離肽。VI.具有N端延伸CAP的生產
如本文所述的ECEMA分子是N端延伸的CAP的例子。本領域的技術人員將意識到其它CAP可以修飾成含有N端延伸，並且意識到通過在CAP上添加其他胺基酸殘基，CAP的活性得到修飾，並在一些情況下，允許待成功利用的CAP保護植物免遭廣譜病原體的感染(其中「廣譜抗性表示至少對一種真菌菌株的抗性和至少對一種細菌菌株的抗性)。
所以，本發明提供了在CAP上添加N端延伸和在體外測試延伸CAP所得到的活性的方法。本發明也提供植物中測試這樣的N端延伸的CAP的方法。在SEQ ID NO5-7和11中提供了N端延伸的例子。另外，不改變N端延伸的能力可以製備這樣的延伸變體，從而使得CAP的表達與植物生理相容，即允許植物生長。變體如上所述可以含有保守的胺基酸的取代、缺失和添加。但是，這些變體N端延伸將保持足夠的抗微生物活性，從而在植物表達後上它們可以增強植物對廣譜病原體的抗性。VI.給予的抗性
細胞對細胞傳輸蛋白質的機制還沒很好了解。但是，已知從病毒分離各種運動蛋白質有利於蛋白質細胞到細胞的運動(Lucas和Wolf，Current Opinion in Plant Biology 2192-197，1999；和Lazarowitz，CurrentOpinion in Plant Biology 2332-338，1999)。另外，已經發現韌皮液含有許多蛋白質並且這些蛋白質的存在與長距離傳遞大分子如蛋白質有關(Thompson，Trends in Plant Science 4354-360，1999)。所以可能當將表達CEMA或CEMA相關肽的轉基因植物組織嫁接到其它非轉基因組織上時，轉基因組織將至少給予非轉基因部分一些病原體抗性。給予非轉基因植物組織病原體抗性在本文中稱為「給予抗性」。「給予抗性」可以通過在轉基因根莖(下面的植物組織)上嫁接幼芽(上面的植物組織)，或通過在非轉基因根莖上嫁接轉基因幼芽來建立。這樣嫁接產生的植物在本文的下面稱為「嵌合植物」。
另外可預料通過將CEMA或CEMA相關蛋白質與病毒運動蛋白質或通常存在於韌皮中的其它蛋白質共表達或可操作連接，能增強非轉基因組織的滲透。
利用交叉物種嫁接可以使嫁接方案更靈活。所以，來自例如杏仁(Prumus amygdalus)的嫁接體可以放置在桃(Prumus persica)的根莖上。這種靈活性增大了可利用給定轉基因組織的植物範圍。例如，在已經產生含有CEMA或CEMA相關肽的杏仁組織後，得到的轉基因組織不僅能用作給予其他杏仁樹抗性而且能用作給予桃樹抗性。
利用給予抗性也降低了依據本發明製備的轉基因導入環境的可能性。這是因為抗性是起源於移植體本身的，而植物的其它部分仍然無轉基因。所以，植物的果實和種子仍然是非轉基因，從而不傳導該基因。
通過防止轉基因導入植物全身，用於人消費的產品可以由非轉基因的植物生產。
另外，如上所述的嵌合植物不一定必須給予非轉基因組織病原體抗性。在一些情況下，嵌合植物的轉基因部分僅對轉基因組織提供所需的病原體抗性。實施例1.選擇和產生編碼CEMA和CEMA相關肽的核酸序列
設定引物(Oligo#15』-CAAGG AAAAA CGGTC TAGAG CATATGAAAT GGAAA C-3』(SEQ ID NO9)；和Oligo#25』-GAACT CGAGCAGCGA GCTCT TACTT AGTTA GCTTC-3』(SEQ ID NO10))各自在擴增片段的5』端具有XbaI識別位點，和在3』端具有BamHI識別位點。將質粒pR78hproCEMA(R.E.W.Hancock，Vancoucer，B.C.；Piers，等，Antimicrob.Agents Chemother.382311-2316，1994)用作PCR的模板。用NucleoSpinTM柱(CLONTECH，Palo Alto，CA，USA)純化含有編碼ECEMA序列的擴增DNA片段，用XbaI和BamHI消化，並且插入已經用XbaI和BamHI消化的載體(Promega Corp.，Madison，WI，USA)中。得到的載體命名為pSAI1。
切出含有CaMV 35S啟動子、GUS基因和NOS-ter序列的pBI121(Clontech)的HindIII-EcoRI片段，用來自pSAI1(含有增強的35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強因子、ECEMA編碼序列(SEQ IDNO3)和NOS-ter序列)的HindIII-EcoRI片段替代。得到的載體指定為pSAI4。然後，將編碼ECEMA的雙鏈DNA克隆進下述的一個或多個載體。2.含有各種啟動子序列的載體
將編碼ECEMA和CEMA的核酸序列組裝進各種植物轉化載體，從而將序列置於各種不同啟動子的轉錄控制下。
將編碼ECEMA和CEMA的核酸序列克隆進一個這樣的載體，並將各個序列置於含有兩個拷貝的CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強元件的啟動子的控制下。Kay等，Science 2361299-1302，1987。將這樣的載體產生的克隆用前綴「pD」命名。所以，例如，pDECEMA命名的是含有在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強子控制下的ECEMA構建體的載體，pDCEMA命名的是含有在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強子控制下的CEMA構建體的載體。
構建了另一個載體以使ECEMA編碼序列在重建的「超級啟動子」的控制下。從這樣的載體產生的克隆命名為pRSHECEMA。含有mas(甘露氨酸合酶)啟動子/激活子區的超級啟動子(Langridge等，Bio/Technology 10305-308，1989)在ocs(章魚氨酸合酶)上遊激活序列的三聯體(反向)的前面。文獻Ni等，The Plant J.7661-676，1995提供了這個超級啟動子更詳細的敘述。
將編碼CEMA的核酸序列克隆進含有單拷貝的CaMV 35S啟動子和來自人嗜中性防衛素蛋白質原區的另一個載體中(Daher等，Pro.Natl.Acad.Sci USA，857327-7331，1988)。得到的載體命名為「pProCEMA」。3.轉化土豆和菸草
將土豆作物，「Russet Burbank」和「Desiree」，以及菸草用作轉化的代表性植物物種。根據文獻De Block，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988，作一些修改進行植物的轉化。用文獻Holster，等，Mol.Gen.Genet.163181-187，1978所述的凍融方法進行根癌農桿菌LBA4404或MP90的轉化。
將轉化的農桿菌細胞塗抹於選擇培養基上(對LBA4404，LB+100g/mL利福黴素+50g/mL卡那黴素；對MP90，LB+10g/mL慶大黴素+50g/mL卡那黴素)。用質粒分離和限制性酶切分析證明在農桿菌細胞中存在質粒pSAI4。
用文獻De Block，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988中所述的修飾的方法進行土豆作物「Desiree」和「Russet Burbank」的轉化。從4周齡的幼苗中切掉葉(5毫米直徑)和莖，並進一步用無菌吸管尖創傷。將約15個創傷葉和莖倒浮在9釐米直徑皮氏培養皿中的15毫升「感染培養基S2」上(Murashige-Skoog(MS)培養基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962)，培養基中補充了30g/L蔗糖、0.5g/L MES(2-[N-嗎啉]乙烷磺酸pH5.5)和20g/L甘露醇)。在皮氏培養皿中加入60L攜帶質粒pSAI4的農桿菌(在含有適當抗生素的LB上生長到對數後期)。在低光強度(500勒克斯)下溫育3天後，用含有1g/L羧苄青黴素的S2培養基洗滌葉子，在無菌濾紙上拍幹，倒置於培養基S4上(Murashige-Skoog培養基補充有200mg/L穀氨酸、0.5g/L MES pH5.5、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、5g/L瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L萘乙酸(NAA)、1g/L羧苄青黴素、50mg/L卡那黴素和10g/L AgNO3)，在高光強度(3000勒克斯)下室溫溫育。兩個星期後，在葉子和莖的創傷邊緣形成了許多小的愈傷組織。將愈傷組織轉移到新鮮S6培養基(沒有NAA的S4培養基)。另兩個星期後，將愈傷組織轉移到S8培養基(加0.1mg/mL赤黴素(GA3)的S6培養基)，允許長出新芽。再兩個星期後，將第一個新苗(0.5cm長)轉移到洋紅茄子瓶中的S1培養基上(「B5」培養基，Gamborg等，Exp.Cell Res.50151-158，1968，含有20g/L蔗糖，補充150mg/LCaCl2、4g/L瓊脂糖、pH5.8，並含有1g/L羧苄青黴素和50mg/L卡那黴素)。通常一個星期後，將苗植根。將再生植物轉移到含有1g/L羧苄青黴素和50mg/L卡那黴素的MS培養基上，並且用於進一步分析。4.篩選對疾病抗性的愈傷組織
對疾病抗性分析的簡單早期檢測方法已經開發。在S4培養基(沒有蔗糖的MS培養基，並補充200mg/L穀氨酸、0.5g/L MES、pH5.7、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、0.5％瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L NAA、1g/L羧苄青黴素以及50g/mL卡那黴素，和10mg/L AgNO3)上生長對照和轉基因愈傷組織。然後將樣品於3000勒克斯光照下室溫放置，允許形成愈傷組織。兩個星期後，在葉和莖的創傷邊緣形成許多小的愈傷組織。取除小的愈傷組織並轉移到新鮮的S6培養基(沒有NAA的S4)中。2-3個星期後，將愈傷組織轉移到新鮮的培養基上並在存在植物病原體(鐮刀菌或疫黴)下生長。將存活並保持亮綠的愈傷組織計數。在對照樣品中未發現真菌抗性的愈傷組織，並且發現對真菌病原體有抗性的愈傷組織是轉化的。5.轉基因植物的分子特徵
用下述方法，從轉基因土豆和菸草植物分離DNA。在一些情況下，純化包括了更嚴格的方案；而在其他情況下，進行簡單粗提取過程。在更嚴格的抽提過程中，取10g新鮮葉組織並立即冷凍在液氮中。將冷凍組織研磨成細粉，並用20mL抽提緩衝液(50mM Tris-HCl緩衝液、5mM EDTA、0.35M山梨醇、0.1％BSA、0.1％巰基乙醇、10％聚乙二醇4000)抽提。將勻漿物通過幾層乾酪包布和一層MiraclothTM(Calbiochem，la Jolla，CA，USA)過濾。然後根據文獻Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842097-2100，1987進行最後的純化步驟。
粗提取方法主要用於製備PCR分析的樣品。對這個過程，收集約200mg新鮮葉子，在液氮中研磨成粉末。在粉末中加入100L 0.5NNaOH並混合(渦旋)30秒。離心上清液5分鐘，將5升上清液加入到45L 100mM Tris緩衝液(pH8.0)中。將得到的基因組DNA粗提液用作PCR擴增的模板。
檢測是否存在ECEMA或CEMA構建體是利用提取的基因組DNA和SEQ ID NO9和10中所示的PCR引物進行PCR反應來實現。根據這一方法，鑑定了用pDECEMA或pRSHECEMA構建體轉化的轉基因菸草和土豆植物。
在一些情況中，用Northern印跡分析證實轉基因的活性表達。用於這種分析的RNA底物從轉基因菸草和土豆植物中分離出來並純化。分離方案按照文獻Verwoerd等，Nucl.Acids Res.172362，1989進行。
在一個說明性的實施例中，pDECEMA用於轉化土豆作物。用pDECEMA通過根癌農桿菌介導轉化兩個土豆作物，Russet Burbank和Desiree。在抗生素選擇後，再生卡那黴素抗性植株。從非轉化(對照)和轉基因植物分離的基因組DNA經過PCR擴增ECEMA序列(SEQID NO3)證實了ECEMA(SEQ ID NO4)整合進了植物基因組DNA。擴增的DNA片段的大小與從pDECEMA質粒DNA擴增的片段相同。同樣，對於Desiree，轉基因植物，在轉化植物而不是非轉化植物的基因組的PCR產物中檢測到了一條帶。因此ECEMA(SEQ ID NO4)已經成功地整合進了這些轉基因土豆植物的基因組中。
用RT-PCR，在RNA水平檢測ECEMA(SEQ ID NO4)的表達。在所有Russet Burbank和Desiree作物的轉基因系中證實了有表達，而對照植物中沒有出現RNA產物。另外，在PCR之前用脫氧核糖核酸酶處理的RNA樣品中沒有帶證明RNA樣品沒有被基因組DNA汙染(圖2)。
將表達ECEMA(SEQ ID NO4)的轉基因Desiree植物和塊莖的形態學特徵與對照非轉化植物比較(圖3A-3B)。然而當與對照植物比較時，Russet Burbank中ECEMA(SEQ ID NO4)的表達在轉基因土豆植物中引起形態學變化。觀察到最明顯的變化是葉子變得捲曲以及塊莖較小和分支。在測試的所有Russet Burbank轉基因系中觀察到了這一明顯的「損傷-模擬」表型。
不論「損傷-模擬」，表達Russet Burbank ECEMA的轉基因植物的產量(總塊莖質量/植株)與對照的非轉化植株的產量相當。
表達ECEMA的Desiree植株的產量(總的塊莖質量/植株)(1845g)大於用GUS轉化的對照(1544g)和非轉化對照(1502g)。
另外，在一系列的對照實驗中，用與上面的構建體相似的方式選擇表達GUS、花旗松NADPH光敏色素P450還原酶或pProCEMA的轉基因植物。這些轉基因植物中沒有一個顯示疾病抗性特徵。6.對細菌病原體的抗性
為了檢測轉基因土豆植物對細菌病原體Erwinia carotovora cvcarotovora的抗性，2mL病原體過夜培養物(LB培養基中室溫生長)用無菌蒸餾水稀釋5倍。將1mL稀釋培養物加入試管中的2mL液體MS培養基中。將從轉基因或對照土豆植物上新切下的分枝(4cm長)插入到試管中，把各個分枝的底邊浸入細菌培養物中，並在室溫下溫育。
一星期後結果顯示，對照植物嚴重感染並且生長抑制。隨後植物死亡。相反，轉基因植物未感染並繼續生長，這表明ECEMA的表達增強了土豆植物對這種細菌病原體的抗性。
從表達CEMA和ECEMA的「Desiree」植株(以及對照植株)收穫的塊莖也被用於塊莖-組織對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌抗性的測試。對於定性試驗，在用無菌木栓穿孔器從塊莖製備的復盤(2cm直徑，1cm厚)表面上移液20升100x稀釋的過夜細菌培養物(大約2×107CFU)。然後室溫下將塊莖復盤在皮氏培養皿中溫育6天。對於定量試驗，在每個塊莖復盤(2cm直徑，3cm厚)中打一小孔。在每個小孔中移入20μ1 100×稀釋細菌過夜培養物，並室溫溫育復盤6天。然後從塊莖復盤中輕柔地除去腐爛的組織，測定餘下組織的質量。
結果表明，在用2×107CFU的胡蘿蔔軟腐歐文氏菌溫育6天後，對照(C；圖4A)土豆塊莖由於軟腐已經丟失了約60％的鮮重。來源於用胡蘿蔔軟腐歐文氏菌感染的轉基因Desiree植物(ME1、ME2、ME3 圖4A)的塊莖復盤的重量的損失小於5％，並且是與未感染的復盤比較的(圖4A)。在另一個實驗中，來自對照(未轉化)的土豆的復盤已經降解了大部分，而來自表達ECEMA的植株的復盤未受影響。在4℃儲藏6個月後，來自未轉化的土豆的塊莖的約1/3自然感染並腐爛，而所有表達ECEMA的轉基因株系仍然健康無疾病徵兆。7.對真菌的抗性
利用下面的方法測試成熟植株對各種真菌的抗性。切下含有鐮孢和疫黴的培養基塊(1cm×1cm×0.5cm)，放置於9釐米皮氏培養皿的V8瓊脂培養基(250ml/L V8汁，7g/L瓊脂)新鮮平板的中央，並在室溫下生長約1個月，或直到真菌菌絲體完全覆蓋了皮氏培養皿。切下轉基因植株的幼苗(約10cm)並轉移到MS培養基中進一步生長。根據不同的處理，允許植株生長3天或2星期直到幼苗長根。然後，將兩塊(1cm×1cm×0.5cm)的真菌瓊脂加到植株幼苗的兩邊，而不損傷幼苗。然後肉眼鑑定得到的感染程度。
在代表性實驗中，將用pDECEMA或pProCEMA轉化的各個轉基因土豆植株(Russet Burbank和Desiree)、用pRSHECEMA、pDECEMA或pProCEMA轉化的菸草植株和對照土豆和菸草植株與仙人掌疫黴接觸。7天後，在MS培養基表面已經生長了仙人掌疫黴，並且滲入了對照植株的根和莖中，引起致命的植物功能損傷。顯然對照植株的根嚴重損傷。對照植株和真菌的相互作用引起了指示腐敗的黃棕色素的分泌。隨後，對照植株失去水分，葉子捲曲，各個莖的底邊發軟，根死亡。相反，轉基因植株卻健康地生長，未顯現疾病症狀，甚至在真菌菌絲體完全覆蓋了MS培養基後也一樣。
在另一個實驗中，用茄病鐮孢攻擊pDCEMA轉基因土豆植株和用pProCEMA轉化的對照土豆植株。6天後，鐮孢生長覆蓋了MS培養基的表面。對照植株的根損傷嚴重。對照植株的莖的基部滲入了鐮孢，莖鬆軟，感染的葉子脈明顯變棕色並壞死。幾天後，對照植株倒下死亡。但是，轉基因植株甚至在茄病鐮孢極度橫行的情況下還繼續生長。
用pDECEMA轉化的Russet Burbank和Desiree植株和植物病原體真菌茄病鐮孢進行相似的一組實驗。感染6天後，在MS培養基表面長滿了鐮孢，並且對照植株的根和莖嚴重損傷。感染後11天，對照植株死亡，而轉基因植株仍然生長正常，無感染的跡象。
ECEMA的表達大大地增強了Russet Burbank和Desiree植株對細菌(歐文氏桿菌)以及真菌(鐮孢、疫黴)植物病原體的抗性，這使得ECEMA成為植物抗微生物中非常有前途的工具。雖然沒有損傷模擬效果，但這些結果在菸草中已經得到重複。上述方案包括採用高水平的攻擊性病原體共培養和以生存作為終點，對疾病抗性高度嚴格生物分析，而其它方案依賴於較不嚴格的分析，例如以對損傷形成增強的抗性作為感染性指徵(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956531-6536，1999；和Heo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96776-771，1999)。
當整個植株生長在病原體中時，上述的攻擊模型更接近地代表野外情況是可能的，在野外土壤和感染植株提供恆定的植物病原體儲備。在這方面，本文所述的轉基因植株在存在細菌和真菌病原體時已經生長了2個月以上，而仍沒有疾病的跡象。進一步，在4C下儲藏一年，此法生產的轉基因土豆塊莖保留了他們的抗微生物特徵，並且保持了對歐文氏桿菌軟腐的抗性。下面所述的ECEMA的提取也使得估計的ECEMA濃度約為3-4μg/g原始塊莖組織，該濃度足以保護塊莖不受細菌的攻擊。另外，預先的一個月的餵養實驗表明來自表達ECEMA的轉基因土豆植株的塊莖對小鼠是沒有毒性的。
在如上述的轉基因Russet Burbank土豆的情況下，ECEMA的構成性表達也可以引起與所謂「損傷-模擬」表型相似的形態學變化。植物中外源基因的表達能引發通常只在發病過程中試圖去除病原體時所激活的植物-防衛機制的活化，已經觀察到這一現象。Mittler等，TrendsMicrobiol.410-15，1996；Abad等，Mol.Plant Microbe Interact.10635-645，1997；和Dempsey等，Trends Microbiol.654-61，1997。但是，在這些前面所報導的觀察中，轉基因植株顯示損傷-模擬應答，但植株未顯示廣譜的病原體抗性。與本文所報導的數據相反，表達ECEMA的Russet Burbank植株具有高水平的抗微生物活性，即使這些植株具有損傷模擬應答。所以能認為本文公開的在對轉基因表達的應答中顯示損傷模擬的轉基因植株將保留病原體抗性。8.生物活性ECEMA的生產
將10克來自土豆塊莖的組織在液氮N2中研磨成精細粉末，並用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑雞尾酒(P9599，Sigma)的10mL抽提緩衝液(EB；50mM Bicine-NaOH，pH9.0；1mM EDTA；20mM NaCl；1％TritonX-100)在4C抽提30分鐘。將勻漿物12000rpm(BeckmanJ2-21)4C離心30分鐘，並將上清液通過0.45μm濾紙過濾以除去微粒物質。將得到的勻漿物加到用EB平衡的陽離子交換柱HiTrapTMSP(0.7×2.5cm；Pharmacia Biotech，Sweden)。在用6個柱體積的含有蛋白酶抑制劑的EB洗滌後，用含有蛋白酶抑制劑的EB中NaCl梯度(0.2M、0.3M和0.5M)洗脫結合的蛋白質和肽。然後在Tricine-SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分析各個組分(Schagger等，Anal.Biochem.166368-379，1987)，並且用於體外抗細菌分析。
利用上述的提取方法，從轉基因土豆塊莖中證明了ECEMA的存在並部分純化了ECEMA。進一步，只在含有和ECEMA同樣大小肽的那些級分中觀察到了殺菌活性(以胡蘿蔔軟腐歐文氏菌作為靶子)(
圖1B)。在同齡的對照和非轉基因的塊莖中完全缺乏肽和殺菌活性。這些結果證明來自轉基因植株的塊莖含有生物活性ECEMA，其濃度足以在4℃延長儲藏過程中保留他們的抗菌特性。9.抵抗後期枯萎(仙人掌疫黴分離株US-8和US-11)的轉化植物和塊莖
在黑麥瓊脂上培養兩個仙人掌疫黴菌株(US-11A1和US-8A11)。通過在2升蒸餾水中煮沸120g有機生長的黑麥顆粒製備黑麥瓊脂。然後，將水保持沸騰煮到1000-1250mL。接著通過在乾酪包布上的幹濾器除去顆粒濾幹得到的混合物。然後，2000rpm離心收集的上清液5分鐘，用蒸餾水將體積加到2升。加入2g葡聚糖和27g BactoAgarTM，高壓滅菌培養基(121℃、40分鐘)，然後冷卻並傾倒。
為了接種植物，用水稀釋兩個菌株，產生含有5000-10000個孢子囊/mL的後期枯萎孢子囊懸浮液，其在5℃冷凍產生動孢子。將得到的含孢子囊的混合物噴灑在具有已知後期枯萎抗性的5個標準土豆株系和ECEMA轉基因Desiree植株。讓植物生長在塑料帳篷中，並引入霧促進疾病發生。
在接種後7、14和21天進行葉子比例計算以評估後期枯萎引起的脫葉百分數。結果表明轉基因土豆植株(Desiree)比測試的五個對照株系的任何一個更能抵抗後期枯萎(圖5)。
進行相似的實驗以評估轉基因塊莖(Desiree)對後期枯萎的抗性。在接種前每個土豆株系洗滌15到20個塊莖，以便從塊莖表面除去土壤並選擇那些沒有疾病症狀的塊莖。對於US-8和US-11的各個表型，將各個土豆株系的重複塊莖在後期枯萎孢子囊懸浮液中蘸接種。研究中也包括五個已知有枯萎抗性的土豆株系。在封閉的氣候控制室中12℃、95-100％溼度下溫育接種的土豆塊莖14-21天。結果表明轉基因塊莖對後期枯萎比測試的五個對照株系中的任何一個都更有抗性。
在多個實施方案和實施例中已經敘述和說明了本發明的原理，本領域的技術人員應該明白本發明可以在排列和細節上作修改而不脫離這些原理。我們要求保護在下面權利要求的精神和保護範圍內的所有修改部分。
序列表
序列表維多利亞大學創新和發展公司顯示廣譜病原體抗性的轉基因植物
(Transgenic Plants Exhibiting Resistance to a Spectrum of Pathogen)3055-22/PAR60/165,2491999-11-1211PatentIn Ver.2.1187DNA人工序列人工序列描述編碼陽離子肽的改造DNA序列1aaatggaaac tgttcaagaa gatcggcatc ggcgccgtgc tgaaactgct gaccaccggt 60ctgccggcgc tgaagctaac taactaa 87228PRT人工序列人工序列描述改造的陽離子肽2Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val 1 5 10 15Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu Thr Lys
20 253105DNA人工序列人工序列描述編碼ECEMA的核酸序列3atggctctag agcatatgaa atggaaactg ttcaagaaga tcggcatcgg cgccgtgctg 60aaagtgctga ccaccggtct gccggcgctg aagctaacta agtaa 105434PRT人工序列人工序列描述改造的陽離子肽4Met Ala Leu Glu His Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile 1 5 10 15Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu
20 25 30Thr Lys54PRT人工序列人工序列描述N-端延伸5Ala Met Trp Lys 164PRT人工序列人工序列描述N-端延伸6Ala Ser Arg His 174PRT人工序列人工序列描述N-端延伸7Ala Leu Trp Lys 1824PRTRana temporaria8Glu Glu Glu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asp Glu 1 5 10 15Arg Asp Val Gln Val Glu Lys Arg
20936DNA人工序列人工序列描述PCR引物9caaggaaaaa cggtctagag catatgaaat ggaaac 361035DNA人工序列人工序列描述PCR引物10gaactcgagc agcgagctct tacttagtta gcttc 35116PRT人工序列人工序列描述N-端延伸11Met Ala Leu Glu His Met 1 權利要求
1.轉基因植物，其表達選自CEMA和CEMA相關肽的陽離子肽。
2.轉基因植物，其包含重組核酸分子，其中核酸分子編碼選自CEMA和CEMA相關肽的肽。
3.根據權利要求2的轉基因植物，其中肽包括選自在SEQ IDNO2和SEQ ID NO4中所闡述的胺基酸序列的胺基酸序列。
4.根據權利要求3的轉基因植物，其中肽進一步包括長度少於25個胺基酸的N端肽延伸。
5.根據權利要求3的轉基因植物，其中肽進一步包括長度小於25個胺基酸的C端肽延伸。
6.根據權利要求4的轉基因植物，其中N端肽選自SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO11。
7.轉基因植物，其含有重組核酸分子，其中核酸分子編碼具有選自P-C和P-E公式的融合肽，其中C是CEMA肽，E是CEMA相關肽和P是陰離子原區肽。
8.轉基因植物，其包含編碼具有選自P-S-C和P-S-E公式的融合肽的重組核酸分子，其中C是CEMA肽，E是CEMA相關肽，P是陰離子原區肽和S是間隔肽。
9.轉基因植物，其包含編碼包括胺基酸序列的肽的核酸分子，所述胺基酸序列選自
(a)SEQ ID NO2和SEQ ID NO4；
(b)與(a)中特定胺基酸序列相差一個或多個保守胺基酸取代的胺基酸序列；和
(c)與(a)中特定胺基酸序列至少共享40％的序列同一性的胺基酸序列，其中肽具有CEMA生物活性。
10.根據權利要求9的轉基因植物，其中肽進一步包括與肽的N端可操作連接的陰離子原區肽。
11.根據權利要求9的轉基因植物，其中肽進一步包括N端延伸。
12.根據權利要求9的轉基因植物，其中肽進一步包括C端延伸。
13.轉基因植物，其包含編碼包括胺基酸序列的肽的重組核酸分子，所述胺基酸序列選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。
14.根據權利要求1、2、7、8、9和13任一個的轉基因植物，其中轉基因植物選自土豆、菸草、玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、莢果、油菜/卡諾拉、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、白菜、棉花、亞麻、花生、三葉草、萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、胡蘿蔔、小蘿蔔、豌豆、小扁豆、甘藍、椰菜、花莖甘藍、湯菜、椒和其它蔬菜；檸檬、蘋果、梨、桃、杏和胡桃和其它果樹；蘭花、康乃馨、玫瑰和其它花；可可豆、咖啡和橡膠樹；花旗松、雲杉、松和其它針葉樹；白楊、榆木和其它落葉樹；和草皮和草坪草。
15.根據權利要求14的轉基因植物，其中轉基因植物是土豆植物。
16.根據權利要求14的轉基因植物，其中轉基因植物是菸草植物。
17.生成至少一種陽離子肽的方法，該方法包括依據權利要求1、2、7、8、9、13和23的任何一個繁殖至少一種轉基因植物，和分離陽離子肽，其中肽是從完整的植物、部分植物或細胞內細胞器分離的。
18.轉基因植物，其表達與陽離子肽可操作連接的末端延伸序列。
19.根據權利要求18的轉基因植物，其中N端延伸序列包括小於25個胺基酸的殘基。
20.根據權利要求19的轉基因植物，其中N端延伸選自SEQ IDNO5、6、7和11。
21.生產轉基因植物的方法，所述轉基因植物給予廣譜病原體抗性的末端延伸的陽離子肽並且與植物生理相容，該方法包括
(a)用編碼N端延伸的陽離子肽的核酸序列轉化植物細胞；
(b)在植物中表達末端延伸的陽離子肽；和
(c)確定表達末端延伸肽的植物對廣譜病原體具有抗性。
22.權利要求21的方法，其中N端延伸序列選自SEQ ID NO5、6、7和11。
23.轉基因植物，由權利要求21的方法生產。
24.生成至少部分具有增強的保存期或儲藏期的植物的方法，該方法包括
(a)根據權利要求1、2、7、8、9、13和23中的任一個種植轉基因植物；和
(b)收穫至少部分植物，其中收穫的植物部分比非轉基因對照保持更長時間的無病原體感染。
25.轉基因植物部分，其中植物部分選自切花、果實、蔬菜和草。
26.嵌合植物，其包含第一部分和第二部分，其中第一部分含有來自權利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉基因植物的組織，第二部分含有非轉基因植物組織。
27.根據權利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉基因植物，其中轉基因植物顯示與非轉基因對應物相比增加的植株產量或植株產物的產量。
28.根據權利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉基因植物，其中轉基因植物對仙人掌疫黴導致的晚期枯萎顯示抗性。
29.根據權利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一個的轉基因植物，其中轉基因植物對胡蘿蔔軟腐歐文氏菌導致的軟腐顯示抗性。
全文摘要
公開了表達抗微生物的CEMA和/或與CEMA相關肽的轉基因植物。在一些實施方案中,這些植物具有增強的廣譜病原體抗性,並且可用作農作物或園藝作物。在其它實施方案中,這些植物用於生產大量的CEMA和/或與CEMA相關的肽。
文檔編號C12N15/82GK1390262SQ0081559
公開日2003年1月8日 申請日期2000年7月14日 優先權日1999年11月12日
發明者桑託什·米斯拉, 威廉·D·凱, 米蘭·奧蘇斯基 申請人:維多利亞大學創新和發展公司