新蛋白質及其應用的製作方法
2023-06-11 20:56:06 1
專利名稱:新蛋白質及其應用的製作方法
技術領域:
本發明涉及新的分泌蛋白質等。
背景技術:
迄今為止,發現與癌相關的基因有細胞增殖因子,與受體相關的基因有腦腫瘤的PDGF(RossR.,Nature 1993,362801)、乳腺癌的erb-B、erb-B2(Cell1983;35,718,Burden S,Neuron 1997;18,847)等,除此之外,還大量發現與促進信號傳導的大腸癌相關的Ki-ras;白血病相關的N-ras;由轉錄因子激活細胞增殖促進基因而導致的白血病、乳腺癌、胃癌等相關的c-myc(Maheswaran,Mol Cell Biol,1994;14(2)1147);成神經細胞瘤相關的N-myc(Schwab,Nature 1983;305.245);肺癌相關的L-myc(Nau,Nature 1985;318,69);甚至還有與Bcl-2、Bcl-1、MDM2等濾泡B細胞淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部癌、p53癌抑制蛋白相拮抗的蛋白質等蛋白類基因(Reed,Nature1997;387,773,Donehower,Nature 1992,356,215)等。此外,又發現與所述這類基因不同,它們當中很多都具有抑制癌細胞擴增作用的基因即APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTS1、RB、P53、WT1等(Weinberg,ScientificAmerican,1996,September,32)。當發現以上這些基因導致細胞、組織癌症化時分析其表達的特異蛋白質,並根據其胺基酸序列信息進行鑑定,其基因表達的過程是多種多樣的。僅僅就現在已經被表達的這些基因來說,仍然不能解釋癌的發病機理以及癌症治癒的機制。
最近很多研究還是從人的基因開始分析研究並報導了機能不詳的EST鹼基序列。
因此,通過機能不詳的EST來探索與癌有特異關係的蛋白質基因,丞待開發新的癌症治療藥物或預防藥物。
發明公開本發明人為了解決上述課題,經過反覆研究,終於以EST鹼基序列為基礎探索出具有新的鹼基序列的分泌型蛋白質基因,並研究出由此編碼的分泌型蛋白質在癌細胞中如何進行特異性表達等。
本發明人基於這些研究,經反覆探索終於完成了此發明。
即,本發明提供(1)蛋白質或其鹽,其特徵在於,它含有與SEQ ID NO1所示胺基酸序列相同或基本相同的胺基酸序列;(2)(1)中所述蛋白質或其鹽,其中與SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的胺基酸序列為SEQ ID NO5所示序列;(3)(1)中所述蛋白質或其鹽,其合成於癌細胞;(4)(1)中所述蛋白質的部分肽或其鹽;(5)(4)中所述部分肽或其鹽,其具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第26位至第34位的胺基酸序列;(6)(4)中所述部分肽或其鹽,其具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第166位至第190位的胺基酸序列;(7)(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽的製造方法,其特徵在於,培養經含有編碼(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽的DNA重組載體轉化形成的轉化體,使之產生該蛋白質或該部分肽;(8)(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽的抗體;(9)(8)中所述抗體為單克隆抗體;(10)(8)中所述抗體為(4)中所述部分肽或其鹽的抗體,其中部分肽或其鹽具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第26位至第34位胺基酸序列;(11)(8)中所述抗體為(4)中所述部分肽或其鹽的抗體,其中部分肽或其鹽具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第166位至第190位胺基酸序列;(12)一種診斷藥物,該藥物包含(8)中所述抗體;(13)一種藥物,該藥物包含(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽或(8)中所述抗體;(14)篩選能夠促進或抑制(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽的方法,其特徵在於,應用(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽;(15)(14)中所述篩選法,其中所述活性為細胞增殖活性;(16)篩選能夠促進或抑制(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽的試劑盒,該試劑盒包含(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽;(17)能夠促進或抑制(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽,該化合物或其鹽通過使用(14)中所述篩選法或(16)中所述篩選試劑盒獲得;(18)一種藥物包含能夠促進或抑制(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽,該化合物或其鹽通過使用(14)中所述篩選法或(16)中所述篩選試劑盒獲得;(19)(18)中所述藥物為治療或預防癌症之藥物。
本發明進一步提供(20)(1)中所述蛋白質或其鹽,其中與SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的序列其同源性約不低於70%,優選約不低於80%,更優選約不低於90%,最優選約不低於95%的胺基酸序列;(21)(1)中所述蛋白質或其鹽,其中與SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的胺基酸序列為,①SEQ ID NO1所示胺基酸序列中缺失1-5個胺基酸(優選其中缺失1-3個)、②SEQ ID NO1所示胺基酸序列中附加1-10個胺基酸(優選其中附加1-5個、更優選其中1-3個)、③SEQ ID NO1所示胺基酸序列中被其它胺基酸置換1-5個(優選其中置換1-3個)、或者④由以上所述序列組合形成的胺基酸序列;(22)(14)中所述篩選法,其特徵在於,(i)當基質與(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽接觸時,和(ii)當基質和待測化合物與(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽接觸時,測定並比較(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽的活性;(23)一種藥物,它包含能夠促進(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或它們之鹽活性的化合物或其鹽,該化合物或其鹽通過使用(14)中所述篩選法或(16)中所述篩選試劑盒獲得;(24)(23)中所述藥物為病變組織摘除後的再生藥物;(25)一種藥物,它包含能夠抑制(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或它們鹽直活性的化合物或其鹽,該化合物或其鹽通過使用(14)中所述篩選法或(16)中所述篩選試劑盒獲得;(26)(25)中所述藥物為治療或預防癌症之藥物;
(27)一種待測溶液中的(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽之定量法,其特徵在於,使(8)中所述抗體與待測液及標記的(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或它們鹽之間發生競爭反應,進而測定結合到該抗體上的標記的(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽的比例;以及,(28)一種待測溶液中的(1)中所述蛋白質或(4)中所述部分肽或其鹽之定量法,其特徵在於,使待測液與固相載體的(8)中所述抗體及標記的(8)中所述抗體之間進行同時反應或連續反應,反應後,測定固相載體上的標記試劑之活性。
本發明,又提供(29)一種雜合體,其具有產生(9)中所述單克隆抗體的能力;(30)(8)中所述抗體為中和抗體;(31)(8)中所述抗體為人型抗體;(32)一種藥物,包含(31)所述抗體;(33)(32)中所述藥物為治療或預防癌症之藥物;(34)一種藥物,它所包含的化合物或其鹽具有抑制自然殺傷細胞的細胞增殖抑制活性,其中細胞增殖抑制由(1)中所述蛋白質或其鹽或(4)中所述部分肽或其鹽所致;(35)(34)中所述藥物為治療或預防癌症之藥物。
圖1表示在實施例1中得到的編碼本發明蛋白質的DNA鹼基序列以及由該鹼基序列推導的胺基酸序列。
圖2表示在實施例2實施的Northern印跡電泳圖象。在A圖(正常組織)中,1為腦、2為心臟、3為骨骼肌、4為大腸、5為胸腺、6為脾臟、7為腎臟、8為肝臟、9為小腸、10為胎盤、11為肺、12為外周血,在B圖(癌細胞)中,1為早幼粒細胞性白血病細胞HL-60、2為子宮頸癌Hela細胞、3為慢性骨髓性白血病細胞K-562、4為淋巴肉瘤性白血病細胞MOLT4、5為人體Burkitt淋巴瘤B細胞Raji、6為人體結腸癌細胞SW480、7為人體肺癌細胞A549以及9為黑色素瘤細胞G361。
圖3表示在實施例2實施的Northern印跡電泳圖象。在C-1圖中,1為人肺癌細胞RERF-LC-A1、2為人肺癌細胞NCI-H345、3為人肺癌細胞NCI-H460、4為人肺癌細胞NCI-H1299、5為人胎兒正常成纖維細胞MRC-5、6為人胎兒正常成纖維細胞WI-38、7為大腸癌細胞HT-29、8為大腸癌細胞WiDr、9為乳腺癌細胞MCF-7。
在C-2圖中,1為成神經細胞瘤細胞GOTO-P3、2為成神經細胞瘤細胞IMR-32、3為神經膠質瘤細胞U-251、4為神經膠質瘤細胞KNS42、5為神經膠質瘤細胞KNS81。
在C-3圖中,1為肺癌細胞NCI-H345、2為成神經細胞瘤細胞IMR-32、3為前列腺癌細胞LNCap、4為前列腺癌細胞PC-3、5為成神經細胞瘤細胞GOTO-P3、6為早幼粒細胞性白血病細胞HL-60、7為黑色素瘤細胞Bowes、8為乳腺癌細胞MCF-7。
圖4表示在實施例4中實施的Western印跡電泳圖象。圖中,1、2為溶胞產物(Cell lysate)、3、4為培養上清液(Culture supernatant)、5為Mock(只含有COS-7細胞的培養上清液)。
圖5表示在實施例5中得到的編碼本發明蛋白質的DNA鹼基序列以及由該鹼基序列推導的胺基酸序列。
圖6表示在實施例6中實施的Northern印跡電泳圖象。圖中,9為人胃癌細胞AGS、10為人體胰腺癌細胞PANC-1、11為人體子宮內膜瘤細胞AN3CA、12為人體子宮內膜瘤細胞KLE、13及14為人軟骨瘤細胞SW1353、15為人體子宮內膜瘤細胞SKN、16為腎腺癌細胞ACHN。
圖7表示在實施例14中測定的小鼠抗血清中抗體效價的結果。
圖中分別表示,各孔中加有下列抗血清的吸光度,如■小鼠1抗血清、□小鼠2抗血清、▲小鼠3抗血清、△小鼠4抗血清、●小鼠5抗血清、○小鼠6抗血清、|小鼠7抗血清、◇小鼠8抗血清。
圖8表示在實施例17中實施的競爭法-EIA的結果。
圖中分別表示由■雜合體No.39-35、□雜合體No.53-16、▲雜合體No.61-2、△雜合體No.76-12、●雜合體No.85-16、○雜合體No.112-3、◆雜合體No.128-18、◇雜合體No.139-26、×雜合體No.151-2產生的單克隆抗體之B/B0值。
又,每個培養上清液的稀釋倍率如下No.39-3550倍No.53-1650倍
No.61-2120倍No.76-1260倍No.85-16120倍No.112-3450倍No.128-18450倍No.139-26120倍No.151-260倍圖9表示在實施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印跡結果。
圖中1、3、5表示CHO-K1/TGC838N-4培養上清液的電泳帶,2、4、6表示CHO-K1/618/839F6-3培養上清液的電泳帶。另外,作為第一抗體,1、2使用了128-18抗體(實施例18)、3、4使用了112-3抗體(實施例18)、5、6使用了家兔抗血清(實施例19)。
圖10表示在實施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印跡結果。
圖中分別表示,1、2為轉染的pCAN618/H838 DNA,3、4為轉染pCAN618/H838F DNA,5、6為轉染的pCAN618/H839F DNA,7、8為轉染的pCAN618DNA的COS7培養上清液電泳帶。第一抗體使用了小鼠抗血清(實施例12)。
圖11表示在實施例24中分析的TGC838蛋白及TGC839蛋白的Western印跡結果。
圖中分別表示,3、4為轉染的pCAN618/H838F DNA,5、6為轉染的pCAN618/H839F DNA,7、8為轉染的pCAN618DNA的COS7培養上清液電泳帶。第一抗體使用了抗FLAG小鼠IgG。
圖12表示在實施例25中分別使用TGC838蛋白及TGC839蛋白的抗體所進行的免疫沉澱分析。
圖中,1、3、5表示轉染pCAN618/H838F DNA的COS7細胞培養上清液,2、4、6表示轉染pCAN618/H839F DNA的COS7細胞培養上清。1、2又表示使用128-18抗體(實施例18)所進行的免疫沉澱反應,3、4表示使用家兔抗血清(實施例19)所進行的免疫沉澱反應,,5、6表示對照組(未添加抗體)。
圖13表示在實施例26中所進行的檢驗附加糖鏈的結果。
圖中分別表示,1、2為轉染的pCAN618/H838 DNA,3、4為轉染的pCAN618/H838F DNA,5、6為轉染的pCAN618/H839F DNA,7、8為轉染pCAN618DNA的COS7培養上清液電泳帶。1、3、5又表示經糖苷酶(N-Glycosidase)處理的電泳帶。
圖14表示在實施例28中所製作的標準曲線。對應於表1。
圖15表示在實施例28中所進行的測定TGC838的量。
圖中分別表示如下所述各培養上清液中的TGC838量,□為CHO-K1/TGC838N-4,◇為轉染pCAN618/H838 DNA的COS7,○為SW1353-1,△為SW1353-2。
圖16表示在實施例28中所進行的測定TGC838的量。
圖中分別表示各血漿中的TGC838量,○為健康人,◇為肝癌患者,△為大腸癌患者。
圖17表示在實施例29中所進行的FACS分析。
圖中,實線表示添加有TGC839FLAG蛋白細胞群,虛線表示未添加TGC839FLAG蛋白細胞群。
圖18表示在實施例29中所進行的FACS分析。
圖中,+FITC-TGC839F表示添加有TGC839FLAG蛋白細胞群,-FITC-TGC839F表示未添加TGC839FLAG蛋白細胞群。
圖19表示在實施例31中所進行的TGC839蛋白對NK細胞損傷的測定。
圖中分別表示TGC839FLAG的濃度,○為0ng/ml、□為50ng/ml、△為150ng/ml、◇為500ng/ml。
圖20表示在實施例31中所進行的TGC839蛋白對NK細胞增殖的測定。
圖中,□和○分別表示來自不同個體的外周血。
圖21表示在實施例31中所進行的TGC839蛋白對K562細胞增殖的測定。
圖22表示在實施例31中所進行的測定培養上清液中的IFN-γ值。
實施發明的最佳方案具有與本發明SEQ ID NO1所示的胺基酸序列相同或基本相同的胺基酸序列之蛋白質(以下稱本發明蛋白質)既可來自人或溫血動物(例如,豚鼠、大鼠、小鼠、家雞、兔子、豬、綿羊、牛、猴子等)的細胞[如肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠質細胞、胰腺β細胞、骨髓細胞、腎小球膜細胞、朗格罕氏細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例如,巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞)、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質細胞、或這些細胞的前體細胞、幹細胞或癌細胞等]或這些細胞所存在的所有組織,例如腦、腦的各部分(例如,嗅球、屏狀核、大腦基底神經節、海馬、丘腦、丘腦下部、大腦皮質、延髓、小腦)、脊髓、腦垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾、顎下腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關節、骨骼肌等,或者紅細胞株的細胞或其培養細胞(例如MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K562、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-102、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-01等)的蛋白質,又可來自合成蛋白質。本發明的蛋白質優選來自人或溫血動物(例如,豚鼠、大鼠、小鼠、家雞、兔子、豬、綿羊、牛、猴子等)的胎兒細胞(特別是胎兒的腦細胞、肺細胞)或癌細胞。
作為一種與SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的序列應具有與SEQ ID NO1所示胺基酸序列的同源性約70%以上,優選約80%以上,更優選約90%以上,最優選約95%以上;優選一種與本發明SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的蛋白質,例如,其胺基酸序列應與前述的SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的胺基酸序列,並且其活性應與前述的SEQ ID NO1所示胺基酸序列的蛋白質活性基本相同。
具體地說,可以舉出SEQ ID NO5所示胺基酸序列的蛋白質等。
其中基本相同的活性,例如有細胞增殖活性等。
所述基本相同是指,其活性在性質上(如,生理生化上、或藥理學上)相同。因此細胞增殖等活性優選相同的(例如約0.1-100倍、優選約0.5-10倍、更優選約0.5-2倍),但活性的大小、蛋白質分子量等量化因素可以彼此不同。
所述細胞增殖可以根據公知方法進行檢測,例如,以下將要闡述的篩選方法。
本發明的蛋白質可以包括所謂的突變蛋白,可包含下述蛋白質例如①SEQ ID NO1所示胺基酸序列中缺失1-5個胺基酸(優選其中缺失1-3個)、②SEQ ID NO1所示胺基酸序列中附加1-10個胺基酸(優選其中附加1-5個、更優選其中1-3個)、③SEQ ID NO1所示胺基酸序列中插入1-5個胺基酸(優選其中插入1-3個)、④SEQ ID NO1所示胺基酸序列中被其它胺基酸置換1-5個(優選其中置換1-3個)、或⑤由所述序列組合形成的胺基酸序列。
如上所述,在胺基酸序列中被插入、缺失或置換時,其插入、缺失或置換的位置不作特殊限定。
本說明書中的蛋白質按照肽標記慣例,其左端為N末端(氨基端),右端為C末端(羧基端)。本發明蛋白質主要為SEQ ID NO1所示胺基酸序列的蛋白質,其C末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-),但是C末端也可為醯胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
此時所示該酯的R有,例如,C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、或正丁基;C3-8環烷基包括環戊基和環己基等;C6-12芳基包括苯基和a-萘基等;C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基或a-萘基C1-2烷基,其中苯基-C1-2烷基又如苯甲基、苯乙基等;a-萘基C1-7烷基又如a-萘甲基等,此外還有廣泛適用於口服給藥的酯如三甲基乙醯氧甲基。
當本發明蛋白質在C-末端以外的位置上具有一個羧基(或羧酸酯)時,它可被醯胺化或酯化,這種醯胺或酯也可以包括在本發明所述蛋白質的範圍之內。所述的酯可以與上述C-末端的酯相同。
本發明蛋白質可以進一步包括下述衍生物,其中N-末端胺基酸殘基(如甲硫氨酸殘基)的氨基用保護基(C1~6醯基,如甲醯基、乙醯基等C1~6烷醯基)保護;所述N末端在體內切割,形成的穀氨醯殘基被焦穀氨酸化;所述蛋白分子中胺基酸側鏈上的取代基(例如,-OH,-SH,氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)可被適當的基團(C1~6醯基,如甲醯基、乙醯基等C1~6烷醯基)保護,或結合蛋白質如通過糖鏈連接的糖蛋白等。
本發明蛋白質的具體實例包括具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的人源蛋白質(圖1),或具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的人源蛋白質(圖5)。
本發明蛋白質的特徵是,該蛋白質在癌細胞或胎兒的腦、肺等進行特異性表達,優選在癌細胞中的特異性表達。
作為本發明蛋白質的部分肽為前面所述的本發明蛋白質的部分肽,其中優選,只要與前述本發明蛋白質的部分肽具有相同活性(例如,細胞增殖活性等)的均可。例如通常使用具有下述情形的肽,在構成本發明蛋白質的胺基酸序列中至少具有胺基酸序列為20%以上,優選50%以上,尤其優選70%以上,更優選90%以上,最優選95%以上,並且應具有細胞增殖活性。
在所述這類肽中,通常其胺基酸序列包含以下情形的胺基酸序列,例如,SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第22-252位、第26-252位或第26-34位(尤其優選第26-252位或26-34位,更優選第26-34位),SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第22-246位、第26-246位、第166-190位(尤其優選第26-246位、第166-190位,更優選166-190位)。
本發明的部分肽還可以在其胺基酸序列中缺失1-5個(優選缺失1-3個)胺基酸,或在其胺基酸序列中附加1-10個(優選附加1-5個,更優選1-3個)胺基酸、或插入1-5個(優選插入1-3個)胺基酸,或被其它胺基酸所置換1-5個(優選置換1-3個)胺基酸。
本發明的部分肽其C末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-),正如前面所述的本發明蛋白質一樣,其C末端也可為醯胺(-CONH2)或酯(-COOR)(其中R的意義同前)。
本發明的部分肽可以進一步同前面所述的本發明蛋白質一樣,它包括下述衍生物,其中N-末端胺基酸殘基(如甲硫氨酸殘基)的氨基用保護基保護;所述N末端在體內切割,形成的穀氨醯殘基被焦穀氨酸化;所述蛋白分子中胺基酸側鏈上的取代基可被適當的基團保護,或結合蛋白質如通過糖鏈連接的糖蛋白等。
另外,本發明的部分肽還可用於形成抗體的抗原,因此該部分肽未必具有細胞增殖活性。
作為本發明的蛋白質或其部分肽之鹽可以使用生理上可接受的酸(如無機酸或有機酸)或鹼(如鹼金屬)形成鹽,尤其優選生理上可接受的酸加成鹽。這類的鹽有,與無機酸(例如,鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽,或與有機酸(例如,乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
本發明的蛋白質或其鹽既可以用所述的人或其它溫血動物細胞(尤其是癌細胞等)或組織(胎兒的腦及肺)純化蛋白質的公知方法來製備,也可以通過培養含有隨後所述蛋白質之編碼DNA的轉化體來製備,也可以用隨後敘述的肽合成方法製備蛋白質。
當從人、哺乳動物組織或細胞(尤其是癌細胞、胎兒的腦及肺等)中製備蛋白質時,首先將人或哺乳動物組織或細胞勻漿,然後用酸等抽提,通過反相層析、離子交換層析等多種層析技術的聯用來分離純化該抽提物。
為了合成本發明蛋白質、部分肽或其鹽或者它們的醯胺物,可以使用可用於醯胺合成的市售的樹脂。這類樹脂的實例包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-苄氧基苯甲醇樹脂,4-甲基二苯甲胺樹脂,PAM樹脂,4-羥甲基甲苯乙醯胺甲基樹脂,聚丙烯醯胺樹脂,4-(2′,4′-二甲氧基苯羥甲基)苯氧基樹脂以及4-(2′,4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂時,將那些α-氨基及其側鏈上功能基團受到相應保護的胺基酸,在樹脂上按目標蛋白質的序列順序,用本領域公知的各種縮合方法縮合。反應結束時,將蛋白質從樹脂上切除下來,同時除去各種保護基團,必要時在高度稀釋溶液中實施分子內二硫鍵形成反應,以獲得目標蛋白質或它們的醯胺物。
進行上述受保護胺基酸的縮合反應時,可使用用於蛋白質合成的多種活化試劑,但優選使用碳二亞胺。其碳二亞胺有DCC、N,N′-二異丙基碳二亞胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨醯基)碳二亞胺。用這些試劑活化時,直接在樹脂上添加受保護的胺基酸及外消旋抑制劑(例如,HOBt、HOOBt),或先將受保護的胺基酸活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯,然後添加到樹脂上。
適用於受保護胺基酸的活化反應或適用於與樹脂的縮合反應的溶劑選自已知可用於蛋白質縮合反應的溶劑。這樣的溶劑有醯胺類如N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺以及N-甲基吡咯烷酮等;滷化烴類如二氯甲烷和氯仿等;醇類如三氟乙醇等;亞碸類如二甲亞碸等;醚類如吡啶、二噁烷和四氫呋喃等;腈類如乙腈和丙腈等;酯類如乙酸甲酯和乙酸乙酯等;以及這些溶劑的適當混合物。反應溫度從已知適用於蛋白質成鍵反應的範圍中選取,通常選約-20℃-50℃。活化的胺基酸衍生物通常以過量1.5~4倍的量使用。用茚三酮反應檢驗所述縮合反應程度,當所述縮合不充分時,可通過不除去保護基團而重複縮合反應來完成。當即使重複反應後仍未充分縮合時,用乙酸酐或乙醯咪唑將未反應的胺基酸乙醯化,以消除對後續反應的可能負影響。
作為保護初始氨基的保護基團有,例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷(adamantyl)氧基羰基,三氟乙醯基、鄰苯二甲醯基、甲醯基、2-硝基苯基亞硫醯基、二苯硫膦基,以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保護,例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基和2-金剛烷基等的線性、支鏈或環狀烷基酯),芳烷基酯化(例如酯化為苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等),苯甲醯甲基酯化,苄氧羰基醯肼化,叔丁氧羰基醯肼化以及三苯甲基醯肼化等。
絲氨酸的羥基可以通過例如酯化作用或醚化作用來保護。適於酯化作用的基團有低級C1~6烷醯基如乙醯基;芳醯基如苯甲醯基;以及來自碳酸的基團如苄氧羰基和乙氧羰基。適於醚化的基團有苯甲基、四氫吡喃基和叔丁基。
適於保護酪氨酸中酚羥基的基團有,例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
適於保護組氨酸中咪唑基的基團有,例如Tos、4-甲氧-2,3,6-三甲基苯磺醯基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
活化原始羧基的有,如對應的酸酐、迭氮基、活化酯[與乙醇(五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、對硝基苯酚、HONB、N-羥甲基琥珀醯亞醯胺、N-羥甲基酞醯亞胺、HOBt)形成的酯]等。活化原始氨基的有與此對應的磷酸胺。
保護基的去除(脫離)方法有,例如在Pd-黑或Pd-碳等催化劑的存在下在氫氣流中所進行的催化還原反應;通過氫氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它們的混合液進行酸的處理;二異丙烯乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的鹼處理;通過液氨中的鈉還原反應等等。上述酸處理的脫離反應一般在約-20℃~40℃的溫度下進行,在酸處理作用中,添加如甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、間苯甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇等陽離子捕集劑是有效的。組氨酸咪唑保護基所用的2,4-二硝基苯基通過硫代苯酚除去,色氨酸吲哚保護基的甲醯基除了所述1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇等存在下經過酸處理而脫離保護之外,也可以通過鹼處理如氫氧化鈉稀溶液、稀釋氨等除去方法。
從公知的基團中適當選擇與初始反應無關的官能團的保護及保護基以及其保護基的脫離,從公知方法中適當選擇與反應有關的官能團的活化。
蛋白質胺物的其它獲得方法有,如首先將羧基末端胺基酸的α-羧基胺基化保護,再在氨基側使肽(蛋白質)鏈增加到所要求的長度,製造2種蛋白質,一種為該肽鏈只除去N末端α-氨基保護基,另一種為只除去C末端羧基保護基,使這兩種蛋白質在所述混合溶劑中縮合。有關縮合反應的詳細情況與前述一樣。由縮合得到的保護蛋白質經過純化之後,按照上述方法除去所有的保護基,可以得到粗蛋白。這種粗蛋白通過各種純化的已知方法,進行凍結乾燥主要的組分進而得到蛋白質胺物。
為獲得蛋白質的酯物,將如羧基末端胺基酸的α-羧基與要求的乙醇類縮合轉換為胺基酸酯後,再與蛋白質胺物的合成一樣從而獲得所要的蛋白質的酯物。
本發明的部分肽或其鹽可按照公知的肽合成方法製備,或可用適當的肽酶切割本發明的蛋白質來製備。其肽的合成法有,例如,固相合成法或液相合成法。即,當夠成本發明部分肽的部分肽或胺基酸與其殘餘部分縮合,其產物有保護基時,通過除去保護基團可以製備目的肽。此時的公知縮合方法或除去保護基團方法例如在下列1)-5)中均有描述1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成,Interscience Publishers,紐約(1966)2)Schroeder和Luebke肽,Academic Press,紐約(1965)3)泉屋信夫等多肽合成的基礎與實驗,丸善公司(1975)4)矢島治明和榊原俊平生物化學實驗教材1,蛋白質化學IV,205(1977)5)矢島治明主編藥物開發續篇,卷14,肽合成,廣川書店另外,反應後將一般的純化方法如,溶劑抽提法、蒸餾法、柱層析法、液體層析法、重結晶法等進行組合來純化回收本發明的部分肽。通過上述方法得到的部分肽若為游離體時,按照公知方法可以適當轉換為鹽,相反獲得其鹽時按照公知方法也可以轉化為游離體或其它的鹽形式。
作為編碼本發明蛋白質的DNA只要是編碼前述本發明蛋白質的鹼基序列均可。它們可以是基因組DNA、基因組DNA基因文庫、前述細胞·組織中的cDNA、前述細胞·組織中的cDNA文庫、合成DNA。
文庫使用的載體包括噬菌體、質粒、粘粒、噬粒等。從所述細胞·組織中製備的總RNA或mRNA組分,用該總RNA或mRNA組分可以直接根據Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(下文,簡稱RT-PCR法)進行擴增。
作為編碼本發明蛋白質的DNA,只要符合下列情形的均可進行選擇,例如,①含有SEQ ID NO2所示鹼基序列的DNA或在高度嚴謹條件下能與SEQ ID NO2所示鹼基序列進行雜交的序列,並且其蛋白質活性基本上與本發明蛋白質的活性相同(例如,細胞增殖活性等);②含有SEQ ID NO6所示鹼基序列的DNA或在高度嚴謹條件下能與SEQ ID NO6所示鹼基序列進行雜交的序列,並且其蛋白質活性基本上與本發明蛋白質的活性相同(例如,細胞增殖活性等)更具體地說,編碼所述具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的本發明蛋白之DNA,可以使用具有SEQ ID NO2所示鹼基序列的DNA;編碼所述具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的本發明蛋白之DNA,可以使用具有SEQID NO6所示鹼基序列的DNA等。
作為編碼本發明部分肽的DNA,只要含有所述編碼本發明部分肽的鹼基序列的DNA則任何一種DNA均可。它們可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、前述細胞·組織中的cDNA、前述細胞·組織中的cDNA文庫、合成DNA。
所述編碼本發明部分肽的DNA,只要符合下列情形的均可進行選擇,例如,①具有部分鹼基序列的DNA,該DNA含有SEQ ID NO2所示鹼基序列,或具有部分鹼基序列的DNA,該DNA在高度嚴謹條件下能與SEQ IDNO2所示鹼基序列進行雜交,並且它所編碼的蛋白質基本上與本發明蛋白質的活性相同(例如,細胞增殖活性等);②具有部分鹼基序列的DNA,該DNA含有SEQ ID NO6所示鹼基序列,或具有部分鹼基序列的DNA,該DNA在高度嚴謹條件下能與SEQ ID NO6所示鹼基序列進行雜交,並且它所編碼的蛋白質基本上與本發明蛋白質的活性相同(例如,細胞增殖活性等)作為DNA的克隆方法,該DNA完全編碼本發明蛋白質或部分肽(以下,在說明克隆編碼這些蛋白質等的DNA及其表達時,通常將這些蛋白質等簡稱為本發明蛋白質),按照下列方法進行。即,首先合成含有本發明蛋白質的部分鹼基序列的DNA,用該DNA作為引物,再根據公知的PCR法進行完全編碼目的DNA的擴增,或者通過與標記物進行雜交篩選,此標記物的使用,編碼具有本發明蛋白質的部分或全部的DNA片段或合成DNA,並將其DNA片段插入到合適載體中。雜交反應可以根據分子克隆第二版(J.Sambrook等,冷泉港實驗室出版社,1989)描述的方法進行。也可用商品化的文庫根據所附說明書進行雜交。
DNA鹼基序列置換可以使用公知的試劑盒,例如,MutanTM-G(寶酒造(株))、MutanTM-K(寶酒造(株))等產品,可以按照Gapped duplex法或Kunkel法等的公知方法或其改良方法進行置換。
已經克隆的編碼該蛋白質的DNA,既可單獨使用,也可根據目的需要,在用限制酶消化後或連接一接頭之後使用。該DNA可能在5′端包含ATG作為翻譯起始密碼子,而在3′端有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始和終止密碼子也可加上合適的合成DNA接頭。
本發明蛋白質的表達載體可通過以下方法生產,例如,(a)從編碼本發明蛋白質的DNA上切割所需DNA片段,(b)將該DNA片段連接到一合適載體上的啟動子下遊。
可以使用的載體包括來自大腸桿菌的質粒(例如,pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質粒(例如,pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質粒(例如,pSH19、pSH15)、噬菌體如λ噬菌體等、動物病毒如反轉錄病毒、痘苗病毒、杆狀病毒等。另外,本發明所使用的啟動子有pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
作為本發明所使用的啟動子,只要是與宿主基因表達相匹配的啟動子均可。例如,當動物細胞作為宿主時,有SRα啟動子、SV40初期啟動子、HIV·LTR啟動子、CMV啟動子、HSV-TK啟動子等。
在這些啟動子中優選使用CMV(巨細胞病毒)啟動子、SRα啟動子等。
當宿主為大腸桿菌屬的細菌時,優選的啟動子有trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等。在使用枯草桿菌屬的細菌作宿主時,優選的啟動子有SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子等。在用酵母作宿主時,優選的啟動子有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子等。在使用昆蟲細胞作宿主時,優選多角體蛋白啟動子、P10啟動子。
表達載體除了上述之外,根據需要還可以使用含有增強子、剪接信號、PolyA附加信號、選擇標記物、SV40複製起點(以下簡稱為SV40ori)等的載體。其中選擇標記物有二氫葉酸還原酶(以下簡稱為dhfr)基因[抗氨甲蝶呤(MTX)]、抗氨苄青黴素基因(以下簡稱為Ampr)、抗新酶素基因(以下簡稱為Neor、抗G418)等。尤其使用CHO(dhfr-)細胞將dhfr基因作為選擇標記物時又可以用不含腺嘌呤脫氧核苷來選擇目的基因。
又,根據需要在本發明蛋白質的N-末端加上適合於宿主的信號序列。當宿主為大腸桿菌屬細菌時,可以使用Pho A信號序列、Omp A信號序列等;當宿主為桿菌屬細菌時可以使用α-澱粉酶信號序列、枯草菌素信號序列等;當宿主為酵母菌時可以使用MFα信號序列、SUC2信號序列等;當宿主為動物細胞時可以使用胰島素信號序列、α-IL信號序列、抗體分子信號序列等。
使用如此構建的、含有編碼本發明蛋白質的DNA載體可以形成轉化體。
其宿主有,如大腸桿菌屬細菌、桿菌屬細菌、酵母菌、昆蟲細胞、昆蟲、動物細胞等。
具體地說,其大腸桿菌屬的例子有大腸桿菌(Escherichia coli)K12DH1[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60卷,160(1968)]、JM103[(Nucleic AcidsResearch),9卷,309(1981)]、JA221[(Journal of Molecular Biology),120卷,517(1978)]、HB101[Journal of Molecular Biology),41卷,459(1969)]、C600[(Genetics),39卷,440(1954)]等。
其桿菌屬有枯草桿菌(Bacillus subtilis)MI114[Gene.24卷,255(1983)]、207-21[(Journal of Biochemistry),95卷,87(1984)]等。
其酵母菌有,例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
其昆蟲細胞有,例如病毒為AcNPV時來自草地夜蛾幼蟲的細胞株(Spodoptera frugiperda cell,Sf細胞)、來自粉紋夜蛾中腸(Trichoplusia ni)的MG1細胞、來自粉紋夜蛾卵(Trichoplusia ni)的High Five TM細胞、來自Mamestra brassicae的細胞或來自Estigmena acrea的細胞等。病毒為BmNPV時有來自於蠶的細胞株(Bombyx mori N細胞,BmN細胞)等。其中所述Sf細胞,還有如Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(Vaughu,J.L.et al.InVivo.13,213-217(1977))等。
昆蟲使用的是家蠶的幼蟲[前田等.Nature.315卷,592(1985)]。
動物細胞有,例如猴子細胞COS-7,Vero、中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為CHO細胞)、dhft基因缺陷中國倉鼠細胞CHO(以下簡稱為CHO(dhfr-)細胞)、小鼠L細胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。進一步也可以使用各種正常人的細胞例如,肝細胞、脾細胞、神經細胞、神經膠質細胞、胰腺β細胞、骨髓細胞、腎小球膜細胞、朗格罕氏細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例如,巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞)、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質細胞、或這些細胞的前體細胞、幹細胞或癌細胞等。
為了轉化大腸桿菌屬細菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69卷2110(1972)]和[Gene,17卷,107(1982)]描述的方法進行轉換。
為了轉化桿菌屬細菌按照[Molecular and General Genetics,168卷,11(1979)]描述的方法進行轉換。
為了轉化酵母菌按照[酶學法,194,182-187(1991)]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75卷1929(1978)]描述的方法進行轉換。
為了轉化昆蟲細胞或昆蟲按照[Bio/Technology.6,47-55(1988)]描述的方法進行轉換。
為了轉化動物細胞按照[《細胞工程學增訂版8,細胞工程學實驗最新方法》秀潤出版社,263-267(1995)]、[病毒學.52卷,456(1973)]描述的方法進行轉換。
由此,可以獲得用含有本發明蛋白質之編碼DNA的表達載體轉化的轉化體。
培養宿主為大腸桿菌屬細菌、桿菌屬細菌的轉化體時,其培養基適用於液體培養基,該轉化體的發育含有必要的碳源、氮源、無機物以及其它物質。碳源有葡萄糖、糊精、可溶性澱粉、蔗糖等;氮源有銨鹽、硝酸鹽、玉米糊、蛋白腖、酪蛋白、肉汁、黃豆餅粉、馬鈴薯提取液等無機或有機物質;無機物有氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。也可以添加酵母提取物、維生素、生長因子等。培養基的pH優選約為5-8。
大腸桿菌屬細菌的培養基,優選M9培養基它含有葡萄糖、酪蛋白胺基酸[米勒,Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold SpringHarbor Laboratory,New York 1972]。根據需要,為使啟動子更能發揮有效作用還可以添加如,3β-吲哚丙烯酸之類的藥物。
當宿主為大腸桿菌屬細菌時,轉化體通常在15-43℃培養,時間約3-24小時,必要時可以通氣或攪拌。
當宿主為桿菌屬細菌時,轉化體通常在30-40℃培養,時間約6-24小時,必要時可以通氣或攪拌。
當培養宿主為酵母的轉化體時,其培養基有Burkholder基礎培養基[Bostian,K.L.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77卷,4505(1980)]或含有0.5%酪蛋白胺基酸的SD培養基[Bitter,G.A.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81卷,5330(1984)]。培養基的pH優選為約5-8。轉化體通常在20-35℃培養,時間約24-72小時,必要時可以通氣或攪拌。
當培養宿主為昆蟲細胞或昆蟲的轉化體時,其培養基可以選用在Grace′sInsecl培養基[Gracc,T.C.C.Nature.195,788(1962)]中適當添加固相化10%牛血清等添加物。培養基的pH優選為約6.2-6.4。轉化體通常在27℃培養,時間約3-5天,必要時可以通氣或攪拌。
當培養宿主為動物細胞的轉化體時,其培養基包括含有約5-20%的胎牛血清的MEM培養基[Science,122卷.501(1952)]、DMEM培養基[Virology,8,396(1959)]、RPMI1640培養基[The Journal of the American MedicalAssociation.199卷,519(1967)]、199培養基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine,73卷,1(1950)]等。培養基的pH優選為約6-8。轉化體通常在30-40℃培養,時間約15-60小時,必要時可以通氣或攪拌。
根據上述,在轉化體的細胞外可以製備本發明蛋白質。
為了從上述培養物中分離純化本發明蛋白質可以採用以下方法實施。
當從培養菌體或細胞中提取本發明蛋白質時,最適宜的方法是,培養後通過公知方法收集菌體或細胞,將其懸浮於適當的緩衝液中,通過超聲波、溶菌酶和/或反覆凍融法等破碎菌體或細胞,經過離心沉澱和過濾得到本發明蛋白質的粗提取液。緩衝液中也可以加入蛋白變性劑如尿素或鹽酸胍等,表面活性劑如Triton X-100TM等。當本發明蛋白質被分泌在培養液中時,結束培養後,按照公知方法離心菌體或細胞,使它們與上清液分開,收集上清液。
上清或包含在所獲抽提物中的本發明蛋白質可通過將已知的分離和純化方法適當組合來進行純化。這些眾所周知的分離純化方法包括利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉澱等;主要利用分子量差異的方法如透析、超濾、凝膠過濾、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳等;利用電荷差異的方法如離子交換層析等;利用特異性親和力差異的方法如親和層析等;利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜等;利用等電點差異的方法如等電聚焦電泳等。
當如此獲得的本發明蛋白質為游離形式時,可用眾所周知的方法或其改良法將其轉換為鹽。相反,當獲得的本發明蛋白質為鹽時,可用眾所周知的方法或改良法將其轉換為游離形式或另一種鹽形式。
重組產生的本發明蛋白質,在純化前或純化後,可用相應蛋白修飾酶處理,從而使本發明蛋白質經適當修飾,部分去除一段多肽。這種蛋白修飾酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨醯內肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
如此產生的本發明蛋白質或其鹽的存在或活性可以通過酶免疫測定法進行檢測,該測定使用了與標記配體結合的實驗以及特異性抗體。
針對本發明蛋白質或部分肽或其鹽的抗體只要是能識別本發明蛋白質或部分肽或其鹽的抗體,既可為多克隆抗體或為單克隆抗體。
作為本發明部分肽或其鹽的抗體來說,優選其針對具有下述胺基酸序列的部分肽或其鹽,例如,①SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第22-252位、第26-252位或第26-34位(尤其優選第26-252位或26-34位,更優選第26-34位),②SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第22-246位、第26-246位、第166-190位(尤其優選第26-246位、第166-190位,更優選166-190位)。
針對本發明蛋白質或部分肽或其鹽(下文,在說明抗體過程中,通常將這些蛋白質等簡稱為本發明蛋白質)的抗體,按照公知製備抗體或抗血清的方法進行,並用本發明蛋白質作為抗原。
(a)單克隆抗體生產細胞的製備將本發明的蛋白質,單獨或與載體或稀釋劑一起給藥於溫血動物體內能產生抗體的部位。為了增加給藥後抗體的產量,可給予完全福氏佐劑或不完全福氏佐劑。有效給藥通常約為每2-6周一次,共2-10次。使用的溫血動物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、家雞,優選小鼠和大鼠。
在製備單克隆抗體生產細胞時,從經抗原免疫的溫血動物如小鼠中選擇抗體效價比較高的動物,在最後一次免疫的2-5天後取脾臟或淋巴結,使其中產生抗體的細胞與同種或異種動物的骨髓瘤細胞融合,獲得產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。抗血清中抗體效價的測定可以通過使抗血清與標記的隨後所述蛋白反應,然後測定標記試劑與抗體結合的活性。可以根據Khler和Milstein(自然,256,495,1975)的方法進行融合。融合加速劑的例子為聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等,優選PEG。
溫血動物骨髓瘤細胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1,優選P3U1。所用抗體產生細胞(脾臟細胞)同骨髓瘤細胞的比例優選約為1∶1到20∶1,加入濃度約為10%-80%的PEG(優選PEG 1000-6000)。然後在20-40℃保溫。為了有效實施細胞融合,優選30-37℃保溫約1-10分鐘。
可以用各種方法篩選產生單克隆抗體的雜交瘤。這些方法有將作為抗原的蛋白質直接或與載體一起吸附至一種固相載體上(如微量滴定板),將雜交瘤上清加入到該固相載體上,然後加入用放射性物質或酶標記的抗免疫球蛋白抗體(如果用小鼠細胞作融合,則用抗小鼠的免疫球蛋白抗體)或蛋白A,檢測結合到固相載體上的單克隆抗體;另一方法為,將雜交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相中,加入用放射性物質或酶標記的蛋白質,檢測結合到固相載體上的單克隆抗體。
單克隆抗體的篩選可以根據眾所周知的方法或其改進方法進行。一般地,在含有HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷)的動物細胞培養基中篩選單克隆抗體。只要雜交瘤能夠在培養基中生長的,可以使用任何篩選或生長培養基。例如,可以使用含有1%-20%,優選10-20%胎牛血清的RPMI 1640培養基、含有1%-10%胎牛血清的GIT培養基(和光純藥工業株式會社)、不含血清雜交瘤培養基(SFM-101,日水製藥株式會社)作為篩選或生長培養基。通常在含5%CO2的條件下,於20-40℃(優選37℃)培養約5天-3周(優選1-2周)。雜交瘤培養上清中抗體效價的測定與上述抗血清中抗體效價的測定方法相同。
(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離和純化可根據公知方法,例如免疫球蛋白的分離和純化方法(如鹽析、乙醇沉澱、等電點沉澱、電泳、離子交換劑(如DEAE)吸附和去吸附、超離心、凝膠過濾、或一種特異性純化方法,其包括僅收集與抗原結合固相、蛋白A或蛋白G等已與活化吸附劑相結合的抗體並使之分離以獲得該抗體)。
本發明多克隆抗體的製備用眾所周知的方法或其改進方法進行。例如,用與上述生產單克隆抗體相似的方法生產免疫原(蛋白質抗原)或配製免疫原與載體蛋白形成的複合物並用其免疫溫血動物。從已免疫的動物中收集產物,其中含有本發明蛋白質的抗體,分離和純化該抗體。
在由免疫原和載體蛋白組成的用於免疫溫血動物的複合物中,對載體蛋白的類型和載體同半抗原的混合比率無限定,只要能針對與載體一起免疫的半抗原有效產生抗體。例如,牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或匙孔蟲戚血藍蛋白與半抗原以載體比半抗原重量比約0.1-20(優選約1-5)的比率偶聯。
不同的縮合劑可用於偶聯載體和半抗原。戊二醛、碳二亞胺、馬來醯亞胺活化酯和含有巰基或二硫代吡啶基的活化酯試劑可用於偶聯。
將縮合產物單獨或與載體或稀釋劑一起給藥於溫血動物體內能產生抗體的部位。為了增加給藥後抗體的產量,可給予完全福氏佐劑或不完全福氏佐劑。大約每2-6周給藥一次,共3-10次。
多克隆抗體從用上述方法免疫的溫血動物的血液、腹水等(優選血液)中收集。
抗血清中多克隆抗體效價的測定與上述測定血清抗體效價的方法相同。
可以根據上述用於分離和純化單克隆抗體的免疫球蛋白分離純化方法來分離和純化多克隆抗體。
下面說明本發明蛋白質或部分肽或其鹽(以下有時簡寫為本發明蛋白質)的應用以及針對本發明蛋白質或部分肽或其鹽(以下有時簡寫為本發明抗體)抗體的應用。
(1)與本發明蛋白質等相關的預防與治療各種疾病的藥物因為本發明蛋白質等具有細胞增殖活性,所以本發明蛋白質等可以用於病變組織摘除(包括全部摘除或部分摘除,但優選部分摘除)後作為組織再生劑等藥物。
當本發明蛋白質用作所述治療或預防藥物時,優選所用純度至少90%,優選95%以上,更優選98%以上,最優選99%以上。
例如,本發明的蛋白質可以以片劑(必要時加糖衣)、膠囊、酏劑、微膠囊等劑型口服,或以可注射型製劑如與水或水以外的但藥學上允許的溶液形成無菌溶液或懸浮液形式經非胃腸道給藥。例如,將本發明的蛋白質等與生理學上可接受的、符合製藥規定的已知載體、調味劑、賦形劑、載色劑、防腐劑、穩定劑、粘合劑等混合製成藥劑常用單位劑型。控制製劑中的活性成分使得在給定範圍內獲得合適劑量。
可與片劑、膠囊等混合的添加劑包括,粘和劑如明膠、玉米澱粉、西黃耆膠和金合歡膠;賦形劑如結晶纖維素;膨脹劑如玉米澱粉、明膠和藻酸;潤滑劑如硬脂酸鎂;甜味劑如蔗糖、乳糖和糖精;加味劑如薄荷、akamonooil和櫻桃。當單位劑型為膠囊形式時,可進一步將液體載體如油和脂肪同上述添加劑一起使用。可根據常規製藥方法製備注射用無菌組合物,例如將活性成分與天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮在載體,如注射用的水中來製備藥物。
用於注射的液體介質的例子包括,生理鹽水、及包含葡萄糖和其它輔助製劑(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉等)的等滲溶液,並可以進一步同合適的助溶劑如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等結合使用。油性介質有芝麻油和豆油,它們可與助溶劑如苯甲酸苄酯和苯甲醇結合使用。此外,上述的治療/預防製劑可進一步與緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液和乙酸鈉緩衝液等)、鎮靜劑(例如苯扎氯胺和鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化劑等結合使用。由此製備的注射液體一般裝在合適的安瓿中。
如此所獲製劑安全、低毒,因此可用於人或其它溫血動物(例如,大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。
本發明蛋白質的劑量依賴於病症、受檢者等而異;例如當口服給藥本發明蛋白質作為病變組織摘除後的組織再生劑時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天,優選大約1.0-50mg/天,更優選1.0-20mg/天。
(2)篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物自然殺傷(NK)細胞具有抑制癌細胞的增殖作用。本發明蛋白質等不會影響正常細胞的繁殖,但由於抑制NK細胞的增殖,所以具有抑制由於本發明蛋白質等抑制NK細胞增殖活性的化合物或其鹽可作為以下各種疾病的治療·預防藥物使用例如各種癌(如子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等疾病。
因此,本發明蛋白質可作為一種試劑,它有益於篩選具有抑制由本發明蛋白質而抑制的NK細胞增殖活性的化合物或其鹽。
即,本發明提供,(1)①一種篩選方法(在(2)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時也稱為本發明篩選法),其用於篩選具有抑制本發明蛋白質或其部分肽或其鹽對NK細胞增殖抑制的活性化合物(在(2)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時簡稱為抑制劑),其特徵在於,該方法應用本發明蛋白質或其部分肽或其鹽;②一種用於篩選抑制劑的試劑盒(在(2)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時也稱為本發明篩選試劑盒),其特徵在於,該篩選試劑盒包含本發明蛋白質或其部分肽或其鹽;更具體地說,本發明提供,例如(2)①抑制劑的篩選方法,其特徵在於(i)當使本發明蛋白質或其部分肽或其鹽與NK細胞接觸時,和(ii)當使本發明蛋白質或其部分肽或其鹽與NK細胞及待測化合物接觸時,而進行的比較;②用於篩選抑制劑的試劑盒,其特徵在於,該試劑盒包含本發明蛋白質或其部分肽或其鹽以及NK細胞。
具體地,所述篩選法和篩選試劑盒的特徵為,如在(i)和(ii)的情況下,測定並比較本發明蛋白質等對NK細胞增殖所產生的抑制活性等。
本發明蛋白質等對NK細胞增殖所產生的抑制活性可以按照公知方法或其改良方法等進行測定,優選隨後敘述實施例的方法。
待測化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、發酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等,這些化合物可為新化合物或已知化合物。
例如,當一種待測化合物在上述(ii)中使本發明蛋白質等對NK細胞增殖產生抑制活性與(i)相比時,抑制至少約20%,優選30%,更優選至少約50%時,該化合物可以作為抑制本發明蛋白質等對NK細胞增殖產生抑制活性的化合物。
通過本發明篩選法或用於篩選的試劑盒獲得的化合物或其鹽,為所述的待測化合物,該化合物選自如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等,其為具有抑制本發明蛋白質等對NK細胞增殖產生抑制活性的化合物。
作為該化合物的鹽使用與所述本發明蛋白質之鹽相同的鹽類。
通過本發明篩選法或用於篩選的試劑盒獲得的化合物,當用作所述治療藥物或預防藥物時,可以按照常規方法給藥。例如,與包含所述本發明蛋白質等藥物一樣,可將該藥物製成片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液製劑等。
如此所獲製劑安全、低毒,因此可用於人或其它溫血動物(例如,大鼠、小鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。
所述化合物或其鹽的劑量依賴於其作用、病症、受檢者、給藥方法等而異;例如以子宮內膜腫瘤為治療目的,當口服給藥具有抑制本發明蛋白質對NK細胞增殖產生抑制活性的化合物時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天,優選大約1.0-50mg/天,更優選1.0-20mg/天。當非胃腸給藥時,一次該化合物的給藥量因給藥對象、病症等不同,例如,以子宮內膜腫瘤為治療目的,當以粉劑形式給藥具有抑制本發明蛋白質對NK細胞增殖產生抑制活性的化合物時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-30mg/天,優選大約0.1-20mg/天,更優選0.1-10mg/天,靜脈注射更為合適。對於其它動物種類,可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
(3)篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物由於本發明蛋白質等具有細胞增殖活性,能夠促進本發明蛋白質等機能(如,細胞增殖活性等)的化合物或其鹽可作為病變組織摘除後的組織再生劑等藥物使用。
另一方面,抑制本發明蛋白質等機能的化合物或其鹽可用作以下各種疾病的治療·預防藥物例如各種癌(如子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等疾病。
因此,本發明蛋白質可作為一種試劑,它有益於篩選具有促進或抑制本發明蛋白質等機能的化合物或其鹽。
即,本發明提供,(1)①一種篩選方法,其用於篩選促進本發明蛋白質或其部分肽或其鹽機能的化合物或其鹽(在(3)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時簡稱為促進劑),或者用於篩選抑制本發明蛋白質或其部分肽或其鹽機能(如,細胞增值活性等)的化合物(在(3)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時簡稱為抑制劑),其特徵在於,該方法應用本發明蛋白質或其部分肽或其鹽;②一種用於篩選促進劑或抑制劑的試劑盒(在(3)「篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物」中有時也稱為本發明篩選試劑盒),其特徵在於,該篩選試劑盒包含本發明蛋白質或其部分肽或其鹽;更具體地說,本發明提供,例如(2)①促進劑或抑制劑的篩選方法,其特徵在於(i)當使本發明蛋白質或其部分肽或其鹽與細胞(如,來自所述各種組織(優選人等)的正常細胞或所述癌細胞等)接觸時,和(ii)當使本發明蛋白質或其部分肽或其鹽與細胞(如,來自所述各種組織(優選人等)的正常細胞或所述癌細胞等)及待測化合物接觸時,而進行的比較;②用於篩選促進劑或抑制劑的試劑盒,其特徵在於,該試劑盒包含本發明蛋白質或其部分肽或其鹽以及細胞(如,來自所述各種組織(優選人等)的正常細胞或所述癌細胞等)。
具體地,所述篩選法的特徵為,如在(i)和(ii)的情況下,測定並比較本發明蛋白質等對細胞增殖的活性等。
本發明蛋白質等對細胞增殖的活性可以按照公知方法或其改良方法等進行測定。
所述細胞,可以使用例如,來自所述各種組織(優選人等)的正常細胞或所述癌細胞等待測化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、發酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等,這些化合物可為新化合物或已知化合物。
為了實施本篩選方法,首先將本發明蛋白質等懸浮於適合篩選的緩衝液中製成本發明蛋白質等的樣品。緩衝液只要不幹擾本發明蛋白質等與待測化合物的反應,可為pH約為4-10(優選pH約6-8)的緩衝液如磷酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液等。
例如,一種待測化合物在上述(ii)中使細胞增殖活性比(i)中增加約至少20%,優選30%以上,更優選約50%以上時,該化合物可以選為促進本發明蛋白質等對細胞增殖活性的化合物,另一方面,當一種待測化合物在上述(ii)中使本發明蛋白質等對細胞增殖活性與(i)相比時,抑制至少約20%,優選30%以上,更優選約50%以上時,該化合物可以作為抑制本發明蛋白質等對NK細胞增殖產生抑制活性的化合物。
通過本發明篩選法或用於篩選的試劑盒獲得的化合物或其鹽,為所述待測化合物,該化合物選自如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等,其為促進或抑制本發明蛋白質等功能(如,細胞增殖活性等)的化合物。
作為該化合物的鹽使用與所述本發明蛋白質鹽相同的鹽類。
通過本發明篩選法或用於篩選的試劑盒獲得的化合物,當用作所述治療藥物或預防藥物時,可以按照常規方法給藥。例如,與包含所述本發明蛋白質等藥物一樣,可將該藥物製成片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液製劑等。
如此所獲製劑安全、低毒,因此可用於人或其它溫血動物(例如,大鼠、小鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、雞、貓、狗、猴等)。
所述化合物或其鹽的劑量依賴於其作用、病症、受檢者、給藥方法等而異;例如以子宮內膜腫瘤為治療目的,當口服給藥具有促進本發明蛋白質等功能的化合物,作為病變組織摘除後的組織再生藥物時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天,優選大約1.0-50mg/天,更優選1.0-20mg/天。對於其它動物種類,可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
另外,以子宮內膜腫瘤為治療目的,當口服給藥具有抑制本發明蛋白質等功能的化合物時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-100mg/天,優選大約1.0-50mg/天,更優選1.0-20mg/天。當非胃腸給藥時,一次該化合物的給藥量因給藥對象、病症等不同,例如,以子宮內膜腫瘤為治療目的,當以粉劑形式給藥具有抑制本發明蛋白質等功能的化合物時,一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-30mg/天,優選大約0.1-20mg/天,更優選0.1-10mg/天,靜脈注射更為合適。對於其它動物種類,可以按每60kg體重換算相應給藥劑量。
(4)對本發明蛋白質或其部分肽或其鹽進行定量作為本發明蛋白質的抗體(下文通常簡稱為本發明抗體),由於它是能夠特異識別本發明蛋白質的,因此可用於定量待測溶液中的本發明蛋白質等,尤其是通過夾心免疫測定法進行定量。因此,本發明提供了下述的定量方法(i)一種定量待測液中本發明蛋白質的方法,其包括,使本發明的抗體與待測液以及標記的本發明蛋白質進行競爭反應,測定與該抗體結合的本發明標記蛋白質等的比率;和,(ii)一種定量待測液中本發明蛋白質等的方法,其包括,同時或先後使所述待測液與固定在固相載體上的本發明抗體以及標記的本發明其它抗體反應,測定固相載體上標記試劑的活性。
在上述方法(ii)中,優選一種抗體能識別本發明蛋白質等N-末端區域,而另一抗體能識別本發明蛋白質等C-末端區域。
針對本發明蛋白質的單克隆抗體(以下有時稱為本發明單克隆抗體)可用於定量本發明蛋白質。此外,也可通過組織染色來檢測本發明蛋白質。為此,可用抗體分子本身或使用抗體分子的F(ab』)2、Fab』或Fab片段。
對使用本發明的抗體進行本發明蛋白質等的定量方法沒有特殊限制;可以使用任何方法,只要它涉及以下方法,即根據待測定液中相應抗原含量(例如蛋白質的量),用化學或物理方法檢測抗體、抗原或抗體-抗原複合物的量,然後根據含已知量抗原的標準溶液製作的標準曲線來計算。優選的方法為,例如比濁法(nephrometry)、競爭法、免疫測定法(immunometric)和夾心法;就靈敏度和特異性而言,特別優選後面將要描述的夾心法。
用於分析方法的標記試劑的例子為放射性同位素、酶、螢光物質和化學發光物質等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。優選酶的例子為穩定、具有高比活的酶,包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。螢光物質的例子包括螢光胺、異硫氰酸螢光素等。化學發光物質的例子包括發光氨、發光氨衍生物、螢光素、光澤精等。此外,也可使用生物素-鏈黴素系統來對抗原或抗體標記。
為了不使抗原或抗體溶解,可以使用物理吸附。也可使用化學結合方法,即通常使蛋白或酶不溶解並固定於載體上。載體的例子包括,不溶性多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素;合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、矽;或玻璃等。
在夾心法中,使被檢液與本非溶性的發明單克隆抗體反應(第一反應),再進一步使標記的其他本發明單克隆抗體反應(第二反應),然後根據測定固相載體上的標記試劑活性可以對被檢液中的本發明蛋白質進行定量。第一反應和第二反應即可顛倒前後順序,也可同時進行,或錯開時間進行。標記的試劑及固相方法可按照上述的方法實施。在夾心免疫分析法中,用於固相的抗體或標記的抗體未必只有一種抗體,只要能提高測定靈敏度等可以使用兩種以上的抗體混合物。
在根據本發明的夾心方法測定本發明蛋白質等時,優選用於第一和第二反應的單克隆抗體與本發明蛋白質等的結合位點彼此不同。因此,在第一和第二反應用的抗體為,當第二反應的抗體識別本發明蛋白質的C端區域時,優選在第一反應中使用能識別除C端區域以外的位點,如N端區域的抗體。
本發明的單克隆抗體可用於除夾心法外的其它分析方法,例如競爭法、免疫測定法和比濁法。
在競爭法中,待測溶液中的抗原和標記抗原競爭與抗體反應,然後將未反應的標記抗原(F)及結合於抗體的標記抗原(B)分離(即B/F分離),測定B或F的標記量,從而可以測定待測溶液中的抗原量。在此類方法的反應中,有一種液相方法和一種固相方法,前者使用可溶性抗體,加入針對第一抗體的第二抗體後,用聚乙二醇來有效分離B/F;後者可用不溶性抗體作為第一抗體,或用可溶性抗體作為第一抗體但第二抗體為固相抗體。
在免疫測定法中,待測溶液中的抗原和固相抗原競爭性地與給定量的標記抗體反應,然後使液相與固相分離;或待測溶液中的抗原與過量標記抗體反應,然後加入固相抗原,使未反應的標記抗體與該固相結合,然後使液相與固相分離。隨後,測定兩相的標記量,來測定待測溶液中的抗原量。
在比濁法中,測定抗原-抗體在凝膠或溶液中反應產生的不溶性沉澱的量。即使待測溶液中抗原量很少且僅獲得小量的沉澱,利用雷射散射的雷射比濁法(nephrometry)也可以實施。
本發明應用這些免疫分析方法進行分析時,不需要任何特殊條件和操作。除了每種方法的常規條件和操作外,本領域技術人員可構建測定本發明蛋白質等的分析系統。所述常規技術的細節,參見如入江寬(編)「放射免疫分析」(1974,講談社,日本);入江寬(編)「放射免疫分析,續編」(1979,講談社,日本);石川榮治等(編)「酶免疫分析」(醫學書院,1978);石川榮治等(編)「酶免疫分析,第二版」(醫學書院,1982);石川榮治等(編)「酶免疫分析,第三版」(醫學書院,1987);「酶學方法」卷70(免疫化學技術(A));同上,卷73(免疫化學技術(B));同上,卷74(免疫化學技術(C));同上,卷84(免疫化學技術(D選擇性免疫分析));同上,卷92(免疫化學技術(E單克隆抗體及普通免疫分析方法));同上,卷121(免疫化學技術(I雜交瘤技術及單克隆抗體))(Academic Press出版)等)。
如上所述,使用本發明的抗體可高度敏感地定量本發明蛋白質等。
此外,使用本發明的抗體可定量本發明蛋白質等的濃度,從而當檢出本發明蛋白濃度的增加時,能夠診斷出如下各種疾病或者將來對這些疾病的高度易感性如,各種癌(如子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
本發明抗體可用於檢出體液或者組織等待檢體中存在的本發明蛋白質等。又可用於抗體柱的製作,該抗體柱可用於純化本發明蛋白質等;檢出各純化組分中的本發明蛋白質等;對被檢細胞內本發明蛋白質的行蹤進行分析等。
(5)含有本發明抗體的藥物本發明抗體具有中和本發明蛋白質等活性的作用,該抗體可用作治療或預防以下各種疾病的藥物例如各種癌(如子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
針對本發明蛋白質等的本發明人型抗體可用作治療或預防以下各種疾病的藥物例如各種癌(如子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、黑素瘤等)等。
所述該人型抗體的製備可以根據Nat Biotechnol,14,845-851.(1996);Nat Genet.15,146-156.(1997);PNAS,97(2),722-727(2000)等描述的方法實施。
下文,在「(5)含有本發明抗體的藥物」中,將本發明的中和抗體及人型抗體統稱為本發明抗體。
上述各種疾病的治療藥物或預防藥物含有本發明抗體,其可直接以原始液體製劑或作成適當劑型的藥物組合物,對人或哺乳動物(例如,大鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)經過口服或非胃腸道形式給藥。本發明抗體的投藥劑量依賴於給藥受體、症狀和給藥方法等而異;當用於治療或預防成人子宮內膜腫瘤患者時,靜脈注射的正常劑量為每天大約0.01-20mg/kg體重,優選0.1-10mg/kg體重,更優選0.1-5mg/kg體重,一天1-5次,優選一天1-3次。其他非腸道給藥或經口給藥均依據此量。症狀特別嚴重者根據其病症可以增加使用量。
本發明的抗體可以直接給藥或者製成適當的醫藥組合物給藥。所述醫藥組合物包含上述化合物或它們的鹽和可藥用載體、稀釋劑或者賦形劑。這種組合物可以為適於經口或非腸道給藥的劑型。
即,適於經口給藥的組合物包括固體型製劑或液體型製劑,具體地有片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片劑)、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。這種組合物可以通過公知的方法生產,其製劑通常包括製藥領域常規使用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如用於片劑的載體或賦形劑有乳糖、澱粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
適於非胃腸道給藥的組合物有針劑、栓劑等,針劑包含的劑型有靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等。這類注射劑根據公知方法,例如將所述抗體或它們的鹽溶解、懸浮或者乳化於無菌水性溶液或無菌油性溶液而製備。注射用水溶液有生理鹽水、包含葡萄糖及其它輔助製劑的等滲溶液,並還可以進一步與合適的助溶劑如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氫的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等結合使用。油性溶液有芝麻油和豆油,它們可與助溶劑如苯甲酸苄酯和苯甲醇結合使用。由此製備的注射液一般裝在合適的安瓿中。用於直腸給藥的栓劑通過將所述抗體或它們的鹽與一般的栓劑基質混合而製備。
上述口服或非口服的醫藥組合物,最好製成適合於活性成分投藥劑量的用藥劑型。其投藥劑型包括,片劑、丸劑、膠囊、注射製劑(安瓿)、栓劑等,每個單位劑型通常含有上述抗體5-500mg,注射劑優選含5-100mg,其他製劑優選含有10-250mg。
此外,前面所述各種組合物也可含有其它活性成分,只要與上述抗體的結合不發生不利的相互作用。
在說明書和附圖中,鹼基和胺基酸的代碼使用IUPAC-IUB生化命名委員會規定的或本領域通用的代碼,如下例所示。對於有光學異構體的胺基酸,除非特別說明,均指L形式。
DNA 脫氧核糖核酸cDNA 互補的脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶I次黃嘌呤核苷R腺嘌呤或鳥嘌呤Y胸腺嘧啶或胞嘧啶M腺嘌呤或胞嘧啶K鳥嘌呤或胸腺嘧啶S鳥嘌呤或胞嘧啶W腺嘌呤或胸腺嘧啶B鳥嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶D腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶V腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶RNA 核糖核酸
mRNA 信使核糖核酸dATP 脫氧腺苷三磷酸dTTP 脫氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脫氧鳥苷三磷酸dCTP 脫氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 纈氨酸Leu 亮氨酸Ile 異亮氨酸Ser 絲氨酸Thr 蘇氨酸Cys 半胱氨酸Met 蛋氨酸Glu 穀氨酸Asp 天冬氨酸Lys 賴氨酸Arg 精氨酸His 組氨酸Phe 苯丙氨酸Tyr 酪氨酸Trp 色氨酸Pro 脯氨酸Asn 天冬醯胺Gln 穀氨醯胺pGlu 焦穀氨酸用下列符號表示本說明書中多次使用的取代基、保護基以及試劑Me甲基Et乙基Bu丁基
Ph 苯基TC 四氫噻唑-4(R)-羧基醯胺基Tos 對甲苯磺醯基CHO 甲醯基Bzl 苄基Cl2-Bzl 2,6-二氯苄基MBzl 甲氧基苄基MeBzl4-甲基苄基OcHeX環己酯OBzl 苄基酯Bom 苄氧甲基Z苄氧碳基Cl-Z 2-氯苄氧羰基Br-Z 2-溴苄氧羰基Boc 叔丁氧基羰基DNP 二硝基苯酚Trt 三苯甲基Bum 叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羥基苯並三唑HOOBt3,4-二羥基-3-羥基-4-氧基-1,2,3-苯並三嗪HONB N-羥基-5-降冰片烯基-2,3-二羧基亞胺DCC N,N′-二環己基碳二亞胺DMF N,N′-甲基甲醯胺TEA 三乙胺WSCD 1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸鈉本說明書的序列表中的序列編號分別表示如下。
表示來自人的本發明蛋白質(TGC839蛋白質)的胺基酸序列。
表示編碼來自人的並具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的本發明蛋白質之DNA序列。
表示在實施例3中使用引物(合成)DNA的鹼基序列。
表示在實施例3中使用引物(合成)DNA的鹼基序列。
表示來自人的本發明蛋白質(TGC838蛋白質)的胺基酸序列。
表示編碼來自人的並具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的本發明蛋白質之DNA序列。
表示在實施例7及實施例20中使用引物(合成)DNA的鹼基序列。
表示在實施例7中使用引物(合成)DNA的鹼基序列。
表示在實施例20中使用引物(合成)DNA的鹼基序列。
在隨後所述實施例3中獲得的大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)SURE/pCAN618/H839於1999年3月10日保藏於日本國茨城縣筑波市東1-1-3的通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-6677,於1999年2月25日保藏於日本國大阪府大阪市澱川區十三本町2-17-85的財團法人·發酵研究所(IFO),保藏編號為IFO 16259。
在隨後所述實施例7中獲得的大腸桿菌轉化體(Escherichia coli)XL10-Gold/pCAN618/H838F於1999年8月2日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-6809,於1999年7月21日保藏於財團法人·發酵研究所(IFO),保藏編號為IFO 16297。
在隨後所述實施例15中獲得的雜合體(hybridoma)克隆No.112-3作為839N-112於2000年3月2日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-7068。
在隨後所述實施例15中獲得的雜合體(hybridoma)克隆No.128-18作為839N-128於2000年3月2日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-7069。
在隨後所述實施例22中獲得的CHO-K1/TGC838N-4於2000年3月10日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-7088。
在隨後所述實施例23中獲得的CHO-K1/618/839F6-3於2000年3月10日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERMBP-7089。
在隨後所述實施例28中獲得的雜合體(hybridoma)839-01於2000年3月10日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERM BP-7086。
在隨後所述實施例28中獲得的雜合體(hybridoma)839-02於2000年3月10日保藏於通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(NIBH),保藏編號為FERMBP-7087。
下面例舉實施例詳細敘述本發明,但並非限制本發明的範圍。使用大腸桿菌(Escherichia coli)進行基因操作按「分子克隆」的方法進行。
實施例1 通過資料庫選擇克隆由スミスクラインビ-チヤム(SB)公司提供資料庫,從該資料庫中選擇的克隆應具有蛋白分泌序列特有的胺基酸序列。
也就是說,在把EST鹼基序列翻譯成胺基酸序列之後,確證5′端存在有Met並且其5′端區域有疏水性的胺基酸序列,進一步選擇在其下遊有親水性、疏水性的胺基酸序列,從最前端的Met至10-30的胺基酸中包含分泌性蛋白所必需的信號序列,即EST克隆。將其中的一個定為HGS2772893。由SB公司函寄並定為TGC839。用含有該基因的質粒轉化至大腸桿菌E.coli,按照操作指南進行培養,製備純化的質粒,再用限制酶EcoRI和XhoI切割該基因,分別切割為2個基因片段約0.9kb和約0.5kb,得知該基因片段為約1.4kb。
然後,用T7和T3引物藉助於ABI 377 Prism螢光DNA序列分析儀分析了該基因的鹼基序列。其鹼基序列和胺基酸序列如圖1所示。
該基因編碼的蛋白質具有252個胺基酸殘基,從它的N末端至第25位胺基酸殘基(Ala)和第26位胺基酸殘基(Gly)之間推測有信號序列被切割。
實施例 2基因表達的確證為了預測在實施例1中得到的基因功能,研究了在人體各種組織和癌細胞株中的基因表達。
首先,用限制酶EcoRI和Xho I將基因切割,斷裂片段約為900個鹼基DNA,將該DNA片段用作探針,再分別從各種組織、細胞中提取mRNA,然後進行Northern印跡分析。クロンテツク公司提供的人各種組織Northern(MTN)Blot、人的癌細胞株(Human Caner cell line)的mRNA Blot,或者將人的各種癌細胞mRNA轉移至尼龍膜上,按照操作指南使它們與同位素標記的DNA探針反應,漂洗尼龍膜後,通過放射自顯影圖像研究該基因表達的組織和細胞。
所述基因的表達在正常成人的組織中幾乎得不到確證,僅在癌細胞、胎兒的腦和肺中確證有該基因的特異性表達(圖2、3)。
實施例3 在動物細胞中通過人TGC839蛋白質構建基因表達載體構建基因表達載體是為了使人TGC839蛋白質在動物細胞中能夠進行表達。此時,為了後面所進行的表達產物更容易檢測出來,在TGC839蛋白質的C端插入由8個胺基酸構成的FLAG序列(DYKDDDDK)。
以下將帶有FLAG序列的TGC839蛋白質特稱為TGC839FLAG蛋白質。
首先,設計一種合成DNA,該DNA是以編碼TGC839蛋白質的cDNA片段為模板,在臨近翻譯起始密碼子ATG的附近有EcoRI限制酶切點,即[5′GCGCTCGAATTCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAG 3′(SEQID NO3)]和在TGC839蛋白質的C末端有DYKDDDDK所示胺基酸序列,然後再設計一種合成DNA,該DNA有翻譯終止密碼子、NotI限制酶切點,用[5′GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTAAAGGACTCTCCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAG 3′(SEQ ID NO4)]進行PCR擴增,獲得包含TGC839ORF的DNA片段。用限制酶EcoRI(寶酒造公司產品)、EagI(New England Biolabs公司產品)進行雙重消化後,將其插入到pCAN618的EcoRI、NotI位點,獲得在人TGC839蛋白質的C端帶有FLAG序列的TGC839FLAG的動物細胞表達載體pCAN618/H839F。
通過公知方法將該pCAN618/H839F轉化至大腸桿菌(Escherichiacoli)SURE株,從而獲得Escherichia coli SURE pCAN618/H839F。
實施例4 在COS7培養上清液中進行人TGC839蛋白質分泌表達為了證明人TGC839蛋白質是一種分泌性蛋白質,使用COS-7細胞使TGC839FLAG蛋白質表達,並檢驗是否分泌於培養基中。在實施例3中製備的表達載體,在轉化該表達載體的前一天,將COS-7細胞以4×105cell/well密度播種,其DMEM培養基(Gibco-BRL)含有10%的FBS(Hyclone),在CO2培養箱中培養24小時。用pCAN618/H839F DNA和Effectene(Qiagen)進行轉化,24小時後更換另一種培養基,即Opti-MEM培養基(Bibco-BRL),該培養基含有1ml的0.1mMABSF[4-(2-氨乙基)-苯硫基氟化物(hydrocloride)](和光純藥)和0.05%CHAPS[3-[(3-膽胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯](同仁化學)。繼續培養36個小時。培養上清轉移至eppendorf樣品管中,離心,除去漂浮的細胞,再用centricon-10(Amicon)使之濃縮至1/10,添加含有等量DTT的SDS-PAGE樣品緩衝液,上樣於SDS-PAGE。Westem blotting第一抗體使用了抗FLAG小鼠IgG單克隆抗體(M125mg/ml,Sigma),第二抗體使用了HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗小鼠IgG抗體(1/2000,Amersham),顯色反應採用ECLwestern blotting kit(Amersham)進行。
其檢測結果表明,TGC839FLAG蛋白質在細胞內為約34KDa一條帶,而在培養上清液中為比在細胞內所看到的帶要大而寬(圖4)。從該實驗結果可得,TGC839蛋白質其分子內有2個N型附加糖鏈部位,即在該位點上附加了糖鏈而被分泌到培養基中。
實施例5 通過資料庫選擇克隆由スミスクラインビ-チヤム(SB)公司提供資料庫,從該資料庫中選擇的克隆應具有蛋白分泌序列特有的胺基酸序列。
也就是說,在把EST鹼基序列翻譯成胺基酸序列之後,確證5′端存在有Met並且其5′端區域有疏水性的胺基酸序列,進一步選擇在其下遊有親水性、疏水性的胺基酸序列,從最前端的Met至10-30的胺基酸中包含分泌性蛋白所必需的信號序列,即EST克隆。將其中的一個定為HGS951123。由SB公司函寄該克隆並定為TGC838。用含有該基因的質粒轉化大腸桿菌E.coli,按照操作指南進行培養,製備純化的質粒,再用限制酶EcoRI和XhoI切割該基因,其切割分別為2個基因片段約1.0kb和約0.4kb,得知該基因片段為約1.4kb。
然後,用T7和T3引物藉助於ABI 377 Prism螢光DNA序列分析儀分析了該基因的鹼基序列。其鹼基序列和胺基酸序列如圖5所示。
該基因編碼的蛋白質具有246個胺基酸殘基,從它的N末端至第25位胺基酸殘基(Ala)和第26位胺基酸殘基(Gly)之間推測有信號序列被切割。
實施例6 基因表達的確證為了預測在實施例5中得到的基因功能,研究了在人體各種組織和癌細胞株中的基因表達。
首先,用限制酶EcoRI和XhoI將基因切割,斷裂片段約為1.0kbDNA,將該DNA片段用作探針,再分別從各種組織、細胞中提取mRNA,然後進行Northern印跡分析。クロンテツク公司提供的人各種組織Northern(MTN)Blot、人的癌細胞株(Human Caner cell line)的mRNA Blot,或者將人的各種癌細胞mRNA轉移至尼龍膜上,按照操作指南使它們與同位素標記的DNA探針反應,漂洗尼龍膜後,通過放射自顯影圖像研究該基因表達的組織和細胞。
所述基因的表達在正常成人的組織中幾乎得不到確證,僅在癌細胞、胎兒的腦和肺中確證有該基因的特異性表達(圖6)。
實施例7 在動物細胞中通過人TGC838蛋白質構建基因表達載體構建基因表達載體是為了使人TGC838蛋白質在動物細胞中能夠進行表達。此時,為了後面所進行的表達產物更容易檢測出來,在TGC838蛋白質的C端插入由8個胺基酸構成的FLAG序列(DYKDDDDK)。
以下將帶有FLAG序列的TGC838蛋白質特稱為TGC838FLAG蛋白質。
首先,設計一種合成DNA,該DNA是以編碼TGC838蛋白質的cDNA片段為模板,在臨近翻譯起始密碼子ATG的附近有EcoRI限制酶切點,即[5′GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3′(SEQ ID NO7)]和在TGC838蛋白質的C末端有DYKDDDDK所示胺基酸序列,然後再設計一種合成DNA,該DNA有翻譯終止密碼子、NotI限制酶切點,用[5′TTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3′(SEQ ID NO8)]進行PCR擴增,獲得包含TGC838OFR的DNA片段。用限制酶EcoRI、NotI進行雙重消化後,將其插入到pCAN618的EcoRI、NotI位點,獲得在TGC838蛋白質的C末端帶有FLAG序列的TGC838FLAG的動物細胞表達載體pCAN618/H838F。
通過公知方法將本發明的質粒pCAN618/H838F轉染至大腸桿菌(Escherichia coli)XL10-Gold株,從而獲得大腸桿菌轉化體Escherichia coliXL10-Gold/pCAN618/H838F。
實施例8 在COS-7細胞培養上清液中純化人TGC839蛋白質在實施例4中證明,人TGC839蛋白質已分泌在COS-7細胞培養上清液中,因此將人TGC839FLAG蛋白質從COS-7細胞培養上清液中可以實施純化。在實施例3製備的表達載體,在轉化該表達載體的前一天,將COS-7細胞以2×106cell/plate密度播種於直徑為10cm的培養皿上(共10個),其DMEM培養基(Gibco-BRL)含有10%的FBS(Hyclone),在CO2培養箱中培養24小時。用pCAN618/H839F DNA和Effectene(Qiagen)進行轉化,24小時後更換另一種培養基,即Opti-MEM培養基(Bibco-BRL),該培養基含有4ml的0.1mMABSF(和光純藥)和0.05%CHAPS(同仁化學)。繼續培養36個小時。10個培養皿(10cm)的培養上清液收集至50ml離心管內,離心,除去漂浮的細胞,再用0.2μm超濾膜過濾。將20倍濃度的TBS添加至濾液中使終濃度為1倍,兩次吸附於ANTI FLAG M2-Agarose Affinity Gel(Sigma),然後用Glycine-HCl緩衝液(pH3.5)洗脫目的蛋白質。通過去鹽層析柱(PD-10,Amershampharmacia)更換該洗脫液的緩衝液,為PBS緩衝液,再用Centriplus-10,Centricon-10(Amicon)濃縮至約60μl得到純化的樣品。將純化的樣品上樣於SDS-PAGE,進行CBB染色,同時觀察到一條約45KDa較寬的帶。
實施例9 對純化的人TGC839FLAG蛋白質N末端胺基酸序列的分析取2μl實施例8獲得的純化樣品,於氣相胺基酸測序儀LF3000蛋白質測序儀(ベツクマンコ-ルタ-)分析N末端胺基酸序列。其結果是,從N末端起依次檢測出下列各種胺基酸殘基1.甘氨酸(5.10pmol)、2.精氨酸(6.53pmol)、3.丙氨酸(3.97pmol)、4.天門冬氨酸(6.92pmol)。
從該分析結果得知,人TGC839蛋白質從其人TGC839蛋白質前體的N末端切割了25個胺基酸殘基的信號序列,從第26位精氨酸殘基開始的該蛋白質以人TGC839成熟蛋白質分泌於培養基中。
實施例10 製備Gly-Arg-Ala-Asp-Pro-His-Ser-Leu-CysTGC-839肽(26-34)把2.27g Boc-Cys(MBzl)-OBzl作為起始物質,用4N-HCl·乙酸乙酯除去Boc基,用當摩爾TEA中和HCl鹽,再用HONB/WSCD·HCl縮合Boc-Leu·H2O。在乙酸乙酯中萃取反應液,用0.1N-HCl、5%-碳酸氫鈉水溶液洗滌,經無水硫酸鈉乾燥後除去溶劑,將其殘渣通過乙酸乙酯和己烷過濾獲得結晶[2.3g(80.3%)]。同樣,用所述Boc-Leu-Cys(MBzl)-OBzl作為起始物質,縮合Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom),從而獲得Boc-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl(I)1.23g。以Pro-OBzl為起始物質合成Boc-Asp(OcHex)-Pro-OBzl,催化還原該合成物除去苄基酯,從而獲得油狀Boc-Asp(OcHex)-Pro-OH(II)。以Ala-OBzl為起始物質使Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly縮合,得Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OBzl,將其催化還原用乙腈和乙醚過濾並得到粉末狀的Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OH(III)。用4N-HCl·乙酸乙酯處理(I)0.407g除去Boc基,然後溶於DMF,用62μl TEA中和後,再用(II)0.23g、HOBt 225mg、WSCD·HCl 160mg縮合。在乙酸乙酯中萃取反應液,用5%-碳酸氫鈉水溶液洗滌,經無水硫酸鈉乾燥後除去溶劑,將其殘渣通過乙酸乙酯和己烷過濾獲得其結晶,從而得到Boc-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys-(MBzl)-OBzl(IV)338mg(63.8%)。用4N-HCl·乙酸乙酯處理(IV)187mg除去Boc基,然後溶於DMF,用22μl TEA中和後,使(III)90g、HOBt 79mg、WSCD·HCl 56mg縮合。除去溶劑,在乙酸乙酯中得到凝膠狀的Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys-(MBzl)-OBzl228mg。使117.8mg與p-甲酚974mg和無水氟化氫10ml一起,在0℃下,處理60分鐘除去所有保護基團。用50%醋酸溶液灌注的肽級分經過SephadexTMG-25柱(2.0×80cm)分級,進一步將主要級分加樣於經過灌注LiChroprepTMRP-18的反相層析柱(2.6×8.0cm)上凍幹獲得30mg白色粉末。
質譜分析(M+H)+955.4(計算值955.4)HPLC洗脫時間10.5分鐘。
柱條件柱子Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脫劑A液(0.1%TFA溶液)B液(含0.1%TFA的乙腈溶液)按A液到B液95/5-45/55的線性密度梯度洗脫(25分鐘)。
流速1.0ml/min實施例11 製備含有TGC-839肽(26-34)的免疫原製備所述實施例10中的TGC-839肽(26-34)和牛甲狀腺球蛋白(BTG)的複合物作為免疫原。也就是說,使10.5Mg的BTG溶於0.9ml的0.1M磷酸緩衝液(pH6.7)中,再與含有1.2mg的N-(γ-馬來醯亞胺丁醯氧基)琥珀亞醯胺(GMBS)的100ml DMG溶液混合,室溫下反應30分鐘。用含有2mM EDTA的0.1M磷酸緩衝液(pH6.5)平衡的SephadexG-25柱除去多餘的GMBS試劑,然後,使帶有馬來醯亞胺基的BTG7.5mg和溶解在0.2ml DMF中的TGC-839肽(26-34)1.5mg混合,4℃下反應2天。反應後,用生理鹽水4℃下透析2天。
實施例12 免疫用所述實施例11的免疫原TGC-839肽(26-34)-BTG複合物同時與福氏完全佐劑對7周齡雌性小鼠BALB/C進行皮下免疫注射。6周後,再用等量的免疫原與福氏不完全佐劑進行追加免疫注射,1周後採血。
實施例13 製備酶標記的抗原製備辣根過氧化物酶(HRP)標記的TGC-839肽(26-34)
使所述實施例10中的TGC-839肽(26-34)與HRP(用於酶免疫測定法,ベ-リンガ-マンハイム)交聯,作為酶免疫測定法(EIA)的標記物。也就是說,將11.6mg的HRP溶解於0.95ml的0.1M磷酸緩衝液(pH6.7)中,再與含有1.2mgGMBS的DMF溶液50μl混合,室溫反應30分鐘,然後,用0.1M磷酸緩衝液(pH6.5)平衡SephadexG-25柱並上樣於該柱進行分級。如上所述帶有馬來醯亞胺基的HRP2.7mg與實施例1製作的0.38mg TGC-839肽(26-34)混合,4℃下反應1天。反應結束後,用0.1M磷酸緩衝液(pH6.5)平衡超凝膠AcA54(フアルマシア)柱並上樣於該柱進行分級,得到標記的HRP TGC-839肽(26-34)。
實施例14 對小鼠免疫TGC839肽(26-34)進而測定抗血清中的抗體效價小鼠抗血清中抗體效價的測定按如下方法實施。為了製作結合抗小鼠免疫球蛋白抗體的微量滴定板,首先將含有100μg/ml的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(IgG片段,カツペル)的0.1M碳酸緩衝液(pH9.6)分別注入96孔微量滴定板上,每孔為100μl,4℃下放置24小時。然後,將滴定板用磷酸緩衝生理鹽水(PBS、pH7.4)漂洗,為了封閉孔內其它結合部位再各自分注300μlPBS(pH7.2)該PBS包含25%封閉劑(ブロツクエ-ス)(雪印乳業)和0.1%NaN3,至少在4℃下反應24小時。
用緩衝液-EC
稀釋小鼠抗血清,取稀釋的小鼠抗血清100μl添加於上述結合抗小鼠免疫球蛋白抗體微量滴定板上的每個孔,使之在4℃下反應16個小時。進而用PBS(pH7.4)洗滌該滴定板,再用緩衝液-C[1%BSA、0.4M NaCl、以及含有2mM EDTA的0.02M磷酸緩衝液(Ph7.0)]稀釋所述實施例13所製備的HRP標記的TGC839肽(26-34),稀釋倍數為120倍,添加該稀釋液100μl,室溫下使之反應7個小時。然後用PBS(pH7.4)洗滌該滴定板,添加100μl TMB微孔過氧化物酶底物系統(KIRKEGAARDPERRY LAB.フナコシ藥品經銷)室溫反應10分鐘,由此測定固相載體上的酶活性。添加1M磷酸100μl終止反應,用滴定板リ-ダ-(MTP-120,コロナ)測定450nm的吸光度(Abs.450)。其結果如圖7所示。對8隻經過免疫的小鼠進行測定,結果表示TGC839肽(26-34)抗體效價升高。
實施例15 單克隆TGC839肽(26-34)抗體的製備對顯示較高抗體效價的小鼠No.3及No.8進行240μg免疫原TGC839肽(26-34)-BTG靜脈注射,從而加強免疫。加強免疫後4天取小鼠脾,用不鏽鋼網篩壓迫過濾,使之懸浮於イ-グルズ極限培養基(MEM)中,獲得脾細胞懸浮液。作為融合的細胞,選用來自BALB/C小鼠骨髓瘤細胞P3-X63.Ag8.U1(P3U1)[Current topics in microbiology and immunology,81,1(1978)]。細胞融合依據[Nature,256,495(1975)]最早提出的方法實施。即用不含血清的MEM各自3次洗滌脾細胞及P3U1,以6.6∶1的比率使脾細胞與P3U1混合,以750轉速離心15分鐘使細胞沉澱。棄去上清液,輕輕去除沉澱,加0.3ml45%聚乙二醇(PEG)6000(コツホライト公司產品),37℃溫水浴靜止7分鐘進行細胞融合。對融合後的細胞逐漸添加MEM,MEM達到15ml時,再以750轉速離心15分鐘棄去上清液。使該細胞沉澱物懸浮在含有10%胎牛血清的GIT培養基(和光純藥)(GIT-10%FCS)中使P3U1每1ml有2×105個,用24孔多孔板(リンブロ)每孔各1ml共播種168個孔,播種後,將細胞在37℃下在含有5%CO2的培養箱培養。24小時後,在每個孔內各自添加1ml的含有HAT(次黃嘌呤核苷1×10-4M、氨基蝶呤4×10-7M、胸腺嘧啶核苷6×10-3M)的GIT-10%FCS培養基(HAT培養基),開始HAT選擇培養。HAT選擇培養在開始融合後4,7天,棄去1ml原液,然後換用1ml的HAT培養基繼續培養。細胞融合後第9天觀察到雜交瘤細胞的增殖,並取其上清液。
上清液中抗體效價按照改良實施例14描述的方法進行實施。也就是說,用培養上清液100μl及緩衝液C稀釋200倍的HRP標記的TGC839肽(26-34),取該標記物100μl添加於結合抗小鼠免疫球蛋白抗體的微量滴定板上的每個孔內,使之在4℃下反應過夜。用PBS洗滌該滴定板,然後,按照實施例14描述的方法測定固相載體上的酶活性。其結果為,從168個孔中選擇有抗體效價的60個孔,凍存雜交瘤細胞。進一步對9個孔內的雜交瘤細胞,即No.39、No.53、No.61、No.76、No.85、No.112、No.128、No.139、及No.151按照稀釋法進行克隆。克隆時,BALA/C小鼠胸腺細胞作為飼養細胞並添加於孔中使每孔細胞為5×105。克隆後,按照同樣方法測定上清液中的抗體效價。陽性克隆從No.39起在20個孔中檢測出6個孔;No.53在20個孔中檢測出2個孔;No.6l在20個孔中檢測出5個孔;No.76在20個孔中檢測出9個孔;No.85在20個孔中檢測出8個孔;No.112在40個孔中檢測出3個孔;No.128在50個孔中檢測出13個孔;No.139在30個孔中檢測出2個孔;及No.151在20個孔中檢測出4個孔。
在這些克隆中選擇No.39-35、No.53-16、No.61-2、No.76-12、No.85-16、No.112-3、No.128-18、No.139-26、No.151-2作為產生單克隆TGC839肽(26-34)抗體的雜交瘤細胞。
實施例16 分析單克隆抗體的類型及其亞類型按照實施例14描述的方法,製作抗家兔IgG抗體結合微孔滴定板。也就是說,將含有100μg/ml山羊抗家兔免疫球蛋白抗體(IgG片段,カツペル)的0.1M碳酸緩衝液(pH9.6)分別注入100μl至96孔微量滴定板的每個小孔內,4℃下放置24小時。然後,用磷酸緩衝生理鹽水(PBS、pH7.4)漂洗滴定板,為了封閉孔內其它結合部位再各自注入300μlPBS(pH7.2)該PBS包含25%封閉劑(ブロツクエ-ス)(雪印乳業)和0.1%NaN3,至少在4℃下處理24小時。在抗家兔IgG抗體結合微孔滴定板中,添加100μl的被包含在緩衝液-EC及バイオラツド公司產品同種型試劑盒所含有的亞型特異抗體,在4℃下反應1天。用PBS pH7.4洗滌滴定板之後,添加上述雜交瘤細胞培養上清液,在4℃下反應1天。用PBS pH7.4洗滌滴定板之後,添加100μl HRP標記的TGC-839肽(26-34),反應6個小時,該標記物是用所述實施例13中緩衝液C稀釋至400倍而製成的。用PBS pH7.4洗滌滴定板之後,按照實施例14描述的方法測定固相載體上的酶活性。其結果是,這些雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的類型及亞類型分別為No.39-35(IgG3)、No.53-16(IgG3)、No.61-2(IgG2、λ)、No.76-12(IgG3)、No.85-16(IgG2b、κ)、No.112-3(IgG1)、No.128-18(IgG1、κ)、No.139-26(IgG1)、No.151-2(IgG2a)。
實施例17 競爭法-EIA根據競爭法-EIA研究所選擇的每個單克隆抗TGC839肽(26-34)抗體與TGC839肽(26-34)的競爭性反應。首先,按照實施例14描述的方法測定每個包含單克隆抗體的培養上清液的抗體效價,分析用於競爭法-EIA的抗體濃度。然後,在抗小鼠免疫球蛋白抗體結合微量滴定板中,對所分析的濃度加入50μl用緩衝液-C稀釋的抗體溶液、逐步稀釋的TGC839肽(26-34)緩衝液-C 50μl,還有50μl HRP標記的TGC839肽(26-34)(用緩衝液-C稀釋1500倍),在4℃下反應1天。反應結束後,用PBS pH7.4洗滌滴定板,然後按照實施例14描述的方法測定固相上的酶活性。如圖8所示。由於40ng/ml的TGC839肽(26-34)的緣故而被抑制了33-92%,由此可知所述這些單克隆抗體與HRP標記的TGC839肽(26-34)之間的結合是由於所述抗體與TGC839肽(26-34)反應的結果。尤其是,No.128-18及No.112-3其B/B050%結合抑制值分別為2ng/ml及7ng/ml,顯示了高親和性。另外,B/B0表示,當TGC839肽(26-34)存在時分別與HRP標記的TGC839肽(26-34)抗體的結合量與當TGC839肽(26-34)不存在時分別與HRP標記的TGC839肽(26-34)抗體的結合量之比。
實施例18 由雜交瘤細胞引起小鼠腹水本發明進行了雜交瘤細胞No.128-18及No.112-3引起小鼠腹水的實驗。首先,將礦物油0.5ml注入小鼠(BALA/C、雌性)腹腔內,每隻小鼠腹腔注射1-3×106個所述雜交瘤細胞,接種後6-20天採集含有抗體的腹水。單克隆抗體由收集到的腹水通過蛋白A柱進行純化。也就是說,將腹水約25ml用等量的結合緩衝液(3.5M NaCl、含有0.05%NaN3的1.5M甘氨酸pH9.0)稀釋,再上樣於用結合緩衝液平衡的重組體-蛋白A-瓊脂糖(Repligen)層析柱上,用分離緩衝液(含有0.05%NaN3的0.1M枸櫞酸緩衝液pH3.0)洗脫特異抗體。於4℃下,用洗脫液對PBS(pH7.4)進行透析兩天。用0.22μm濾膜過濾(ミリポア公司產品)除菌,並貯存於4℃或-80℃下。把所得單克隆抗體命名為128-18抗體、112-3抗體。
實施例19 製備能識別TGC838部分肽的家兔抗血清與實施例10方法相同,合成一段由25個胺基酸殘基組成的肽,它相當於TGC838蛋白Tyr166-Cys190(將翻譯啟始密碼子的Met作為第一位)。對於8.2mg的肽要使用N-(6-Maleimidocaproyloxy)Succinimide及KeyhokeLympet Hemocyanin 19.7mg,在含有8M尿素和0.9%NaCl的磷酸緩衝液(20mM pH7.4)中,反應15個小時(室溫)製作結合物。將該結合物分批與佐劑混合併注射於家兔皮下,經過免疫之後,採血,離心血液,以除去血細胞成分,獲得抗血清。
實施例20 建立TGC838的表達載體建立基因表達載體是為了使人TGC838蛋白質在動物細胞中能夠進行表達。首先,設計一種合成DNA,該DNA是以編碼TGC838蛋白質的cDNA片段為模板,在翻譯起始密碼子的附近有Eco RI限制酶識別位點,即[5′GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3′(SEQ ID NO7)]和另外一種合成DNA,該DNA在終止密碼子之後有Not I識別位點,即[5′TTGCGGCCGCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3』′(SEQ ID No9)],用這兩種DNA進行PCR擴增,得到包含TGC838的ORF片段。用限制酶Eco RI和Not I切割所得DNA片段,並將其插入pCAN618的Eco RI和Not I位點上,以得到在動物細胞內能夠表達TGC838蛋白質的pCAN618/H838載體。
實施例21 在COS7細胞內表達TGc838蛋白質及TGC839蛋白質將COS-7細胞以4×105cell/well密度播種在6孔平板之上進行培養,其DMEM培養基(GibcoBRL)含有10%的FBS(胎牛血清),培養時間為24小時。用LipofectAMINE(GibcoBRL)將實施例20、實施例3或實施例7所得的表達載體pCAN618/H838 DNA、pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839FDNA轉導至所述細胞中,繼續培養18個小時。然後,將培養基更換為含有0.05%CHAPS的Opti-MEM培養基(Bibco-BRL),培養24小時,離心以除去漂浮的細胞,回收培養上清液。然後直接濃縮或者經過超濾作用(Centricon-10,Amicon)檢測其表達產物。
實施例22 在CHO-K1細胞內表達TGC838蛋白質採用磷酸鈣共沉澱技術將TGC838蛋白質表達載體轉染至CHO-K1細胞內。首先在包含10%FBS的Ham′s F12培養基(Bibco-BRL)的組織培養皿(10cm)中培養1×105個CHO-K1細胞24小時。用CellPhect TransformationKit(Pharmacia)使在實施例20中得到的pCAN618/H838 DNA與磷酸鈣一起沉澱,添加於所述的CHO-K1細胞內。培養12個小時後,用5ml的Ham′s F12培養基(不含FBS)洗滌2次,加3ml甘油溶液(15%甘油、150mM NaCl、20mMHEPES、pH7.4)靜止3分鐘。再用5ml的Ham′s F12培養基(不含FBS)洗滌1次,再添加含有10%FBS的Ham′s F12培養基培養36個小時。將舊培養基更換為含有500μg/ml的Geneticin(和光純藥)以及10%FBS的Ham′s F12培養基,培養時間為24個小時。然後,通過有限稀釋從單個細胞中製備能夠表達的細胞克隆,為此,用各種稀釋率在96孔含有500μg/ml的Geneticin(和光純藥)以及10%FBS的Ham′s F12培養基的平板上,進行細胞培養。進而獲得來自單個細胞並能表達TGC838蛋白質的CHO-K1細胞株CHO-K1/TGC838N-4。將對數期生長的細胞培養基更新為含有0.05%CHAPS的Opti-MEM培養基,經過24小時培養後,回收CHO-K1/TGC838N-4細胞株培養的上清液。離心,除去懸浮的細胞並檢測其表達產物。
實施例23 在CHO-K1細胞內表達TGC839蛋白質採用磷酸鈣共沉澱技術將TGC839蛋白質表達載體轉染至CHO-K1細胞內的方法與實施例22方法相同。把在實施例3中得到的pCAN618/H839FDNA轉染至在10cm組織培養皿中培養的CHO-K1細胞內。用Geneticin進行篩選。經過篩選發育的細胞通過菌落篩選表達細胞,再用有限稀釋方法從單個細胞中製備能夠表達TGC839蛋白質的CHO-K1細胞株CHO-K1/618/839F6-3。回收CHO-K1/618/839F6-3培養上清液的方法與實施例22的方法相同。
實施例24 通過Western Blot分析TGC838蛋白質及TGC839蛋白質把含有2-巰基乙醇的SDS凝膠加樣緩衝液加到實施例21-23所得的培養上清液(轉染為表達載體pCAN618/H838 DNA或pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839F DNA的COS7細胞或CHO-K1細胞的上清液)中裂解細胞,用Peptide-PAGE(TEFCO)進行電泳,從凝膠上直接把蛋白質電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham)。作為第一抗體使用了實施例19所得家兔抗血清(稀釋倍數為2000倍)、或實施例12所得小鼠抗血清(稀釋倍數為50000倍)、或實施例18所得小鼠IgG(2μg/ml)、或實施例19所得的家兔抗FLAG小鼠IgG(10μg/ml,Sigma)。作為第二抗體來說,使用了HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗小鼠IgG抗體(稀釋倍數為2000倍,Amersham)、或HRP標記的抗家兔IgG抗體(稀釋倍數為2000倍,Amersham)。顯色反應採用ECLplus Western Blot Detection System(Amersham)進行。從顯色結果可知,TGC838蛋白質及TGC839蛋白質分泌在培養上清液之中(圖9)。另外,在轉染pCAN618/H838 DNA或pCAN618/H838F DNA的COS7細胞上清液中,從電泳上來看,分泌形成的產物,它們的遷移率是相同的。這些分泌產物用抗FLAG肽抗體無法檢測,進一步由此可知所分泌的TGC838蛋白質其C末端已被處理(圖10及圖11)。
實施例25 通過各自TGC838蛋白質及TGC839蛋白質抗體進行的免疫沉澱用TBS-T/BSA(25mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、0.05%Tween20、0.01%BSA)處理10μl的蛋白G-Sepharose(Pharmacia),處理時間為30分鐘。然後添加用TBS-T/BSA稀釋的10μg小鼠IgG或5μl的家兔抗血清於處理過的蛋白G-Sepharose,使之反應2個小時。用TBS-T/BSA洗滌3次,再添加實施例21所得培養上清液(把轉染表達載體pCAN618/H838F DNA或pCAN618/H839F DNA的COS7細胞的上清液通過超濾濃縮形成),使之反應2個小時。用TBS-T/BSA洗滌4次之後,加入SDS凝膠加樣緩衝液,在90℃下,反應2分鐘與蛋白質結合併洗脫所述蛋白質。同時加入含有2-Mercaptoethanol等量的SDS凝膠加樣緩衝液,用Peptide-PAGE進行電泳,從凝膠上直接把蛋白質電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham),進行Western Blot分析(圖12)。作為第一抗體使用了小鼠抗血清(No.8小鼠,如實施例14所述),作為第二抗體來說,使用了HRP標記的抗小鼠IgG抗體(稀釋倍數為2000倍)。顯色反應採用ECLplus Western Blot DetectionSystem(Amersham)來進行。
實施例26 確證TGC838蛋白質及TGC839蛋白質上是否帶有糖鏈為了確證在TGC838蛋白質及TGC839蛋白質的胺基酸序列上所推測的2個位置即N型糖鏈附加部位上是否帶有糖鏈,採用酶處理法以除去這些糖鏈。通過超濾作用使實施例21所得COS7細胞上清液濃縮10倍,再用N-糖苷酶F Deglycosylation Kit(Boehringer)除去糖鏈。所得反應產物經過超濾濃縮後,用實施例24方法對其蛋白質進行Western Blot分析。分析結果證實,TGC838蛋白質及TGC839蛋白質的分子量均減少了10KDa,這些蛋白質明顯地帶有N型糖鏈(圖13)。
實施例27 人軟骨肉瘤細胞株(SW1353)的培養和培養上清液的回收SW1353細胞用含有10%FBS的L15培養基(ICN Biochemicals)培養至對數生長期的後期為止,取其培養上清液。離心除去懸浮的細胞,研究上清液中的表達產物。
實施例28 用抗TGC839FLAG單克隆抗體設計EIA通過以下方法製備TGC839FLAG。也就是說,用中空纖維技術將1000ml培養上清液濃縮至20ml,該上清液為實施例23中所得產生TGC839FLAG的細胞CHO-K1/618-839 F 6-3。濃縮液中加入1/10體積的含有1.5M NaCl的500mM MOPS緩衝液(pH7.5),所得溶液提供於經過含有150mM NaCl的500mM MOPS緩衝液(pH7.5)平衡的Anti-FLAG M2 AffinityGEL(SIGMA)5ml,使TGC839FLAG吸附。用含有150mM NaCl的50mMMOPS緩衝液(pH7.5)充分洗滌之後,再用100mM Glycine-HCl緩衝液(pH3.5)洗脫TGC839FLAG。該洗脫液進一步用1M Tris-HCl緩衝液(pH9.0)中和,用Centricon30(Amicon)濃縮至1ml。通過BCA蛋白質測定試劑(PIERCE)檢測所得純化樣品蛋白質的濃度。從而從1000ml的培養上清液中得到約500μg的TGC839FLAG。
產生抗TGC839FLAG單克隆抗體細胞的製備主要根據實施例15進行實施。也就是說,通過上述方法將純化的TGC839FLAG對小鼠進行免疫,經免疫之後,分離該小鼠的脾細胞。將該細胞與小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U.1融合雜交形成雜交瘤。然後,測定其TGC839FLAG抗體效價,從具有抗體效價的克隆中,篩選產生單克隆抗體No.839-01的雜交瘤839-01及產生單免隆抗體No.839-02的雜交瘤839-02作為抗TGC839FLAG單克隆抗體的雜交瘤。
通過以下方法製備抗TGC839FLAG單克隆抗體的EIA系。也就是說,將1/8英寸的聚苯乙烯珠(イムノケミカル公司商品)浸泡在含有抗TGC839FLAG單克隆抗體No.839-01(20μg/ml)的50mM MOPS緩衝液(pH7.5)中,4℃下靜止過夜,然後將該珠子用含有1%BSA的50mM MOPS緩衝液(pH7.5)洗滌3次。再將珠子浸泡於含有1%BSA的50mM MOPS緩衝液(pH7.5)中,4℃下靜止過夜,進而製備了抗TGC839FLAG單克隆抗體珠子。另外,抗TGC839FLAG單克隆抗體No.839-02按照常規方法(石川英治編,《酶標記法》.學會出版中心(1991)p62所述方法)標記了過氧化物酶(POD、Roche)。
用上述備好的製劑測定FLAG。用全自動化學發光酶免疫測定裝置-スフイアライト180(Olympus光學工業)。也就是說,將1個所述抗TGC839FLAG單克隆抗體珠子置於該測定裝置內,並與已調配成各種濃度的標準溶液50μl的TGC839FLAG和含有2%BSA的50mM MOPS緩衝液(pH7.5)90μl一起在37℃下,反應7分鐘,然後取出珠子用生理鹽水衝洗。使該珠子與POD標記抗TGC839FLA單克隆抗體溶液140μl一起在37℃下,反應7分鐘,所述抗體溶液用含有2%BSA的50mM MOPS緩衝液(pH6.5)稀釋,稀釋濃度為5μg抗體/ml。反應結束後,繼續用生理鹽水洗滌珠子,再與含有5mM氨基苯二醯肼和0.02%過氧化氫50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)140μl反應,由此測定發光量(cps)(表1)。所得標準曲線如圖14所示。
表1
接著,用建立的EIA系在各種細胞株的培養上清液中,測定健康人和癌症患者血漿中的TGC838之量。CHO-K1/TGC838N-4及COS7/TGC838細胞培養上清液的提取方法如下實施。也就是說,把實施例22得到的CHO-K1/TGC838N-4細胞接種在6孔板上培養長滿之後,將培養液換為含有0.05%CHAPS的Opti-MEM培養基(ライフテツクオリエンタル),培養2天。另外,一種COS7/TGC838細胞培養的上清液根據實施例21的方法提取。SW1353細胞的培養上清液用含有10%胎牛血清的MEM培養基經過匯合生長之後而進行提取。實際上,已經對健康人(男(M)5例、女(F)3例)表2
表4
實施例29 使用FACS對TGC839蛋白質結合細胞的鑑定(1)紅細胞的製備通過比重密度梯度離心法可獲取人外周血的紅細胞。用等量的PBS稀釋含有40ml的0.1%EDTA 2鈉鹽的人外周血。將3.5ml的分層液Ficoll-Paque PLUS[Amersham Pharmacia Biotech AB公司(Uppsala,Sweden)17-1440-02]分別裝入15ml離心管中,在每個離心管的上部加一層用PBS稀釋的血液7ml。經400×g離心30分後,分離回收淋巴細胞和單核細胞組成的紅細胞層。在回收的紅細胞中加入3倍體積的PBS,離心,回收洗滌的細胞,進一步用PBS洗滌3次,回收紅細胞。
(2)對所得紅細胞進行染色分別在2×106個細胞中加入100μl含有TGC839-FLAG蛋白質10ng/μl的洗滌液(PBS/0.1%NaN3/1%FBS)或加入只有100μl洗滌液(陰性對照),使之懸浮,4℃下反應1個小時。反應結束後,離心除去反應液,用500μl洗滌液2次洗滌反應後的紅細胞。再次除去反應液,加入100μl含有10ng/μl抗FLAG M2抗體[Sigma(MO,USA)F-3165]的洗滌液使之懸浮,4℃下反應40分鐘,用500μl洗滌液洗滌2次。然後加入100μl含有10ng/μlFITC標記-山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體[PharMingen(CA,USA)12064D]的洗滌液使之懸浮,暗處4℃下反應40分鐘,用500μl洗滌液洗滌2次。再用100μl洗滌液懸浮,然後,加入20μl的PE(Phycoerythrin)標記-抗人CD 56抗體(B159)溶液[PharMingen(CA,USA)31665X],暗處室溫下反應25分鐘,用1000μl洗滌液洗滌2次。進一步用500μl洗滌液懸浮,用細胞清除儀除去細胞塊等雜質從而供於FACS。
(3)FACS分析FACS採用BECTON DICKINSON公司(NJ,USA)的FACScan,分析軟體使用BECTON DICKINSON公司的CellQuest version1.2.2。對每個樣品中的1×105個細胞進行分析獲得測定數據。
對所有細胞進行了測定,其結果是,X軸為FITC強度,Y軸為細胞數。當分析與TGC839-FLAG蛋白結合的細胞數時,在添加有TGC839-FLAG蛋白的樣品裡觀察到很多被FITC染色的細胞,該染色細胞要比沒有添加TGC839-FLAG蛋白的陰性對照組多,由此可以確證與TGC839-FLAG蛋白結合的淋巴細胞的存在(圖17)。該分析結果進一步顯示,在淋巴細胞中還包括與TGC83蛋白結合的細胞。
另外,關於那些測定的細胞,研究了細胞分布情況,其中X軸為FITC強度,Y軸為SSC(單相散射光)。分揀允許結合有TGC839-FLAG蛋白的細胞群通過(ゲ一トをかけた)(R1)。然後研究R1細胞群的分布,其中X軸為FITC強度,Y軸為PE強度。當把結合有TGC839-FLAG並進行CD56表達的細胞群(R2)和非表達CD56細胞群(R3)分開時,結合有TGC839-FLAG蛋白的所有細胞都顯示了CD56的表達現象,並且確證了在NK細胞中TGC839受體能夠進行表達(圖18及表5)。由此可以提示我們,在NK細胞中TGC838受體也能夠進行表達。
表5
實施例30 TGC839蛋白質對NK細胞的細胞損傷性的影響通過Ficoll-Paque(Pharmacia)比重密度梯度離心法分離新鮮的人外周血中的白細胞,用MACS及NK cell Isolation kit(兩者均為,Miltenyi Biotec)獲得NK細胞。將獲取的細胞放在含有10%FBS及IL15(50/ng/ml,RDSystems)的RPMI1640培養基中培養24小時。把細胞洗滌後,放在含有10%FBS及IL12(1/ng/ml,RD Systems)及TGC839FLAG(0-500ng/ml)的RPMI1640培養基(GibcoBRL)中培養16小時,再一次洗滌細胞,然後,研究效應細胞的細胞損傷性。另外,靶細胞是用51Cr標記的人白血病細胞株K562(ATCC)。用RPMI1640培養基洗滌5×106細胞K562後,加100μCi的[51Cr]Na2CrO4(NEN)於37℃標記1小時。細胞洗滌後,放在含有10%PBS的RPMI1640培養基中培養1小時。洗滌細胞,以每孔為104個細胞接種於96孔平板上。用1-12倍的比率將所述的效應細胞加入該平板上培養7個小時。細胞的損傷性通過γ計數器(Beckman)測定培養上清液中的游離放射活性,用下式求得(圖19)。 實施例31 TGC839蛋白質對NK細胞及K562細胞的細胞增殖影響用實施例1的方法獲取人外周血的NK細胞。將獲取的細胞放在含有10%FBS及IL15(50/ng/ml)的RPMI1640培養基中培養24小時後,洗滌細胞。在96孔平板上接種所述NK細胞(105/Well)及K562細胞(2×104/Well),並放在含有10%FBS及IL12(1/ng/ml)和TGC839FLAG(0-500ng/ml)的RPMI1640培養基中培養40個小時。最後的12個小時用BrdU進行標記,利用CellProliferation ELISA(Boehringer)研究細胞增殖情況。在450nm(A450)下,測定其吸光度(圖21,圖21)。
離心除去細胞之後,用Quantokine IFN-γImmunoassay(R D Systems)測定培養上清液中的IFN-γ值(圖22)。
工業利用例如,本發明蛋白質等具有細胞增殖活性等的特性,因此,它可用於病變組織摘除後的組織再生藥物等。本發明蛋白質還可用作篩選能促進或抑制本發明蛋白質活性的化合物或其鹽的試劑之用。通過篩選而得的抑制劑可望作為預防或治療各種癌症(如,子宮體癌、子宮內膜腫瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、成神經細胞瘤、膀胱癌、黑色素腫瘤等)的藥物。
本發明蛋白質的抗體可以特異地識別本發明蛋白質,因此,它可用於定量本發明的待測溶液中的蛋白質,還可用作診斷各種所述癌病的藥物。另外,本發明蛋白質人型抗體還可用作預防或治療各種所述癌病的藥物。
序列表110武田藥品工業株式會社120新蛋白質及其應用130B00033150JP 11-0683021511999-03-15150JP 11-2136351511999-07-28150JP 11-2222001511999-08-0516092101211252212PRT213人4001Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ser Arg Ala Gly Arg Ala Asp Pro His Ser20 25 30Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg35 40 45Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr50 55 60Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys65 70 75 80Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu85 90 95Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn100 105 110Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu115 120 125Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp130 135 140Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr145 150 155 160Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys165 170 175Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly180 185 190Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser195 200 205Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala210 215 220Thr Ala Thr Pro Ser Ser Phe Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala225 230 235 240Ser Ser Ser Leu Ala Ser Glu Glu Ser Pro Leu Glu245 250 2522102211756212DNA213人4002ATGGCAGCAG CCGCCGCTAC CAAGATCCTT CTGTGCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCGTCATC120CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT180TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA240CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA300CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC360CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG420TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG480GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG540TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC600ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC660CAACTCAGGG CCACAGCCAC CCCCTCATCC TTTGCTGCCT CCTCATCATC CTCCCCTGCT720TCATCCTCCC TGGCATCTGA GGAGAGTCCT TTAGAG 756210321140212DNA213人工序列2202234003GCGCTCGAAT TCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG 40210421176212DNA213人工序列2202234004GCGGCCGCTC ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAGTCCTCTA AAGGACTCTC CTCAGATGCC60AGGGAGGATG AAGCAG762105211246212PRT213人4005Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ser Arg Ala Gly Arg Ala Asp Pro His Ser20 25 30Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg35 40 45Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr50 55 60Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys65 70 75 80Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu85 90 95Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn100 105 110Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu115 120 125Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp130 135 140Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr145 150 155 160Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys165 170 175Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly180 185 190Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser195 200 205Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala
210 215 220Thr Ala Thr Thr Leu Ile Leu Cys Cys Leu Leu Ile Ile Leu Pro Cys225 230 235 240Phe Ile Leu Pro Gly Ile245 2462106211738212DNA213人4006ATGGCAGCAG CCGCCGCTAC CAAGATCCTT CTGTGCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCGTCATC 120CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT 180TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA 240CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA 300CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC 360CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG 420TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG 480GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG 540TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC 600ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC 660CAACTCAGGG CCACAGCCAC CACCCTCATC CTTTGCTGCC TCCTCATCAT CCTCCCCTGC 720TTCATCCTCC CTGGCATC738210721163212DNA213人工序列2202234007GCGCTGAATT CCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG ATCCTTCTGT GCCTCCCGCT 60TCT 63210821171212DNA213人工序列2202234008TTGCGGCCGC TCACTTGTCA TCGTCGTCCT TGTAGTCGAT GCCAGGGAGG ATGAAGCAGG 60GGAGGATGAT G71210921147212DNA213人工序列2202234009TTGCGGCCGC TCAGATGCCA GGGAGGATGA AGCAGGGGAG GATGATG 4權利要求
1.蛋白質或其鹽,其特徵在於,它含有與SEQ ID NO1所示胺基酸序列相同或基本相同的胺基酸序列。
2.權利要求1所述蛋白質或其鹽,其中與SEQ ID NO1所示胺基酸序列基本相同的胺基酸序列為SEQ ID NO5所示胺基酸序列。
3.權利要求1所述蛋白質或其鹽,其合成於癌細胞。
4.權利要求1所述蛋白質的部分肽或其鹽。
5.權利要求4所述部分肽或其鹽,其具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第26位至第34位的胺基酸序列。
6.權利要求4所述部分肽或其鹽,其具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第166位至第190位的胺基酸序列。
7.權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽的製造方法,其特徵在於,培養由含有編碼權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽的DNA重組載體轉化形成的轉化體,使之產生該蛋白質或該部分肽。
8.針對權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽的抗體。
9.權利要求8所述抗體為單克隆抗體。
10.權利要求8所述抗體是針對權利要求4所述部分肽或其鹽的抗體,其中所述部分肽或其鹽具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的第26位至第34位胺基酸序列。
11.權利要求8所述抗體是針對權利要求4所述部分肽或其鹽的抗體,其中所述部分肽或其鹽具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的第166位至第190位胺基酸序列。
12.一種診斷藥物,該藥物包含權利要求8所述抗體。
13.一種藥物,該藥物包含權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽或權利要求8所述抗體。
14.篩選能夠促進或抑制權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽的方法,其特徵在於,應用權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽。
15.權利要求14所述篩選法,其中所述活性為細胞增殖活性。
16.篩選能夠促進或抑制權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽的試劑盒,該試劑盒包含權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽。
17.能夠促進或抑制權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽活性的化合物或其鹽,所述化合物或其鹽通過權利要求14所述篩選法或權利要求16所述篩選試劑盒獲得。
18.一種藥物,它包含能夠促進或抑制權利要求1所述蛋白質或權利要求4所述部分肽或其鹽之活性的化合物或其鹽,該化合物或其鹽通過權利要求14所述篩選法或權利要求16所述篩選試劑盒獲得。
19.權利要求18所述藥物為治療或預防癌症之藥物。
20.一種雜合體,其具有產生權利要求9所述單克隆抗體的能力。
21.權利要求8所述抗體為中和抗體。
22.權利要求8所述抗體為人型抗體。
23.一種藥物,包含權利要求22所述抗體。
24.權利要求23所述藥物為治療或預防癌症之藥物。
25.一種藥物,它所包含的化合物或其鹽具有能夠抑制自然殺傷細胞的細胞增殖抑制活性,其中細胞增殖抑制由權利要求1所述蛋白質或其鹽或權利要求4所述部分肽或其鹽所致。
26.權利要求25所述藥物為治療或預防癌症之藥物。
全文摘要
本發明涉及的範圍包括:新的分泌性蛋白質、或其部分肽或其鹽;所述蛋白質的製造方法;含有該蛋白質等的藥物;所述蛋白質的抗體;促進或抑制所述蛋白活性的化合物或其鹽的篩選法和/或篩選試劑盒;通過所述篩選法獲得的化合物;含有該化合物的藥物等。本發明的蛋白質或其部分肽等,例如可以作為組織病變後之摘除的一種再生藥物或用作診斷癌症的藥物等。本發明抗體還可用於定量待測溶液中的蛋白質等。本發明蛋白質進一步可用作篩選能夠促進或抑制蛋白活性的化合物的試劑。
文檔編號G01N33/574GK1368978SQ00806861
公開日2002年9月11日 申請日期2000年3月14日 優先權日1999年3月15日
發明者音田治夫, 大儀和宏, 北田千惠子, 鈴木伸宏, 大久保尚一, 新谷靖, 菊地久仁子 申請人:武田藥品工業株式會社