促腎上腺皮質素釋放因子-結合蛋白抑制劑及其用途的製作方法

2023-06-11 06:41:11

專利名稱：：促腎上腺皮質素釋放因子-結合蛋白抑制劑及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明總地涉及提高內源性神經肽水平，特別是提高腦內促腎上腺皮質素釋放因子水平的方法。本發明的背景最近的臨床資料顯示CRF和神經精神病以及神經退化性疾病，如早老性痴呆相關。早老性痴呆是一種能導致進行性記憶喪失或痴呆的神經退化性腦疾病。據目前估計，在美國有超過二百萬的人遭受此疾病的折磨。尤其是作為證據的幾個跡象顯示CRF和早老性痴呆(AD)相關。首先，在AD中受影響的大腦皮質區域有引人注目(超過50％)的CRF的降低(Bissette等人，JAMA2543067，1985；DeSouza等人，大腦研究(BrainResearch)397401，1986；Whitehouse等人，神經病學37905，1987；DeSouza，醫院實踐(HospitalPractice)2359，1988；Nemeroff等人，規則肽(Regul.Peptides)25123，1989)以及相應的CRF受體的增加(DeSouza等人，1986；DeSouza，1988)，而在非受影響的皮層區域內，既無CRF的也無CRF受體的數量上的變化(DeSouaz等人，1986)。其次，化學親和力交聯研究表明在AD患者的大腦皮層中增加的CRF受體群具有正常的生化性質(Grigoriadis等人，神經藥理學28761，1989)。再者，腦脊液中CRF濃度降低的觀察結果(Mouradian等人，中性肽8393，1986，May等人，神經病學37535，1987)明顯地和總體神經精神的損傷額值相關，這意味著較大的認知損傷和腦脊液中較低的CSF濃度相關聯(Pomara等人，生物精神病學(BiologicalPsychiatry)26500，1989)。有效的治療痴呆的方法嚴重缺乏。最近批准的藥物，TacrineTM是能改進早老性痴呆人的邊緣記憶且還有升高肝酶的不良副作用。腦中CRF含量的變化也發現於和AD具有某些共同的臨床和病理特徵的帕金森氏病以及進行性核上麻痺，神經病中。在帕金森氏病例中，CRF含量降低且表現出和AD病例中相似的染色型(Whitehouse等人，1987；DeSouza，1988)。在進行性核上麻痺病例中，CRF降低到大約為額葉，顳葉和枕葉的對照值的50％(Whitehouse等人，1987；DeSouza，1988)。一些抑鬱性疾病也和CRF水平的降低相關。現已證實那些在季節性抑鬱病的抑鬱狀態下的病人以及在慢性疲勞綜合症的疲勞期內的病人的腦脊液中CRF含量較低(Vanderpool等人，臨床內分泌學症變雜誌(J.Clin.Endocrinol.Metab.)731224，1991)。雖然一些抑鬱症有較高的好轉率且許多最終可以自我控制，但病人的康復率卻有著很大的不同。治療的一個主要目的就是減輕症狀的程度和提高此類抑鬱症的康復率以及防止它們的復發。典型地給予病人抗抑鬱劑，但可導致嚴重的副作用(如服用氟西汀導致的自殺，服用安非布他酮導致的驚厥)。(見Klerman等人，精神藥物的臨床評價原理和指南，R.F.PrienandD.S.Robinson(編輯)，Raven有限出版社，紐約，1994，P.281)。已證實用於CRF含量低所致實的應激系統的低活化可能也在其它疾病中起作用。例如，一些類型的肥胖的特性在於低活性的下丘腦-垂體-腎上腺軸(Kopelman等人，臨床內分泌學(Clin.Endocrinol.)(Oxford)2815，1988；Beinini等人，激素研究(Horm.Res.)31133，1989)，一些外傷後的應激症狀的病人具有低的皮質醇分泌(Mason等人，J.Neu.Men.Dis。174145，1986)，以及那些正在戒菸的病人都降低了腎上腺素和非腎上腺素的分泌且減少了血液中皮質醇的量(West等人，精神藥理學(Psychopharmacology)84141，1984；Paddy等人，臨床實驗藥理生理學(Clin.Esp.Pharmacol.Physiol.)11423，1984)。由於CRF是下丘腦-垂體-腎上腺軸的主要的調節劑，所以這些現象歸根結底說明在這些疾病中CRF起著重要的作用。這些疾病的療效差。例如，最有效的治療肥胖的方法是行為改變方案。然而，幾乎沒有什麼參與者達到目標體重而且復發率高(見Halmi等人，精神藥物的臨床評價原理和指南，R.F.PrienandD.S.Robinson(編輯)，Raven有限出版社，紐約，1994，P.547)。由於這些疾病的治療方法缺乏，所以需要更多的有效療法。本發明利用CRF水平的降低和各種基於神經生理的疾病的關聯從而通過增加游離CRF的水平來有效治療這些疾病，並且進一步提供其它相關的優勢。本發明的簡述本發明提供了提高患者腦中游離CRF水平的方法，該方法是結予病人有效劑量的CRF/CRF-結合蛋白(CRF/CRF-BP)複合物的配體抑制劑。服用該配體抑制劑可使CRF從CRF-結合蛋白上釋放出來。該配體抑制劑可以是從CRF衍生出的肽，CRF的類似物，或者是只要能引起CRF釋放的與CRF無關的物質。該配體抑制劑也可是從天然或合成的化學庫中分離的非肽類化合物。在本發明的一個實施方案中，該配體抑制劑是一從由h/rCRF(胺基酸6-33)，h/rCRF(胺基酸9-33)和h/rCRF所構成的組中選擇的肽。在相關的方面中，本發明提供了包括結合於生理上可接受的載體或稀釋劑的配體抑制劑的治療組合物。在本發明的其它方面提供了改進學習和記憶的方法；減少食物攝入的方法；激活CRF神經循環的方法；治療和腦中低水平CRF相關的疾病的方法；治療和早老性痴呆相關的症狀的方法；治療肥胖病的方法；治療異型抑鬱症的方法；治療分娩後抑鬱的方法；治療年齡相關性記憶喪失的方法以及治療藥物濫用戒斷的方法。在這些方法中，將用作治療這些狀況的有效治療劑是CRF/CRF-結合蛋白的配體抑制劑給予病人。還提供了挑選治療候選人的準則以及評估療效的方法。已發現某些對人CRF-BP具有高度親和性的藥劑可用來給予病人從而和與CRF-BP構成複合物的人CRF進行有效的競爭且將以這種方式增加哺乳動物內源性hCRF的體內有效濃度，以及/或者為了達到特定的治療目的，可選擇性地使用有效濃度的CRF激動劑或CRF拮抗劑和此藥劑協同給藥。換句話說，這些藥物是用來阻斷CRF-BP效應的並從而在機體的那些存在CRF-BP的區域內增加內源性CRF的濃度的。更具體地，已發現長度約為19到28個殘基的肽對hCRF-BP具有高親和性但它們本身對CRF受體表現出了相對小的結合傾向。結果，可以給藥該肽來阻止內源性CRF在特別的區域內清除並因此在體內刺激CRF的生物學效應，而且在一些情況下，和CRF或CRF激動劑聯合給藥該肽可能是有益的。這些藥物的重要性質是可以將可能的副作用減少到最小程度或徹底避免。它們也可以和CRF拮抗劑聯合給藥以防止一些CRF拮抗劑從靶區域的清除，特別是在該CRF拮抗劑對hCRF-BP有相當高的結合親和力的情況下；然而，由於內源性CRF的釋放必定將另外導致CRF-BP從而在某些程度上抵消該效應。這些藥物用於促進孕婦分娩；刺激呼吸系統；消除肥胖；抵消早老性痴呆和慢性疲勞綜合症的效應；然而，為了這些目的，必須用一合適的方式給藥從而使它們能釋放到腦中。另外，本發明也提供了篩選特別有效的CRF拮抗劑的方法，該方法通過雙重篩選檢測這種可能的拮抗劑以測定它們阻斷CRF結合於天然CRF受體的能力以及該候選CRF拮抗劑和hCRF-BP結合的親和力。本發明也提供了篩選神經肽-結合蛋白的方法。在一相關的方面，本發明提供了篩選神經肽/神經肽-結合蛋白複合物，特別是CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑的方法。在一個實施方案中，該方法包括在配體抑制劑存在的水溶液中使CRF和CRF-BP接觸，進一步混合於非離子型洗滌劑，分離該非離子洗滌劑和該水溶液，然後檢測水溶液中CRF的量，從而決定該配體抑制劑是否分解了該CRF/CRF-結合蛋白複合物。在某些實施方案中，可在高於該非離子洗滌劑濁點的溫度下進行混合且優選的非離子型洗滌劑為辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。這些以及其它方面將由於下述詳細敘述的參考資料和附圖而變得很顯然。附圖的簡要敘述圖1提供了來自人(hCRF)(SEQIDNO1)和綿羊(OCRF)(SEQIDNO4)的CRF的胺基酸序列。圖2表示了結合於CRF-BP的以及游離的CRF的水平。在早老性痴呆病人以及正常年齡匹配的對照人的腦組織中測定CRF水平。在有或無CRF-BP配體抑制劑，α-螺旋綿羊CRF(9-41)加入情況下測定CRF水平。圖3表示取自正常對照或早老性痴呆患者的腦組織四個區域的CRF的水平(圖A)和CRF-BP的水平(圖B)。圖4表示腦室內(ICV)注射賦形劑或者CRF(6-33)或者CRF(1-41)後的莫裡斯氏水迷宮試驗和升高十字迷宮試驗的結果。7-10隻為一組的大鼠在試驗前15分鐘接受ICV注射。在莫裡斯氏水迷宮試驗中記錄的是到達平臺的時間。在升高十字迷宮試驗中記錄的是花在開放的臂上時間的百分數。星號表示統計學上的顯著差異。圖5表示了大鼠在Y-迷宮試驗中的結果。在試驗前15分鐘接受ICV注射0，1，5或者25μgCRF(6-33)的大鼠7-10隻為一組。測定其正確反應的百分率。星號表示統計學上的顯著差異。圖6表示大鼠在連續灌輸誘導依賴水平的尼古丁(依賴期)以及兩周的戒斷(戒斷期)過程中體重的改變和食物攝取。體重用方格表示且以克數度量；食物攝取用線條表示且以克數度量。圖7表示給予配體抑制劑h/rCRF(6-33)後依賴於食物攝取的尼古丁的戒斷效果。本發明的詳細描述在進一步闡述本發明之前，理解某些將在下文中使用的術語的定義可能有幫助。「CRF」是指一種調節促腎上腺皮質激素(ACTH)，β-內啡肽，以及其它從垂體中衍生的肽-鴉片樣促黑皮激素原(POMC)的釋放的肽。已測定出人的，大鼠的以及其它物種的CRF的胺基酸序列如圖1(IDNO1序列)所示。大鼠和人的CRF的胺基酸序列是相同的且該蛋白質叫做「h/rCRF」。「游離CRF」是指那些不和CRF-結合蛋白或者CRF受體複合或者結合的CRF。「CRF-結合蛋白」(CRF-BP)是指作為人血漿中的可溶因子存在的或和細胞膜相關聯的蛋白並且其具有可用兩種方法的一種檢測的抑制CRF功能的能力(1)CRF誘導的ACTH從培養的垂體細胞或者從灌注的大鼠垂體前葉系統釋放，或者(2)CRF誘導的CAMP從具有CRF受體的細胞或者從用克隆的CRF受體轉染的細胞中產生。編碼CRF-BP的cDNA克隆的實例已從人肝臟和大鼠腦中分離出來(Potter等人，自然349423，1991)。「CRF/CRF-BP」是指CRF和CRF-BP的複合物。CRF和CRF-BP可以通過疏水的，離子的或者共價的相互作用而結合。「人CRF結合蛋白」(hCRF-BP)是指通過特異性地和hCRF結合使hCRF在體內和體外失去ACTH促分泌素活性的37KDa的血清蛋白。人CRF-BP對hCRF具有高親和性而對oCRF的親和性低，提示hCRF-BP可以促進外周血漿中hCRF的消除。當hCRF和hCRF-BP結合時，它便在體內和體外試驗中失去了刺激ACTH的能力。CRF的頭8個胺基酸已確定為和受體的活化有關而C-末端主要是對受體親和性起作用的。hCRF-BP通過結合中心區域而防止hCRF刺激促腎上腺皮質並從而防止配體和受體的相互作用進而導致ACTH的釋放。CRF/CRF-結合蛋白的配體抑制劑如上所述，本發明通過給予有效劑量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑以便使CRF從CRF-BP中釋放從而提供了一種提高腦中游離CRF水平的方法。該「CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑」用可逆的或不可逆的方式置換了CRF。置換可以通過引起結合的CRF分子變成游離的CRF而發生。另外，由於配體抑制劑對人CRF-BP的高度親和性，所以該配體抑制劑可以抑制游離的CRF和CRF-BP的結合，從而和內源性CRF競爭與hCRF-BP的結合。可逆或不可逆的置換可以通過該配體抑制劑直接和CRF結合位點結合或者替代以該配體抑制劑和非CRF結合位點的位點結合且引起結合的CRF的別構置換而決定。配體抑制劑可以是從CRF或CRF相關序列中衍生的肽或者是為引起結合的CRF置換而設計的隨機的肽。而且，配體抑制劑也可是從天然的小分子庫中衍生的非肽分子，合成的天然分子的類似物，基於CRF/CRF-BP結合複合物的天然特性而特別設計的小分子或其它配體抑制劑。配體抑制劑也可以為給藥化合物的代謝產物。無論是通過CNS(中樞)給藥或全身給藥，該配體抑制劑必須進入大腦。優選地，該配體抑制劑的特徵是其為CRF受體的低親和性拮抗劑(Ki≥1μM)或其對CRF結合蛋白具有100倍的選擇性(Ki≤10nM)。該CRF-BP配體抑制劑也可以對該CRF受體(Ki≥50nM)表現出較溫和的激動劑活性。和CRF-BP結合且置換內源性CRF的肽序列可以是從CRF肽序列，CRF相關肽序列或無關肽序列中衍生出的。已發現長度介於大約為19和28個殘基的較短肽能有效地競爭結合於hCRF-BP而同時對CRF受體表現出非常低的結合親和性。結果，該特別的肽組和該hCRF-BP結合卻基本不和CRF受體結合和/或相互作用。當這些肽單獨給藥時，它們能提高內源性游離CRF的量，並且仍有效地和該CRF受體相互作用。因此，這些肽可用於保證或者提高特別區域或機體器官的內源性CRF的效應。相似地，這些肽如果作為合劑而和CRF受體激動劑或拮抗劑聯合給藥則可以提高它們的功效；然而，若和CRF拮抗劑聯合給藥將在某種程度上由於內源性CRF的釋放而抵消。CRF相關蛋白的實例包括硬骨魚緊張肽和蛙皮降壓肽。優選的肽是那些從h/rCRF中衍生出的。在這個意義上，在本發明的上下文中許多不同的肽都可用於置換內源性結合的CRF。這樣的肽包括α-螺旋oCRF(綿羊CRF)(9-41)(括號中的數字是指胺基酸)，h/rCRF(6-33)，h/rCRF(9-33)，硬骨魚緊張肽I，蛙皮降壓肽以及h/rCRF。優選的肽是h/rCRF(6-33)，h/rCRF(9-33)以及h/rCRF(1-41)OH，因為這些肽和CRF-BP結合但並不對CRF受體表現出可觀的親和性結合。特別優選的是C-末端的游離酸(OH)，而不是在天然CRF中發現的醯胺化。h/rCRF的胺基酸的C-末端的脫醯氨基作用並不影響其對CRF-BP的結合親和力，但大大降低了h/rCRF對該CRF受體的親和力。這些藥劑的N-末端可以通過醯化作用而防止降解，如用乙醯基(AC)進行醯化，並且如此修飾的肽被認為是等價的。現已發現的和CRF-BP結合的但不和CRF受體明顯相互作用的CRF的最小序列為9-33個胺基酸。尤其是22-25個胺基酸殘基在與CRF-BP的結合中起關鍵作用。也可以基於與上述肽系列的同源性設計其它肽。如上所述，在設計肽時最好C-末端胺基酸含有游離酸基。圖1顯示了已知的CRF和CRF相關分子的胺基酸序列的對比。如上所述，9-33個殘基含有和CRF-BP結合所需的最小序列，而22，23和25殘基被認為在結合中起關鍵作用。在設計肽時，一個優選的方法則是和第22位殘基相對應的胺基酸是丙氨酸，和23位殘基相對應的是鹼性胺基酸(精氨酸或賴氨酸)而和25位殘基相對應的是穀氨酸。合適的肽的實例包括人CRF，即hCRF(1-41)的片段，其含有序列Ser-Gln-Gln-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile(IDNO1序列)所用的一個優選片是序列如下的hCRF(6-33)Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser(IDNO1序列)。通過消除序列的殘基該片段在N-末端可縮短到4個殘基和/或者在C-末端縮短到5個殘基，如hCRF(9-33)，hCRF(6-30)以及hCRF(8-29)。可以替換使用的其它肽的實例包括hCRF(6-33)類似物如[Nle21]-hCRF(6-33)，[Nle21]-hCRF(9-33)，[Ile24]-hCRF(6-33)，[Asn26]-hCRF(6-33)，[Nle18，21]-hCRF(6-33)，[Ile27]-hCRF(6-33)，[Va28]-hCRF(6-33)，[Asn29，30]-hCRF(6-33)，[Lys16]-hCRF(6-33)，[Asp17]-hCRF(6-33)，[Leu12]-hCRF(6-33)，[Arg13]-hCRF(6-33)，[Glu9]-hCRF(6-33)，[Va31]-hCRF(6-33)，[Thr33]-hCRF(6-33)，[Arg32]-hCRF(6-33)，[Ile10]-hCRF(6-33)和[Ile14]-hCRF(6-33)。其它可用於此目的肽由如下序列(IDNO2序列)定義Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Ala-Xaa23-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33或者為它們的從N-末端刪除序列中的1到8個殘基或從C-末端刪除序列中的1到5個殘基或者同時刪除兩者所形成的生物活性片段，其中Xaa23為Arg或Lys，Xaa24為Ala，Ile，Asn，Met，Nle或者Leu，並且每一保留的Xaa代表存在於人CRF(1-41)中各自位置上的殘基，或者為另一天然存在的胺基酸，優選地為該天然存在的殘基的保守置換殘基。另一優選的肽組由如下序列(IDNO2序列)定義Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Ala-Xaa23-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33以及其從N-末端刪去序列中的1-8殘基，或者從C-末端刪去序列中的1-5殘基，或者同時刪去兩者而形成的生物活性片段，其中Xaa6為Ile，Met，Leu或者Nle；Xaa8為Leu或Ile；Xaa14為Leu，Met或Nel；Xaa17為Glu或者Ash；Xaa18為Val，Met，Leu或Nle；Xaa19為Leu或Ile；Xaa20為Glu或His；Xaa21為Met，Leu，Nle或Arg；Xaa23為Arg或Lgs；Xaa24為Ala，Ile，Asn，Met，Nle或Leu；Xaa26為Gln，Asn或Glg；Xaa27為Leu，Glu或Gln；Xaa28為Ala或Arg；Xaa29為Gln或Glu；Xaa32為His，Glu或Leu，Xaa33為Ser，Leu或Ile；並且每個保留的Xaa代表存在於人CRF(1-41)中各自位置上的殘基或者另一天然胺基酸，優選的是該天然胺基酸的保守置換。優選地刪除N-末端的2到5殘基。最優選地，Xaa7為Ser，Xaa9為Asp，Xaa10為Leu，Xaa11為Thr，Xaa12為Phe，Xaa13為His，Xaa15為Leu，Xaa16為Arg，Xaa30為Gln而Xaa11為Ala。另一優選的肽組由以下序列(IDNO3序列)定義Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa8-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Glu-Xaa21-Ala-Arg-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Gln-Ala-Xaa32-Xaa33或者其從N-末端刪去序列中的1到8殘基或從C-末端刪去序列中的1到5殘基或者同時刪去兩者而形成的生物活性片段，其中Xaa8是Leu或Ile；Xaa17是Glu或Asn；Xaa18是Val，Met，Leu或Nle；Xaa19是Leu或Ile；Xaa21是Met，Leu或Nle；Xaa24是Ala，Ile或Asn；Xaa26是Gln或Asn；Xaa27是Leu，Glu或Gln；Xaa28是Ala或Arg；Xaa29是Gln或Glu；Xaa32是His或Gln；而Xaa33是Ser或Leu。在後一組中，特別優選的肽包括以下類似物，而不是前述hCRF片段[Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，29，Arg28，Gly32，Len33]-hCRF(6-33)[Asn17，26，Nle18，Ile19，24，Glu27，29，Arg28，Gly32，Leu33]-hCRF(9-33)[Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，Arg28]-hCRF(4-28)[Ile19，24，Asn17，26，Nle18，Glu27，Arg28]-hCRF(7-31)[Ile8，19，Asn17，24，26，Met18，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32，Leu33]-hCRF(6-33)[Asn17，24，26，Met18，Ile19，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32，Leu33]-hCRF(9-33)[Ile8，19，Asn17，24，26，Met18，Gln27，Arg28]-hCRF(8-28)[Ile8，19，Asn17，24，26，Nle18，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32]-hCRF(8-32)[Ile8，19，Asn17，24，26，Nle18，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32]-hCRF(8-32)[Ile8，19，Asn17，24，26，Nle18，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32]-HCRF(8-32)[Met6，14，18，24，Ile8，19，33，Asn17，His20，Arg21，28，Lys23，Gly26，Glu27，29，Leu32]-hCRF(6-33)[Ile8，19，33，Met14，18，24Asn17，His20，Arg21，28，Lys23，Gly26，Glu27，29，Leu32]-hCRF(9-33)[Nle6，14，18，24，Ile8，19，33，Asn17，His20，Arg21，28，Lys23，Gly26，Glu27，29，Leu32]-hCRF(6-33)[Ile8，19，Nle14，18，24，Asn17，His20，Arg21，28，Lys23，Gly26，Glu27，29]-hCRF(8-30)肽的命名見Schroder和Lubke，「肽」，學術出版社(1965)其中，按照傳統表示法，氨基在左邊而羧基在右邊。標準的三字母縮寫式用於確定α-胺基酸殘基，且其中的胺基酸殘基有同分異構體，除非另有說明，這裡所表示的胺基酸是L-型胺基酸，如Ser＝L-絲氨酸，Orn＝L-鳥氨酸，Nle＝L-正亮氨酸，Nva＝L-正纈氨酸，Har＝L-高精氨酸而CML＝L-CαMeleu。該肽可通過諸如專門的固相合成技術，部份固相合成技術，片段縮聚或經典的液相加成法等合適的方法合成。化學合成肽使用合適的保護基保護不同的胺基酸部分的不穩定側鏈基團以防止在該位點發生化學反應直到該保護基最終被去除。大多數方法是在實體於羧基上反應時保護胺基酸或片段的α-氨基，隨後選擇性地除去該α-氨基保護基以使該位置進行隨後的反應。如此的典型肽的合成例子見1993年10月10日頒布的美國專利NO.5,235,036，其公開內容作為參考資料併入本發明。如以其公開內容作為參考資料併入本發明的美國專利NO.4,489,163所述，上文中具體提到的諸如hCRF(6-33)和hCRF(9-33)及其它類似物的肽是用固相工藝人工合成或用BeckmanModel990肽合成儀自動合成的。簡單地說，叔丁氧羰基(Boc)用於α-氨基保護，而TFA-CH2Cl2(3∶2)用於去保護。標準的偶聯通過1，3-二異丙基碳化二亞胺(DIC)介導，而困難的偶聯則是使用2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)完成的。保護肽樹脂是在3％的甲基硫化物存在下用無水氫氟酸(HF)裂解，隨後真空除去HF。粗製肽用多步反相HPLC純化。多肽類似物包括具有和在此具體顯示的其中有一個或多個殘基被一胺基酸殘基在上文所提及的位置上所取代的序列基本相同的胺基酸殘基序列的任何多肽。只要該多肽表現出導致游離CRF增加的能力，如和CRF-BP強烈結合，那麼可用一具有功能上相似側鏈的殘基進行保守置換。保守置換的一般例子包括以一個非極性(疏水的)殘基，諸如異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸，亮氨酸或者蛋氨酸等置換另一個殘基；以一個極性(親水的)殘基置換另一個殘基，諸如精氨酸置換賴氨酸，穀氨酸置換天冬醯氨，蘇氨酸置換絲氨酸；用一個諸如賴氨酸，精氨酸或組氨酸等鹼性殘基置換另一個殘基；以及用一個酸性殘基諸如天冬氨酸或穀氨酸置換另一個胺基酸。該「保守置換」也包括使用化學衍生化殘基代替非衍生化殘基，條件是該多肽表現出所需的結合活性。如前所述，該保守置換可以發生在一個或多個Xaa6-Xaa21和Xaa26-Xaa33殘基；優選的保守置換的實例如表1所述表1＂化學衍生物「是指一個或多個殘基是通過功能性側鏈的反應化學衍生而來的多肽。例如，此衍生的分子包括那些分子，其游離氨基被衍生成胺鹽酸化物，對-甲苯磺醯基，苄酯基，叔丁氧羰基，氯乙醯基或者甲醯基。游離的羧基可被衍生成鹽，甲基和乙基酯或其它類型的酯或醯肼。游離的羥基可被衍生成O-醯基或O-烷基衍生物。組氨酸咪唑氮可被衍生成N-內苯醯組氨酸。化學衍生物還包括那些含有標準胺基酸的一個或多個天然存在胺基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸，5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸，3-甲基組氨酸可取代組氨酸，高絲氨酸可取代絲氨酸，而鳥氨酸可取代賴氨酸。此外，如下文所更詳細討論，合成的隨機肽可隨後進行篩選以鑑定符合從CRF/CRF-BP複合物中置換CRF的功能標準的肽。隨機肽可通過生物學方法，或者組合的化學技術而產生(見Gallop等人，醫藥化學雜誌(J.Med.Chem.)371234，1994)。製備隨機肽的生物學方法至少包括四個不同的方法。首先，可將隨機的核苷酸插入宿主基因從而在微生物體表面表現肽(Charbit等人，Embo.雜誌，53029，1986；Agterberg等人，基因8837，1990，Fuch等人，生物/技術91369，1991；Thery等人，實用環境微生物學(Apple.Environ.Microbiol.)55984，1989)。在此類方法中，不同細菌細胞表面蛋白用作融合配體，其中插入寡檢苷酸產生融合到胞外的蛋白環之一中的肽。LamBOmpA，PhoE，PAL以及傘毛蛋白均可作為在細菌上表現肽的載體。另一可供選擇的在噬菌體表面呈現肽的系統是一優選的方法。所使用的載體是從絲狀噬菌體如M13，fv和fd中衍生的。一般地，諸如pIII或pVIII的膜蛋白作為肽的表面載體。(Smith，科學2281315，1985；Parmley和Smith，基因73305，1988；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378，1990；Markland等人，基因10913，1991，美國專利NO.5,223,409)。噬菌體表現和細菌表現方法在肽和該編碼肽的DNA之間有著自然的聯繫從而便於該DNA序列分離和增殖。第三，肽可通過在其C-末端融合進該DNA結合蛋白LacI而附著於質粒上(Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865，1992)。然後，該融合蛋白和質粒上的Lac啟動子結合從而使得該肽成為和編碼它們的DNA序列特異而穩定地連接。第四，肽還可在失速翻譯後在多核蛋白體表現。通過引起RNA和含有仍然連接於它們編碼的RNA(Gallop等人，醫藥化學雜誌(J.Medicinalchem.)371233，1994)的新生肽的多核蛋白體的積累，編碼該肽的基因材料可以回收。在所有這些方法中，基於引導肽CRF的變體庫可以通過控制相應的插入的「不正確」鹼基的水平而合成。除了生物學方法外，基於組合化學技術的方法也可用於製備隨機肽。已發展的該方法的變型已用於合成多重的，同類的可用於測定的肽。這些方法包括多一針合成(Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813998，1984；Valerio，分析化學(Anal.Biochem).197168，1991；Bray等人，四面體通訊(TetrahedronLett.)326163，1991)和「茶包」方法(Houghten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA825131，1985；Houghten等人，Int.J.Pept.ProteinRes.27673，1986)。也可以合成多重的簡併肽來使用。胺基酸混合物和一單個樹脂支持物的同步偶合是一合成多重肽的一般策略。最近，可溶性肽(Houghten等人，自然35484，1991；Houghten等人，生物技術13412，1992)和固定於固體支持物上的肽(Len等人，自然35482，1991)的組合庫已通過「分裂合成」方法而合成出來。已發展了基於這些合成法的許多變構方法(見Gallop等人，Supra，forreview)，包括在含有該肽結構的鑑定標誌的珠上肽的合成法(PCTWO93/06121)。其中一個這樣的鑑定標誌是一寡核苷酸序列(Needels等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010700，1993)。隨機肽的其它合成法是眾所周知的且可以為本領域的普通技術人員所輕易完成。一些天然的或合成的小，非-肽分子也可用作配體抑制劑。被篩選用作該CRF/CRF-BP複合物配體抑制劑的小分子庫可得自土壤樣品，植物提取物，海洋微生物，發酵液，真菌液，藥物化學庫，組合庫(化學的和生物的)及其類似物。這些庫可來源於商品的和專利的不同渠道。可以合成那些和候選化合物具有相似的但不完全相同結構的分子且按下文所述測試配試體抑制劑。小肽序列可模仿CRF的溶液NMR結構。如前所述，CRF中和CRF-BP結合的關鍵連接殘基是殘基22，23和25。這樣，從殘基20-27衍生的肽序列可由人CRF的參考溶液結構仿製，該結構是通過IHNMR(檢磁共振)和使用抑制分子動力學的遠距離幾何學而測定(蛋白質工程(ProteinEngineering)6149，1993)。由於CRF的α-螺旋結構當進行較大缺失時可能喪失，所示完整的CRF分子用作仿製的基礎。然後，跨越重要的連接殘基的小肽的3-D結構可用於尋找模仿肽結構的非-肽分子的計算機庫。選擇IC-50值比起始分子低的分子。基於最初化合物及其分子的物理和生化特徵可合成進一步的分子。特別優選的候選分子將是IC-50值在10nM或更低的分子。以上討論的任何抑制劑是否都具有要求的特性可通過測定該抑制劑從CRF/CRF-BP結合複合物中置換CRF的能力以及隨後通過評估其結合該CRF受體的能力進行確定。可通過生物學測定試驗或者體外測定試驗篩選候選配體抑制劑的從CRF/CRF-BP複合物中置換CRF的能力。一個適合的生物學測定試驗是測定培養的垂體細胞釋放ACTH。此測定試驗按下述方法進行。來自大鼠的垂體前葉腺用無菌的HEPES緩衝液洗6遍，轉移到含膠原酶的溶液中。隨後轉移到25mlBello分散瓶中，將垂體於37℃攪拌30分鐘，研製，而培養30分鐘，再研製。通過離心收集部分分散的細胞。將細胞塊重新懸浮於10ml的神經氨酸苷酶且再用離心法收集。將該細胞片狀沉澱在25mlBBM-P(BBM(IrvineScientific)加100μg/L皮質醇，1μg/L胰島素，0.1μg/LEGF2，0.4μg/LT3，0.7μg/LPTH，10μg/L胰高血糖素和2％胎中血清)中重新配製，再離心，且所得的片狀沉澱最終在BBM-P中重新配製。然後將細胞以50,000-100,000/孔的密度加於48孔平板培養2天。在試驗那天，為了準備用肽候選分子或CRF刺激用BBM-T洗滌細胞一次。用最大刺激劑量的h/rCRF(1nM刺激細胞且通過RIA或免疫放射測量試驗檢測ACTH的釋放。當加入阻斷濃度的CRF-BP時，釋放的ACTH量減少且可表示為最大釋放部分。按不同的劑量加入配體抑制劑。肽的從CRF-BP中置換CRF的能力可通過表示為由於CRF的單獨加入而引起的最大釋放部分的ACTH的釋放量來測量。篩選候選配體抑制劑的一個優選方式是在體外的配體免疫放射測定試驗(LIRMA)。在LIRMA中，CRF-BP可從腦組織，血清或表達重組體的細胞中分離。重組hCRF-BP可在帶有pSG5-hA3和RSV-neo質粒的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中生產。穩定的CHO轉染子通過G418(SigmaChemical，St.Louis，Mo)選擇下稀釋進行克隆且在Dwlbecco氏改良的補充有2mML-穀氨醯胺和3％胎中血清的Eagle培養基中維持。為了測定hCRF-BP的產量，將轉染的CHO細胞接種到10,000MWCO生物反應器中(CellPharmMicroMouse，UnisynTechnologies，Tustin，CA)。每天從生物反應器中收穫富集培養基且在純化之前貯存於-20℃。裝有重組細胞和組織培養基的在37℃環境中慢慢旋轉的密封轉瓶也可作為一代替方案。hCRF-BP可通過一個3步方法加以純化，而每一步的部分可使用下述方法進行測定。首先，富集培養基用生物指示色譜儀(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)進行親和-純化。利用N-羥基琥珀醯亞胺使人CRF和Affi-Prep10(BioRadLaboratories，Richmond，CA)通過伯氨基偶合。然後，將親合凝膠裝入XK16或相當的柱(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)。親和純化包括以2毫升/分鐘的流速使富集培養基濾過柱，以10柱床體積的100mMHEPESHCl(pH7.5)在5毫升/分鐘的流速下洗滌且以1柱床體積的含有20％乙腈的80mM甲酸三乙基銨(pH3.0)以5毫升/分鐘洗脫。在如pH約為10.5的弱鹼性條件下洗脫也可作為代替的方法。第二次純化使用凝膠色譜。將親和-純化的hCRF-BP冷凍乾燥且在以0.1M乙酸銨緩衝的6M胍-HCl(pH4.75)中重新配製。將一臺FPLC儀和兩根在此純化步驟中串聯的Superose12HR10/30柱(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweben)相連。將1ml親和-純化的hCRF-BP上樣，隨後以6M胍-HCl/0.1M乙酸銨(pH4.75)在0.4毫升/分鐘流速下洗脫，收集每一分鐘的洗脫組份。然後將從第二步純化中得到的活性組份進行反相HPLC。該HPLC儀由2個100A型泵(Beckman，PaloAlto，CA)，一個AxxiomHPLC控制器(ColeScientific，Calabasas，CA)，一個調到214nM的Spectroflow773吸收檢測器(KratosAnalytical，Ramsey，NJ)，以及一個Pharmaciamodel482圖表記錄儀(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)所組成。緩衝液A是0.1％的三氟乙酸(TFA)/5％的乙腈，而緩衝液B是0.1％TFA/80％乙腈。將連續的1ml親和-純化的篩分的hCRF-BP注射液加到半製備性C4HPLC柱(Vydac，Hesperia，CA)，在25％的B緩衝液中流速為2.5毫升/分鐘，當最後的鹽峰通過後，開始使用25％的B緩衝液直止在30分鐘內增加到95％B緩衝液進行單梯度洗脫。然後主要的吸收峰通過hCRF-BPIRMA和胺基酸分析來定量測定。在LIRMA中，將從腦組織，血清或表達重組體的細胞中分離的CRF-BP於結合緩衝液中(0.02％NP-40的50mM磷酸鹽緩衝鹽水)加入96孔平板的孔，小聚丙烯微量離心管，或者玻璃硼矽酸鹽管中。將125I-h/rCRF(NewEnglandNuclear)和10μM的候選配體抑制劑加入且在室溫下培養1小時。在每一管中加入適當稀釋的抗CRF-BP抗體，如兔抗hCRF-BP(Potter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894192-4196，1992)，進一步培育後，加入山羊抗兔抗體從而沉澱結合複合物。離心收集含有125I-CRF的沉澱且用γ計數器測定片狀沉澱中放射活性的量。如果候選配體抑制劑從CRF-BP中置換了CRF，那麼片狀沉澱物中放射活性將比無候選肽加入的對照要低。125I/rCRF與CRF-BP結合的最大抑制(即100％)是通過在用10μM的CRF-BP肽配體h/rCRF(6-33)培育後殘留在片狀沉澱物中的放射活性量來定義的。這樣，候選配體抑制劑的結合能力將通過和標準h/rCRF(6-33)能力的比較而定。優選地，當配體抑制劑存在時至少表現出50％的抑制。該抑制結合親和常數(Ki)是主要的，據報導通過這個試驗，有希望和已發現為0.17+0.01nM的人CRF的Ki比較而得到每一個相對應的值。這樣，一個Ki值比hCRF低的配體將比hCRF本身和hCRF-BP結合得更緊密，而Ki值較高的配體將具有相對較低的結合親和力。因此，由於需要的就是在跟hCRF-BP結合時和hCRF展開合理有效的競爭，所以該藥劑或肽的Ki值越低，其將對此目的具有的價值越大。優選地，該藥劑的Ki值約為20nM或更低，更優選地約為10nM或更低，最優選地，此Ki值為低於5nM。已測定且發現hCRF(6-33)的Ki值為3.5+0.44nM。由於該藥劑也對人CRF受體有低結合親和力，即抑制結合係數大於1000nM且表現出低於約為0.1％的oCRF的CRF激動效應，所以其被認為是本發明方法中可使用的優異選擇。人CRF(9-33)的Ki為11+0.36nM，其受體Ki大於1000nM且是一更弱的CRF激動劑，所以其也是在本發明方法中非常有用的。其它相似的藥劑和肽，特別是那些具有其19到28殘基的hCRF的類似物可以合成且可用此直接的方法測定其在這此有價值的體內增加內源性hCRF有效濃度方法中的作用。這裡具體列舉的肽已被認為是特別有價值的。例如(Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，Arg28)-hCRF(4-28)的Ki的1.7+1.2且對hCRF受體具有相對低的結合親和力。這樣，使用上述LIRMA試驗或其它包括ACTH釋放和2-位點ELISA等方法的高通過量篩選可用於鑑定從CRF/CRF-BP複合物中置換CRF的小分子。在首輪篩選中，全部可能的候選分子都在10μM的單劑量下試驗。然後將任何在10μM劑量下表現出高於50％抑制的化合物選擇出來用於進一步的篩選。通過使用6點劑量的反應曲線的第二輪篩選證實所有符合這種標準的候選分子的活性。計算IC-50值並將那些值在10-100μM範圍內的候選分子進行進一步檢測以證實該候選化合物是從CRF/CRF-BP複合物置換CRF而不是幹擾抗體和CRF-BP的結合。用除了以0.2nM的125I-hCR-BP代替未標記的CRF-BP外其它如LIRMA所述的試驗驗證CRF的特定置換。配體抑制劑也可通過結合的和游離的CRF通過洗滌劑相分離而分離的體外試驗法而篩選。簡單地說，在一個實施方案中，如上所述分離的CRF-BP和125I-h/rCRF以及10μM的配體候選抑制劑一起在結合緩衝液(0.02％NP-40的50mM磷酸鹽緩衝鹽水)中培養。室溫培養1-2小時後，加入諸如商品名為TritonX-114TM的辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的洗滌劑且渦旋混合。高於它們的濁點溫度時，TritonX-114TM和其它非離子型洗滌劑在水中不溶。在此溫度時，發生微觀相分離。低於此溫度時，洗滌劑形成清亮的微胞溶液並且高於此溫度時將形成一耗盡和一富集洗滌劑的兩個清晰的相。TritonX-114TM的濁點溫度是20℃。如此，優選TritonX-114TM。具有親水親油的α-螺旋的CRF更容易在TritonX-114TM中溶解而分配到洗滌劑相中。相反，結合了CRF-BP的CRF則更容易在水溶液中溶解。從而，TritonX-114TM和水溶液的相分離將能分隔結合的和游離的CRF。相分離可通過離心而方便地完成。移去水相(上層)並測定125I-h/rCRF的量。與無配體抑制劑存在下所得的放射活性有關的放射活性減少意味著配體抑制劑從CRF-BP中置換了CRF。125I-h/rCRF和CRF-BP結合的最大抑制(即100％)是通過在用10μM的CRF-BP肽配體h/rCRF(6-33)培育後水相中的放射活性量而定義的。這樣，候選配體抑制劑的結合能力將通過和標準h/rCRF(6-33)的能力比較而測定。優選地，當配體抑制劑存在時至少有50％的抑制。此外，此測定方法還可廣泛地應用於一般結合蛋白的神經肽的篩選。一些神經肽，如NPY和CRF具有相似物理特徵即均為極其疏水的且是有α螺旋。如此，NPY也應該比較水溶液而言更易溶解於非離子洗滌劑如TritonX-114TM。既然該NPY或其它有意義的神經肽一般分配到TritonX-114TM洗滌劑相中，那麼上述的方法可普遍地應用可篩選神經肽結合蛋白。通過例子簡單地說，將來源於不同器官的組織在1％NP-40/PBS增溶緩衝液中均化。3000xg，10分鐘離心除去粒狀物。將50μl的上清液與500PM的125I標記的神經肽一起培養，且如上進行測定，血清或血漿也可作為神經肽結合蛋白的可能的來源。將一定濃度範圍(0.1-1000nM)的非標記神經肽和放射性標記的神經肽同時培養以確定推想的結合蛋白是否特異性地結合放射性標記的神經肽。若該結合是特異性的，TritonX-114TM分離後保留在水相中的放射活性則降低。使用該方法，可測定出每一神經肽和組織提取物的IC-50值。此外，該方法還可用於篩選針對其神經肽結合蛋白的神經肽的配體抑制劑。簡單地說，將放射性標記的神經肽和該神經肽結合蛋白或可溶性受體一起培養並且如上所述進行反應。在這些方法中，無論是重組神經肽結合蛋白或受體或從組織樣品中分離的粗製神經肽結合蛋白都可使用。一個優選的配體抑制劑具有對CRF受體的低親和性拮抗劑作用或具有對CRF結合蛋白的100倍的選擇性。因此，對IC-50值在10-100μM範圍內且特異性地抑制CRF/CRF-BP複合物的化合物結合於CRF受體進行進一步的測試。該配體抑制劑拮抗CRF受體的能力可在CAMP產生試驗中測定。該試驗比較了配體抑制劑增加游離CRF水平，從而結合CRF受體並且刺激CAMP的產生的能力。作為穩定的轉染子該試驗細胞系表達CRF受體。該試驗按照Battaglia等人(Synapse1572，1987)的方法稍作改進進行。試驗細胞在不同濃度的CRF和配體抑制劑中培養1小時。洗滌細胞，並且在培養16-18小時後細胞內CAMP釋放，隨後在20mMHCl，95％乙醇中抽提。凍幹胞溶物，隨後溶於乙酸鈉緩衝液中。CAMP的水平用一單一抗體試劑盒，如得自BiomedicalTechnologies(Stonghton，MA)的試劑盒測定。作為前述競爭性體外測定一個替換方法，該配體抑制劑可用和人CRF受體結合的方法進行測定。該人CRF受體以及和該受體和人CRF的結合試驗如Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA908967-8971，1993所述，其公開內容作為參考資料併入本發明。該藥劑可用放射性標記的[Nle21，Tyr32]CRF計算抑制性結合親和常數(Ki)而測定。優選地，該藥劑的受體Ki至少約為100nM而更優選地為大於1000nM。由於大鼠CRF和人CRF的胺基酸序列相同，所以其還可滿意地用大鼠CRF受體來代替。還可用大鼠垂體前葉細胞測定ACTH的分泌試驗來確定是否配體抑制劑起到hCRF受體的CRF激動劑的作用。所使用的步驟除了只將配體抑制劑加入細胞外其它如前述。在攻擊劑量的CRF存在下進行測定可以確定拮抗作用。將該配體抑制劑的作用和成為用於此目的的標準拮抗劑，如CD-Phe12，Nle21，38J-rCRF(12-41)或CRF的α螺旋片段(AHC)如AHC(9-41)的作用進行比較。上述立足於刺激ACTH分泌的測定CRF激動劑和拮抗劑活性的體外試驗可使用hCRF(6-33)和hCRF(9-33)來進行。作為此試驗的結果，hCRF(6-33)表現出比標準oCRF低得多的且人為地定為1.0的CRF激動劑生物活性。該肽沒表現出實質的CRF拮抗劑活性。由於該肽有低於約0.1％的標準肽的CRF激動劑活性，從這個意義上看，它是可接受的。而肽hCRF(9-33)是更弱的CRF激動劑，其具有明顯低於0.01％的oCRF的活性。需要的是使用的藥劑不和CRF受體強烈結合。一般來說，一種藥劑應該有低於約25％的oCRF的CRF激動劑活性並且不應該表現出實質性的CR競爭性拮抗劑活性。優選地，其應該有低於5％的本標準肽[D-phe12，Nle21，38]-hCRF(2-41)的拮抗劑活性。然而，應該明白的是在該試驗中其值越低，那麼其在本方法中的功能應該越好，這是因為其由於結合於CRF受體的可能的阻斷作用將最小化。本發明除了提供治療方法，還提供了在體內給哺乳動物用藥的篩選作為更有效的CRF拮抗劑的肽或其它藥劑的方法。為實施本篩選方案，首先以前述的眾所周知的方法在培養的大鼠內垂體細胞中測定一候選肽的抑制試驗劑量的CRF的刺激ACTH分泌的生物學效應。然後，該候選肽在如前述的hCRF-BP競爭結合試驗中進行測定以確定其如前文解釋的作為結合於hCRF-BP的親和力指徵的Ki值，且其表現出了從針對的靶細胞位點清除注射的肽的趨勢。基於此兩試驗的測定結果，可選出特別有效的CRF拮抗劑，該拮抗劑在CRF拮抗試驗中表現高值且也有高(CRF-BP)Ki值，意味著其對結合於hCRF-BP表現出相對低的親和力。按本試驗標準，CRF拮抗劑[D-Phe12，Nle21，38]-hCRF(12-41)在測定培養的垂體細胞中ACTH分泌的實驗中表現出Ki值約為60±10nM的很好的拮抗特徵。其(CRF-BP)Ki是300±20nM。另一沒有本標準有效的好的CRF拮抗劑即AHC(9-41)，其Ki值為特別低的0.10±0.036nM。[D-Phe12，Nle21，38，CML37]-hCRF(12-41)的(CRF-BP)Ki值高於1000nM且在垂體細胞培養物的ACTH分泌試驗中其IC50值為45±11nM，因此其甚至比本試驗標準更好。因此，基於這些篩選試驗，後面的肽或本實驗標準應該是選擇的肽和AHC(9-41)相比它在體內實驗中具有大得多的被複合或被hCRF-BP清除的趨勢。該篩選方法提供了一篩選最新合成肽的有用的工具，用於評定它們的在體內治療中作為可能的CRF拮抗劑的總體的相對價值。提高CRF的水平本發明通過給藥CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑而提供了提高腦中游離CRF水平的方法。該游離CRF水平的提高可用體外試驗如ELISA，刺激ACTH的釋放或刺激cAMP的產生而測定。在任何的這些試驗中，由於給藥配體抑制劑而導致的游離CRF增加可和一參照配體抑制劑，在本發明中為h/rCRF(6-33)相比較而測定。最小可接受的增加值是h/rCRF(6-33)值的10％；良好的值為50％，優選的值為80％，而特別優選的值為100％。在這裡所述的方法中，游離CRF的水平可通過雙位點ELISA法對腦樣品的勻漿液，腦脊液或其它體組織和體液進行測定。總CRF首先通過下述方法而定量。將ELISA板孔用抗-CRF抗體如蛋白G純化-綿羊抗-CRF進行包被。洗板，用無關蛋白如酪蛋白，牛血清白蛋白或類似物封閉板上非結合位點。將已製備好的組織樣品和含有己知量CRF的標準品加入孔中且在室溫下結合。隨後再洗板，再加入不同的抗-CRF抗體如RC-70，兔抗人CRF抗體。RC-70和包被板的綿羊抗CRF相比不但來源於不同的物種，而且能檢測不同的抗原決定基。洗板後，加入檢測RC-70或其等同物的酶聯抗體。RC-70抗體也可替代地被酶聯。優選的酶聯物是辣根過氧化物酶和鹼性磷酸酶，但本領域的技術人員會認識到包括放射標記而不是酶在內的許多不同的可接受的替代物都可以使用。加入酶底物，顯色。反應終止後，吸收度的測量用於在組織樣品中存在的總CRF的定量。本領域的技術人員將會認識到在本試驗中可用單克隆抗體或抗體片段代替多克隆抗體。用類似的方法，結合的CRF可通過用抗CRF-BP抗體包被板隨後再用抗CRF抗體檢測結合型CRF的ELISA方法定量。結合的CRF可特異性地被CRF-BP配體α-螺旋oCRF(9-41)所置換從而導致檢測信號的降低。由於α-螺旋oCRF(9-41)不和RC-70，即抗CRF抗體發生交叉反應，所以其可用於置換。而且，存在於上清液中的置換的CRF可用上述的雙位點ELISA方示進行測定。然後，游離CRF可通過計算總CRF和結合型CRF的差值或直接檢測而確定。在直接測定中，在用抗CRF-BP多克隆抗體收集結合的複合物後，移去上清液，再用上述的雙位點ELISA法測定游離的CRF。這裡公開了能提高正常人和早老性痴呆患者腦組織中游離CRF水平的配體抑制劑，α-螺旋綿羊CRF。使用雙位點ELISA測定總體和結合型CRF的量。α-螺旋綿羊CRF的加入導致了所有結合型CRF的釋放(見圖2和實施例5)。除了已描述的在組織中或腦脊液中測定總體的，結合的和游離的CRF的體外試驗外，其它方法可在體內進行。這些方法包括MRI，PETSCAN，透射掃描或其它類似的造影技術，其中的一些方法使用了CRF-BP或CRF受體的放射標記配體。優選的方法是使用單光子-發射配體(如123I標記的CRF-BP或CRF受體的配體)的PET位置發射配體(如，11C，18F)的影像分析。游離CRF的水平和放射性標記的配體的結合量有關。游離CRF水平的增加可通過放射性標記的CRF-BP以及CRF受體的配體的結合的降低來證明。在此造影技術中，對本發明的上下文來說游離CRF水平增加約10％-30％或更多就足夠了。在本發明的上下文中，給藥有效量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑可用於CRF水平降低的疾病或症狀的治療。CRF水平可在腦脊液中或腦中用造影或其它方法(如cAMP產生，ACTH釋放，或雙位點ELISA)直接測定。這些疾病或症狀包括痴呆症或學習和記憶喪失，肥胖，慢性疲勞綜合症，非典型性抑鬱，產後抑鬱，季節性抑鬱，甲狀腺機能減退，外傷後緊張綜合症，尼古丁戒斷，易致炎症。這些症狀群(除了肥胖，慢性疲勞綜合症以及易發炎症)的定義由精神病的診斷和統計手冊(DiagnosisandStatisticalManualofMentalDisorders)第4版，美國精神病協會，WashingtonD.C.1994(下文的DSM-IV)提供。改善學習和記憶如上所述，本發明提供了通過給予病人有效治療劑量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑改進學習和記憶的方法。這樣的患者可基於痴呆或學習和記憶喪失某症狀的臨床診斷而鑑定。健記症病人損傷了學習新信息的能力或不能回憶起以前已學習過的信息或過去的事情。記憶的缺失在要求自發回憶的任務面前最明顯而且在晚一些的時候當檢查者為回憶的人提供刺激時得以證實。記憶的混亂必然充分嚴重地引起社會生活或工作能力的明顯障礙並且必然表現出先前機能水平的明顯下降。痴呆特徵性表現為多重的臨床認知的明顯缺失，這意味著比先前功能水平的明顯改變。要求將包括無能力學習新材料或者忘記以前學習過的材料在內的記憶損傷診斷為痴呆。記憶可以通過要求人記錄，記住，回憶和認識信息而正規地測試。痴呆的診斷也要求至少有下述一種認知紊亂失語症，失用症，失認證或執行機能紊亂。這些語言，運動機能，目標認識以及抽象思維的每一個缺失必然充分嚴重地和記憶缺失相連從而引起工作或社會能力的損傷且必然意味著以前較高水平的機能的衰退。此外，還可利用一些使CRF水平和記憶和學習損傷相關的生化檢測試驗。例如，可通過ELISA或RIA測定腦脊液中的游離CRF水平。而且，或者作為替代方法，上述的用對CRF-BP或CRF受體特異的標記配體的腦影像學方法也可用於游離受體或者CRF-BP的定量測定，從而使人得知游離CRF的減少。最後，用對游離CRF特異的配體的腦影像分析方法可用於直接檢測腦中游離CRF的量。病人的最低意識狀況可通過學習和記憶的最小意識測試而記錄，該測試是臨床醫師確定病人是否有學習和記憶損傷的標準測試(Folstein等人，精神病學研究雜誌(J.PsgchiatricRes.)12185，1975)。該測試包括一些簡單任務和書面問題。例如，「配對-聯繫」學習能力在包括那些遭受頭外傷，Korsakoff氏病或打擊(Squire，1987)在內的嚴重型的痴呆病人中受到了損傷。該被檢測者閱讀十對無關的單詞(如軍隊-桌子)。然後給出每對的第1個單詞讓被檢測者回憶第2個單詞。和平行的對照組相比，記憶損傷的量度就是所回憶的配對-聯繫單詞的減少的數目。這作為痴呆或健忘症早期迅速惡化的那種短期工作記憶的一個指標。學習和記憶的改進構成(a)接受配體抑制劑治療的病人的行為表現和安慰劑組成員相比的統計學上的明顯不同；或者構成(b)有關疾病模型的量度朝著常態方向的行為表現的統計學上的明顯改變。該策略已成功地用於鑑定用於記憶改進的治療上有用的擬膽鹼藥。該疾病的動物模型或臨床病例均表現出和正常對照明顯區別的症狀。這樣，有效的藥物療法將是主要的，但不需要徹底的逆轉症狀。可以對記憶病理學的動物和人模型給予臨床有效的用於改進記憶任務行為表現的「認知增強」的藥物而方便地改進記憶。例如，對痴呆和早老性痴呆型記憶喪失的病人給予作為擬膽鹼藥替換治療的認知增強劑可明顯地改進諸如配對-聯繫任務的短期工作記憶(Davidson和Stern，1991)。通過對衰老小鼠的最近記憶的縱向研究而有效模擬的年齡相關性行為表現缺失提示了抗記憶損傷治療的另一個可能的應用。在動物中利用一些已建立的學習和記憶模型來測定有益的認知增強效應和可能的CRF敏感神經元的與焦慮相關的副作用。認識增強效應通過莫裡斯氏迷宮(Stewart和Morris，有關行為的神經科學(inBehavioralNeuroscience)，R.Saghal，Ed.(IRL出版社，1993)P.107)和Y-迷宮(Brits等人，大腦研究公報(BrainRes.Bull.)6，71(1981))試驗來測定；而與焦慮相關的效應則通過升高十字迷宮來評估(Pellow等人，神經科學方法雜誌(J.Neurosci.Meth.)14149，1985)。Morris氏水迷宮是最有效的學習和記憶模型之一，且對各種藥劑的增加認知效應敏感(McNamara和Skelton，大腦研究綜述(BrainRes.Rev.)1833，1993)。該迷宮中執行的任務特別敏感於腦中對動物來說是空間學習的而對人來說是記憶強化的重要的區域的海馬距的控制。並且，在莫裡斯水迷宮中行為表現的改進是作為認知增強劑的化合物的臨床療效的預兆。例如，用膽鹼酯酶抑制劑或者選擇性的毒蕈鹼膽鹼激動劑治療逆轉了在莫裡斯迷宮中學習和記憶的動物模型以及臨床痴呆病人的學習能力缺乏(McNamara和Skelton，1993；Davidson和Stern，1991；McEntee和Crook，1992；Dawson等人，1992)。此外，該動物範例精確地模擬了隨著年齡增長而增加的損傷程度(Levy等人，1994)以及增加的作為健忘症患者特徵的對事先試驗延遲或幹擾(Stewart和Morris，1993)的記憶痕的脆弱性。該試驗是將動物置入由於加入了奶粉而不透明的溫水中的簡單空間認知任務。動物用定位於迷宮和試驗房間中的視覺信號學習判斷平臺的位置；該學習是指地點學習。如下文中更詳細的討論(見實施例6)，在第1到第3天的每天訓練前15分鐘給動物組ICV注射對照溶液或0.1，1，5，或25μg也作為CRF受體激動劑的配體抑制劑肽h/rCRF(6-33)或者h//rCRF。若使用非肽抑制劑，那麼注射的量則相應調整。對照組動物於三天訓練後，一般能在5-10秒內爬上平臺。配體抑制劑的記憶調節器效應的量度是這段時間的改變值。給予配體抑制劑導致了突觸CRF有效性的劑量依賴性增加以及獲取信息和記憶保持能力的行為性劑量依賴性增加。每天的試驗前給予h/rCRF和h/rCRF(6-33)明顯地提高莫裡斯水迷宮試驗中的學習能力(圖4，上圖)。為了使學習和記憶能力提高需要較高劑量的CRF(6-33)。基於視覺辨別力的Y-迷宮試驗則是另一個關於動物的學習和記憶的試驗。在此迷宮中，其兩個臂的末端是半透明的塑料板且底下有-40W的電燈泡。開始的盒子用手動的鍘門和第三條臂分開。在第一個試驗中，允許全部動物探索該迷宮五分鐘且在每一臂上都可得到食物顆粒。第二天，將每一動物都放入門已關閉的開始盒中。當門打開時，允許動物移下臂且吃放在兩個臂上的食物顆粒。在第三天，在選擇點將一個臂關閉，不存在辨別的刺激物，但在打開的目的盒中可獲得兩個食物顆粒，然後將動物分成三組進行六次試驗。在第4-10天，將帶有食物顆粒的臂末端燈打開且做十次實驗，三組重複進行。記下動物得到食物顆粒的時間。在Y-迷宮試驗中，配體抑制劑改進學習和記憶的有效性如下法檢測。在第4-10天的每組訓練試驗前的15分鐘，給動物組ICV注射對照溶液或劑量分別為1，5，或25μg的肽配體抑制劑。當然，如使用非-肽配體抑制劑則劑量作相應調整。期望對照組動物能作出50％正確的選擇。治療對記憶效果的量度是正確反應的增加。若每天試驗前給予CRF(6-33)配體抑制劑則表現出了正確反應的明顯增加(圖5)。升高十字迷宮試驗在包括一個開放的明亮的空間對照著一個黑暗的封閉的空間的趨於逃避的環境中測定焦慮反應。將兩個空間均升高且建立兩個交叉成「十」號的通道。這種趨於逃避的環境是一經典的「情緒」試驗並且對產生抑制解除和應激反應的治療非常敏感。將動物置於迷宮的中央並且允許它們在五分鐘試驗期內自由地接近全部四個臂。記下花在每一臂上的時間。每天於試驗前ICV注射各種劑量的h/rCRF從而在產生學習和記憶提高的同時也產生已被該升高十字迷宮試驗結果所證實的焦慮(圖4，下圖)。已發現了劑量依賴性抑鬱。這樣，CRF受體激動劑對治療由於CRF水平降低而導致的記憶和學習缺乏的有用性[即Ki≤1nm]因為相關的副作用而值得懷疑。而明顯相反，對CRF受體具有低親和性的配體抑制劑CRF(6-33)卻不改變在升高十字迷宮試驗中的焦慮表現(圖4，下圖)。而且也沒有明顯的如在給予h/rCRF時所見到的行為改變。這些資料證明認知增強和焦慮效應可以被分別控制。這些資料也證明了給予CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑的治療價值。對人類來說，記憶和學習的改進方法可以用如Wechsler記憶尺度或配對-聯繫記憶任務來檢測。Wechsler記憶尺度是一個廣泛使用的認知和記憶能力的鉛筆-紙試驗方法。在正常人群中，標準化的檢測平均得分是100且標準差為15，從而一個中度痴呆可通過得分減少10-15分而檢查出來，而較嚴重的痴呆則有20-30分的減少，如此類推(Squire，1987)。在臨床面談中，一組測試，包括，但非局限於，最低意識測試，Wechsler氏記憶尺度或者配對-聯繫學習用於記憶喪失症的診斷。這些測試對普通認知損傷和記憶/學習能力的特殊喪失(Squire，1987)都具有一般的敏感性。除了痴呆或健忘症的特殊診斷，這些臨床的測試也用於鑑別那些隨著年齡的增長而智力機能他覺衰退但鑑於年齡依然在正常範圍內的年齡相關性認知衰退(DSMIV，1994)。如上述，如果在配對-聯繫測試中朝著正常的方向有統計學意義上的明顯不同，如在配體抑制劑治療病人和給予安慰劑的人中比較行為表現或在隨後對同樣病人的測試中比較，那麼在本發明的上下文中存在著學習和記憶的「改進」。降低食物攝入如上述，本發明提供了通過對病人給藥有效治療量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑降低食物攝入的方法。這樣的病人可通過肥胖而鑑定。一個肥胖個體體重超過了將年齡，性別和身高考慮在內的目的體重並且可通過其機體質量指數(BMI-將重量(公斤)除以身高(米)的平方而計算出來)達到或者超過了相同參照人群的第85個百分點而客觀地鑑定出來(國立健康統計中心，「美國肥胖和超重成人」系列11，NO.BO，美國政府印刷所，Washington，D.C.1983)。此外，CRF和特定的個體有關的證據可通過證明其腦脊液中CRF水平降低或者通過上述的腦影像學分析而獲得。由於下丘腦是介導CRF對食物攝入的效應和內分泌參數的共同的腦區域，所以垂體激素濃度的改變也可反映出下丘腦CRF水平的改變。食物攝入的減少可通過延遲進餐衝動和減少消耗食物的總時間或總量來測量。Smith，「SatietyandtheProblemofMotivation，」inD.W.Pfaff(ed)，ThePhysiologicalMechanismofMotivation，Springer-Verlag，NewYork，PP.133-143，1982。此外，在一食物選擇環境中具體營養物的選擇作為特定飢餓者的補充測量。已建立了兩個食慾調節的動物模型。其一只是簡單的食物攝入測量，而其二則是在自助餐環境中的自我選擇食物的量度。在第一個方法中，食物的攝入局限在24小時內，隨後的兩小時則進入動物籠中的預先稱重的實驗食物部分。在60和120分鐘通過稱量殘留顆粒的重量而測量食物的攝入。這些試驗也可以對那些由於基因突變而肥胖的以及有效重現暴食和營養選擇紊亂的動物進行。在自助餐環境中，由於食物特別由各種不同的高營養成份，如碳水化合物，蛋白質和脂肪所構成，從而測量偏愛的基於感覺吸引或攝入後利益的特種食物。食物選擇的改變部分地是由於各種各樣的神經化學系統。這些試驗用於檢測引起現象的食物攝入調節的細微改變，如嗜欲，並和飲食紊亂，如食慾減退和肥胖的診斷有關。建立了動物的原始資料後，在試驗前15分鐘給每一動物ICV注射對照溶液或劑量為1，5，或25μg的肽配體抑制劑，或者合適劑量的非肽配體抑制劑。用如上述的餵養試驗或在自助餐環境中的自我選擇的食物實驗來測量食物攝取，並將試驗結果和原始資料比較。對人類來說，肥胖不只和過量飲食相關，也和消耗營養不平衡食物和大量偏食甜食或含脂肪食物有關。(Drewnowski等人，Am.J.Clin.Nutr.46442，1987)，從而，食慾調節的臨床表現可通過控制實驗食物或在自助餐中使用能按數量，用餐時間和選擇來記錄攝入模式的自我選擇方案來方便地檢測(Kissileff，Neurosci.Biobehav.Rev.8129，1984)。在這些試驗中，還要測定每一個體的原始資料即食物攝入或在自動餐中的自我選擇。在治療前後肥胖症的改進是指和安慰劑組相比治療組病人的體重下降或食物攝入的減少。而且，這種方案也成功地應用於鑑定肥胖症的5-羥色胺激動劑。和CRF低水平相關的疾病如上述，本發明提供了通過給予病人有效治療劑量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑治療和CRF低水平相關的疾病的方法。這樣的疾病通過診斷可分為飲食失調，神經內分泌失調以及認知病如早老性痴呆。此外，其它和CRF水平降低有關的症狀如非典型性抑鬱，季節性抑鬱，慢性疲勞綜合症，肥胖症，易感染症，外傷後緊張病以及精神興奮劑戒斷症等通常表現為甲狀腺功能下降的輪廓並且降低以尿中游離皮質醇降低和血漿中ACTH降低為特徵而鑑定的應激系統活性。從而這些疾病和狀態很可能通過腦中CRF水平的恢復或加強而部分地解決(Chronsos和Gold，JAMA2671244，1992)。這些若干種人類疾病狀態的特徵是推測腦中CRF失調的垂幹體-腎上腺軸調節障礙。因此，實驗動物的CRF/垂體-腎上腺系統的實驗性改變重現著上述病症即行為性絕望(Pepin等人，1992)，運動疲勞(Rivest和Richard，1990)，肥胖(Rothwell，1989)以及和精神興奮劑戒斷相關的過度興奮(Koob等人，1993；Swerdlow等人，1991)等的主要特徵的事實提示意欲使內源性CRF水平正常化的藥物治療具有廣泛的應用價值。季節性抑鬱(主要是隨著季節變化的抑鬱症)的主要特徵是在每年的特定時期多數抑鬱症狀的開始和緩和。在大多數病例中，各症狀事件發生在秋季或冬季並在春季緩和。伴隨季節而發生的大部分抑鬱症狀通常特徵性地表現為過於旺盛的精力，失眠，暴食，體重增加和偏食碳水化合物以及必然持續至少為兩周的時間，在該時間內或者情緒壓抑或者對幾乎所有活動失去興趣。外傷後緊張綜合症的主要特徵是暴露於一特別嚴重外傷緊張者的特徵性症狀的發展，該緊張者包括那些真正的或威脅性的死亡或對個人自身或他人身體整個性的嚴重傷害的事件的直接個人經歷。其對該事件的反應必然是嚴重害怕，無助或恐懼。該外傷事件通過幹擾性的回憶或惡夢而重現從而觸發了嚴重的心理痛苦或生理反應。這個完整的症狀必然會存在超過一個月的時間並導致明顯的臨床痛苦症狀或者社會生活或工作能力的損傷。尼古丁戒斷症(尼古丁誘導的疾病)的主要特徵是出現特徵性的戒斷綜合症，該症是由長期(至少幾個星期)每天使用含有尼古丁的產品後突然終止或減少而引起的。尼古丁戒斷綜合症的論斷需要鑑別以下的四個或更多的特徵焦慮或情緒壓抑，失眠，易怒，焦躁，難以集中注意力，不安定或無耐心，心律降低和食慾增加或體重增加。這些症狀群必然引起明顯的臨床痛苦或社會生活，工作能力的損傷。病情的好轉意味著(a)基於有關疾病模型的量度而將治療後個體的症狀情況和其原始資料或治療前的狀況對比有統計學意義上的明顯改變；或者(b)給予配體抑制劑治療的病人和安慰劑組的症狀有統計學意義上的明顯不同。臨床病例表現出和正常對照明顯區別的症候群。關於抑鬱，可以使用一些抑鬱評定尺度。(見Kleman等人，精神藥物的臨床評價原理和指南，PrienandRobinson(編輯)，Raven有限出版社，紐約，1994)。其中的一個試驗即漢密爾頓氏抑鬱評定尺度廣泛應用於評價抑鬱並且也用於評估治療後症狀的改觀。其它試驗和評定方法可見於DSM-IV手冊。關於評估尼古丁戒斷和其它疾病的嚴重程度的各種測試可見於DSM-IV手冊。早老性痴呆如上所述，本發明提供了通過對病人給予有效治療劑量的CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑治療早老性痴呆的方法。該病患者通過基於不能歸因於其它原因的痴呆或學習和記憶喪失的症候群的臨床診斷而鑑別。而且，該病患者還可通過由核磁共振影像所確定的腦萎縮的診斷而鑑別。已證明CRF水平的降低和早老性痴呆有關係。選擇從死亡的十個AD患者和十個精神正常的對照人中取出腦進行研究。從新鮮大腦中分別解剖額極，側極，顳極和枕極的標準區域，乾冰凍存，貯存於-70℃直到用於CRF放射免疫測檢和CRF-BP分析。將福馬林固定的大腦皮層和海馬樣品包埋於石蠟中，隨後切片並用蘇木精/伊紅染色，銀浸漬。檢查AD病人大腦的染色切片發現有AD典型的豐富神經斑和神經原纖維纏繞。而對照病例沒有。還檢測了對照組早老性痴呆患者的大腦皮層中的CRF和CRF-BP水平。已在大鼠腦，綿羊腦和人血漿中鑑別並表徵了CRF-BP。在本研究的大腦皮層中，大部分(＞85％)CRF-BP是和隔膜相聯繫的。當和可溶性的血漿CRF-BP的重組體相對比時，則由對照組或早性痴呆病人的腦膜溶解的CRF-BP的藥理學特徵在和CRF及配體抑制劑的結合特徵方面沒有表現出不同。對早老性痴呆病人的大腦來說，其額，側和顳腦皮層的CRF水平和正常腦相比有驚人的下降，但其枕皮層中CRF水平則僅有輕微的下降(圖3A)。相反，CRF-BP的水平在AD病人和正常對照的腦中卻是相似的(圖3B)。這些資料提供了直接證據證明了在正常和AD腦組織中CRF-BP的存在並提示在AD中可見的CRF水平的缺失可能是因為合成量的減少或CRF的降解增加而非神經元丟失。在AD中若有神經元丟失，則更可能是那些非-CRF神經元。在人腦組織中CRF和CRF-BP相互作用的特性可通過測定複合於CRF-BP的CRF和游離CRF的比例而確定。使用特異的方法測定總CRF和結合CRF，發現在正常和早老性痴呆病人的腦皮層提取物中分別大約有40％和60％總CRF複合於CRF-BP。而且，由於用人CRF(6-33)或α-螺旋oCRF(9-41)處理組織從CRF/CRF-BP複合物中置換了CRF，所以CRF是以可逆的方式結合於CRF-BP的(圖2)。這些資料直接地證明了CRF-BP配體抑制劑增加CRF的自由濃度。而且，用CRF-BP配體抑制劑治療能將AD腦中的自由CRF水平提高到正常腦的水平。已建立起幾個集中於膽鹼中能的缺乏的早老性痴呆的動物模型。在AD中膽鹼能的缺乏的主要作用已很好地建立起來。在AD中，膽鹼乙醯轉移酶活性的降低和在額葉，枕葉和顳葉中CRF水平的降低具有明顯的正相關(DeSonza等人，1986)。相似地，在這三個皮層(同上)中膽鹼乙醯轉移酶的活性和CRF受體的增加數目負相關。在兩種其它的神經退化病中，在帕金森氏病中CRF和膽鹼乙醯轉移酶活性具有極明顯的相關性，但在進行性上核麻痺中則僅有輕微的相關性(Whitehouse等人，1987)。在大鼠中，解剖學上和行為學上的研究證實了CRF和膽鹼能系統的相互作用。首先，在一些腦幹核中，CRF和乙醯膽鹼酯酶同時存在，並且一些膽鹼能神經無也含有CRF。其次，CRF抑制氨甲醯膽鹼誘導的行為(氨甲醯膽鹼是毒蕈鹼樣作用的膽鹼能受體拮抗劑)，提示CRF能作用於膽鹼能系統(Crawley等人，肽6891，1985)。用另一毒蕈鹼樣作用的膽減能受體拮抗劑，阿託品進行治療引起CRF受體的增加(DeSouza和Battaglia，大腦研究397401，1986)。總之，這些資料表明在人和動物中CRF和膽鹼能系統具有類似的相互作用。通過給予東莨菪鹼即一種阻斷乙醯膽鹼的突觸後刺激的非選擇性的突觸後毒蕈鹼樣作用受體的拮抗劑，建立一個關於膽鹼能缺乏的早老性痴呆的動物模型。在這些動物中，通過消極逃避或延緩調整到位置的試驗的測量，即從痴呆或實驗治療的認識增強效果中區別運動或者感覺缺乏，可方便地觀察到其記憶的明顯缺乏。這樣，在東莨菪鹼誘導的痴呆後利用莫裡斯迷宮和Y-迷宮試驗檢定其記憶損傷以及給予配體抑制劑後的記憶增強。在莫裡斯迷宮中，除了包括在第1到3的每天的訓練前30分鐘腹膜內注射東莨菪鹼氫溴化物(0.3mg/kg)在內的調整以外，實驗設計基本如上所述。在大鼠中，該痴呆劑量的東莨菪鹼損傷了空間和逃避學習變化表的獲得和保持。和平行的給予或不給予東莨菪鹼的對照組對比測量了1，5，或25μg肽配體抑制劑或者合適劑量的非肽配體抑制劑的抗痴呆效果。測試該配體抑制劑對逆轉東莨菪鹼試誘導的痴呆的作用與上述Y-迷宮試驗類似進行。該試驗的改進包括在第5到10天的訓練前30分鐘腹膜內注射東莨菪鹼氫溴化物(0.3mg/kg)。和平行對照及東莨菪鹼處理的對照組對比測定了ICV給藥的1，5，或25μg肽配體抑制劑和中樞或全身給藥的相同劑量的非肽配體抑制劑的抗痴呆效果。已設計出幾個在AD中量度認知行為的試驗。(見Gershon等人，精神藥物的臨床評價原理和指南，Prien和Robinson(編輯)，Raven有限出版社，紐約，1994，P.467)。其中的一個試驗，BCRS，測量濃度，最近的記憶，過去的記憶，定向和功能及自我照顧。BCRS只是設計用於認知功能的量度。該試驗和Weschler氏記憶尺度及早老性痴呆相關尺度可用於確定在配體抑制治療後的好轉。如上所述，如果在Weschler氏記憶尺度試驗中朝著正常的方向有統計學意義上的明顯的不同，例如在給予配體抑制劑治療的病人行為表現和給予安慰劑的組成員的行為表現之間或者在隨後的對於同樣病人的試驗之間的統計學意義上的明顯的不同，那麼本發明的上下文中出現早老性痴呆的「好轉」。此外，人的東莨菪鹼誘導的痴呆症可用作試驗配體抑制劑效果的模型系統。給予配體抑制劑如這裡使用的，術語「藥物可接受的」，「生理可接受的」和它們的語法變化詞，當它們指組成，載體，賦形劑及試劑時是可以互換使用的。優選地，是那些能對哺乳動物給藥卻又不產生如嘔吐，眩暈，胃部不適及其它類似情況的生理副作用的材料。用有效治療劑量對病人給予CRF/CRF-BP複合物的配體抑制劑。治療有效劑量是計算出的能達到所需效果的劑量，或者增加腦中游離CRF含量，改進學習和記憶，降低食物攝入，激活腦中CRF神經循環，治療腦中與CRF低水平相關的疾病，治療和早老性痴呆相關的症候群，治療肥胖病，治療非典型性抑鬱，治療物質濫用戒斷症，治療外傷後抑鬱症或者年齡相關性記憶喪失。對本領域的技術人員來說，可以隨著治療的特殊性而改變給藥途徑且也可以給予或者肽類或者非肽類配體抑制劑。給藥途徑可以是侵入性的或非侵入性的。非侵入性給藥途徑包括口服，口腔含化/舌下給藥，直腸內用藥，鼻黏膜給藥，局部給藥(包括透皮和眼用藥)，陰道，膀胱內和肺。侵入性給藥途徑包括ICV，動脈，靜脈，真皮內，肌內，皮下，腹膜內，鞘內和眼內。對動物的ICV注射如下述進行。將動物用2-溴代-2-氯化-1，1，1，-三氟乙烷麻醉並用KOPF趨觸儀監測。將一導套管對準側室埋入且用兩個不鏽鋼螺釘和牙科用的粘固粉將其錨定於顱骨。為了注射，將一連於60cm的PE10管上的30號(aguge)的不鏽鋼插管通過導管插到距其尖端1mm處。只是通過抬起管超過動物的頭部直到開始流動而由重力作用在一分鐘內注入2μl的配體抑制劑。其它給藥途徑的步驟是本領域的技術人員熟知的。所需的劑量可以隨著具體的治療情況和給藥途徑而改變。一般地，給予的肽類配體抑制劑是約達到終度50-125μg/1.5g腦組織或者15-38nmoles/1.5g組織。然而，根據該蛋白或多肽的大小使用相對較大或較小的量。這些治療每周進行2或3次。為了治療效果的保持，該治療可能需要連續進行。通過用如上所述的影像學方法測定腦脊液或腦中CRF水平而監測病人。此外在每一治療中都用上述的各種試驗評價其行為表現而監測病人。該治療的給藥是在醫師的指導下進行的，並且該藥物組合物包括置於藥物可接受的載體中的配體抑制劑。這些載體是本領域的技術人員眾所周知的並且典型地包括非毒性鹽和緩衝液。該載體可以包括那些如生理鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水的緩衝液；如葡萄糖，甘露糖，蔗糖，甘露醇或右旋糖酐的碳水化合物，如甘氨酸的胺基酸；抗氧化劑，如EDTA或穀胱甘肽的螯合劑，佐劑和防腐劑。可接受的非毒性鹽包括酸加成鹽或金屬複合物如與鋅，鐵，鈣，鋇，鎂，鋁或其類似物的複合物(為了本應用的目的而考慮作為加成鹽)。作為該酸加成鹽的例子的是鹽酸化物，氫溴化物，硫酸鹽，磷酸鹽，鞣酸鹽，草酸鹽，富馬酸鹽，葡萄酸鹽，藻酸鹽，馬來酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，苯甲酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，抗壞血酸鹽，酒石酸鹽及其類似物。若活性組分以片劑給藥，該片劑可以含有粘合劑如西黃蓍膠，玉米澱粉或明膠；崩解劑如藻酸；及潤滑劑如硬脂酸鎂。若需要以液態給藥，則可使用甜味劑和/或矯味劑，並且在等滲鹽水，磷酸鹽緩衝液或其它類似物中靜脈給藥。在醫師的指導下給予該肽通常是以含有該配體抑制劑和藥物可接受的普通載體的藥物組合物形式。通常，劑量為宿主動物每天每公斤體重約1-1000μg肽；它還常常在100μg到約1mg之間且可能變到約為10mg。可用這些肽進行治療以緩解症狀和糾正有害表象，該表象是發生在早老性痴呆患者和慢性疲勞綜合症病人中的相對低的周圍CRF水平的特徵。在前面的病例中，治療可改進短期和中期記憶。然而，對包括食慾減退在內的許多適應症來說，該肽需要被送至腦中並且優選地，其和一通透過血腦屏障的藥劑偶聯。通過靜脈，肌肉或者皮下注射給藥可以提高皮質醇水平並且減輕疲勞。用這些配體抑制劑治療也可用於升高游離CRF的有效生物濃度以便當藥物到達腦中後可以刺激人呼吸系統。對於急診情況，如由於藥物或病理因子而引起的心血管停滯和休克的治療，可通過靜脈，肌肉或皮下注射而達到皮質醇水平的提高。為促進妊娠的分娩，可以給予配體抑制劑，或許加入hCRF(或其類似物)使血漿中游離hCRF的濃度升到至少約250pmole/升或優選地至少達到約0.1ng/ml。類似地，也可對通常皮質醇水平低的AIDS病人給藥以便該CRF-BP阻斷劑能升高ACTH和皮質醇。當該藥劑和CRF或CRF激動劑協同給藥時，該CRF肽可按每天每公斤宿主動物體重約1到200μg的CRF肽的劑量給藥。合適的CRF激動劑的實例如美國專利Nos.4,415,558，4,489,163，4,594,329，5,112,809，5,235,036和5,278,146所述，其公開內容作為參考資料併入本發明。當該藥劑和CRF拮抗劑協同給藥時，該CRF拮抗劑可按每公斤宿主體重約介於0.01-10mg肽的劑量給藥。合適的CRF拮抗劑如美國專利Nos.4,605,642，5,109,111和5,245,009中所述，其公開內容作為參考資料併入本發明。優選的CRF拮抗劑包括[D-Phe12，N21，38]-hCRF(12-41)和[D-Phe12，Nle21，38，CML37]-hCRF(12-41)。優選的CRF激動劑包括[His20，Nle21，Leu38]-hCRF，[D-Phe12，Nle21，38，Leu36]-hCRF，[D-Pro4，D-Phe12，Asp25，Nle21，38]-hCRF和[D-Pro4，D-Phe12，Nle21，38，CML37]-hCRF。如下的實施例為說明而非局限的目的而提供。實施例1配體-免疫放射計量測定(LIRMA)用於測定配體抑制劑從CRF-BP中置換CRF的能力該測定在600μl的聚丙烯微量離心管或96孔平板上進行。首先，將50μl濃度為250ng/ml的純化重組體CRF-BP加入150μl的PBS結合緩衝液(50mM磷酸鈉，0.15MNaCl和0.02％NP-40)。其次，加入125I-h/rCRF到終濃度200PM和50μl的10-100μM濃度的該配體抑制劑並在室溫下培養1小時。將以測定緩衝液1∶1000稀釋的50μl抗CRF-BP抗體，5144加入每一管中並置室溫下再結合1小時。將所有管中的總體積用測定緩衝液調整到300μl。將該結合複合物通過加入200μl的1∶20的在1％正常兔血清，4％PEG，50mM磷酸鈉，0.1％疊氮化鈉中預沉澱的山羊抗兔(GAR)二抗而沉澱，隨後置室溫下培育1小時。然後於BeckmanGS-15R離心機上4℃離心(3000xg)20分鐘收集該結合了125I-CRF的抗體沉澱。使用BeekmanBiomer1000自動工作站，抽吸各管並用600μl加入NP-40的PBS洗滌一次。然後將含有片狀沉澱的管轉移至12×74mm的計數管中並在γ計數器上計數。抑制結合親和性常數(Ki)的值使用由LIGAND電腦程式計算的參數和vax/vms計算機系統而確定，Munson等人，分析化學107220，1980。通過3次重複結合測定計算平均標準誤差。實施例2洗滌劑相分離測定配離體抑制劑從CRF-BP中置換CRF的能力將200ng/ml的重組人CRF-BP於含有放射標記的125I-h/rCRF(80pm)結合緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水，pH7.4/0.02％NP-40)中，置室溫培育2小時。培育後，通過加入以測定緩衝液辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(SIGMA)1∶10稀釋的TritonX-114TM而將結合型的和游離型的CRF分離。TritonX-114TM在室溫下不溶於水並且在水溶液中可被分離到洗滌劑相中。加入Triton-X-114Tm後，渦旋各管並立即在室溫下12,000xg離心5分鐘。可見洗滌劑相在管底而水相在上層。親水親油的α-螺旋的CRF分隔入洗滌劑相。而當CRF結合於CRF-BP時，該CRF/CRF-BP複合物保持在水相中。這樣，取50μl水相併轉移到一12×74mm的塑料管中並計數以確定上清液中殘留的放射活性的量。實施例3游離CRF的ACTH釋放測定斷頭處死四隻大鼠並取下垂體前葉腺。用無菌HEPES緩衝液將垂體前葉腺洗滌6遍並轉移到20ml的膠原蛋白酶溶液中(4mg/ml)。然後將在膠原蛋白酶中的垂體轉移到25mlBellco分散瓶中並在37℃攪拌30分鐘。30分鐘後，通過用一10ml的移液管吸垂體而研製該垂體細胞懸液並在進一步研製之前再培育30分鐘。進一步將該細胞懸液培育45分鐘並將該部分分散的細胞轉移到一無菌的50ml管中且4000rpm離心4分鐘。將該片狀細胞沉澱在10ml的神經氨酸苷酶(8μl/ml)中重新配製和渦旋混合。將該懸液置於水浴中9分鐘，再渦旋混合4分鐘並再次離心。傾出上清液並將片狀細胞沉澱通過渦旋在25mlBBM-P(250mlBBT加5ml2％的胎中血清)中重新配製。離心收集細胞並最終將懸液在22ml的BBM-P中重新配製。然後將該細胞按50-100,000/孔的密度加入一48孔平板中並在一增溼的CO2培養箱中培養2天。在測定當天，為了準備用各種相關類似物刺激，用BBM-T將該細胞洗一次。在有和無阻斷嘗試的CRF-BP(5nm)存在的情況下用最大刺激劑量的h/rCRF(1nm)刺激細胞。該濃度的CRF-BP通過和h/rCRF結合降低從垂體細胞中ACTH的釋放量。該減少表示為在無CRF-BP存在的情況下由1nmCRF導致的ACTH釋放量部分。將跟h/rCRF(1nm)結合的CRF-BP(5nm)和一系列濃度的配體抑制劑(如該CRF-BP配體h/rCRF(6-33)的典型濃度範圍是0.1-1000nm)一起培養。該配體抑制劑結合於CRF-BP且從複合物中置換CRF導致了CRF-P抑制的h/rCRF誘導ACTH分泌作用的劑量依賴性逆轉。該CRF-BP的效力被表示為由1nMCRF單獨刺激而引起的ACTH釋放部分。實施例4測量游離CRF的CAMP產生測定該CRF刺激的腺苷酸環化酶活性的檢測試驗按以前所述(Battaglia等人)稍作改進進行。標準的測定混合物是含有2mML-穀氨酸，20mMHEPES，1mMIBMX(異丁基甲基黃嘌呤)的DMEM緩衝溶液。在刺激研究中，將已用編碼CRF受體的克隆轉染的細胞置於24孔平板中並和不同濃度的CRF相關及無關肽一起在37℃培養1小時。培養後，吸乾培養基，用新鮮的培養基輕洗每孔一次並抽乾。在將細胞在300μl的95％乙醇溶液和20mMHCl於20℃裂解16-18小時後測定細胞內的cAMP量。將該溶胞產物轉移到1.5mlEppendorf管，另以200μlEton/HCl洗滌孔並將洗滌液併入溶胞產物中。將溶胞產物凍幹並重懸於500μlpH6.2的乙酸鈉緩衝液中。用生物醫學技術公司(BiomedicalTechnologiesInc.)(Stoughton，MA)的單一抗體試劑盒測量cAMP。為估測CRF受體拮抗劑的功能，將能引起cAMP產生的80％刺激作用的單一濃度的CRF或相關肽和不同濃度的競爭化合物(10-12-10-6M)一起培養。該cAMP的培養和測量條件如上述進行。實施例5測量CRF水平的兩位點ELISAA.腦組織樣品的製備將屍體解剖樣品稱重並在5ml10％的蔗糖溶液中均化。在每一樣品中取1ml在室溫下10,000xg離心10分鐘並將所得膜片狀沉澱在SPEA(50mM磷酸鈉pH7.4，0.1MNaCl，25mMEDTA，0.1％疊氮化鈉，含0.25％的牛血清白蛋白(BSA)和1％的NP-40)中重新配製。將800μl大腦皮層勻漿(於10％的蔗糖中)加入200μlTTBS(含0.5％Tween-20，1％NP-40，1％BSA的Tris緩衝鹽水)進一步抽提，隨即渦旋攪拌1分鐘。於室溫下將該樣品10,000xg離心10分鐘。將所得上清液保留待用於採用兩位點CRFELISA分析「總CRF」，「結合型CRF」(即結合於CRF-BP的CRF)和「游離型CRF」。B.總CRF測定簡單地說，將ELISA平板用稀釋於50mM，pH9.5的碳酸氫鈉緩衝液中的蛋白G純化的綿羊抗CRF抗體(20μg/ml)於37℃包被2小時。用TTBS洗板一次並用1％酪蛋白在室溫下封閉1小時。加入100μl樣品或標準品於各孔中並置室溫結合。以TTBS洗板五次。加入RC-70兔抗人CRF抗體(以TTBS/1％BSA1∶1000稀釋)。於室溫培育1小時後，以TTBS緩衝液洗板五次，然後加入辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔(GAR)二抗在室溫下作用1小時。最後，以TTBS洗板五次並加入100μlTMB過氧化物酶底物溶液(KikegaardandPerryLaboratories，Inc.)顯色。測定450nm吸收度。C.結合型CRF的測定結合型CRF的測定方法是將CRF/CRF-BP複合物收集於已用抗人CRF-BP單克隆抗體(5μg/ml抗體的50mMNaHCO3緩衝液溶液，pH9.5)預包被的孔中，並隨後基本按檢測總CRFELISA所述用RC-70抗人CRF抗體檢測結合型CRF。D.游離型CRF的測定游離型CRF在由抗-CRF-BP單抗收集結合複合物後於上清液中測量。結合樣品材料後，將上清液轉移到新的已用蛋白G純化的綿羊抗CRF抗體包被的ELISA平板中。然後按測定總CRF水平所述進行測定。實施例6篩選配體抑制劑候選的配體抑制劑可通過篩選確定它們的從CRF/CRF-BP複合物中置換CRF的能力。合適的測定方法，如培養垂體細胞的ACTH釋放(見實施例2)或兩位點LIMRA(見實施例1)已應用於分別測定CRF和CRF-BP的水平。在該LIMRA測定中，一般按照實施例1的步驟。將濃度為10μM的配體抑制劑和125h/rCRF一起加入反應體系中。若該候選配體抑制劑能從CRF-BP中置換CRF，那麼和無候選肽加入的對照相比該片狀沉澱中將含有較少的放射性。候選肽再用六點劑量曲線重新篩選。計算IC-50值。用該方法針對CRF/CRF-BP複合物已篩選出配體抑制劑人CRF，α-螺旋綿羊CRF(9-41)，人CRF(6-33)和綿羊CRF。使用以前描述的放射配體結合測定(DeSouza，神經科學雜誌，(J.Neurosci.)788，1987)在Ltk-小鼠成纖維細胞的受體的穩定轉染了的膜製劑中測定了這些肽對克隆的人重體CRF受體的親和性。所得結果如下表所示。此外，也對早老性痴呆和對照的個體的大腦皮層的CRF-BP測試了這些配體抑制劑。表1CRF/CRF-BP的配體抑制劑肽IC50值(nM)人重組的大腦皮層中CRF-BP對照愛默爾氏病CRF-BPCRF-R人CRF0.300.180.191.0α-螺旋綿羊0.160.040.209.9CRF(9-41)人CRF(6-33)1.61.11.6＞1000綿羊CRF6675954712.4這些結果表明人CRF，α-螺旋綿羊CRF(9-41)和人CRF(6-33)在從CRF/CRF-BP複合物中置換CRF上具有幾乎相同的效果。相反，綿羊CRF不能有效地置換CRF。該來自患病或正常個體大腦皮層中的CRF-BP和該重組體是等價的。在這三個最佳的配體抑制劑中，人CRF和α-螺旋綿羊CRF(9-41)在和人CRF-R結合上幾乎是等價的。明顯不同的是人CRF(6-33)的結合效果要低2-3logs。實施例7用配體抑制劑治療將五個早老性痴呆患者的和五個年齡相配的正常對照的大腦皮層樣品按照實施例4製備並合併。按實施例4所述測定總CRF，結合型CRF以及游離型CRF的水平。如圖2所見，正常人腦中有40％的總CRF複合於CRF-BP而在早老性痴呆患者腦中則有60％複合。在50nM的α-螺旋綿羊CRF(9-41)存在的情況下，以單抗收集CRF/CRF-BP複合物後測定高親和性CRF-BP配體置換結合型CRF的效應。用CRFELISA方法在CRF-BP的單克隆抗體收集後剩下的血清液中測定置換的游離CRF。如圖2所示，用配體抑制劑處理腦組織導致了早老性痴呆病人和對照的組織中全部結合型CRF的釋放。此外，用該配體抑制劑治療早老性痴呆患者的大腦皮層後將其游離CRF水平補充到了在年齡相配的對照人中所見的水平。組織也用50nM的配體抑制劑α-螺旋綿羊CRF(9-41)培育。用如實施例4中所述的兩位點ELISA法測定上清液中置換的CRF。實施例8莫裡斯水迷宮試驗莫裡斯水迷宮試驗是一個要求最小量壓力和經驗的簡單的空間認識任務。不需要有動機的強制如休克或不給食物。將動物置於溫水中，該水由於加入了奶粉而不透明。監測其找到隱藏的平臺所需的時間。該動物學習定位平臺，與迷宮和試驗室內的視覺定位有關；該學習是指位置認知。該試驗尤其對動物的空間認識和人的記憶強化中所涉及的大腦關鍵區域海馬的調節敏感。在該試驗中使用的器皿是一個裝有23cm深的不透明水(22℃-25℃)的池子(直徑46.4cm，高45.7cm)。一個直徑為10cm的載重靶平臺的頂部位於水面下1-2cm。於內表面將該池分成四個相等的扇形區。將動物放入一稱為扇形區的池中並記錄其接近和爬上平臺的時間；在整個實驗中平臺和實驗動物位置保持不變。爬爬平臺頂部後，允許動物休息20秒鐘。將在60秒內沒發現平臺的實驗動物放到平臺上並讓其休息20秒鐘。試驗前15分鐘，對大鼠ICV注射配體抑制劑h/rCRF(6-33)或CRF受體激動劑h/rCRF。h/rCRF(6-33)的劑量是0，1，15，25，50或125μg；h/rCRF的劑量為0，0，1，1，或2.5μg。每組處理7-10隻大鼠。統計學分析證實了用h/rCRF(6-33)(p＜0.05)或者CRF(p＜0.05)處理後其行為有明顯的改進(圖4)。在一段時間內表現也有明顯的改進(p＜0.0001)。實施例9Y-迷宮視覺辨別試驗該Y-迷宮視覺辨別試驗是使用正增強法研究動物在最小壓力下學習的認知試驗。不讓實驗動物進食並僅在訓練後餵食；動物可以不反應，但在大多數情況下因為大鼠喜歡的食物顆粒的正增強特性都會反應。該Y-迷宮包括三個相同長度的臂(61cm長，14cm寬，30cm高)。其中一個臂用作開始盒並通過手控鍘門和其它兩個目的臂分開。在兩遠側臂的末端的豎直表面裝有一8W電燈炮。在訓練的第一天，允許已被禁食至80％體重的大鼠在每一目的臂的末端各有兩粒食物(45mgNoyes)的迷宮中探索5分鐘。在第二天，允許每隻大鼠沿每一放有誘餌食物顆粒的目的臂往返一次。在第三天，三隻編為一組的大鼠在作為選擇目標的一個目的臂關閉並有兩粒45mg食物在打開的目的盒但沒有提供視覺辨別刺激物(關燈)的情況下進行6次空間試驗。在6次試驗過程中該打開臂從左邊轉到右邊並從一個實驗動物輪換到下一個實驗動物。在第4-10天，兩個目的臂都打開且也打開一個目的臂末端的燈。也是三隻一組的大鼠每天進行10次試驗，試驗間隔約為90秒。每天在訓練得出結論後給裝於籠中的實驗動物餵15克試驗食物。在第4-10天，試驗前立即ICV注射配體抑制劑。7-9隻一組的大鼠接受3，0，1，5或25μg的配體抑制劑h/rCRF(6-33)。記錄正確反應的百分率。給予5和25μgCRF(6-33)的大鼠的表現在統計學意義上明顯好於給予0或1μg配體抑制劑的大鼠。實施例10升高十字-迷宮試驗該升高十字迷宮試驗預測了動物如何對包括和陰暗的封閉的區域對照的開放且光亮的區域的趨於逃避的環境作出反應。在該迷宮中，兩個空間均升離地面並有兩條交叉成「十」字的走道。這種類型的趨於逃避環境是一經典「情緒」測定試驗並且對產生抑制解除(如鎮靜或催眠藥物)和緊張的治療非常敏感。無需有動機的強制並且動物可以隨便地呆在陰暗處或走到開放臂中探險。該升高「十」字迷宮器有四條成直角的臂(50cm長，10cm寬)並升離地面(50cm)。其中兩個臂以圍牆封閉(40cm高)而另兩個則沒有圍牆(開放臂)。將受試動物分別置於該迷宮的中心並在5分鐘的試驗期內，允許其自由接近所有的四條臂。花在每一臂上的時間以光電管自動存儲器以及所連接的計算機自動記錄。將7-10隻為一組的大鼠ICV注射該配體抑制劑h/rCRF(6-33)或h/rCRF(1-41)。大鼠分別接受了0，0.1，1或25μg的h/rCRF(1-41)。1和25μg劑量的h/rCRF(1-41)產生了統計學意義上的明顯更多的時間於開放臂放上。從而提示增加的焦慮(圖5)明顯不同的是，記憶增強劑量的CRF(6-33)以及2到5倍高的劑量(50-125μg)並沒有改變行為或產生可與h/rCRF(1-41)相比的明顯的行為改變。已知h/rCRF(1-41)為CRF-受體激動劑。因此，這些資料證明了配體抑制劑的有效的認知增強作用和產生焦慮的副作用功能上鮮明的離異。實施例11肥胖的動物模型肥胖就是因能量的攝入水平超過了消耗而引起的身體脂肪過剩。臨床肥胖人群的複雜病因學可能包括飲食過量，異常的脂類代謝，胰島素過量以及運動的減少。這些現象和產生的體重增加可使用遺傳性的肥胖大鼠和小鼠，腦中下丘腦區域損傷的動物和不同的長期藥物處理的動物而在動物中模擬出來。中樞給藥CRF對阻止遺傳性肥胖的Zucker大鼠的過度的體重增加起著有益的厭食作用。最近，使用CRF/CRF結合蛋白複合物的配體抑制劑h/rCRF(6-33)考察了內源性CRF的食慾抑制作用。該配體抑制劑作為間接的能提高腦中游離的，非結合型CRF的突觸水平的CRF激動劑。在給于禁食24小時動物實驗食物前剛好兩小時對其中樞給藥h/rCRF(6-33)可以產生劑量依賴性食慾抑制。較之於CRF，h/rCRF(6-33)在降低食慾方面具有明顯低的效力，並和CRF相反的是其不能改變非禁食受試動物的兩小時的食物攝入。此外，在單獨的實驗中，厭食劑量的h/rCRF(6-33)並沒有誘導出在中樞給藥CRF本身後所期望的那種恐懼樣行為。這些結果揭示了用h/rCRF(6-33)藥物治療通過刺激生理相關的內源性CRF水平的提高起著選擇性的溫和的食慾抑制作用。體重增加和飲食過量是尼古丁戒斷的副作用，其可以通過藥物靶向作用於異常的能量平衡和食慾控制的生物學和神經化學的底物而解決。停止吸菸後，增大的飢餓感和體重增加通常持續至少六個月並導致第一年內體重平均增加4-6磅。這種在四分之三的戒菸者中出現的情隱性肥胖不能通過一般的關於行為的體重減輕方法而有效的治療。作為一個臨床表現的實例，一個調查人員報導了雖然熱量攝入在正常範圍，但戒菸後26周的禁慾婦女的體重超過基準9磅。這種長期的戒斷症狀可能是戒菸中出現的主要現象。戒菸後的食慾和體重的異常是可在動物中模擬的尼古丁戒斷症狀中重現。圖6表明了小鼠在連續灌注依賴-誘導水平的尼古丁兩周後和停止尼古丁給藥的兩周戒斷後體重和食物攝入的變化。和賦形劑處理組相比慢性尼古丁給藥降低了食物攝入和體重增長率，而和對照組相比隨後的尼古丁戒斷卻誘導了飲食過量和體重正常化。由於尼古丁替換治療對戒斷的食慾和體重紊亂有解毒作用，所以戒菸對能量平衡的效應好像是由突然的尼古丁去除誘發的。這一臨床觀察通過動物模型而證實，在該動物模型中在尼古丁注入終止後的24小時內所測得的行為上的混亂和總的戒斷跡象可通過劇烈的全身性給予尼古丁而減輕。在一意欲揭示在尼古丁戒斷-誘導飲食過量前後的CRF-BP拮抗劑的有益厭食特徵而設計的實驗中，那些非依賴性的和尼古丁戒斷的受試動物在停止尼古丁給藥後四天的餵食前剛好兩小時都給予h/rCRF(6-33)。圖7揭示了對首次給予尼古丁的對照組，配體抑制劑WrCRF(6-33)沒有改變其食慾，而尼古丁戒斷受試動物則呈現出由於h/rCRF(6-33)給藥明顯誘導的食物攝入水平的增加。總之，這些結果揭示了不改變非禁食或自然飢餓的動物的食慾劑量的配體抑制劑有效地降低了由禁食或尼古丁戒斷刺激的過量食慾。從上文中可以知道雖然為了說明的目的這裡已描述了本發明的具體實施方案，但各種沒有偏離本發明精神和範圍的改進仍可進行。相應地，除了附加的權利要求書外，本發明沒有其它限制。序列表(1)一般信息(i)申請人Behan，DominicP.Heinrichs，StephenC.Sutton，StevenW.Lowry，PhillipJ.Rivier，JeanE.F.DeSouza，ErrolB.ValeJr.，WylieW.(ii)發明題目提高內源性促腎上腺皮質素釋放因子水平的方法(iii)序列數目4(iv)聯繫地址(A)收信人SEED和BERRY(B)街道6300哥倫比亞中心，701第五大街(C)城市西雅圖(D)州華盛頓(E)國家美國(F)郵編98104-7092(v)計算機可讀形式(A)磁碟型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)目前申請資料(A)申請號US(B)遞交文件日期1995年6月7日(C)分類(viii)律師/代理機構信息(A)名字Nottenburg，Carol(B)註冊號碼39,317(C)參考/證書號碼690068.403(ix)電信信息(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(C)電報3723836SEEDANDBERRY(2)IDNO1序列信息(i)序列特徵(A)長度41個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈狀況單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽IDNO1序列描述SerGluGluProProIleSerLeuAspLeuThrPheHisLeuLeuArg151015GluValLeuGluMetAlaArgAlaGluGlnLeuAlaGlnGlnAlaHis202530SerAsnArgLysLeuMetGluIleIle3540(2)IDNO2序列信息(i)序列特徵(A)長度30個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈狀況單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽(xi)IDNO2序列描述XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaAlaXaaXaaGluXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa202530(2)IDNO3序列信息(i)序列特徵(A)長度30個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈狀況單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽(xi)IDNO3序列描述ProProIleSerXaaAspLeuThrPheHisLeuLeuArgXaaXaaXaa151015GluXaaAlaArgXaaGluXaaXaaXaaXaaGlnAlaXaaXaa202530(2)IDNO4序列信息(i)序列特徵(A)長度41個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈狀況單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽(xi)IDNO4序列描述SerGlnGluProProIleSerLeuAspLeuThrPheHisLeuLeuArg151015GluValLeuGluMetThrLysAlaAspGlnLeuAlaGlnGlnAlaHis202530SerAsnArgLysLeuLeuAspIleAla3540權利要求1.用於製備能增加大腦中游離CRF水平的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF和CRF-結合蛋白的結合。2.如權利要求1的配體抑制劑，其中的配體抑制劑是選擇於h/rCRF(胺基酸6-33)，h/rCRF(胺基酸9-33)和h/rCRF中的肽。3.如權利要求1的配體抑制劑，其中的配體抑制劑是一種肽。4.如權利要求1的配體抑制劑，其中的配體抑制劑是一種非肽。5.用於製備能改進學習和記憶的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能導致CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。6.用於製備能降低食物攝入的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能導致CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者防止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。7.用於製備能治療和腦中CRF低水平相關的疾病的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。8.如權利要求7的配體抑制劑，其中的疾病是Alzheimer氏病。9.如權利要求7的配體抑制劑，其中的疾病選自於慢性疲勞綜合症，非典型性抑鬱，肥胖，分娩後抑鬱和年齡相關性記憶喪失或阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。10.按照權利要求5-9的任何一個的配體抑制劑，其中的配體抑制劑為一種肽。11.按照權利要求5-9的任何一個的配體抑制劑，其中的配體抑制劑是一種非肽。12.按照權利要求5-9的任何一個的配體抑制劑，其中的配體抑制劑在藥物可接受的載體中給藥。13.用於製備能治療和早老性痴呆相關的疾病的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。14.用於製備治療肥胖的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能導致CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。15.用於製備治療非典型性抑鬱的藥物的CRF/CRF-結合蛋白的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。16.用於製備治療藥物濫用戒斷症的藥物的CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或者阻止游離CRF和CRF-結合蛋白的結合。17.用於製備治療產後抑鬱症的藥物的CRF/CRF-結合蛋白的配體抑制劑，所說的配體抑制劑能引起CRF從CRF-結合蛋白中的釋放或者阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白。18.按照權利要求13-17的方法，其中的配體抑制劑是一種肽。19.按照權利要求13-17的方法，其中的配體抑制劑是一種非肽。20.能引起CRF從CRF-結合蛋白中釋放或阻止游離CRF結合於CRF-結合蛋白的配體抑制劑，該抑制劑用作活性治療藥物。21.篩選配體抑制劑的方法，包括和CRF/CRF-結合蛋白複合物一起溫育候選配體抑制劑；並用一種試驗測定游離CRF的水平。22.按照權利要求21的方法，其中的游離CRF用體外的配體免疫放射計量試驗測定。23.按照權利要求21的方法，其中的游離CRF用一種生物檢定法測量。24.用於製備能提高體內CRF或CRF類似物活性的藥物的且對人CRF-結合蛋白具有高親和力而對人CRF受體具有低親和力的藥劑，該藥劑能有效地和CRF-BP形成充分的複合物以便提高能和CRF受體結合的內源性hCRF濃度。25.如權利要求24的藥物，其進一步包括CRF或作為其激動劑或拮抗劑的CRF類似物。26.按照權利要求24的藥劑，其中所說的藥物是長度介於大約19到28個殘基的肽。27.按照權利要求26的藥劑，其中所說的肽是hCRF(9-33)。28.按照權利要求26的藥劑，其中所說的肽是hCRF(6-33)。29.按照權利要求26的藥劑，其中所說的肽具有序列(IDNO2序列)Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Ala-Xaa23-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33或其從N-末端刪去1到8的殘基，或從C-末端刪去1到5的殘基或同時刪去兩者所形成的生物活性片段，其中Xaa23是Arg或Lys；Xaa24是Ala，Ile，Asn，Met，Nle或Leu；並且每一Xaa是獨立的天然胺基酸殘基。30.按照權利要求29的藥劑，其中的每一Xaa獨立代表存在於人CRF(1-41)各自的位置的殘基或其保守置換。31.按照權利29的藥劑，其中所說的肽具有序列(IDNO3序列)Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa8-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Glu-Xaa21-Ala-Arg-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Gln-Ala-Xaa32-Xaa33或者其從N-末端刪去從1到8殘基，或從C-末端刪去從1到5殘基，或者同時刪去兩者而成的生物活性片段，其中Xaa8是Leu或Ile；Xaa17是Glu或Asn；Xaa18是Val，Met，Leu或Nle；Xaa19是Leu或ILe；Xaa21是Met，Leu或Nle；Xaa24是Ala，Ile或Asn；Xaa26是Asn；Xaa27是Leu，Glu或Gln；Xaa28是Ala或Arg；Xaa29是Gln或Glu；Xaa32是His或Glu；並且Xaa33是Ser或Leu。32.按照權利要求29的藥劑，其中所說的肽具有分子式(Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，Arg28)-hCRF(4-28)。33.按照權利要求29的藥劑，其中所說的肽具有分子式(Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，29，Arg28，Gly32，Leu33)-hCRF(6-33)。34.按照權利要求29的藥劑，其中所說的肽具有分子式(Asn17，24，26，Met18，Ile19，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32，Leu33)-hCRF(9-33)。35.用於製備用於孕婦催產的藥物的對人CRF-結合蛋白具有高親和力而對人CRF受體具有低親和力的藥劑，其中所說的藥劑以充足的劑量存在導致血漿中游離hCRF濃度升至至少約為250Pmole/升的水平。36.按照權利要求35的藥劑，其中所說的藥劑是一種肽。37.按照權利要求35用於治療早老性痴呆的藥劑，其中所說的藥劑是一種肽並且以有效劑量存在以便使所致的大腦中游離內源性CRF的增加引起短期到中期記憶的改進。38.具有如下序列(IDNO3序列)的一種肽Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Glu-Xaa21-Ala-Arg-Xaa24-Glu-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Gln-Ala-Xaa32-Xaa33或者其從N-末端刪去從1到8的殘基，或者從C末端刪去從1到5的殘基，或同時刪去兩者所形成的生物活性片段，其中Xaa8是Leu或Ile；Xaa17是Glu或Asn；Xaa18是Val，MetLeu或Nle；Xaa19是Leu或Ile；Xaa21是Met，Leu或Nle，Xaa24是Ala，Ile或Asn；Xaa26是Gln或Asn；Xaa27是Leu，Glu或Gln；Xaa28是Ala或Arg；Xaa29是Glu；Xaa32是His或Glu；而Xaa33是Ser或Leu。39.按照權利要求38的肽，選自於hCRF(6-33)；hCRF(9-33)；[Ile8，19，24，Asn17，26，Met18，Glu27，29，Arg28，Gly32，Leu33]-hCRF(6-33)；[Asn17，24，26，Met18，Ile19，Gln27，Arg28，Glu29，Gly32，Leu33]-hCRF(9-33)；[Met6，14，18，24，Ile8，19，33，Asn17，His20，Arg21，28，Lys23，Gly26，Glu27，29，Leu32]-hCRF(6-33)；以及其以高親和力結合於hCRF-BP的C-末端的和/或N-末端縮短的片段。40.篩選用於對哺乳動物體內給藥有效的CRF拮抗劑的方法，該方法包括篩選一組CRF拮抗劑候選肽以確定(a)每一候選肽的沒有明顯激活所述受體的結合於人CRF受體(hCRF-R)的親和力以及(b)每一候選肽結合於hCRF-結合蛋白(hCRF-BP)的親和力；比較所說的每一候選肽親和性測定結果(a)和(b)；並選出表現出對結合於hCRF-R較高的親和力而沒有明顯激活所述受體的且又表現出對結合hCRF-BP較低親和力的候選肽。41.按照權利要求40的方法，其中所說的第一個測定(a)是使用培養的垂體細胞並以攻擊劑量的CRF測定每一候選肽在阻斷ACTH分泌中的作用來進行的。42.按照權利要求40的方法，其中所說的第二個測定(b)是通過將每一候選肽和hCRF-BP以及預定劑量的適當標記的具有已知的對hCRF-BP的結合親和力的配體一起置於溶液中而進行的抑制結合親和力測定來完成的。43.篩選CRF/CRF-結合蛋白複合物的配體抑制劑的方法，包括(a)在水溶液中有候選配體抑制劑存在的情況下使CRF與CRF-BP接觸；(b)加入非離子型洗滌劑於步驟(a)的溶液中；(c)從水溶液中分離非離子型洗滌劑，並(d)檢測水溶液中結合型CRF的量或非離子型洗滌劑中游離型CRF的量，由此確定該候選的配體抑制劑是否破壞了CRF/CRF-結合蛋白複合物。44.按照權利要求43的方法，其中步驟(b)是在非離子型洗滌劑的濁點以上的溫度下進行的。45.按照權利要求43的方示，其中非離子型洗滌劑是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。全文摘要通過給病人投用促腎上腺皮質素釋放因子(CRF)/促腎上腺皮質素釋放因子(CRF)-結合蛋白複合物的配體抑制劑可以使其腦中游離CRF水平提高。該配體抑制劑和CRF-結合蛋白結合導致CRF的釋放。該配體抑制劑可以是CRF衍生出的一種肽或者是一種相關蛋白或者非肽。投用該配體抑制劑可以引起學習和記憶的改善，從而減少食物攝取或者為那些和腦中CRF低水平相關的疾病，特別是早老性痴呆提供治療。本發明也提供了為了選擇用於在體內對哺乳動物用藥的特別有效的CRF拮抗劑對化合物進行篩選的方法。文檔編號G01N33/566GK1157620SQ95194716公開日1997年8月20日申請日期1995年7月14日優先權日1994年7月15日發明者D·P·比翰,P·J·勞雷,W·W·小瓦爾,S·C·海因裡斯,S·W·蘇湯,J·E·F·裡維爾,E·德索薩申請人:紐羅克裡恩生物科學有限公司,薩爾克研究所,雷丁大學