作為癌症的標記物的Seprase的製作方法

2023-06-11 20:29:11 1

專利名稱：作為癌症的標記物的Seprase的製作方法
作為癌症的標記物的Seprase描述本發明涉及有助於評估癌症的方法。其公開了人成纖維細胞活化蛋白(FAP/ s印rase)作為不同癌症類型的通用標記物的用途。S印rase有助於評估與肺有關的癌症或 肺癌(LC)或結腸癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)或結直腸癌(CRC)，而且還可能有助於評估 其他特定類型的癌症。此類特定癌症類型是例如食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎 癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌或前列腺癌。此外，其特別地涉及用於通 過測量來源於個體的液體樣品中的s印rase來從所述樣品評估癌症的方法。s印rase的測 量可以例如用於癌症的早期檢測或用於經歷手術的患者的監測。癌症仍然是主要的公共衛生挑戰，儘管在檢測和治療上已取得進步。癌細胞以癌 症相關標記蛋白的產生為特徵。在攜帶癌細胞的個體的組織和體液中都發現了癌症相關蛋 白。它們的水平在致癌性進展的早期通常很低，在疾病的進展過程中增加，並且只在極少的 情況下觀察到蛋白在疾病進展過程中顯示降低的水平。此類蛋白的靈敏檢測是用於診斷癌 症(特別地在癌症的早期診斷中)的有利的和有前景的方法。最普遍的癌症類型是乳腺癌 (BC)、肺癌(LC)和結直腸癌(CRC)。用於實體瘤的最重要的治療方法是a)腫瘤的手術切除，b)化學療法，c)使用生物學如抗腫瘤抗體或抗血管生成抗體的療法和d)上述方法的組合。腫瘤的手術切除已被廣泛接受為早期實體瘤的一線療法。然而，大多數癌症只有 當它們顯示症狀，即當患者已處於疾病進展的相當晚期時才被檢測到。癌症的分期是根據程度、進展和嚴重度對疾病的分類。其將癌症患者分類，這樣可 對治療的預後和選擇進行歸納。按照Duke的分期A至D將CRC的不同分期用於分類。今天， Μ系統是最為廣 泛使用的癌症的解剖學範圍的分類。其代表了國際上接受的統一的分期系統。存在3個 基本變量T(原發性腫瘤的範圍)、Ν(區域淋巴結的狀態)和M(遠端轉移的存在或不存 在)。TNM 標準由 UICC (國際防癌聯盟(International Union Against Cancer)), Sobin, L. H. ， ffittekind, Ch. (eds) :TNM Classification of Malignant Tumours,H 6 IK,2002) 公布。一旦 Μ狀態被確定，患者則被分類至由範圍從I至IV(IV是最晚期疾病的分期) 的羅馬數字表示的疾病分期。
Μ分期和UICC疾病分期彼此相應，如取自Sobin L.H.和 ffittekind (eds.)(同上)的下表中所示的。TW分期與UICC疾病分期的相互關係
尤其重要的是癌症例如CRC的早期診斷轉變為好得多的預後。在CRC中，結腸直腸 的惡性腫瘤起於良性腫瘤，即來自腺瘤。因此，最佳預後使患者在腺癌期被診斷。早在Tis、 NO、MO或T1-3 ；NO ；MO期被診斷的患者，如果經適當治療，與對於當遠端轉移已存在時診斷 的患者只有10%的5年存活率相比較，在診斷後具有90%以上的機會存活5年。目前的檢測方法(包括成像方法，例如X射線或核共振)在理論上可能至少部分 適合用作一般篩查工具。然而，它們極其昂貴，因而對於衛生保健系統來說不能承擔其在大 量受試者(特別對於無任何腫瘤症狀的受試者)的普查中普遍和廣泛的使用。因此，本發明的目的是提供簡單且成本效率的腫瘤評估方法，例如以鑑定懷疑患 有癌症的個體。為此目的，可在體液例如血液或血清或血漿中檢測到的一般腫瘤標記物或 一組此類標記物將是令人期待的。許多血清腫瘤標記物已用於臨床應用。例如cytoceratin 19的可溶性30kDa 片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原(carcinoembryogenic antigen) (CEA)、神經元特異烯醇 化酶(NSE)和鱗狀細胞癌抗原(SCC)是最突出的LC標記物。然而，它們中沒有一個 滿足篩查工具所需的靈敏度和特異性標準(Thomas，L.，Labor和Diagnose (2000) TH BooksVerIagsgese1lschaft, Frankfurt/Main, Germany)。為了具有臨床效果(clinical utility)，作為單個標記物的新型診斷標記物應當 可與本領域內已知的其他標記物相當，或更好。或者，如果分別地將新型標記物單獨使用或 與一個或更多個其他標記物組合使用，其應當導致診斷靈敏度和/或特異性的提高。最好 通過其受試者工作特性(將在下面進行詳細地描述)評估檢測的診斷靈敏度和/或特異 性。全血、血清或血漿是臨床常規中最廣泛使用的樣品來源。可有助於可靠的癌 症檢測或提供早期預後信息的早期腫瘤標記物的鑑定可導致可大大促進該疾病的診斷和管理的方法。因此，存在提高癌症，特別地LC的體外評估的緊迫臨床需要。提高癌 症例如LC的早期診斷尤其重要，因為對於早期診斷的患者，存活的機會與在疾病的晚期 (progressedstage)診斷的患者相比要高得多。最近已對肺癌中生物化學標記物的臨床功用進行了綜述。(Duffy，M. J. ,Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。CYFRA 21-1目前被認為是當前已知的肺癌腫瘤標記物中最好的標記物。即使這 樣，也未在肺組織中顯著地發現其器官特異性。CYFRA 21-1對於肺癌的靈敏度在95%的針 對其他良性肺病的特異性下被描述為在46至61%之間。增加的CYFRA 21_1血清水平還與 明顯的良性肝疾病、腎功能不全和浸潤性膀胱癌相關。CYFRA 21-1檢測被推薦用於術後治 療監測。CEA屬於胎兒癌性抗原類群，通常在胚胎發生過程中產生。CEA不是器官特異性的 並且主要用於結直腸癌的監測。除了惡性腫瘤外，還有幾種良性疾病例如肝硬化、支氣管 炎、胰腺炎和自身免疫疾病與增加的CEA血清水平相關。在對於良性肺疾病95%的特異性 下，其對於肺癌的敏感度據報導為29-44%。CEA的優選用途是肺癌的治療監測。NSE是SCLC的腫瘤標記物。通常，發現增加的NSE血清水平與神經外胚層和神經 內分泌瘤相關。還在患者中發現增加的血清水平與良性肺病和腦病例如腦膜炎或腦的其他 炎性疾病以及對頭的跌打損傷相關。雖然對於SCLC (在95%的特異性下)的靈敏度據報導 為60-87%，但對於NSCLC，NSE的性能較差(7-25%的靈敏度)。NSE被推薦用於SCLC的治 療監測。關於標記物特徵和針對提高的肺癌的診斷，公布了使用基於模糊邏輯學的分類算 法來組合CYFRA 21-1、NSE和C反應蛋白(CRP)(其為一般炎症標記物)的血清水平的方 法(Schneider, J.，等人，Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者報導了在 95% 的特異 性下的92%的靈敏度。然而，在該研究中，例如CYFRA 21-1作為單個腫瘤標記物的靈敏度 據報導在95%的特異性下為72%，這比在許多其他報導的研究中報導的顯著更高。Duffy， Μ. J. , in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225_262才艮導了 46%至61%的靈敏度。由Schneider等人獲得的該異常高的性能引起了一些懷疑，其可能 由於幾個因素造成。第一，對照患者群體似乎比患者群體更年輕，即群體年齡不十分匹配， 並且患者群體包括許多晚期分期。第二且更至關重要地，在用於模糊邏輯限定詞的確定的 訓練集的樣品上檢查算法的性能。因此，這些限定詞嚴格來說是針對該集「特製的」並且不 用於獨立的驗證集。在正常情況下，勢必期望用於更大的、獨立的且充分平衡的驗證集的相 同算法將導致顯著降低的總體性能。本發明的任務是調查是否可鑑定可用於評估癌症疾病的生物化學標記物。特別 地，本發明的發明者調查是否可在體液中鑑定用於評估不同癌症類型例如肺癌、乳腺癌、結 腸癌、前列腺癌和腎癌的生物化學標記物。在本發明的非常優選方面，調查了用於肺癌(LC) 或結直腸癌(CRC)的評估的生物化學標記物的鑑定。令人驚訝地，已發現標記物s印rase的使用可至少部分地克服現有技術中目前已 知的標記物的一些問題。本發明涉及用於體外評估癌症的方法，其包括測量樣品中seprase多肽和/或其 片段的濃度和/或活性以及將測量結果，特別地測定的濃度和/或活性用於癌症的評估中。
令人驚訝地，發現受試樣品中減少的s印rase多肽和/或其片段的濃度和/或活 性與癌症的風險和/或發生相關。還發現seprase是對於單一類型的癌症無特異性但為許 多類型癌症的標記物(即，一般腫瘤標記物)的標記物。因為s印rase對致瘤過程表現出 相當的特異性，因此新型腫瘤標記物對於不同種類的腫瘤類型具有潛在的臨床效果。本發明的方法適用於評估許多不同類型的癌症。已例如分別在特定的癌症類型如 肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱 癌、子宮內膜癌和前列腺癌中發現，與正常對照相比較，樣品中seprase或其片段的濃度和 /或活性減少。根據本發明的優選實施方案，為了體外評估特定癌症類型例如肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和 前列腺癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據本發明的另一個優選實施方案，為了體外評估癌症例如肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據本發明的另一個優選實施方案，為了體外評估癌症例如肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌或膽管癌，測量樣品中seprase的濃度和/或活性。根據本發明的另一個優選實施方案，為了體外評估癌症例如肺癌(LC)或結直腸 癌(CRC)，測量樣品中s印rase的濃度和/或活性。根據本發明的另一個優選實施方案，為了體外評估癌症例如肺癌(LC)，測量樣品 中s印rase的濃度和/或活性。本發明的一個實施方案涉及區分可能不患癌症的個體與可能被分類為「疑似」病 例的個體的人群的普查。然後可以例如利用成像方法或其他合適的方法使後一個個體群體 經歷進一步的診斷過程。本發明的另外的實施方案涉及適合於診斷一般性癌症的腫瘤標記物組或適合於 診斷特定腫瘤類型例如肺癌或結腸癌的腫瘤標記物組的改進。本發明還涉及用於利用生物化學標記物體外評估癌症的方法，其包括測量樣品中 seprase和特異於癌症的一個或更多個其他標記物的濃度和/或活性，以及將測量結果，特 別地測定的濃度用於癌症的評估。與seprase組合使用的優選標記物在另一個方面是為一 般性腫瘤標記物(即不特異於單個腫瘤類型的標記物)的標記物或，在另一方面，是為特定 腫瘤的標記物(為特異於單個腫瘤類型的標記物)的標記物。例如用於癌症例如肺癌或 結腸癌的評估的優選標記物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。此類標記物可各自單個地使用或以任何組合與s印rase —起使用。如果，根據本發明的方法，評估癌症，則各癌症的一個或更多個其他標記物優選選 自 Cyfra 21—1、CEA、NSE、CA19—9、CA125、PSA、ASC、S100A12 禾口 NNMT。因此，在優選實施方案中，本發明還涉及包括標記物s印rase和例如Cyfra 21-1, CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12和NNMT中的至少一個其他腫瘤標記物的標記 物組在評估癌症例如肺癌和/或結腸癌中的用途。優選，本發明涉及用於利用生物化學標記物評估癌症例如肺癌或結腸癌的方法， 其包括測量樣品中seprase和/或其片段以及一個或更多個其他癌症標記物，例如肺癌或 結腸癌的一個或更多個其他標記物的濃度和/或活性，以及將測量結果，特別地測定的濃
7度用於癌症評估中。優選，一個或更多個其他標記物選自Cyfra 21_1、CEA、NSE、CA19_9、CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。在優選實施方案中，本發明還涉及包括至少s印rase和CYFRA 21-1的標記物組在 評估癌症，特別地LC或結腸癌以及更特別地NSCLC或結直腸癌中的用途。本發明還涉及包括至少s印rase和CEA的標記物組用於評估癌症，特別地LC或結 腸癌，以及更特別地NSCLC或結直腸癌的用途。本發明還涉及包括至少s印rase和SCC的標記物組用於評估癌症，特別地LC或結 腸癌，以及更特別地NSCLC或結直腸癌的用途。本發明還涉及s印rase多肽和/或其片段在評估癌症中的用途，其中減少的 seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。本發明還涉及s印rase在評估幾種特定類型的癌症，特別地肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和 前列腺癌中的用途。本發明還涉及抗s印rase多肽和/或其片段的抗體在評估癌症中的用途，其中減 少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。本發明還涉及用於測量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的試劑在評估癌症 中的用途，其中減少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。本發明還提供了用於進行根據本發明的方法的試劑盒，其包括至少特異性測量 seprase多肽和/或其片段和一個或更多個其他癌症標記物所需的試劑。本發明還提供了用於進行根據本發明的方法的試劑盒，其包括至少特異地測量 seprase和一個或更多個癌症標記物(例如上述肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管 癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的標記物)所 需的試劑，其中其他標記物可各自單個地使用或以其任何組合使用。本發明還提供了用於進行根據本發明的方法的試劑盒，其包括至少分別特異性地 測量seprase和CYFRA 21-1所需的試劑和任選地用於進行測量的輔助試劑。本發明還提供了用於進行根據本發明的方法的試劑盒，其包括至少分別地特異性 地測量s印rase和CEA所需的試劑和任選地用於進行測量的輔助試劑。本發明還提供了用於進行根據本發明的方法的試劑盒，其包括至少分別特異性地 測量seprase和SCC所需的試劑和任選地用於進行測量的輔助試劑。在優選實施方案中，本發明涉及用於體外評估癌症的方法，其包括測量樣品中(a) seprase多肽和/或其片段，(b)任選地一個或更多個其他癌症標記物的濃度和/或活性， 和(c)將步驟(a)和任選地步驟(b)的測量結果用於癌症的評估，其中減少的s印rase和 /或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。術語「測量」優選包括樣品中seprase多肽的定性、半定量或定量測量。在優選實 施方案中，測量是半定量測量，即，確定s印rase的濃度和/或活性是高於還是低於截止值 (cut-off value) 0如本領域技術人員將理解的，在是_(存在)或否_(不存在)測定中， 通常將測定靈敏度設置至匹配截止值。可以例如根據健康個體組的檢測來確定截止值。優 選地，將截止值設置至導致90 %的特異性，還優選地將截止值設置至導致95 %的特異性， 或還優選地將截止值設置至導致98%的特異性。低於截止值的值可以例如預示癌症的存在。特別地低於截止值的值可以例如預示著肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰 腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的存在。在另外的優 選實施方案中，seprase的測量是定量測量。在另外的實施方案中，seprase的濃度和/或 活性與基本診斷問題如例如疾病的分期、疾病進展或對治療的反應相關。人wprase(別名成纖維細胞活化蛋白(FAP))是170kDa的具有明膠酶和二肽 基肽酶活性的膜結合糖蛋白。其由兩個相同的單體單位(UniProt KB資料庫，登錄號 P 27487)(特徵在於SEQ ID N0:1(圖3)中給定的序列)組成。S印rase單體包含766 個胺基酸並且具有97kDa(SDS-PAGE)的表觀分子量(Pineiro-Sanchez等人，J.Biol. Chem. 272(1997)7595-7601 ;Park 等人，J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。seprase 的可溶性形式是抗纖溶酶切割酶(antiplasmin-cleaving enzyme) APCE (Lee等人，Blood 103 (2004) 3783-3788 ；Lee 等人，Blood 107 (2006) 1397-1404)。APCE 的 N 末端胺基酸序列 相應於s印rase的殘基24至38，預測其在成纖維細胞細胞質內具有前6個N末端殘基，接 著是20個殘基的跨膜結構域，然後是734個殘基的細胞外C末端催化結構域(Goldstein 等人，Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19 ；ScanIan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1994)5657-5661)。Pineiro -Sanchez等人(同上)發現增加的s印rase的表達與人黑色素瘤和癌細 胞的侵襲性表型相關。Henry等人，Cl in. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水 平的間質s印rase的人結腸腫瘤患者更可能具有侵襲性疾病進展以及轉移或復發的潛在 發展。因此，本領域的上述文獻中沒有一個表明體液中減少的seprase多肽和/或其片 段的濃度和/或活性預示著癌症。令人驚訝地，在本發明中發現體液中s印rase多肽和/或其片段的，特別地APCE 的濃度和/或活性例如酶促活性的確定使得能夠評估癌症例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸 癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺 癌。甚至更令人驚訝地，發現與正常對照相比較，樣品中減少的s印rase或其片段的濃度和 /或活性預示著癌症的風險或發生。如本文中所使用的，每一個下列術語在該部分中具有與其相關的意義。冠詞「a」和「an」在本文中用於指一個或更多個(即，至少一個)冠詞的語法賓語。 例如，「a標記物」意指一個標記物或更多個標記物。術語「至少」用於表示任選地一個或更 多個另外的物體可存在。例如，包括至少(標記物)s印rase和CYFRA 21_1的標記物組可 任選地包括一個或更多個其他標記物。表述「一個或更多個」表示1至50，優選1至20，還優選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或15。本文中使用的術語「標記物」或「生物化學標記物」是指被用作靶以分析患者的受 試樣品的分子。此類分子靶的實例是蛋白質或多肽。在本發明中用作標記物的蛋白質或多 肽預期包括所述蛋白質的天然發生的變體以及所述蛋白質或所述變體的片段，特別地免疫 學可檢測片段。免疫學可檢測片段優選包括所述標記物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20 個連續胺基酸。本領域技術人員認識到由細胞釋放的或存在於細胞外基質中的蛋白質可在 例如炎症期間被破壞，並且可開始降解或被切割成這樣的片段。某些標記物以無活性的形
9式合成，所述形式隨後可通過蛋白質水解激活。如本領域技術人員將理解的，蛋白質或其片 段還可作為複合物的部分存在。這樣的複合物在本發明的意義上也可用作標記物。標記物 多肽的變體由相同基因編碼，但作為備選的mRNA或pre-mRNA剪接的結果，可在它們的等電 點(=PI)或分子量(=MW)或兩者上不同。變體的胺基酸序列與相應的標記物序列達到 95%或更多的同一。此外，或備選地，標記物多肽或其變體可具有翻譯後修飾。翻譯後修飾 的非限定性實例是糖基化、醯基化和/或磷酸化。Seprase 根據本發明，術語「S印rase多肽和/或其片段」是指單體或多聚體，特別地二聚 體多肽。此外，術語「S印rase多肽和/或其片段」特別地指s印rase和/或其片段的可溶 性形式，特別地抗血纖溶酶切割酶(APCE)以及指以與另一種多肽的複合物的形式存在的 seprase 禾口 / 或 seprase 片段。優選在適當的樣品，特別地體液中檢測S印rase多肽，特別地s印rase多肽和/或 其片段的可溶性形式。優選樣品是體液例如血液、血漿、血清、痰、尿、糞便等。優選，樣品來 自人受試者，例如腫瘤患者或處於腫瘤的風險中的人或懷疑患有腫瘤的人。根據本發明，測定seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性。在一個實施方 案中，通過使用特異性結合劑從樣品特異性地測量標記物。特異性結合劑是例如s印rase的受體、結合s印rase的凝集素或抗s印rase的抗 體。特異性結合劑對於其相應的靶分子具有至少IO7Vmol的親和力。特異性結合劑優選 對於其靶分子具有IO8Vmol或也優選IO9Vmol的親和力。如本領域技術人員將理解的，術 語特異性用於表示存在於樣品中的其他生物分子不顯著結合特異於seprase的結合劑。優 選，對除了靶分子外的生物分子的結合水平分別導致至多僅為10%或更少，僅為5%或更 少，僅為2%或更少或僅為或更少的對於靶分子的親和力的結合親和力。優選特異性結 合劑將滿足上述關於親和力以及特異性的最低標準。特異性結合劑優選是與seprase反應的抗體。術語抗體是指多克隆抗體、單克隆 抗體、此類抗體的抗原結合片段、單鏈抗體以及指包含抗體的結合結構域的基因構建體。可使用保持特異性結合劑的上述標準的任何抗體片段。通過現有技術方法，例如， ^PITijssen, P. , Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam, the whole book，特別地第 43 至 78 頁中描述的方法，產生 抗體。此外，本領域技術人員十分了解基於可用於抗體的特異性分離的免疫吸附劑的方法。 通過此類方法，可提高多克隆抗體的質量，從而增強它們在免疫測定中的性能。(Tijssen， P.，同上，第108至115頁)。為了達到本發明中公開的成就，可使用在兔子中產生的多克隆抗體。然而，也很顯 然，還可使用來自不同物種例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體以及單克隆抗體。因為單克隆抗 體可以以任何需要的量和恆定的性質產生，它們代表了用於臨床常規測定的開發的理想的 工具。在根據本發明的方法中抗seprase的單克隆抗體的產生和應用分別代表了其他優選 實施方案。適合於檢測s印rase的抗體的優選實例公開於Pifieiro-Sdnchez等人，同上，例 如抗體D8、D28和D43。正如本領域技術人員現將認識到s印rase已被鑑定為用於評估癌症優選肺癌或 結腸癌的標記物。不同的免疫診斷方法可用於獲得可與本發明的成就相當的結果。例如，可使用產生抗體的備選策略。這樣的備選策略包括除其他以外，合成肽的使用、提供seprase 的表位以進行免疫。備選地，可使用也稱為DNA疫苗接種的DNA免疫。為了進行測量，將獲自個體的樣品在適合於結合劑seprase複合物形成的條件下 與s印rase的特異性結合劑一起溫育。這樣的條件不必詳細說明的，因為本領域技術人員 無需任何發明努力就可容易地鑑定這樣的合適的溫育條件。在癌症優選肺癌的評估中測量 和使用結合劑seprase複合物的量。本領域技術人員將理解，存在許多測量特異性結合劑 seprase複合物的量的方法，其全都詳細地描述於相關教科書(參見，例如，Ti jssen，P.，同 上，或 Diamandis, E. P.,禾口 Christopoulos, T. K. (eds. ), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。優選，在夾心類型測定形式中檢測seprase。在這樣的測定中，將第一特異性結合 劑用於將seprase捕獲在一側，並且將經標記可被直接或間接檢測的第二特異性結合劑用 於另一側。用於夾心類型測定形式的特異性結合劑可以是特異性抗seprase抗體。在一方 面，可通過使用不同的捕獲和標記抗體(即，識別s印rase多肽上的不同表位的抗體)進行 檢測。在另一個方面，還可使用抗s印rase的相同表位的捕獲和標記抗體進行夾心類型測 定。在該實施方案中，只有seprase的二聚體和多聚體形式可被檢測到。根據本發明的另外的實施方案，通過使用適合於檢測seprase的酶促活性的檢測 方案來從樣品特異性地測量標記物s印rase。酶促活性可以例如是明膠酶活性或肽酶活性。 可以例如使用明膠酶的酶譜，通過酶譜法來測定明膠酶活性。可以例如，使用肽底物，通過 螢光測定法來測定肽酶活性。用於測量seprase活性的測定法由例如Lee等人(2006)(同 上)描述。在本發明的意義上「癌症的標記物」和特別地「肺癌的標記物」以及「結腸癌的標 記物」是如果與標記物s印rase組合可在癌症的評估中，例如在一般性癌症的評估中或在某 些癌症類型的評估中(例如在LC或CRC的評估中)增加相關信息的任何標記物。如果可 通過將所述標記物包括入已包含標記物s印rase的標記物組合來分別提高對於癌症評估 的敏感度(在給定的特異性下)或特異性(在給定的靈敏度下)，則信息被認為是相關或為 相加值(additive value) 0在優選癌症評估的實施方案中，靈敏度或特異性的提高分別地 在ρ = . 05、. 02、. 01或更低的顯著性水平上是統計學上顯著的。優選，一個或更多個其他 腫瘤標記物選自 CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9, CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。本文中使用的術語「樣品，，是指獲得用於體外評估目的的生物樣品。在本發明的 方法中，樣品或患者樣品優選可包括任何體液。優選樣品是全血、血清、血漿、支氣管灌洗物 (bronchial lavage)或痰，血漿或血清是最優選的。術語「評估癌症」和特別地「評估肺癌」或「評估結腸癌」用於表示根據本發明的方 法將(單獨地或與其他標記物或變量，例如由UICC所示的標準(參見上文)一起)例如幫 助醫師確定或確認癌症特別地LC或CRC的不存在或存在或幫助醫師預後、檢測復發(術後 患者的隨訪)和/或監測治療特別地化學治療。如本領域技術人員將理解的，任何此類評估是在體外進行的。之後棄去患者樣品。 患者樣品只用於本發明的體外診斷方法，並且不將患者樣品的材料轉移回患者體內。通常， 樣品是液體樣品，例如全血、血清或血漿。在優選實施方案中，本發明涉及用於利用生物化學標記物評估癌症例如LC或CRC的方法，其包括測量樣品中seprase的濃度和將測定的濃度和/或活性用於癌症例如LC或 CRC的評估。本發明的發明者已令人驚訝地能夠在顯著百分比的來源於患有癌症特別地患有 肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱 癌、子宮內膜癌和前列腺癌的患者的樣品中檢測到減少的標記物seprase的濃度和/或活 性。更令人驚訝地，他們已能夠證明獲自個體的此類樣品中減少的s印rase的濃度和/或 活性可用於癌症特別地上述癌症疾病的評估。進行診斷的理想的情形是其中單個事件或過程可在例如感染性疾病中引起各自 疾病的情形。在所有其他情況下，正確的診斷可能非常困難，尤其當疾病的病因學未完全弄 清楚時，對於許多癌症類型例如對於LC的情況就是如此。如本領域技術人員將理解的，不 存在對於給定的多因子疾病例如LC的診斷既具有100%的特異性同時又具有100%的靈敏 度的生物化學標記物。相反，生物化學標記物例如CYFRA 21-1、CEA、NSE，或如本文中所顯 示的seprase可用於以某種可能性或預測值例如存在、不存在或嚴重度來評估疾病。因此 在常規臨床診斷中，通常在潛在的疾病的診斷、治療和管理中同時考慮不同的臨床症狀和 生物學標記物。可以單個地測定生物化學標記物或在本發明的優選實施方案中使用基於晶片或 珠粒的陣列技術同時測量它們。然後例如使用各標記物的個體截止值獨立地解釋生物標記 物的濃度，或將它們組合以進行解釋。在另外的優選實施方案中，在方法中進行根據本發明的癌症的評估，所述方法包 括測量樣品中a) seprase多肽和/或其片段，和b) —個或更多個其他癌症標記物的濃度和 /或活性，以及c)將測量結果，例如分別在步驟(a)和步驟(b)中測定的濃度用於癌症的評 估。在癌症的評估中，標記物seprase在一個或更多個下列方面中是有利的篩查；診 斷幫助；預後；治療例如化學治療、放射治療和免疫治療的監測。篩查篩查定義為就疾病的指標，例如癌症的存在鑑定個體例如處於風險中的個體的檢 測的系統性應用。優選篩查群體由已知處於比平均水平更高的癌症風險中的個體組成。例 如，肺癌的篩查群體由已知處於比肺癌的平均風險更高的風險中的個體(如吸菸者、曾吸 煙者(ex-smoker)和暴露於鈾、石英和石棉的工人)組成。在優選實施方案中，體液例如血清或痰在癌症例如肺癌或結直腸癌的篩查中用作 樣品。對於許多疾病，循環中沒有單個生物化學標記物可以總是滿足篩查目的所需的靈 敏度和特異性標準。這對於癌症，特別地肺癌似乎也是如此。勢必期望必須將包括多個標記 物的標記物組用於癌症的篩查。本發明中確定的數據表明標記物s印rase將形成適合用於 篩查目的的標記物組的構成整體所必需的(integral)部分。本發明因而涉及s印rase作 為癌症標記物組(即包括seprase和一個或更多個另外的用於癌症篩查目的的標記物的標 記物組)的一個標記物的用途。特別地，本發明涉及s印rase作為一般性癌症標記物組中 的一個標記物的用途。這樣的標記物組包括標記物s印rase和一個或更多另外的標記物， 例如一般性癌症標記物和/或用於上述類型的癌症的標記物。
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Seprase還可能貢獻於用於某些特定類型癌症例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、 胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的 標記物組。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優選類型的癌症是肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優選類型的癌症是肺癌、結腸癌、食道 癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌。使用包括s印rase的標記物組評估的其他優選類型的癌症是肺癌、結腸癌。使用包括s印rase的標記物組評估的優選類型的癌症是肺癌(LC)。本數據還表明標記物的某些組合在癌症的篩查中是有利的。例如，參考篩查LC 或CRC的優選實施方案，本發明還涉及包括s印rase和CYFRA 21-1的標記物組、或包括 s印rase和CEA的標記物組、或包括s印rase和NSE的標記物組、或包括s印rase和CA 19-9 的標記物組、或包括s印rase和CA 125的標記物組、或包括s印rase和PSA的標記物組、或 包括s印rase和ASC的標記物組、或包括s印rase和S100A12的標記物組、或包括s印rase 和NNMT的標記物組、或包括s印rase和兩種或更多種選自CYFRA 21-1, CEA,NSE, CA 19-9, CA 125，PSA, ASC, S100A12和NNMT的標記物組的用途。診斷輔助物標記物可以有助於特定器官中良性對惡性疾病的鑑別診斷，幫助區分不同的組織 學類型的腫瘤或在手術前建立基線標記物值。當今，用於檢測癌症的重要方法是放射學和/或計算機斷層(CT)掃描。可通過 這些方法顯現小瘤(Small nodule)即可疑組織的小區域。然而，許多此類小瘤_90%以上 (通過CT)-代表良性組織變化，只有少數小瘤代表癌性組織。標記物s印rase的使用可有 助良性對惡性疾病的區分。因為作為單個標記物的s印ras可能優於其他標記物，例如在LC的情況下優於其 他標記物，如CEA或NSE，因此勢必期望將s印rase用作診斷輔助物(特別地通過在手術前 確定基線值)。本發明因此還涉及seprase用於在癌症的手術之前確定基線值的用途。預後預後指標可定義為以一定的可能性預測疾病結果的癌症患者和它們的腫瘤的臨 床、病理學或生物化學特性。它們的主要用途是幫助合理地計劃患者管理，即分別避免對侵 襲性疾病的處理不足和對怠惰性疾病(indolent disease)的治療過度。Molina，R.，等人， Tumor Biol. 24(2003)209-218 評估了 CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC 和 NSE 在 NSCLC 中的 預後價值(prognostic value) 0在他們的研究中，標記物NSE、CEA和LDH(乳酸脫氫酶)的 異常血清似乎表示更短的存活時間。由於S印rase單獨地顯著促進癌症患者例如LC或CRC患者與健康對照的區分，因 此必需期望其將有助於評估患有癌症優選患有LC或CRC的患者的預後。將最可能把術前 seprase的水平與一個或更多個其他癌症標記物和/或TNM分期系統組合。在優選實施方 案中，seprase用於患有LC或CRC的患者的預後。化學治療的監測Merle，P.，等人，Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315 已評估了用誘導化療法治療的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21_1血清水平的變化。他們得出 CYFRA 21-1血清水平的早期監測可以是III期NSCLC患者中腫瘤反應和存活的有用的預 後工具。此外，報告已描述了 CEA在監測患有LC的患者的治療中的用途(FukasawaJ.，等 人，Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867)。大多數此類研究是基於回憶的、非隨機 化的並且包括少數患者。如在使用CYFRA 21-1的研究的情況下，CEA研究表明a)CEA水平 降低同時接受化學治療的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的結果以及(b) 對於所有患者，CEA水平的增加與疾病的進展相關。預期s印rase將是分別與CYFRA 21-1或CEA至少一樣好的用於化學治療的監測 的標記物。本發明因此還涉及s印rase在監測處於化學治療中的癌症患者，優選肺癌(LC) 或結腸癌(CRC)患者中的用途。在一個優選實施方案中的治療監測中，可將對於s印rase 的測量與對於至少一種選自CYFRA 21-1、CEA和/或NSE的標記物的測量組合，然後將其用 於肺(LC)癌的評估。隨訪大部分經歷目的在於完全清除癌性組織的手術切除的LC患者日後發生復發性 或轉移性疾病(Wagner，H.，Chest 117(2000) 110-118 ；Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此類復發在術後前2至3年內發生。因為如果檢測得太 遲，復發性/轉移性疾病常常是致命的，因此相當多的研究集中在處於早期，從而潛在地可 治療的分期的癌症復發上。因此，許多癌症患者例如LC患者經歷了頻繁包括使用CEA的定期監測的術後監 測方案。已顯示手術切除術後一年使用CEA的系列監測甚至在疑似症狀或體徵不存在的 情況下，在大約97%的特異性下以大約29%的靈敏度檢測到早期術後復發/轉移性疾病 (Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75(2003)973-980)。因此，術後患有 LC 的患者的隨 訪是合適的生物化學標記物的用途的最重要的領域之一。由於s印rase在被調查的LC患 者中的高度靈敏度，seprase (單獨地或與一個或更多個其他標記物組合)可能極大地幫助 LC患者的隨訪，尤其在術後LC患者的隨訪。包括s印rase和一個或更多個LC的標記物的 標記物組合在LC患者的隨訪中的用途代表了本發明的另外的優選實施方案。本發明在優選實施方案中涉及s印rase在癌症的診斷領域中的用途。優選， seprase分別用於肺癌(LC)、結腸癌(CRC)、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子 宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌的評估。在另外的優選實施方案中，本發明涉及seprase作為與一個或更多個另外的癌症 標記分子組合的癌症例如一般性癌症或特定類型的癌症(例如肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸 癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺 癌)的標記分子的用途。另外的標記分子可以是癌症類型非特異性一般性標記分子和/或 癌症類型特異性標記分子，例如肺癌或結腸癌的標記物。Seprase和至少一個另外的標記物 用於獲自個體的液體樣品中癌症例如肺癌或結腸癌的評估。優選選擇的可將其與seprase 的測量組合的其他癌症標記物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA125、CA19-9, PSA、ASC、S100A12 和NNMT。特別地，優選選擇的可將s印rase的測量與其組合的其他LC標記物CYFRA 21-1, CEA和/或NSE。用於評估癌症例如LC的優選標記物組包括seprase和至少一個選自CYFRA 21-1和CEA的其他標記分子。
如本領域技術人員將理解的，存在許多使用兩個或更多個標記物的測量以改進調 查中的診斷問題的方法。在相當簡單但通常有效的方法中，如果樣品對於至少一種被調查 的標記物是陽性的，則假定為陽性結果。這可以例如是當診斷感染性疾病如AIDS時的情 況。然而，頻繁地，評估標記物的組合。優選，將測量的標記物組的標記物例如s印rase 和CYFRA 21-1的值算術組合，並且使組合的值與基本診斷問題發生關係。可通過任何合 適的現有技術數學方法來組合標記物值。用於使標記物組合與疾病發生關係的熟知的 數學方法使用方法如判別分析(DA)(即線性-、二次-、正則化-DA)、核方法(即SVM)、 非參數法(即k-最近鄰分類器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二 乘法)、基於樹的方法(即邏輯斯蒂回歸、CART、隨機森林法(RandomForest Method)、 Boosting/套袋法(Bagging Methods))、廣義線性模型(即邏輯斯蒂回歸)、基於組成分 的方法(Principal Components basedMethod)(即SIMCA)、廣義加法模型、基於模糊邏輯 的方法(Fuzzy Logicbased Method)、神經網絡和基於遺傳算法的方法。本領域技術人 員在選擇合適的方法評估本發明的標記物組合中將沒有問題。優選，用於使本發明的標 記物組合例如與LC的不存在或存在發生關係的方法選自DA(即線性_、二次_、正則化判 別分析)、核方法(即SVM)、非參數法(即k-最近鄰分類器)、PLS(偏最小二乘法)、基 於樹的方法(Tree-BasedMethod)(即邏輯斯蒂回歸、CART、隨機森林法、Boosting法)或 廣義線性模型(即邏輯斯蒂回歸)。關於此類統計方法的詳細內容見於下列參考文獻 Ruczinski，I·，等人，J· of Computational and Graphical Statistics，12 (2003) 475-511 ； Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association84(1989) 165-175 ； Hastie， Trevor, Tibshirani， Robert， Friedman， Jerome， The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics (2001) ；Breiman，L.，Friedman，J. H.， Olshen，R. A.，Stone，C. J. (1984)Classification and regression trees，California Wadsworth ；Breiman, L，Random Forests，Machine Learning，45 (2001) 5-32 ；Pepe，M. S.， TheStatistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical Science Series 28(2003)；禾口 Duda，R. 0.，Hart，P. E.，Stork，D. G.， Pattern Classification, Wiley Interscience，第 2 片反(2001)。本發明的優選實施方案是使用生物學標記物的基本組合的最優化多變量截止值 來區分狀態A與狀態B (例如區分患病的與健康的)。在該類型的分析中，標記物不再是獨 立的而是形成標記物組。診斷方法的精確性通過其受試者工作特性(ROC)(特別地參見Zweig，Μ. H.，和 Campbell,G.，Clin. Chem. 39(1993)561-577)得到最佳描述。ROC圖是由在整個觀察到的數 據範圍內連續改變決策閾值產生的所有靈敏度/特異性對的曲線。實驗室檢測的臨床性能取決於其診斷精確性或正確地將受試者分類至臨床相關 亞組的能力。診斷精確性測量檢測的正確區分被調查的受試者的兩個不同狀況的能力。此 類狀況是例如健康和疾病或良性疾病對惡性疾病。在各情況下，ROC曲線通過在完全的決策閾值範圍內將靈敏度對1-特異性作圖 來描述兩個分布之間的重疊。靈敏度或真陽性分數[定義為(真陽性檢測結果的數目)/ (真陽性檢測結果的數目+假陰性檢測結果的數目)]在y軸上。這也稱為在疾病或病狀存在的情況下的陽性。其只根據受影響的亞組來計算。假陽性分數或ι-特異性[定義為 (假陽性結果的數目)/(真陰性結果的數目+假陽性結果的數目)]在X軸上。其是特異 性的指數並且完全根據未受影響的亞組來計算。因為通過使用來自兩個不同亞組的檢測結 果完全分別地計算真陽性分數和假陽性分數，因此ROC曲線不依賴於樣品中疾病的流行性 (prevalence)。ROC曲線上的各點代表相應於特定決策閾值的靈敏度/1-特異性對。具有 完美區分(兩個結果的分布中無重疊)的檢測具有通過左上角的ROC曲線，其中真陽性分 數是1.0或100% (完美的靈敏度)，並且假陽性分數為0(完美的特異性)。無區分(對 於兩組為相同的結果分布)的檢測的理論曲線是從左下角至右上角的45°對角線。大部 分曲線落在這兩個極端值之間。(如果ROC曲線完全落在45°對角線以下，這可通過將「陽 性」標準從「大於」轉變成「小於」或反之亦然來容易地矯正)。定性地，曲線越接近左上方 的角，檢測的總體精確性越高。定量實驗室檢測的診斷精確性的一個優選方法是利用單個數字表示其性能。這樣 的總體參數例如稱為「總誤差(total error)」或備選地「曲線下的面積=AUC」。最普遍的 全局測量是ROC曲線下的面積。按常規，該面積總是大於0. 5 (如果不是，可顛倒決策規則 來使其大於0. 5)。值在1. 0 (兩組的檢測值完全分離)至0. 5 (兩組檢測值之間無顯著分布 差異)之間變化。面積不僅取決於曲線的特定部分例如離對角線最近的點或在90%特異性 下的靈敏度，而且還取決於整個曲線。這是ROC曲線接近完美曲線(面積=1.0)的程度的 定量描述性表述。在優選實施方案中，本發明涉及用於通過分別測量樣品中至少s印rase和CYFRA 21-1以及任選地CEA和/或NSE的濃度，然後使測定的濃度與癌症例如LC或CRC的存在 或不存在發生關係來提高癌症例如LC或CRC對健康對照的診斷精確性的方法，當與基於任 何單個的單獨調查的標記物的分類相比較時，改進導致更多的患者被正確地分類為患有癌 症，例如LC或CRC對健康對照。在根據本發明的優選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase和CYFRA 21-1的 濃度，並且將標記物組合用於評估癌症例如LC或CRC。在根據本發明的另外的優選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase和CEA的 濃度，並且將標記物組合用於評估癌症例如LC或CRC。在根據本發明的另外的優選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的濃度，並且將標記物組合用於評估癌症例如LC或CRC。在根據本發明的另外的優選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的濃度，並且將標記物組合用於評估癌症例如LC或CRC。在根據本發明的另外的優選方法中，分別測定至少生物標記物s印rase、CYFRA 21-1和NSE的濃度，並且將標記物組合用於評估癌症例如LC或CRC。提供下列實施例、參考文獻、序列表和圖來幫助理解本發明，其真實範圍示於所附 權利要中。應當理解，可在所示的方法中進行變動而不背離本發明的精神。附圖概述

圖1顯示結直腸癌(CRC)患者和健康對照患者以及健康對照中血清s印rase濃度 的分布。圖2顯示肺癌(LC)患者和健康對照中血清s印rase濃度的分布。
圖3顯示人s印rase的胺基酸序列(SEQ ID NO :1)。實施例1使用大鼠單克隆抗s印rase抗體(克隆D8、D28和D43)作為s印rase特異性結合 分子(Pineiro-Sanchez，Μ. -L.，等人，J. Biol. Chem.，272 (1997) 7595-7601)。單克隆大鼠IgG的生物素化使單克隆大鼠IgG(克隆 D28 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl 中達到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1生物素-N-羥基琥珀醯亞胺(3. 6mg/ml於DMSO 中)。在室溫下進行 30 分鐘後，將樣品在 Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上進行層析。收集含有生物素化的IgG的級分。單克隆大鼠IgG的地高辛化(Digoxygenylation)使單克隆大鼠IgG (克隆 D8 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, 30mM NaCl，pH 7. 5 中 達到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1地高辛-3-0-甲基羰基-ε -氨基己酸-N-羥基 丁二酷亞胺活化月旨(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (3. 8mg/ ml 於 DMSO 中)。在室溫下進行 30 分鐘，將樣品在Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上進行層析。收集含有地高辛化的IgG的級分。實施例2用於人血清和血漿樣品中s印rase的測量的ELISA。為了檢測人血清或血漿中的s印rase，發展了夾心ELISA。在第一測定形式中，將 綴合有生物素的抗seprase單克隆抗體和綴合有地高辛(參見實施例1)的等分用於捕 獲和檢測抗原(D28XD8形式)。在第二測定形式中，將分別綴合有生物素和地高辛的抗 seprase單克隆抗體D43(參見實施例1)的等分用於捕獲或檢測抗原(D43XD43形式)。將樣品(75 μ 1)與150 μ 1各自含有0. 375 μ g的D28_生物素和D8-地高辛抗體 或備選地D43-生物素和D43-地高辛抗體的抗體試劑於溫育緩衝液(40mM磷酸鹽、200mM酒 石酸鈉、IOmM EDTA、0. 05%苯酚、0. 聚乙二醇 40000、0· Tween 20,0. 2% BSA,0. 1% 牛IgG和0. 02% 5-溴-5-硝基-1，3- 二噁烷並且調整至pH 7. 4)中混合。在溫育2小時後，將2X100 μ 1的混合物轉移入鏈黴抗生物素塗鋪的微量滴定板 的分開的孔中，再溫育另外1小時。用清洗緩衝液(10mMTris、150mM NaCl,0. 05% Tween 20)清洗板3次。在下一步驟中，用30mU/ml的通用綴合緩衝液(Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Germany, Catalog #11684825) Φ W^liftι Φ "HRP fAtx^ (Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany, Catalog#1633716)溫育孔，進行60分鐘，然後如之前一樣進行清洗。^Bffl 100μ 1(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog#12034425)溫育孔進行1小時。加入2N硫酸(50 μ 1)終止顯色並且將藍色轉變成黃色。用ELISA讀數器在450nm測量0D。所有溫育在室溫下進行。用溫育緩衝液預稀釋人血清或血漿的樣品至 0.15%的終濃度。為了進行校準，將血清池用作標準。用溫育緩衝液將其稀釋至 0. 09/0. 18/0. 27/0. 36/0. 45% 的終濃度以分別產生具有 0. 03/0. 06/0. 09/0. 12/0. 15 單位
17/ml的任意給定的值的標準。通過線性回歸分析計算校正曲線方程，將其用於將孔的吸光度讀數轉換成相應的 濃度值。將結果乘以預稀釋因子以獲得各樣品本身的濃度。實施例3CRC研究群體在第一研究中，使用來源於49孔表徵的患有結直腸癌(表1中給出的UICC分類) 的患者的樣品。魁CRC研究跨UICC分期的樣品的分布 與獲自50個明顯健康的無任何已知惡性疾病(=對照組群)的個體的對照樣品 相比較，評估表1的樣品。實施例4LC研究群體完全不依賴於第一研究的第二研究集中於非小細胞肺癌(NSCLC)。更具體地，調查 患有主要類型的NSCL、腺癌和鱗狀細胞癌的患者。表2a描述了癌症組群的類型和分期分 布。表 2aLC研究LC樣品的類型和分期 本研究中的對照組群經特別地定義包括來自表2b中描述的吸菸者和不抽菸者 的樣品。對各個體進行肺量測定法(spirometry)肺功能檢測(Miller，Μ. R.等人，Eur. Respir. J. 26 (2005) 319338)。只有供體的結果在正常範圍內時，才將樣品包括在對照組群中。表 2bLC研究對照組群的組成 實施例5S印rase區分癌症患者與健康對照seprase的血清濃度在癌症患者與健康對照之間顯著不同，如在兩個研究中發現 的一樣。在圖1和2中，顯示了使用D28和D8抗體的組合物測定的結果。癌症患者組群的平均濃度顯著比對照組群的低在CRC和LC研究中分別看到患者 中的22. 6和20. 9U/ml對對照中的33. 6和35. 6U/ml。對於對各對照組群產生95%的特異 性的截止值，結直腸癌的靈敏度為67%。對於肺癌其為62%。靈敏度對於癌症的所有分期都相似，如從CRC和LC數據(表3和4)可看到的。因 此，seprase可用作疾病的早期指示劑。對於肺癌，對於鱗狀細胞癌的靈敏度比對於腺癌的 更高(表4)。^t 3CRC研究靈敏度取決於UICC分類
LC研究靈敏度取決於類型和分期 使用只檢測seprase的二聚體或多聚體形式的2個D43抗體的測定的結果與其密 切相關(數據未顯示)。實施例6用於CRC和LC的其他標記物的靈敏度除了 seprase以外，我們在CRC和LC研究樣品中測定了 10個其他熟知的腫瘤標 記物。在該情況下使用可商購獲得的檢測試劑盒。為了在它們之間進行公平比較，將被調 查的各標記物的截止值設置為在各自研究的對照組群中產生95%的特異性。表5提供了各標記物對於兩種癌症類型的檢測的靈敏度。魁CRC和LC的不同癌症標記物靈敏度 S印rase對於CRC和LC顯示相似的靈敏度。總體上，其平均為64. 5%，為在所有 評估的標記物中觀察到的最高值。只有Cyfra 21_1具有相同的平均靈敏度。然而，Cyfra 在CRC的檢測中不如s印rase有效。與這兩者相比較，通過所有其他測量的腫瘤標記物顯 示的性能相當差。實施例7標記物組合如果各組的至少一個標記物超過某個閾值，則個體被分類為患有癌症。通常，此類 截止值與用於單個標記物情況的值不同，但類似地對於各組合物產生95 %的特異性。兩個最顯著的標記物s印rase和Cyfra 21-1的組合顯著地提高了癌症的檢測並 且在LC研究中產生80%的靈敏度。實施例8使用Seprase作為腫瘤標記物進行的不同癌症與年齡匹配的健康對照的區分在該研究中，測量來自患有不同癌症疾病的良好表徵的患者的樣品(樣品編號和 UICC分類提供於表6中)。通過將表6的樣品與264個年齡匹配的對照患者相比較來進行 評估，所述對照患者是無任何已知惡性疾病的明顯健康的個體。在該對照組群中，測定截止 值，獲得95%的特異性。 不同癌症實體中的靈敏度
在食道癌、頭頸癌、胃癌和膽管癌中以及對於LC和CRC (表5中顯示的數據)獲得 了對於s印rase的高靈敏度。已發現s印rase對於胰腺癌和腎癌的良好靈敏度。還發現 seprase在子宮頸癌、卵巢癌和乳腺癌的評估中的較低的靈敏度。儘管在篩查設置(在95% 的特異性下)中在乳腺癌中具有相對較低的靈敏度(18%)，但s印rase還可被認為是乳腺 癌的復發監測的有吸引力的標記物。常規用於該期望的用途的標記物CA 15-3和CEA在乳 腺癌集合中分別只顯示6%和11%的靈敏度，這低於標記物s印rase。
權利要求
用於體外評估癌症的方法，其包括測量樣品中下列物質的濃度和/或活性a)seprase多肽或其片段，b)任選地一個或更多個其他癌症標記物，和c)在癌症的評估中使用步驟(a)和任選地步驟(b)的測量結果，其中減少的seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。
2.權利要求1的方法，其用於評估特定癌症類型。
3.權利要求2的方法，其中特定癌症類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管 癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌。
4.權利要求2或3的任一項的方法，其中特定癌症類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸 癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌或乳腺癌。
5.權利要求2至4的任一項的方法，其中特定癌症類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸 癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌或腎癌。
6.權利要求2至5的任一項的方法，其中特定癌症類型是肺癌、結腸癌、食道癌、頭頸 癌、胃癌或膽管癌。
7.權利要求2至6的任一項的方法，其中癌症是肺癌(LC)或結直腸癌(CRC)。
8.權利要求2至7的任一項的方法，其中癌症是肺癌(LC)。
9.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物是癌症類型非特 異性一般性癌症標記物。
10.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物是癌症類型特異 性癌症標記物。
11.權利要求1的方法，其中所述一個或更多個步驟(b)的其他標記物選自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
12.權利要求11的方法，其中所述一個或更多個其他標記物是CYFRA21-1。
13.權利要求11的方法，其中所述一個或更多個其他標記物是CEA。
14.權利要求1至13的任一項的方法，其中樣品是體液樣品。
15.權利要求1至14的任一項的方法，其中樣品是血液、血清或血漿樣品。
16.權利要求1至15的任一項的方法，其中樣品是人樣品。
17.權利要求1至16的任一項的方法，其中測量s印rase多肽和/或其片段的濃度。
18.權利要求17的方法，其中通過免疫學方法測量濃度。
19.權利要求1至18的任一項的方法，其中測量seprase多肽的二聚體或多聚體形式。
20.權利要求1至19的任一項的方法，其中測量seprase多肽的單體形式。
21.權利要求1至21的任一項的方法，其中測量s印rase多肽和/或其片段的酶促活性。
22.權利要求21的方法，其中測量抗血纖溶酶切割活性。
23.seprase多肽和/或其片段在癌症的評估中的用途，其中減少的s印rase和/或其 片段的濃度和/或活性預示著癌症。
24.抗s印rase抗體和/或其片段在癌症的評估中的用途，其中減少的s印rase和/或 其片段的濃度和/或活性預示著癌症。
25.用於測量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的試劑在癌症的評估中的用途，其中減少的seprase和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌症。
26.權利要求23至25的任一項在肺癌特別地NSCLC的評估中或在結腸癌特別地結直 腸癌(CRC)的評估中的用途。
27.包括s印rase多肽和/或其片段以及一個或更多個其他癌症標記物的標記物組在 癌症的評估中的用途，其中減少的seprase多肽和/或其片段的濃度和/或活性預示著癌 症。
28.權利要求27的用途，其中一個或更多個標記物是癌症類型非特異性和/或癌症類 型特異性標記物。
29.權利要求28的用途，其中一個或更多個其他標記物在肺癌或結腸癌的評估中是肺 癌標記物。
30.權利要求27至29的任一項的用途，其中一個或更多個其他標記物選自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
31.權利要求27至30的任一項的用途，其中標記物組包括至少s印rase和/或其片段 和 CYFRA 21-1。
32.用於進行根據權利要求1至22的任一項的方法的試劑盒，所述試劑盒包括特異性 地測量seprase多肽和/或其片段以及一個或更多個其他癌症標記物所需的試劑。
全文摘要
本發明涉及有助於評估癌症的方法。其公開了人成纖維細胞活化蛋白(FAP/seprase)作為不同癌症類型的通用標記物的用途。Seprase有助於與肺有關的癌症或肺癌(LC)或結腸癌例如非小細胞肺癌(NSCLC)或結直腸癌(CRC)，而且還可能其他特定類型的癌症的評估。此類特定癌症類型是例如食道癌、頭頸癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌和前列腺癌。此外，其特別地涉及用於通過測量來源於個體的液體樣品中的seprase來從所述樣品評估癌症的方法。seprase的測量可以例如用於癌症的早期檢測或用於經歷手術的患者的監測。
文檔編號G01N33/574GK101896818SQ200880119930
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月8日 優先權日2007年12月10日
發明者J·P·科錢, J·卡爾, M·塔克, M·羅斯勒, W·羅林格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司