用於全身性癌症治療的egfr導航雙鏈rna載體的製作方法
2023-06-11 16:36:41
專利名稱：用於全身性癌症治療的egfr導航雙鏈rna載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於癌症治療的領域，涉及包含帶有EGFR-結合試劑的雙鏈RNA(dsRNA)的載體，所述EGFR-結合試劑能夠將dsRNA特異性導向過量表達EGFR的癌細胞，從而動員免疫系統用於過量表達EGFR的腫瘤的治療。縮寫dsRNA 雙鏈RNA ；EGF 表皮生長因子；EGFR =EGF受體；PBMC 外周血單核細胞；PEG 聚(乙二醇)；PEI 聚乙烯亞胺；pIC，PolyIC 聚肌苷酸-聚胞苷酸雙鏈RNA ；pIC/ MPPE =PolyIC/蜂毒素-分枝的聚乙烯亞胺-聚乙二醇-EGF ；pIC/PPE =PolyIC/線性的聚乙烯亞胺-聚乙二醇-EGF ；pIC/PPGEll =PolyIC/線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-(肽)GEl 1。
背景技術：
表皮生長因子受體(EGFR)在各種實體人類腫瘤中過量表達，包括非小細胞肺癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、結腸直腸癌症、腺癌、卵巢癌症、膀胱癌和前列腺癌 (Hynes et al.，2009)。美國癌症學會的新癌症病例和死亡的估計顯現了 2008年在美國 1，437，180例新癌症病例以及565，650例癌症死亡。大多數癌症死亡的原因是癌症向內臟的轉移，其實際上不可能通過常規方法來治療。與死亡相關的所有癌症的大部分與EGFR的過量表達相關。因而，EGFR是靶向的癌症治療的最重要的候選物之一。兩種最先進的EGFR靶向療法是小的膜可透過的EGFR激酶抑制物，以及抗EGFR抗體，它們阻止受體活化和/或引起受體減量調節。這些試劑誘導臨時或部份緩解，並表現某些存活效益，但是實際上不治癒患者。這很可能因為EGFR對於靶向的癌細胞的存活不是關鍵的。PolyIC, 一種合成的聚肌苷酸-聚胞苷酸雙鏈RNA，是已知的細胞毒性試劑。非靶向的PolyIC的腫瘤內和腫瘤周施用已經展現了在抗腫瘤免疫治療中是有效的(Fujimura et al.，2006)。這樣的治療僅限於局部的腫瘤，非靶向的PolyIC治療癌症的全身性應用的嘗試也已經顯示了這一點。存活益處是最小的，同時觀察到顯著的全身毒性(Butowski et al.，2009 ；Salazar et al.，1996)。微弱的效果最可能是由不能將足夠劑量的PolyIC導入腫瘤細胞而引起。大部分的非靶向性PolyIC可能通過正常組織擴散進入非癌細胞並誘導毒性反應。近來，我們開發了利用EGFR的高水平表達，而不是它本身的活性的策略，作為腫瘤的致命點。通過利用負載PolyIC的EGFR導航化學載體實現了這一點(Shir et al., 2006 ；WO 04/045491)。PolyIC/蜂毒素-聚乙烯亞胺-聚乙二醇-EGF(PolylC/MPPE)向顱內生長的過量表達EGFR的成膠質細胞瘤( 1 X IO6個受體/細胞)、以及向裸鼠中作為異種移植物生長的過量表達EGFR的乳腺和表皮樣癌的腫瘤內應用，引起了這些局部化腫瘤的完全消除，治癒了小鼠。此外，包含過量表達野生型EGFR的細胞以及帶有突變的EGFRvIII 的細胞的1 1混合物的腫瘤，其不內在化所述載體，也被完全地消滅。這種「旁觀者效應」 是由於PolylC/MPPE影響的腫瘤細胞在腫瘤位置產生的抗增殖細胞因子，例如幹擾素-α。發明概述
本發明涉及表皮生長因子受體(EGFR)-導航(homing)載體，其包含帶有EGFR-結合肽或多肽的雙鏈RNA(dsRNA)分子，與免疫細胞一起用於過量表達EGFR的癌症的治療。本發明進一步涉及治療特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的組合(i)EGFR-導航載體，其包含帶有EGFR-結合肽或多肽的dsRNA分子，所述EGFR-結合肽或多肽能夠將所述載體靶向過量表達EGFR的腫瘤細胞；和(ii)免疫細胞。在某些實施方式中，本發明提供用於全身性施用的藥物組合物，其包含藥學上可接受的載運體(carrier)和EGFR-導航載體(vector)，所述載體包含帶有EGFR-結合多肽的雙鏈dsRNA分子。在某些其他實施方式中，本發明提供了治療特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用有效量的EGFR-導航載體，所述載體包含帶有EGFR-結合多肽的雙鏈dsRNA分子。在某些實施方式中，EGFR-導航載體進一步包含核酸載運體，例如，由與聚乙二醇(PEG)共價連接的聚乙烯亞胺(PEI)組成，dsRNA是與載體的PEI部分非共價締合的 polyIC, EGFR-結合肽或多肽是與載運體的PEG部分共價連接的EGF或肽GEl 1。本發明的載體、組合物和方法預期用於選自非小細胞肺癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其轉移的癌症的治療。附圖
的簡要說明
附圖IA-C描繪了柱形圖，其顯示了 PBMC通過PolyIC/MPPE轉染的MDA-MB-468和A431 細胞的培養基被選擇性地活化。如「方法」中描述的，500，000個PBMC播種到M孔平板中， 在0. 5ml培養基中生長過夜。PBMC然後用從PolyIC/PEI-PEG-EGF+PEI_Mel轉染的A431、 MDA-MB-468、U87MG或U138MG細胞轉染後48小時移去的0. 5ml培養基攻擊。在攻擊後M 和48小時採集PBMC培養基，使用ELISA分析測量IFN- y、IL-2和TNF- α。(IA)攻擊後24 和48小時，PBMC的培養基中IL-2的表達。(IB)攻擊後48小時，PBMC的培養基中IFN- γ 的表達。(IC)攻擊後48小時，PBMC的培養基中TNF-α的表達。「未處理」顯示了在未攻擊的PBMC中細胞因子的表達。「UT」顯示了用未轉染的細胞的培養基攻擊的PBMC的細胞因子表達。聚穀氨酸(pGlu)/MPPE被用作對照。附圖2A-D顯示了免疫細胞向PolylC/MPPE+PBMC治療的過量表達EGFR的腫瘤中的浸潤，但是不浸潤入U138MG細胞(沒有EGFR表達)。A431 (2A)或MDA-MB-468 (2B)細胞皮下地注射(s. c.) Λ SCID-NOD小鼠的右肋，U138MGQC-2D)注射入左肋(比較附圖2Α與附圖2C，以及附圖2Β與附圖2D)。當腫瘤達到大約IOOmm3時，用3次連續的PolylC/MPPE I. V.注射5 μ g/小鼠/天啟動治療。最後的PolylC/MPPE注射之後M小時，3百萬個PBMC I. P.注射二4小時後提取腫瘤，固定在4%福馬林中。然後製備石蠟切片，用H&E染色，進行組織病理學分析。短劃線顯示了免疫細胞浸潤的區域。附圖3A-D顯示了 PBMC介導的旁觀者效應。附圖3A.為了展現PBMC介導的旁觀者效應，100，000個MDA-MB-468細胞播種到6孔平板中，與2mL培養基生長過夜(Shir et al.，2006)。細胞然後用Poly IC/MPPE以標明的濃度轉染。轉染後48小時，來自轉染的細胞的0. 5mL培養基(「條件培養基」)添加到500，000個PBMCs中，所述PBMC早先24小時播種到M孔平板中並在0. 5ml培養基中生長。來自攻擊的PBMC的0. Iml培養基然後交換為來自早先M小時播種的另外的未轉染的MDA-MB-468細胞(「指示細胞」)的0. Iml培養基。在用來自PBMC的培養基攻擊後48小時，這些細胞的存活通過次甲基藍分析來測定(圖畫中的黑色柱)。並行地，為了顯示直接旁觀者效應，0. Iml的條件培養基用於替換來自早先M小時播種到96孔平板並在0. 2ml培養基中生長的、未轉染的MDA-MB-468細胞(「指示細胞」)的0.1ml培養基。這些細胞的存活在添加條件培養基後48小時使用次甲基藍測定(畫陰影線的柱)；附圖3B顯示了 poly IC轉染的MDA-MB-468細胞對未轉染的U138MG 細胞的旁觀者效應；附圖3C-3D顯示了 poly IC轉染的A431細胞分別對未轉染的A431細胞和未轉染的U138MG細胞的旁觀者效應。「未處理」顯示了不經歷任何培養基交換的指示細胞的存活率。「PBMC UT」顯示了用來自未攻擊的PBMC的培養基處理的指示細胞的存活率。「UT」顯示了用來自未轉染的細胞攻擊的培養基的PBMC的培養基處理的指示細胞的存活。「無PBMC」(灰色柱)表示如下時的存活，當條件培養基添加到PBMC生長培養基但是不存在PBMC時，將這在48小時後用於攻擊指示細胞。這個最後的對照被用於檢測在不存在 PBMC的PBMC培養基中孵育之後，條件培養基的可能殘餘的直接旁觀者效應。附圖4A-C顯示了活化的PBMC的體外癌細胞殺傷。細胞如在方法中描述的來生長。細胞然後用0. 1μ g/ml的PolylC/MPPE轉染。24小時後，500，000個PBMCs/孔添力口到癌細胞，共孵育另外M小時。細胞凋亡細胞(亮點)使用Armexin-V-Biotin試劑盒 (Biosource, Inc.)顯現。為了辨別腫瘤細胞和PBMC，腫瘤細胞用FITC-軛合的EGFR抗體(Biosource，he.，灰色細胞)來標記。細胞用螢光顯微鏡顯現並利用數位照相機拍照 A431細胞、MDA-MB-468細胞和U138MG細胞分別在附圖4A、4B和4C中顯示。附圖5A-E顯示了 PolylC/MPPE/PBMC治療對帶有彌散性(disseminated)腫瘤的小鼠的存活的影響。彌散性腫瘤如方法中所描述的來建立。(5A)在治療開始時小鼠肺的組織病理學分析(細胞注射後15天)。箭頭指向肺毛細血管中的腫瘤。(5B，5C)細胞注射後 15天，動物隨機分組(每組5隻小鼠)，用M小時間隔的20 μ g PolylC/MPPE的4次連續的靜脈內注射來開始治療。最後的PolyIC注射後M小時，動物用四百萬PBMC注射一次。 (5B)顯示了帶有A431腫瘤的動物的存活。(5C)顯示了帶有MDA-MB-468腫瘤的動物的存活。pGlu/MPPE，聚穀氨酸/MPPE ;UT，未治療的。(5D，5E)細胞注射後10天，動物隨機分組 (每組5隻小鼠)，用M小時間隔的20 μ g PolylC/MPPE的3或4次連續的靜脈內注射的3 個循環來開始治療(共10次注射)。循環之間的間隔時間是48小時。這個操作消除了治療樣體重損失的有毒影響(數據未顯示)。對照組包括用pGlu/MPPE (聚穀氨酸/MPPE)治療的小鼠，來確定沒有PolyIC的軛合物和HBG緩衝液(Hepes-緩衝的葡萄糖)的作用O)。 (5D)顯示了帶有A431腫瘤的動物的存活。(E)顯示了帶有MDA-MB-468腫瘤的動物的存活。 UT，未治療的。附圖6描繪了載體pIC/MPPE和pIC/PPE對用它們轉染的細胞的存活的影響。使用的細胞是U87MG和MDA-MB468 (每種4000個細胞)，它們表達不同水平的EGFR(U87MG表達 IX IO5 的 EGFR ；MDA-MB468 表達 2X IO6 的 EGFR)，和 U138MG(3000 個細胞)(其不表達 EGFR)。細胞播種到96孔平板中並生長過夜。細胞然後用與軛合物MP25tePE或P221PE配製的 PlC轉染。通過次甲基藍分析在轉染後48小時分析細胞的存活。UT，未處理的細胞。pGlu， 聚穀氨酸處理的細胞。附圖7描繪了載體pIC/PPE和pIC/PPGEll對用它們轉染的細胞的存活的影響。使用的細胞是 MCF7、MDA-MB231 (MDA231)、U87MG, U87MGwtEGFR 和 MDA-MB468 (MDA468)(每種4000個細胞)，它們表達不同水平的EGFR(MDA231表達3-7 X IO5, U87MG表達IX IO5的 EGFR ；MDA468表達2 X IO6的EGFR)和U138MG(3000個細胞)(其不表達EGFR)。細胞播種到96孔平板中並生長過夜。細胞然後用與軛合物P251PE或P251PGEll配製的pIC轉染。通過次甲基藍分析在轉染後48小時分析細胞的存活。UT，未處理的細胞。附圖8A-B 顯示了不同載體(pGlu/MPPE、pGlu/PPE、pIC/MPPE 和 pIC/PPE)對裸鼠中s. c. A431生長的體內的作用。對於8A中描繪的實驗，雌性4-5周齡小鼠用溶於200 μ 1 PBS中的2百萬Α431細胞(表達高水平的EGFR的人上皮癌細胞系)s. c.注射。當腫瘤達到 80mm3時，小鼠分成5組，每組5隻動物。與標明的軛合物配製的10 μ g pIC每48小時IV注射。對於8B中描繪的實驗，雌性6-7周齡小鼠用溶於100 μ 1 PBS的2百萬U138MG 細胞s. c.注射。當腫瘤達到 75mm3時，小鼠分成3個組，每組9隻動物。然後小鼠IV注射標明劑量的pIC/P221PE (每48小時10或25 μ g/小鼠一次)。pGlu，聚穀氨酸。發明的詳細說明
在某些實施方式中，本發明提供了 EGFR-導航載體，其包含dsRNA分子，一種已知其細胞毒性和細胞穿透能力的試劑；帶有能夠將所述載體靶向過量表達EGFR的腫瘤細胞的 EGFR結合肽或多肽，與免疫細胞組合使用用於治療過量表達EGFR的腫瘤。在某些其他實施方式中，本發明提供了治療特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的組合(i)包含帶有EGFR-結合肽或多肽的dsRNA分子的EGFR-導航載體，所述EGFR-結合肽或多肽能夠將所述載體靶向過量表達EGFR的腫瘤細胞；以及(ii)免疫細胞。本發明中使用的dsRNA分子是合成的雙鏈分子，其在每條鏈中可以包括不同、但是優選相同，的數量的核糖核苷酸。dsRNA分子的每條鏈可以包含相同的或不同類型的核糖核苷酸，包括肌苷酸(I)、胞苷酸(C)、腺苷酸(A)、鳥苷酸(G)和尿苷酸(U)。在某些優選的實施方式中，每條鏈由單一種類的核糖核苷酸組成，更優選的，兩條鏈的核糖核苷酸是匹配的核糖核苷酸對，例如，腺苷酸-尿苷酸，或肌苷酸-胞苷酸配對。在某些優選的實施方式中，dsRNA完全由匹配的核糖核苷酸對組成，更優選的， 肌苷酸(I)-胞苷酸(C)對。因而，dsRNA分子包括聚肌苷酸鏈和聚胞苷酸鏈，在此稱為 「polylC」或「pIC」。通過誘導幹擾素-Y產生，Poly IC可以刺激細胞毒性細胞因子的釋放，可以提高各種免疫造血細胞的數量和破壞瘤的活性。本發明的載體的polylC可以由RNA鏈組成，所述RNA鏈各自包含至少22個、優選的至少85個核糖核苷酸。在某些實施方式中，每條鏈具有100-300範圍內的核糖核苷酸數量。能夠將載體靶向過量表達EGFR的腫瘤細胞的EGFR-結合肽或多肽可以是多肽，例如， EGF本身。在某些實施方式中，EGFR-結合肽是EGFR的肽配體，例如，分離自噬菌體文庫的序列YHWYGYTPQNVI的12_mer肽GE11，其是合成的並顯示了與EGF競爭性結合EGFR(Li et al.，2005 ；Song et al.，2008)。dsRNA優選地與載體的靶向部分非共價締合。這方便於在到達目標細胞/組織以及它在腫瘤細胞/組織中內在化之後dsRNA從目標部分的解離，引起將免疫細胞吸引到腫瘤位置的趨化因子的產生。polylC與靶向分子的非共價的締合優選地通過核酸載運體來實現，所述核酸載運體與dsRNA分子和靶向部分兩者締合。核酸載運體可以包含聚陽離子聚合物和/或非離子的水溶性聚合物。可以用作核酸載運體的聚陽離子聚合物包括聚-L-賴氨酸，或優選的，聚乙烯亞胺(PEI)。PEI是一種聚陽離子聚合物，由於雙鏈RNA分子的聚陰離子特性，具有與雙鏈RNA分子非共價地締合的能力，從而中和dsRNA分子的負靜電電荷，並因此抵抗dsRNA與陰離子分子化學反應的任何傾向。聚乙烯亞胺在用多核苷酸轉染細胞中的運用是本領域公知的；然而，在它的傳統用途中，聚乙烯亞胺攜帶dsRNA到細胞膜，附著在膜上，經歷內體攝取，以及隨後在內體膜降解時dsRNA的細胞質遞送。相比之下，在本發明中，dsRNA向癌細胞表面上EGFR受體的靶向和結合是dsRNA內在化的主要路線。在本發明中用作核酸載運體的非離子的水溶性聚合物優選地是聚(乙二醇) (PEG)，其是生物相容的、生物學惰性的，並且被廣泛地用於攜帶體內藥物。在某些優選的實施方式中，本發明中使用的dsRNA載運體包含聚乙烯亞胺(PEI) 和聚乙二醇(PEG)兩者，PEG共價連接到PEI。PEG為複合物賦予了極好的水溶性和組織分布，並提高了它的血清半衰期。PEI可以是分枝或線性的，具有選自約l_25kDa、約5_23kDa、約15_25kDa的分子量，PEG具有選自約0. 3-50kDa、約l_20kDa、約3_10kDa的分子量。在某些實施方式中，dsRNA 載運體包含25kDa的分枝的PEI。在某些優選的實施方式中，dsRNA載運體由與3，4kDa的 PEG共價連接的22kDa的線性PEI組成。載體的靶向部分，S卩，EGFR-結合肽或多肽優選地共價結合到PEI-PEG軛合物的 PEG部分，而polyIC非共價地與PEI部分締合，例如，通過離子締合。在某些實施方式中，核酸載運體可以進一步包含能夠促進內體膜降解的化合物， 從而便於dsRNA分子從目標細胞/組織內體向細胞質內的釋放，此時dsRNA最佳地介導細胞毒性。在某些實施方式中，這種化合物是蜂毒素或蜂毒素衍生物，其優選地與dsRNA載運體的聚乙烯亞胺共價締合。根據本發明可以使用的EGFR-導航載體的實例包括，無限制地，在此稱為pIC/ MPPE 的載體(包含 polyIC/ 蜂毒素-分枝的 25kDa PEI-PEG-mEGF, Shir et al.，2006 和 WO 04/04M91 中描述的)以及新的載體pIC/PPE (包含 polyIC/線性 22kDa PEI-PEG-mEGF) 和 pIC/PPGEll (包含 polyIC/ 線性 22kDa PEI-PEG-肽 GEl 1)。因而，在某些實施方式中，本發明提供了新的EGFR-導航載體pIC/PPE以及pIC/ PPGE11，在此表示為第二代載體(相對於第一代載體，例如，W004/045491中描述的pIC/ MPPE)。第二代載體不包含蜂毒素，包含線性的PEI代替分枝的PEI。此外，在第二代載體之一中，重組的小鼠EGF(mEGF)用12-mer肽GFll替換。與第一代相比除了第二代載體的製備過程的簡化之外，本發明還發現，用線性PEI替代分枝PEI提供了殺傷癌細胞的更高的效力。這是相當令人驚訝的，因為在第二代載體中，在每個線性PEI分子上僅有一個EGF分子，相比之下第一代載體的分枝PEI上有幾個EGF，預期第二代載體對EGFR有更低的親和力。為了建立腫瘤，它必需避免免疫系統的消滅。許多癌症發展了抑制免疫監督的機制，甚至可以在存在識別癌症抗原的免疫淋巴細胞的情況下生長。這種局部抑制的機制是不清楚的，雖然已經檢查了許多理論。PolylC，一種有效的佐劑，以及幹擾素，一種強免疫激活物，可以很好地克服這種局部抑制作用，並且活化先存的癌症特異性免疫淋巴細胞，另外吸引和活化其他免疫細胞。我們早先顯示了(Shir et al.，2006)，用EGFR靶向的poly IC轉染的癌細胞分泌細胞因子Gro-α (生長調節癌基因-α)以及ΙΡ_10，其已知能夠吸引免疫細胞。然而不清楚的是，這些細胞因子是否以足夠的數量分泌，以實際地引起免疫細胞在癌細胞位置的積
累ο根據本發明已經發現的是，由靶向的PolyIC誘導的這些細胞因子將免疫細胞吸引到轉染的腫瘤，並且強烈地增強殺傷腫瘤細胞的效力。這誘導了顯著的協同效應，引起彌散性腫瘤的完全消除，即使當以EGFR靶向的poly IC的很低的總劑量在一定距離治療時 (見實施例6)。活化的免疫細胞強烈增強IFN- α導致的旁觀者效應(參見實施例4)，其將促進異質的癌症的殺傷。由於PolylC/MPPE被選擇性地靶向癌細胞，我們不預期發生顯著的全身性免疫毒性反應。注射到小鼠中的人類PBMC不誘導移植物抗宿主反應、而是誘導強的抗腫瘤反應的事實支持了這一假定。如上文中提及的，非靶向的PolyIC的腫瘤內或腫瘤周施用已經展現了在抗腫瘤免疫治療中是有效的(Fujimura et al.，2006)。這樣的治療僅限於局部的腫瘤。相比之下，EGFR靶向的PolyIC在治療不可能通過局部療法來治療的彌散性腫瘤方面是高效的。如本發明所教導的，EGFR靶向的PolyIC因而可以與幾種癌症免疫治療組合。這些癌症免疫治療包括癌症疫苗以及癌症靶向的(工程化的或提取的)T細胞。為了介導體內的抗腫瘤效應，癌症靶向的T細胞必需運送到腫瘤地點，從循環中外滲，然後介導效應物功能來引起癌細胞的破壞(Rosenberg，2008)。在腫瘤細胞中選擇性地被靶向的PolyIC強烈地誘導的IP-IO和Gro-α (表2，；3)將促進向腫瘤的運輸和外滲，而幹擾素將增強T細胞介導的癌症殺傷。此外，同種異體的免疫細胞移植來活化移植物抗腫瘤反應(Ciceri et al.，2007) 可以與在此所示的本發明的EGFR-導航載體組合。在本發明中外源的PBMC向PolylC/MPPE 治療的小鼠的注射(附圖5B，C)實際上類似於這樣的組合。移植的免疫細胞應賦予比患者自己的免疫細胞更強的抗腫瘤效應。與本發明的EGFR-導航載體組合使用的免疫細胞的實例有腫瘤浸潤性T細胞 (TILs)，腫瘤特異性的工程化T細胞或外周血單核細胞(PBMC)。工程化的T細胞是被遺傳地重新編程或「重新指導」以表達腫瘤反應性T細胞受體(TCR)或嵌合TCR分子的細胞，其展現了抗體樣腫瘤識別能力，稱為「T-體」。T-體方法組合了抗體識別和T細胞效應物功能。它基於表達嵌合受體的T細胞，所述嵌合受體由連接到淋巴細胞觸發分子的、作為它們的細胞外識別元件的抗體衍生的Fv或scFv。不同於抗體，T細胞非常適合於穿透和破壞實體腫瘤。免疫細胞可以伴隨載體來施用，但優選地所述載體和免疫細胞連續地施用。在某些優選的實施方式中，載體首先全身地施用，隨後以期望的時間間隔施用免疫細胞。重要地，載體和免疫細胞在殺傷腫瘤細胞方面展現了協同作用。鑑於本發明的載體與PBMC組合在小鼠中獲得的實驗結果，這種組合的治療可能是有益的，產生了在具有功能性免疫系統的癌症患者中的完全治癒。
因而，在此我們首次展現了在SCID小鼠中消滅彌散性過量表達EGFR的腫瘤的策略，所述小鼠的免疫系統已經用人類外周血淋巴細胞(PBMC)重構。蜂毒素-聚乙烯亞胺-聚乙二醇_EGF(PolyIC/MPPE)靜脈內遞送4天，隨後在第五天4百萬PBMC的一次腹膜內注射，誘導了帶有預先建立的彌散性過量表達EGFR腫瘤的SCID-NOD小鼠中的完全治癒， 沒有不良副作用。免疫細胞和它們產生的細胞因子可以局限於治療的動物的腫瘤位點。治療停止後十二個月，治療的小鼠仍然是無癌症的和健康的。我們在此步展現了由於內在化的polyIC所產生的趨化因子，免疫系統導航向腫瘤的位置，表明裝載polyIC的ETOR-導航載體可以動員免疫系統來治療以及可能治癒帶有彌散性過量表達EGFR的腫瘤的患者。本發明的組合EGFR-導航載體/免疫細胞可以用於特徵在於EGFR的表達的癌症的治療。在此使用的術語「表達」應當理解為還包括術語「過量表達」，其在性質上是相對的術語，在本領域中常常通過測量與正常細胞上存在的受體數量相比較的癌細胞上存在的受體的相對的基因擴增或數量來評估，例如在表1中示出的。因而，過量表達可以定義為如通過螢光原位雜交(FISH)測定的、EGFR基因的兩倍或更高的擴增，或在免疫組織化學(IHC) 分析中使用抗EGFR抗體的陽性(1+、2+或3+)染色。本領域中測定過量表達的其他指標有用特異性抗體標記的細胞膜的部分；因而EGFR的過量表達可以定義為至少的膜染色以及1+強度，或至少10%的膜染色。此外，細胞可以分類為不表達或具有不可檢測水平的 EGFR的細胞，表達低水平EGFR(約1000到約100，00個受體/細胞)、中水平的EGFR(約 10，000到約100，000個受體/細胞)的細胞，以及表達高水平EGFR的細胞(約1 X IO6或更多個受體/細胞)。因此，對使用本發明的組合的治療敏感的癌症是特徵在於EGFR基因的兩倍或更高擴增的、陽性(1+、2+或3+)1此分析、至少或至少10%膜染色、中水平的 EGFR，以及優選的特徵在於高水平EGFR的癌細胞，的癌。在此使用的術語「治療癌症」是指癌細胞生長的抑制。優選的，這樣的治療還引起腫瘤生長的退化，即，腫瘤的大小的降低或完全衰退。在優選的實施方式中，該術語是指彌散性腫瘤，即，轉移的治療和緩解或完全治癒。術語「腫瘤」和「癌症」在此可互換地使用。特別地，本發明的組合在過量表達EGFR 的癌症的治療中是有用的，所述癌症選自非小細胞肺癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其轉移。表1.各種臨床研究中HER1/EGFR過量表達/擴增的流行率。
權利要求
1.一種表皮生長因子受體(EGFR)導航載體，其包含帶有EGFR-結合肽或多肽的雙鏈 RNA (dsRNA)分子，與免疫細胞組合用於特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的治療。
2.權利要求1的EGFR-導航載體，其中所述dsRNA分子由每條鏈中具有至少22個核糖核苷酸的聚肌苷酸鏈和聚胞苷酸鏈(poly IC)組成。
3.權利要求2的EGFR-導航載體，其中所述polyIC在每條鏈中具有85-300個核糖核苷酸。
4.權利要求1到3的任一項的EGFR-導航載體，進一步包含dsRNA載運體。
5.權利要求4的EGFR-導航載體，其中所述dsRNA分子非共價附著於所述dsRNA載運體上。
6.權利要求4的EGFR-導航載體，其中所述dsRNA載運體是聚陽離子聚合物和/或非離子的水溶性聚合物。
7.權利要求6的EGFR-導航載體，其中所述聚陽離子聚合物是聚乙烯亞胺或聚-L-賴氨酸，所述非離子的水溶性聚合物是聚(乙二醇)(PEG)。
8.權利要求5的EGFR-導航載體，其中所述dsRNA載運體是共價附著於PEG的聚乙烯亞胺。
9.權利要求4的EGFR-導航載體，其中所述EGFR-結合肽或多肽共價附著於所述dsRNA 載運體。
10.權利要求4的EGFR-導航載體，其中所述EGFR-結合多肽是EGF。
11.權利要求4的EGFR-導航載體，其中所述EGFR-結合肽是序列YHWYGYTPQNVI的肽 GEl 1。
12.權利要求4的EGFR-導航載體，進一步包含能夠促進內體膜的降解的化合物。
13.權利要求12的EGFR-導航載體，其中所述化合物是蜂毒素。
14.權利要求4的EGFR-導航載體，選自載體polyIC/蜂毒素-分枝的聚乙烯亞胺-聚乙二醇-mEGF(pIC/MPPE)、polyIC/ 線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇 _mEGF(pIC/PPE)和 polyIC/ 線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-肽GEll (pIC/PPGEll)。
15.權利要求1到14的任一項的EGFR-導航載體，其中所述免疫細胞是腫瘤浸潤性T 細胞(T-TIL)、腫瘤特異性工程化的T細胞或外周血單核細胞(PBMC)。
16.權利要求15的EGFR-導航載體，其中所述載體和所述免疫細胞連續地施用。
17.權利要求1的載體，其中所述癌症是非小細胞肺癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其轉移。
18.一種治療特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用以下的組合(i)包含帶有EGFR-結合肽或多肽的dsRNA分子的EGFR-導航載體，所述EGFR-結合肽或多肽能夠將所述載體靶向過量表達EGFR的腫瘤細胞；以及(ii) 免疫細胞。
19.權利要求18的方法，其中所述癌症是非小細胞肺癌、乳腺癌、成膠質細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌以及其轉移。
20.一種用於全身性施用的藥物組合物，其包含藥學上可接受的載運體和EGFR-導航載體，所述載體包含帶有EGFR-結合多肽的雙鏈dsRNA分子。
21.一種治療特徵在於過量表達EGFR的細胞的癌症的方法，所述方法包括向需要的患者全身地施用有效量的EGFR-導航載體，所述載體包含帶有EGFR-結合多肽的雙鏈dsRNA 分子。
22.權利要求20的藥物組合物或權利要求21的方法，其中所述載體選自載體polyIC/ 蜂毒素-分枝的聚乙烯亞胺-聚乙二醇-mEGF (pIC/MPPE)、polyIC/線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-mEGF (pIC/PPE)和polyIC/線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-肽GEll (pIC/PPGEll)。
23.選自polyIC/線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-mEGF(pIC/PPE)或polyIC/線性聚乙烯亞胺-聚乙二醇-肽GEll (pIC/PPGEll)的EGFR-導航載體。
全文摘要
公開了一種表皮生長因子受體(EGFR)-導航載體，其包含帶有EGFR-結合肽或多肽的雙鏈RNA(dsRNA)分子，與免疫細胞組合用於過量表達EGFR的癌症的治療。
文檔編號C12N15/117GK102325794SQ200980157255
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月22日 優先權日2008年12月22日
發明者席爾 A., 萊維茨基 A. 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司