細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用的製作方法

2023-06-03 19:30:01

細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用，本發明還公開了一種細菌菌蛻的大規模發酵方法。本發明的有益效果主要體現在：本發明提供了細菌菌蛻的大規模製備方法，為菌蛻疫苗的商品化生產奠定了堅實的基礎；此外，本發明系統性的評價了菌蛻的佐劑功能，結果表明菌蛻能極大的提高病毒性疫苗的免疫效力，而且菌蛻作為佐劑使用方法簡單，可一定程度的降低疫苗的生產成本，對人類和動物病毒性傳染病的防控具有重大意義。
【專利說明】細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及細菌菌蛻的規模化發酵製備方法與菌蛻作為佐劑在病毒性疫苗中的 應用。本發明屬於基因工程與免疫學【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 細菌菌蛻（bacterial ghost，BG)是在革蘭氏陰性菌中通過控制PhiX174噬菌體 的裂解蛋白E的表達使宿主菌發生裂解而產生的細胞空殼。E蛋白介導的溶菌通道大小受 細胞個體差異影響，孔徑介於40nm到200nm之間。通道一旦形成，細菌胞漿內容物在內外 滲透壓的作用下通過通道流出胞外，形成一個完成的細菌空殼。E蛋白介導的溶菌作用已成 功應用於各種大腸桿菌、沙門氏菌、胸膜肺炎放線桿菌、肺炎克雷伯氏菌、幽門螺旋桿菌、霍 亂弧菌、流感嗜血桿菌、巴氏桿菌等。範圍如此之大說明E蛋白介導的溶菌可能會在所有革 蘭氏陰性菌中發生。
[0003] 菌蛻本身可以作為一種很好的疫苗。其外殼結構沒有被破壞，保留與活菌一樣的 胞膜結構和相關抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫細胞通過模式識別受體識別的高度保守 結構 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、膚聚糖、CpG、OmpA、 菌毛等，能有效地被抗原遞呈細胞（APCs)吞噬、加工和遞呈。這也是菌蛻與常規滅活疫苗 相比的一個突出優勢。目前，菌蛻通過靜脈、皮下、氣體等途徑免疫已經在小鼠、兔子、豬等 動物模型中取得了良好的免疫保護效果。用胸膜肺炎放線桿菌菌蛻經氣體免疫接種豬，誘 導了針對A. pleuropneumoniae引起的胸膜肺炎的完全保護。霍亂弧菌菌脫經皮下注射小 鼠誘導血清產生高水平的抗霍亂的抗體並且足以保護新生小鼠免遭霍亂弧菌的感染。另 夕卜，菌蛻又是完美的載體，可以接收大量的外源物質。重組蛋白可通過特定的膜錨定結構插 入細胞膜，或填充於胞周間隙和細胞空腔中，以獲得重組菌蛻多價苗和多聯苗。
[0004] 菌蛻生產簡單，發酵後可用離心重懸的方法進行收集，並可以凍幹的形式保存於 室溫，無需像蛋白疫苗那樣複雜的純化工作。理想的菌蛻不含胞漿、核酸等內容物，因此不 存在毒力增強的問題，使用安全，對環境無汙染。
[0005] 理想的佐劑是以最小的免疫刺激可引起適當的免疫促進作用，且無不良反應。鋁 鹽佐劑是目前獸用疫苗和人用疫苗上應用最廣泛的佐劑，已大量應用於細菌、病毒等病原 微生物疫苗，雖然該佐劑在提高抗體水平和安全方面已獲得長期的實踐證實，但存在許多 不足之處：不能凍幹；批次之間差異大；與許多重組或合成的多肽疫苗抗原共同免疫時未 能激發有效的免疫應答，使之很難滿足新型疫苗發展的需要。通常而言，油/水乳劑型佐 劑以注射投遞途徑為主，包括M F59、QS21、A S02以及Montanide等水包油或油包水型佐 齊U，這類佐劑通過肌肉或皮下注射接種來增強疫苗抗原的免疫原性。此外，機體內源性細胞 因子如IL-2、IL-12、GM-CSF等，也可作新型疫苗佐劑，主要通過注射途徑進行接種，所引發 的免疫應答類型與油/水乳劑型佐劑相似。但此類佐劑大都成本較高。目前，單純的黏膜 途徑型佐劑較少，主要以大腸桿菌LT毒素及其突變體為主，誘導以黏膜免疫為主的應答反 應，分泌特異性slgA，也可產生系統性免疫應答，但強度較注射途徑弱。這類佐劑較黏膜途 徑投遞相對安全，即便佐劑存在一定毒性，但在有效劑量時進行黏膜投遞仍較為安全，而且 還具有投遞簡便，無創傷等顯著優點。具備註射和黏膜兩種免疫途徑的新型疫苗佐劑受到 青睞。在不同的免疫途徑下，這類佐劑既可誘導出系統免疫應答，也可產生黏膜免疫效果， 既有體液免疫也有細胞免疫。由於菌蛻擁有完好的天然的細菌外殼結構，能同時激發體液 和細胞免疫應答。其菌毛、纖毛等表面黏附結構使之能靶向黏附在特異性的組織，如胃腸道 和呼吸道的黏膜表面，容易被機體吞噬細胞，如PP結（Peyer' s Patches)的M細胞識別捕 獲，因而可有效遞送疫苗抗原至黏膜表面和誘發相關黏膜免疫應答。
[0006] 目前，國內外研究者關注的焦點是菌蛻作為一種新型疫苗用於預防細菌感染。而 系統性的評價菌蛻的佐劑功能並將其作為佐劑應用於病毒性疫苗的免疫尚未見相關報導。 另外，本發明克服了以往菌蛻製備規模小的瓶頸問題，利用發酵罐大量地製備了沙門氏菌 菌蛻，實現了菌蛻的規模化生產。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的之一是提供細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用。
[0008] 其中，所述的細菌菌蛻的佐劑功能主要體現在其能特異性提高病毒疫苗的免疫效 力、提高病毒疫苗的抗體持續期以及病毒疫苗的保護率。
[0009] 在本發明中，所述的菌蛻來自多種細菌，優選地來自沙門氏菌菌株。所述的細菌菌 蛻可經皮下、口、局部、黏膜、肺和/或鼻施用。
[0010] 本發明的目的之二是提供一種細菌菌蛻的規模化製備方法，包括以下步驟：
[0011] (1)構建含有打孔質粒PBV-E的細菌，其中所述的打孔質粒pBV-E是通過將 PhiX174噬菌體的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220質粒中得到的；
[0012] (2)將含羧苄青黴素的LB瓊脂板上的含有打孔質粒PBV-E的細菌單克隆轉接到 含羧苄青黴素的LB液體培養基中，37°C 200rpm振蕩培養10-14小時，作為一級種子液；按 5% (v/v)接種量，將一級種子液轉接到含羧苄青黴素的LB液體培養基中，37°C 200rpm培 養6小時，作為二級種子液；向發酵罐中加入LB液體培養基進行原位滅菌；按5% (v/v)接 種量，取二級種子液轉接到發酵罐中同時加入羧苄青黴素進行發酵；通過程序化控制誘導 前發酵條件：37°C、200rpm、10L空氣/分鐘，將細菌培養至0D600 = 0· 75?L 0 ;
[0013] (3)升溫至42°C誘導E蛋白表達，在誘導2. 5小時的時間點，加入終濃度 150-200 μ g/ml的氯黴素；誘導全程時間為4小時；
[0014] (4)收集菌體，70_90°C處理，凍幹。
[0015] 其中，優選的，PhiX174噬菌體的裂解蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示。其中，優選的，各步驟中羧苄青黴素的濃度均為100 μ g/ml。
[0016] 其中，優選的，所述的細菌為沙門氏菌菌株，在本發明的一個具體實施例中，所述 的沙門氏菌菌株為沙門氏菌Sm6。
[0017] 將未加佐劑的新城疫滅活苗半成品與所述菌蛻混合，對SPF雞進行免疫。將未加 佐劑的禽流感滅活疫苗半成品與所述菌蛻混合，對SPF雞進行免疫。將未加佐劑的2型豬 圓環病毒疫苗半成品與所述菌蛻混合，對豬進行免疫。同時設不添加菌蛻的疫苗作為對照， 結果發現，相較於未添加菌蛻的疫苗，添加菌蛻作為佐劑的疫苗能特異性提高病毒疫苗的 免疫效力、提高病毒疫苗的抗體持續期，並最終提高病毒疫苗的保護率。
[0018] 本發明的有益效果主要體現在：
[0019] 1、本發明提供了細菌菌蛻的大規模製備方法，為菌蛻疫苗的商品化生產奠定了堅 實的基礎；
[0020] 2、系統性的評價了菌蛻的佐劑功能，菌蛻能極大的提高病毒性疫苗的免疫效力， 而且菌蛻作為佐劑使用方法簡單，可一定程度的降低疫苗的生產成本，對人類和動物病毒 性傳染病的防控具有重大意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為pBV_E/Sm6的裂解曲線圖；
[0022] 圖2為Sm6菌蛻掃描電鏡圖；
[0023] 圖3為新城疫血凝抑制抗體效價檢測結果；
[0024] 圖4為新城疫HI抗體持續期檢測結果；
[0025] 圖5為禽流感HI抗體持續期檢測結果。

【具體實施方式】
[0026] 下面通過實驗並結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例 僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。
[0027] 實施例1 :腸炎沙門氏菌菌蛻的規模化製備與鑑定
[0028] (1)含有打孔質粒pBV-E的腸炎沙門氏菌Sm6的構建
[0029] 根據GenBank中噬菌體PhiX174裂解基因 E設計引物：
[0030] Lysise-U(5,-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3'）
[0031] Lysise-L (5,-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3,）
[0032] 上、下遊引物5'端分別引入了 EcoR I和BamH I限制性酶切位點，由 Invitrogen (上海）公司合成。以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴增裂解基因 E，其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR擴增反應體系為50 μ L，其中：滅菌的去離子水22 μ L， PrimeSTAR MAX Premix (2 X) 25 μ L ;10μ M 的上下遊引物各1 μ L ;PhiX174雙鏈DNAl μ L (含 12.5ng DNA)。擴增的循環參數為：1)94°C 20s，55°C 10s，72°C 20s，30 個循環；2)72°C 5min。PCR產物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收E基因片段。採用 BamH I和EcoR I對E基因片段和pBV-220質粒分別進行雙酶切，酶切反應體系如下：E基 因或pBV-220質粒15μ L ;BamH I 2μ L ;EcoR I 2μ L ;10XThermo Scientific FastDigest buffer 5 μ L ;滅菌去離子水26 μ L，總體積50 μ L，37°C水浴lh，膠回收E基因片段及線性 pBV-220 載體。
[0033] 沙門氏菌菌種Sm6系由本研究室自發病雞群分離得到。以無菌接種環取凍存的於 普通LB平板劃線，同時在含氨苄青黴素（Amp)的LB平板劃線做對照，37°C溫箱培養過夜。 次日挑取生長良好的單個菌落接種於5mL LB液體培養基中37°C振搖培養過夜。取ImL活 化後的培養液加到IOOmL LB液體培養基中，37°C振搖培養2. 5-3h使OD6tltlmi達到0. 4左右。 在無菌條件下將細菌培養物倒入滅菌後冰預冷的離心管中，冰浴l〇min，4°C 1600rpm離心 lOmin，盡棄上清。用IOmL冰預冷的0. IM CaCl2溫和懸起細菌沉澱，冰浴放置30min。4°C IlOOrpm離心IOmin後盡棄上清。以4mL冰預冷的0. IM CaCl2溶液再次重懸沉澱，加入終 濃度為15%的滅菌甘油混勻後分裝為200 μ 1/管,置於冰塊中,加入預冷的連接產物10 μ L 於感受態細胞中。在冰塊中冰浴30min，再置42°C熱休克90s，熱休克後立即冰浴2min，再 加入事先預熱到37°C無抗生素的100 μ L LB培養液，37°C搖動培養lh，之後3500rpm離心 3min，棄去多餘上清，剩餘100 μ L，混勻菌體，取100 μ L均勻塗布於含50 μ g/mL氨節青黴素 的LB平板上，37°C培養12?16h。隨機挑取菌落，接種於5mL含50 μ g/mL氨節青黴素的 LB培養基中過夜培養，採用鹼裂解法小量提取質粒DNA，分別用PCR和雙酶切進行鑑定，所 得陽性克隆，即為pBV-E/Sm6。
[0034] (2)菌蛻的發酵
[0035] 將LB瓊脂板（含100 μ g/ml羧苄青黴素）上的含有打孔質粒pBV-E的腸炎沙門 氏菌Sm6單克隆轉接到含IOml LB液體培養基（含100 μ g/ml羧苄青黴素）的IOOml三角 瓶中，37°C 200rpm振蕩培養過夜（10-14小時），作為一級種子液。按5% (v/v)接種量，將 一級種子液轉接到含150ml LB液體培養基（含100 μ g/ml羧苄青黴素）的500ml錐形瓶， 37°C 200rpm培養6小時，作為二級種子液。向15-L發酵罐（BIOSTAT C-15, Sartorius， Germany)中加入IOL pH7. 2的LB液體培養基進行原位滅菌。按5% (v/v)接種量，取二級 種子液轉接到發酵罐中同時加入羧苄青黴素至終濃度1〇〇μ g/ml進行發酵。存檔以下參 數：溫度、流動、攪拌子、？11、？02。通過程序化控制誘導前發酵條件（371：、200印111、1(^空氣 /分鐘）將細菌培養至對數生長期（0D600 = 0. 75?1. 0)。升溫至42°C誘導E蛋白表達， 在誘導2. 5小時的時間點，加入終濃度170 μ g/ml的氯黴素；誘導全程時間為4小時。誘導 前與誘導期間每隔〇. 5小時取IOml發酵樣品，檢測光密度值，直至光密度不再降低，將樣品 塗布LB平板於37°C培養12小時，菌落計數法計算菌蛻濃度。4°C 80000Xg離心10分鐘 收集菌體，用pH7. 0的PBS洗滌沉澱兩次，將沉澱於70-90°C處理3分鐘。按最後凍幹所需 的菌蛻濃度，加入相應體積的PBS或凍幹保護劑（明膠-蔗糖或脫脂乳），分裝於5ml疫苗 瓶，每瓶Iml (含菌蛻5 X IOltlCfu)，使用VirTis GENESIS凍幹機將樣品凍幹48小時。保存 於-20。。。
[0036] (3)裂解曲線繪製與裂解效率測定
[0037] 發酵誘導前與誘導期間每隔0. 5小時取IOml發酵樣品，檢測光密度值，直至光密 度不再降低，將樣品塗布LB平板於37°C培養12小時，菌落計數法計算裂解效率。
[0038] 實驗結果：菌落計數表明，含打孔質粒pBV-E的腸炎沙門氏菌Sm6在誘導後1小時 已經開始溶菌，4小時可充分裂解（圖1)，裂解效率達到99. 999%
[0039] (4)菌蛻的掃描電鏡觀察與菌蛻的活菌檢測
[0040] 取凍幹前的菌蛻，3%戊二醛重懸，4°C固定過夜，乙醇逐級脫水，乙酸戊二酯置換， 乾燥後噴金，掃描電鏡觀察。實驗結果如圖2,絕大多數細菌菌體呈現空泡狀結構，形態完 整，並可見200nm左右的溶菌孔道。
[0041] 取凍幹前與凍幹後的菌蛻原液，塗布LB平板於37°C培養12小時，結果平板上無菌 落出現，表明所製備的菌蛻無活菌存在。
[0042] 實施例2菌蛻作為新城疫疫苗免疫佐劑的效果
[0043] 雞新城疫油乳劑滅活苗與未加佐劑的新城疫滅活苗半成品為哈爾濱維科生物技 術開發公司生產。腸炎沙門氏菌菌脫按實施例1方法製備。
[0044] (1)皮下免疫途徑檢測菌蛻的佐劑效果
[0045] 1)分組處理
[0046] 7日齡SPF X鳥共60隻，隨機分為4組，每組15隻，即試驗I組（X鳥新城疫油乳齊IJ 滅活苗組，頸部皮下免疫，〇. 3ml/只）、試驗II組（菌蛻疫苗佐劑組，新城疫滅活苗半成品 與菌蛻混合比例為1:2 (體積比），菌蛻為5 X IO9Cfu,頸部皮下免疫，0. 3ml/只）、試驗III組 (LPS佐劑組，新城疫滅活苗與100 μ g/ml LPS 1:1混合，頸部皮下免疫，0. 3ml/只）和對照 組（PBS，頸部皮下免疫，0. 3ml/只）。首次免疫日記為第0天，共免疫2次，每次免疫間隔兩 周。二免一周（第21天）後對試驗雞隻進行滴鼻，點眼，攻新城疫強毒株，每隻雞的攻毒劑 量為IO 5EID5tl。攻毒後每日觀察其臨床症狀，觀察15天。計算疫苗的保護率。
[0047] 2)病毒血凝抑制抗體效價與持續期檢測
[0048] 於一免二周（第14天）和二免一周（第21天）翅靜脈採血，進行血凝（HA)與血 凝抑制（HI)試驗。
[0049] HA試驗：取96孔"V"形微量反應板，自左至右各孔加50 μ L PBS，於左側第1孔加 50 μ L NDV雞胚尿囊液，混勻後，吸50 μ L至第2孔，反覆吹打數次後，依次稀釋至第11孔， 吸棄去50 μ L，經倍比稀釋，雞胚尿囊液的稀釋倍數為21-211，第12孔不加雞胚尿囊液，作 為對照，然後自左至右向各孔加1 %雞紅細胞懸液50 μ L，振蕩混勻，37°C靜置25min，觀察 結果，以試驗排中能使等量紅細胞發生完全凝集的最高稀釋倍數作為雞胚尿囊液中NDV的 血凝價（HAU)，用log2表示。
[0050] HI試驗：按HA試驗測出的NDV血凝價除以4即為4單位HAU，按照稀釋倍數配製4 單位NDV液。並進行血凝實驗，驗證4單位抗原，取96孔"V"形微量反應板，自左至右1-10 孔各加50 μ LPBS，11和12孔分別加4單位NDV液和血清對照；第1孔加入50 μ L待檢血 清，反覆吹吸混勻後，取50 μ L至第2孔混勻，依次稀釋至第10孔，吸棄50 μ L，經倍比稀釋， 血清的稀釋倍數為2^21° ;自第1至第10孔各加50 μ L 4單位NDV液，第12孔加50 μ L血 清，震蕩混勻，置37°C溫箱作用20min ;自第1至第12孔各加1 %雞紅細胞50 μ L，震蕩混 勻，37°C靜置20min，以完全抑制凝集的血清最高稀釋倍數作為HI滴度，用log2表示。
[0051] 血凝抑制結果表明：試驗I組與試驗II組均能增強特異的病毒血凝抑制抗體的效 價，且高於試驗III組（圖3)。
[0052] 二免一周後每周進行翅靜脈採血，進行血凝抑制試驗。結果表明：直到二免十二周 (第112天），兩個實驗組都可以保持較高的血凝抑制價效價（圖4)。
[0053] 3)新城疫攻毒後各組的保護情況和排毒情況
[0054] 攻毒後，對照組的雞出現眼觀症狀：頭頸向後或一側扭轉，眼半開或全閉，冠漸變 暗紅色，嗉囊內充滿液體內容物，倒提時會出現大量酸臭液體流出；從第5天開始死亡，第 10天全部死亡，剖檢可見喉頭、氣管、小腸漿膜黏膜出血，腺胃乳頭腫脹、出血。試驗III組於 第10天有兩隻雞跛行，到15天沒有死亡。試驗I組、試驗II組的雞無眼觀症狀，對強毒的 攻擊可以達到100 %保護。
[0055] 攻毒後每日觀察SPF雞的健康狀況，並在攻毒後第3d、第5d、第7d採集SPF雞的咽 部拭子和洩殖腔拭子，置於含50%甘油的PBS(含青黴素、鏈黴素）中，樣品液4°C 2000Xg 離心10分鐘，取上清以200 μ L/枚的接種劑量接種於9日齡SPF雞胚，棄掉24小時內死亡 的雞胚，72小時後收取雞胚尿囊液，通過HA試驗檢測判定SPF雞是否排毒。實驗結果表明： 在攻毒後第3d，試驗I組和試驗III組的咽喉拭子和洩殖腔拭子均檢測到排毒，而試驗II組 在洩殖腔拭子中未檢測到排毒。至第l〇d，試驗I組、試驗II組在咽喉和洩殖腔均檢測不到 排毒，結果如下表1所示。
[0056] 表1新城疫攻毒後的病毒分離結果與病死率
[0057]

【權利要求】
1. 細菌菌蛻在製備病毒性疫苗佐劑中的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細菌菌蛻能特異性提高病毒疫苗的免 疫效力。
3. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細菌菌蛻能提高病毒疫苗的抗體持續 期。
4. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細菌菌蛻能提高病毒疫苗的保護率。
5. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細菌菌蛻來自多種細菌，優選地來自 沙門氏菌菌株。
6. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細菌菌蛻經皮下、口、局部、黏膜、肺和 /或鼻施用。
7. -種細菌菌蛻的大規模發酵方法，其特徵在於包括以下步驟： (1) 構建含有打孔質粒PBV-E的細菌，其中所述的打孔質粒pBV-E是通過將PhiX174噬 菌體的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220質粒中得到的； (2) 將含羧苄青黴素的LB瓊脂板上的含有打孔質粒pBV-E的細菌單克隆轉接到含羧苄 青黴素的LB液體培養基中，37°C 200rpm振蕩培養10-14小時，作為一級種子液；按5% (v/ v)接種量，將一級種子液轉接到含羧苄青黴素的LB液體培養基中，37°C 200rpm培養6小 時，作為二級種子液；向發酵罐中加入LB液體培養基進行原位滅菌；按5% (v/v)接種量， 取二級種子液轉接到發酵罐中同時加入羧苄青黴素進行發酵；通過程序化控制誘導前發酵 條件：37°C、200rpm、10L空氣/分鐘，將細菌培養至0D600 = 0? 75?1. 0 ; (3) 升溫至42°C誘導E蛋白表達，在誘導2. 5小時的時間點，加入終濃度150-200 y g/ ml的氯黴素；誘導全程時間為4小時； (4) 收集菌體，70-90°C處理，凍幹。
8. 如權利要求7所述的發酵方法，其特徵在於PhiX174噬菌體的裂解蛋白E基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
9. 如權利要求7所述的發酵方法，其特徵在於各步驟中羧苄青黴素的濃度均為 100 u g/ml〇
10. 如權利要求7所述的發酵方法，其特徵在於所述的細菌為沙門氏菌菌株。
【文檔編號】C12N1/21GK104353072SQ201410531678
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優先權日:2014年10月10日
【發明者】劉思國, 於申業, 司微, 危豔武, 陳利蘋 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所