Luterial和用於其分離及培養的方法與流程

2023-06-03 02:54:08 3

本發明涉及作為源自體液的線粒體樣未鑑定的納米大小的顆粒的Luterial且涉及用於分離及培養它的方法。

背景技術：

血液中的微物質如微泡之前認為是不具有特定功能的物質。然而，多項實驗數據已證明微泡也具有生物活性。例如，發現了源自血小板的微泡發揮功能以通過泡表面蛋白刺激一些細胞(CD154、RANTES和/或PF-4；Thromb.Haemost.(1999)82:794；J.Boil.Chem.(1999)274:7545)，且報導了血小板微泡中的生理活性脂質(例如HTET或花生四烯酸)對某些靶細胞具有一定的作用(J.Biol.Chem.(2001)276；19672；Cardiovasc.Res.(2001)49(5):88)。因此，由於存在於生物樣品中的物質如泡的特徵(例如大小、表面抗原、細胞來源的確定、有效載荷(payload))可提供診斷、預後或治療診斷讀出，對於鑑定可用於檢測和治療疾病的生物標記物仍存在需求。因此，已有嘗試來使用RNA和其他與泡相關的生物標記物以及泡的特徵以提供診斷、預後或治療診斷(參見WO 2011/127219)。

同時，癌症是其中細胞異常生長以幹擾正常細胞功能的疾病，且其通常的實例包括肺癌、胃癌(GC)、乳腺癌(BRC)、直腸結腸癌(CRC)等，但癌症其實可發生於任何組織中。過去，癌症的診斷以通過癌細胞生長引起的生物組織的外部變化為基礎，但近年來，已有嘗試使用血液、生物組織或細胞中存在的痕量生物分子(乙二醇鏈、DNA等)實施診斷和檢測。然而，最常用的癌症診斷方法是使用通過活檢獲得的組織樣品或成像的診斷方法。然而活檢在患者中引起巨大的疼痛，價格昂貴且對於癌症診斷需要很長時間。此外，如果患者具有癌症，癌症可在活檢過程中轉移，且在組織樣品不能從其位點通過活檢獲得的情況中，存在疑似具有疾病的組織通過手術操作提取前不可能進行疾病的診斷的缺點。同時，在基於成像的診斷中，基於X射線成像、核磁共振(NMR)成像(採用具有附於其上的疾病靶向劑的成像劑)等診斷癌症。然而，該基於成像的診斷方法具有的缺點在於誤診可由於臨床醫師或解讀醫師的低技能而產生，且在於所述方法極大地依賴於成像裝置的精確性。此外，基於成像的診斷方法具有的缺點在於：難以在早期檢測疾病，因為甚至最精確的裝置不能檢測具有數mm或更小尺寸的腫瘤。此外，基於成像的方法具有的缺點在於：由於患者或疑似具有疾病的人暴露於用於成像的高能電磁波，其可引起基因突變，所述方法可引起另一種疾病，且在於通過成像診斷的次數是受限的。

換言之，對於癌症診斷的活檢是耗時、昂貴、不便的，且引起疼痛。由於此原因，對於能夠顯著減少非必需的活檢步驟次數的方法以及能夠在早期診斷癌症的方法存在需求。

在這種情況下，本發明的發明人發現了疾病可通過觀察在從患者排出的體液中存在的微物質的特徵而診斷和預測。該發現內容在2013年7月12日提交了專利申請(韓國專利申請號10-2013-0082060)。本發明的發明人將該未鑑定的納米大小的顆粒命名為"Luterial"。

然而，有效分離和培養微物質Luterial從而能夠進行臨床應用的技術尚不知曉。

因此，本發明的發明人開發了一種能夠有效分離存在於自患者或正常人排出的體液中的未鑑定的納米大小顆粒Luterial的方法，並表徵了通過該方法分離的Luterial，由此完成了本發明。

技術實現要素：

技術問題

本發明的目的是提供用於分離和培養在從患者或正常人排出的體液中存在的Luterial的方法。

本發明的另一目的是提供Luterial，其具有對應於原核生物和真核生物之間的中間體的那些的整合性特徵，顯示與Janus綠B、Mitotracker紅和羅丹明123的陽性螢光染色反應，是移動的，且具有產生ATP的能力。

技術方案

為實現上述目的，本發明提供了用於分離Luterial的方法，其包括步驟：分離血小板和具有大於來自血液的血小板的大小的源自血液的物質；離心去除血小板和具有大於血小板的大小的源自血液的物質後獲得的血液級分；通過收集離心後的上清分離Luterial；和(4)洗滌分離的Luterial。

本發明還提供用於分離Luterial的方法，其包括步驟：離心體液以提供上清，並將上清過濾通過具有2-5μm孔徑的過濾器，由此獲得經過濾的溶液；並離心經過濾的溶液以提供上清，且將上清過濾通過具有0.5-2μm孔徑的過濾器。

本發明還提供源自體液的Luterial，其具有一個或多個下列特徵：

(a)在螢光測試中其顯示與Janus綠B、吖啶橙和羅丹明123的陽性染色反應；

(b)在最適環境中(pH 7.2-7.4)，其表達源自β-變形菌和源自γ-變形菌的基因且具有30-800nm的大小；

(c)在酸性環境中，其不僅表達源自β-變形菌和源自γ-變形菌的基因，還表達源自真核鏈型植物(Streptophyta)基因，且生長至400nm至2000nm或更大的大小；

(d)在正常條件下參與ATP產生；

(e)其為完全不同於線粒體或外來體的細胞或細胞樣結構；

(f)其在正常狀態中為圓形或橢圓形，且源自患者的Luterial具有大於正常狀態的Luterial的大小(長軸直徑：800nm或更大)，且經突變以形成具有不均勻形態的突變體Luterial；

(g)其具有多重環樣膜且是粘附的；

(h)其可存在於細胞內或細胞外；

(i)其為移動的且經歷融合和/或分裂事件；

(j)在某些條件下突變體Luterial破裂且在破裂後具有乾性(stemness)；和

(k)其具有調節p53基因和端粒的功能。

本發明還提供用於培養Luterial的方法，其包括：將水添加至分離的源自體液的Luterial並在18-30℃的溫度在用IR光照射下培養所述Luterial。

本發明還提供含有Luterial作為活性成分的抗癌複合物。

附圖簡述

圖1顯示用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Zeiss)、透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡和共聚焦掃描儀(Leica TCS-SP8)成像的源自血液的未鑑定的納米大小顆粒Luterial的圖像。

圖2描述的圖像顯示具有多種大小的Luterial的形狀和形態：((a):39.6-49.0nm，用Mito-tracker紅染色後的超高解析度顯微鏡(SR-GSD)圖像；(b):50.1-85.1nm，用Mito-tracker紅染色後的超高解析度顯微鏡(SR-GSD)圖像；(c):76.5nm，透射電子顯微鏡圖像；(d):160nm，透射電子顯微鏡圖像；(e):170-230nm，透射電子顯微鏡圖像，多重膜結構；(f):234nm，用Janus綠B染色後的圖像；(g):250nm，原子力顯微鏡圖像；(h):361nm，透射電子顯微鏡圖像；(i):650.1nm，透射電子顯微鏡圖像；和(j):用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色後具有5μm或更大大小的Luterial的雷射掃描顯微鏡圖像。

圖3的圖像顯示用羅丹明123染色Luterial且隨後觀察Luterial是否陽性染色的結果。

圖4的圖像顯示用Mito-tracker染色Luterial且隨後觀察Luterial是否陽性染色的結果。

圖5的圖像顯示用吖啶橙染色Luterial且隨後觀察Luterial是否陽性染色的結果。

圖6的圖像顯示用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色Luterial且隨後觀察Luterial是否陽性染色的結果。

圖7描述的圖像顯示使用納米追蹤劑測量Luterial移動性的結果((a)測量前；(b)1秒後；(c)3秒後)。

圖8顯示正常Luterial的生命周期A和突變的Luterial的生命周期B。

圖9顯示突變的Luterial的生命周期和特徵。

圖10顯示從癌症患者體液分離的Luterial。具體地，圖10(a)顯示形成伸長的分支時源自癌症患者的Luterial，且圖10(b)顯示用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、Mito-tracker和羅丹明123染色的源自癌症患者的Luterial。

圖11顯示Luterial的生命周期。

圖12的圖像顯示測量Luterial和突變的Luterial的大小的結果。

圖13描述的圖像顯示用原子力顯微鏡探針刮擦Luterial並去除膜的結果。

圖14(a)和14(b)為融合狀態的突變Luterial的原子力顯微鏡圖像，且圖14(c)和14(d)顯示用懸臂剝離膜後由原子力顯微鏡成像突變的Luterial的結果。

圖15描述的圖像顯示用原子力顯微鏡探針刮擦Luterial且隨後通過DAPI染色圖像觀察DNA的結果。

圖16(a)顯示分析Luterial是否包含DNA的生物分析儀結果。

圖16(b)顯示qRT-PCR的結果，其指示DNA的GAPDH基因表達依賴於Luterial的大小而改變。

圖17顯示分析Luterial是否包含DNA的生物分析儀結果。

圖18顯示通過使用螢光素-螢光素酶反應和發光計在具有添加的不同Luterial的介質中測量ATP含量的結果(SSH:三星環；SSF:漆黃素(fisetin)；12h:實驗前在37℃激活12小時)。

圖19是顯示Luterial和外來體之間差異的圖。圖19中，外來體具有20-120nm的大小，不清晰的膜和相對淺的內部顏色，而Luterial具有50-800nm的大小和獨特的膜或經包裝的內部結構。

圖20描述的照片比較了Luterial、外來體和微泡間的形態。

圖21描述了本發明實施例中所述的Luterial文庫的透射電子顯微鏡(TEM)的圖像。

圖22描述了顯示由培養引起的Luterial大小改變的共聚焦雷射掃描顯微鏡的圖像。

圖23描述的圖像顯示通過培養引起的Luterial大小和形態改變。

圖24顯示Luterial DNA的細菌同源性百分比，如通過對源自健康人的血液(血液pH:7.2-7.4)的具有多種尺寸的Luterial的16S rRNA測序確定的((a):100nm或更小；(b):100-200nm；(c):200-400nm；(d):400-800nm)。

圖25顯示Luterial DNA的細菌同源性百分比，如通過對源自疲勞和疾病狀態的血液和精液(pH:7.0或更低)的具有多種尺寸的Luterial的16S rRNA測序確定的((a):100nm或更小；(b):100-200nm；(c):200-400nm；(d):400-800nm)。

圖26(a)、26(b)和26(c)顯示基於源自血液的Luterial的16S rRNA序列的進化樹。

圖27顯示用多種濃度的具有100-800nm大小的Luterial和商業可獲得的抗癌藥順鉑處理卵巢癌細胞系(SKOV3和A2780)後通過MTT測定法測量的細胞活力。

實施本發明的最佳模式

除非另外定義，本文使用的全部技術和科學術語與本發明所屬領域的技術人員所理解具有相同的含義。一般而言，將在下文描述的本文使用的命名法和實驗方法為本發明所述技術領域熟知且通常採用的那些。

如本文使用，由本發明的發明人命名的術語"Luterial"指存在於動物中的活生物體且意為具有與約800nm的病毒大小相似的大小的精細物質(在正常分裂階段50-800nm/在異常融合階段800nm或更大)。Luterial具有下列特徵：(1)其為具有對應於原核生物和真核生物之間的中間體的那些的整合性特徵的細胞或細胞樣結構；(2)其存在於體液(包括血液、精液、腸液、唾液、細胞流體等)中；(3)其在螢光染色測試中顯示用Janus綠B、吖啶橙和羅丹明123的陽性染色反應；(4)在最適環境中(pH 7.2-7.4)，其具有表達與β-變形菌和γ-變形菌同源的基因的性質且具有30-800nm的大小；(5)在酸性環境中，其不僅表達與β-變形菌和γ-變形菌同源的基因且還表達真核基因(特別是鏈型植物基因)，且生長至400nm至2000nm或更大的大小；(6)在正常條件下其參與ATP產生；和(7)其為不同於線粒體且完全不同於外來體的細胞或細胞樣結構。在哺乳動物(包括人)的情況中，Luterial存在於血液、唾液、淋巴管、精液、陰道流體、母乳(特別是初乳)、臍帶血、腦細胞、脊髓和骨髓。此外，在有角動物的情況中，Luterial還存在於角中。

正常的Luterial具有50-800nm的大小，且通過融合形成的突變體Luterial具有數十微米的大小。術語「Luterial」可指包含mRNA、miRNA和DNA的原線粒體(proto mitochondria)。Luterial的獨特之處在於其不溶於消化液且浸潤入血液。

預期Luterial不僅與信號轉導、細胞分化和細胞死亡密切相關，其還與細胞周期和細胞生長的調節密切相關。本發明的發明人已發現Luterial與癌症的診斷密切相關。

正常的Luterial預期發揮功能以預防癌細胞的生長並使細胞回復至健康的免疫狀態，且其功能通過起作用以標準化基因的RNAi(RNA幹擾)活性實施。當健康人或動物血液中的RNAi信息系統偏離正常狀態並指導以產生引起異常疾病的蛋白時，Luterial會故意幹擾信息系統從而抑制疾病如癌症的發展。當Luterial生長至200-500nm或更大的大小時，其也會參與能量代謝，且當用具有一定波長的光照射Luterial時，其會發揮功能以擴增光能量作為響應並將如葉綠體般發揮作用。因此，如果Luterial未實施正常功能，其可引起穩態平衡和ATP產生方面的嚴重病症且可引起呼吸和能量代謝兩者中的疾病。

不能實施如上文所述的正常功能的突變體Luterial顯示不同於正常Luterial的現象和特徵且具有多種尺寸和形狀。具體地，正常Luterial在其形成雙孢子後停止生長，但在癌症患者或具有慢性疾病的患者的血液中發現的突變體Luterial具有無限生長的特徵，與幹細胞相似，且因此具有600-800nm至200μm(200,000nm)或甚至更大的尺寸。此外，與病毒相似的是，Luterial顯示可進入紅細胞、白細胞、血小板等或在其內生長或與其他Luterial聚集的獨特的特徵。

因此，預期可通過觀察Luterial的形態學或生化特徵來診斷或治療疾病且由此確保了其在眾多應用中的廣泛用途。然而，分離自從動物(包括人)排出的體液的Luterial難以觀察，因為其在體外迅速解體或經歷形態變化。此外由於正常Luterial在24小時內於異常環境下變為突變體Luterial，這使其難以精確診斷或治療疾病。

在本發明中，存在於分離自患者或正常人體液中的未鑑定的納米大小顆粒Luterial通過兩種方法分離。

因此，一方面，本發明涉及分離來自體液的Luterial的方法。

根據本發明的第一種方法是用於從血液分離的Luterial的方法，其包括步驟：(1)分離血小板和具有大於來自血液的血小板的大小的源自血液的物質；(2)去除血小板和具有大於來自血液的血小板的大小的源自血液的物質後離心血液；(3)從離心所獲的上清分離Luterial；並(4)洗滌分離的Luterial。

步驟(1)可包括使血液通過具有0.8-1.2μm孔徑的過濾器並去除未過濾的物質的步驟。步驟(2)可包括以1,200-5,000rpm反覆離心血液5-10分鐘以去除一般的微泡如外來體並回收上清的步驟。步驟(3)可包括將可見光照射至通過離心所獲的上清並通過移液分離朝光聚集的移動的Luterial顆粒的步驟。步驟(1)中使用的血液可源自哺乳動物中的人。Luterial是自發螢光且移動的，且因此上清中的Luterial顆粒可在暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡下由可見光照射協助通過移液可見的Luterial而分離。步驟(3)中分離的Luterial可通過具有50nm孔徑的過濾器，且未過濾的部分可用PBS洗出用於Luterial的分離。因為Luterial具有50nm或更大的長軸直徑，小於Luterial的源自血液的物質可通過上述步驟去除。

根據本發明的第二方法是用於從體液如血液或精液分離Luterial的方法，其包括步驟：離心體液以提供上清，並將上清過濾通過具有2-5μm孔徑的過濾器，由此獲得經過濾的溶液；離心經過濾的溶液以提供上清，並將上清過濾通過具有0.5-2μm孔徑的過濾器。

具體地，第二方法可包括步驟：以2,000-4,000rpm離心體液5-30分鐘以提供上清，並將上清過濾通過具有2-5μm孔徑的過濾器；並以3,000-7,000rpm離心過濾的溶液5-20分鐘，隨後過濾通過具有0.5-2μm孔徑的過濾器。

第二方法可進一步包括將可見光照射至過濾的溶液並通過移液分離朝光聚集的移動的Luterial顆粒的步驟。本文中，Luterial是自發螢光且是移動的，且因此上清中的Luterial顆粒可通過用可見光照射可視化。分離的Luterial可通過具有50nm孔徑的過濾器，且未過濾的部分可用PBS洗出，由此獲得Luterial。由於Luterial具有50nm或更大的長軸直徑，小於Luterial的源自血液的物質可通過上述步驟去除。

由這兩種方法中的每一種分離的Luterial可通過暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察，且可通過順序使用200nm、400nm、600nm、800nm和1000nm過濾器根據大小分成50-200nm(發育期)/200-400nm(成熟期)/400-600nm(有絲分裂期)/600-800nm(超過有絲分裂期)。

在本發明中，表徵了分離的Luterial。

(1)形態學

發現正常的Luterial具有50-800nm的大小(圖2和12)，且在不存在異常融合的情況下生長至800nm的大小。源自患者的Luterial具有大於源自健康人Luterial的大小(800nm或更大的長軸直徑)，其經突變形成具有不均一形態的突變體Luterial，且當異常融合持續時生長至數千nm的大小。

此外，Luterial的形狀為圓形或橢圓形，且在SEM或TEM圖像中顯示多重環樣膜結構，但不具有內部嵴結構(圖1)。

(2)螢光染色

已知線粒體由Janus綠B和螢光染料(包括羅丹明123、Mitotracker、吖啶橙和DAPI)陽性染色，且發現Luterial還通過與用於線粒體的那些相同的染料染色。螢光圖像指示Luterial而非外來體在螢光染色測試中顯示與線粒體相似的反應且顯示自發螢光(圖2(a)、2(b)、2(f)和2(j)，和圖3-6)。

(3)性質

與外來體和微泡不同的是，Luterial是粘附和移動的且經歷了融合或分裂事件。發現突變體Luterial在一些條件下破裂，破裂後具有乾性，且可在細胞內或細胞外存在(圖8、9和11)。

(4)ATP產生

具有200-400nm大小的Luterial中ATP的產生使用螢光素-螢光素酶反應和發光計證明。包含Luterial的介質相比無Luterial的介質顯示ATP濃度的增加，指示Luterial具有產生ATP的能力。將SSH和SSF進一步添加至介質並檢查了其通過Luterial對ATP產生的影響。相比具有SSH的介質，包含SSF的介質通過Luterial誘導更高的ATP產生，因此發現能夠通過Luterial有效增加ATP產生的介質混合物(圖18)。

(5)核酸含量

通過DAPI和吖啶橙(AO)染色發現Luterial不僅包含RNA還包含DNA。具體地，已知AO在460nm的激發波長和650nm的發射波長以橙色AO染色RNA，且在502nm的激發波長和525nm的發射波長以綠色染色DNA。已知DAPI對DNA陽性染色。使用如上文所述的染色測試確認根據本發明的Luterial包含RNA和DNA(圖5和6)。Luterial中的RNA進一步使用提取試劑盒分離和純化，且隨後在針對人GAPDH基因轉錄物的qRT-PCR後進行瓊脂糖凝膠電泳。發現人GAPDH基因的表達水平依賴於Luterial的大小而變化(圖2(h)，16和17)。

(6)16S rRNA測序

使用FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals,Cat 6560-200)提取Luterial的gDNA，且隨後使用示於下文表1和2中的引物擴增16S rRNA基因。

此外，使用GenBank資料庫(NCB資料庫)對1461個擴增的基因片段的同源性進行了分析。結果，源自血液和精液的Luterial顯示與源自β-變形菌、γ-變形菌、酸桿菌(Acidobacteria)、藍藻(Cyanobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)和真核生物的基因的那些具有同源性的16S rRNA序列，且顯示對應於原核生物和真核生物之間的中間體的那些的整合特徵(圖24和25)。

觀察到在最佳條件中(血液pH:7.2-7.4)，源自血液的Luterial顯示與源自β-變形菌和γ-變形菌的基因的同源性(圖24)且具有50-800nm的大小。

在正常條件下，源自精液的Luterial顯示與源自β-變形菌和γ-變形菌、擬桿菌(Bacteroidetes)和脊索動物(Chordata)的基因的同源性。

與之相反，在酸性條件中，不僅在正常條件中表達源自β-變形菌和γ-變形菌的基因，還表達其他不同的源自細菌的基因和源自真核生物的基因。Luterial主要表達鏈型植物和浮黴菌(planctomy)的16S rRNA特徵(圖25)且生長至400-2000nm。

表1：正向引物

表2:反向引物

(7)與外來體和線粒體的差異

下文表3總結了Luterial與外來體和線粒體的差異。

表3

Luterial具有200-800nm的平均大小，其小於線粒體(400-1,000nm)且大於外來體，且外來體具有不清楚的膜和相對淡的內部顏色，而Luterial具有獨特的膜或經包裝的內部結構(圖19)。此外，Luterial具有完全不同於外來體和微泡的那些的形態(圖20)。

在螢光染色中，與外來體不同的是，Luterial顯示與線粒體相似的反應。Luterial存在於細胞內和細胞外而外來體僅存在於細胞外。Luterial可通過攝入食物供給，而線粒體是不可通過攝入食物提供的細胞內物質。

此外，與外來體和線粒體不同的是，Luterial是移動的，且可自然生長，其生長可通過培養維持，並顯示自發螢光。此外，Luterial、外來體和線粒體都經歷融合事件，但在外來體中，無接觸和分開的動作及ATP產生。而且，外來體存在於細胞外且線粒體存在於細胞內，而Luterial可存在於細胞內或細胞外(圖11)。

16S rRNA測序的結果指示線粒體顯示與α-變形菌的同源性，而Luterial顯示與γ-變形菌、β-變形菌、擬桿菌、厚壁菌和真核生物的同源性。

另一方面，本發明聚焦於源自體液的Luterial，其具有一個或多個下列特徵：

(a)其在螢光測試中顯示用Janus綠B、吖啶橙和羅丹明123的陽性染色；

(b)在最適環境中(pH 7.2-7.4)，其表達與β-變形菌和γ-變形菌同源的基因且具有30-800nm的大小；

(c)在酸性環境中，其不僅表達與β-變形菌和γ-變形菌同源的基因且還表達與真核鏈型植物同源的基因，且生長至400nm-2000nm或更大的大小；

(d)其在正常條件下參與ATP產生；

(e)其為完全不同於線粒體或外來體的細胞或細胞樣結構；

(f)其在正常狀態中為圓形或橢圓形，且源自患者的Luterial具有大於正常狀態的Luterial的尺寸(長軸直徑：800nm或更大)且經突變以形成具有不均勻形態的突變體Luterial；

(g)其具有多重環樣膜結構-且是粘附的；

(h)其可存在於細胞內或細胞外；

(i)其為移動的且經歷融合和/或分裂事件；

(j)在某些環境中突變體Luterial破裂且在破裂後具有乾性；和

(k)其具有調節p53基因和端粒的功能。

同時，Luterial的大小(直徑)、面積、形態和納米追蹤速度取決於個體中疾病的存在或不存在而不同，且因此上述的一個或多個特徵使得診斷疾病或預測疾病預後成為可能。這可由下列事實可見：源自無疾病的健康人的Luterial和源自具有疾病的人的Luterial具有不同的大小、形態、納米追蹤速度等。

健康人中的正常Luterial僅形成經歷分裂的雙孢子，但具有慢性疾病或癌症的患者中的Luterial(突變體Luterial)具有下列特徵：其彼此融合或凝集或破裂以粘附至細胞如紅細胞或癌細胞，由此異常地改變其形態和大小(圖8-10)。突變體Luterial是高度粘度的，且因此其融合通過上述周期加速以將其大小增加至約600-800nm或更大，且任何這樣的突變體Luterial也可具有200μm(200,000nm)或更大的大小。本發明的發明人發現Luterial的形態取決於癌症的種類或進展是一致的，且此發現的內容提交了專利申請(韓國專利申請號10-2013-0082060)。

因此，可能通過觀察Luterial的形態和生化特徵來診斷疾病或預測疾病預後，指示Luterial可在不受限制的應用中使用。

Luterial具有正常形、鞭毛形、塊型、棒形或組合形。本文中，正常形可以是不經歷額外修飾如融合或破裂的形式，具有1:1-3:1的長軸直徑對短軸直徑比率。Luterial可顯示接近圓形的形狀。其在顯微鏡觀察中作為小點出現。

鞭毛形可以是由Luterial的修飾或融合以具有附著在外的鞭毛樣結構所致的形式。本發明的發明人發現鞭毛形的百分比隨癌症進展至晚期癌症急劇增加且該鞭毛形Luterial在99.1％的診斷為4期癌症的患者中觀察到(韓國專利申請號2013-0082060)。如果鞭毛形Luterial的百分比達到80-100％，其會作為腫瘤標記物以指示末期癌症。這樣的患者的生存期為約1-4個月，且特別地，主要具有鞭毛形Luterial的患者不能長期生存。

塊形(M形狀)是由於Luterial的破裂或融合從正常形所變的形式。其為不規則的大體積形狀，其長軸直徑對短軸直徑的比率不大。優選地，其可具有3:1-5:1的長軸直徑對短軸直徑比率。觀察到塊形的多種形式。

棒形(R形狀)指由Luterial的破裂、修飾或融合導致的形式。其具有大於塊形的長軸直徑對短軸直徑比率。優選地，其可具有5:1-12:1的長軸直徑對短軸直徑比率。其包括圓形或橢圓形單鏈組成的棒1形；和由兩條或多條單鏈彼此結合組成的棒2形。棒1形指生長至棒狀的單個Luterial。其可由破裂和/或突變導致。棒2形指由兩個或多個Luterial的融合形成的棒狀Luterial。其可由一次或多次破裂、突變和融合導致。鞭毛形在廣義上可包括在棒形範圍內，但其與棒形的不同在於其具有鞭毛樣結構。因此，Luterial形式應首先確定其是否為棒形且隨後取決於鞭毛樣結構的存在進一步歸類於鞭毛形。

組合形可以是棒狀和塊狀的組合。其可意為單微顆粒物質的一部分具有棒狀且其其他部分具有塊狀。

棒形可以是選自下組的一種：由單圓形或橢圓形組成的棒1形；和由兩條或多條單鏈彼此結合組成的棒2形。組合形可以是棒狀和塊狀的組合。

如上文所述，體內Luterial的形態依賴於疾病的發生和進展而改變，且因此可通過觀察Luterial的形態特徵來診斷疾病或預測疾病預後。此外，Luterial的形態變化也與Luterial序列及Luterial中的核酸含量的變化相關，且因此使得能夠從Luterial的核酸表達形式分析(16S rRNA測序)對疾病進行診斷。例如，可能通過將正常Luterial的16S rRNA序列與源自患者的Luterial的16S rRNA序列進行比較診斷疾病(特別是癌症)。具體地，Streptopyta基因和真核生物基因的共表達可用作診斷和預測致癌作用的標記物。

然而，分離自從患者或正常人排出的體液的Luterial難以觀察，這是由於其在體外在短時間趨於消失或改變其形狀。此外，在異常環境中，正常Luterial在24小時內變為突變體Luterial，使其難以精確診斷或治療疾病。然而，根據本發明的培養方法，可培養Luterial使得其大小不超過一定的尺寸(500nm)。

因此，另一方面，本發明涉及用於培養Luterial的方法，其包括：添加水至Luterial；並在18-30℃(優選20-25℃)的溫度在用IR光照射下培養Luterial。

添加至培養過程的水可以為鹽水或PBS溶液，但不限於此。培養前源自體液的Luterial可根據本發明的分離方法獲得且可具有50-200nm的大小。根據本發明的培養方法培養的Luterial可具有300-800nm的大小。本文中，可將Luterial控制在顯微鏡觀察下500nm或更小的尺寸。完成培養後，Luterial可根據大小分選，並冷卻和保存在-80℃或保存在氮氣下或可在高於零的溫度保存。對於保存，可將防腐劑添加至Luterial。

如上文所述培養的Luterial可保存一定的時間段而不改變Luterial的特徵，且可有效用於診斷疾病和預測疾病預後。如本文使用，表述「不改變Luterial的特徵」意為Luterial的形態或大小維持在與在介質中培養前相似的水平。此外，其意為Luterial的活性如移動性(例如納米追蹤速度)維持在與培養前相似的值。

具體地，根據本發明的培養方法培養的Luterial可出於下列目的使用。突變體Luterial由於融合或凝集具有異常增加的形態或大小，與正常Luterial不同(圖8-10)。通過培養突變體Luterial，能夠抑制或防止Luterial突變的物質可從候選物質中通過觀察培養的Luterial突變體是否變化而進行篩選。

此外，促進突變體Luterial分裂的物質可通過用候選物質或手段處理培養的突變體Luterial而篩選。由於突變體Luterial顯示融合類型或凝集事件(圖8、9和11)，通過用候選物質處理突變體Luterial並檢查其是否促進突變體Luterial的分裂以具有正常Luterial的大小，可能篩選抑制Luterial突變或將突變體Luterial轉變為正常Luterial的物質，即預防由突變體Luterial導致的疾病的物質。

實施例

此後，本發明將進一步參照實施例進行描述。對本領域的技術人員顯而易見的是這些實施例僅出於闡述目的且不應理解為限制本發明的範圍。因此，本發明實質範圍將通過所附權利要求及其等同物限定。

實施例1：源自血液的Luterial的分離

從非小細胞肺癌患者收集50cc的血液並通過具有0.8μm或更大孔徑的過濾器，並去除未過濾的物質。過濾的血液反覆以1,200-5,000rpm離心5-10分鐘以去除一般的微泡如沉澱中收集的外來體，並收集上清。用可見光照射上清，並通過移液分離具有移動性的聚集的Luterial顆粒。由於Luterial是自發螢光和移動的，Luterial顆粒可如上文所述通過用可見光照射可視化。此時，移動的Luterial顆粒在暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡的觀察下通過移液分離。將分離的Luterial過濾通過具有50nm孔徑的過濾器，並僅將未過濾的部分用PBS洗滌，由此獲得Luterial。根據上述步驟，可獲得具有50-800nm長軸直徑的Luterial，其可通過暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察。獲得的Luterial根據大小分選成50-200nm(發育期)/200-400nm(成熟期)/400-600nm(有絲分裂期)/600-800nm(超過有絲分裂期)。根據相似的方法，構建了如圖21所示的具有多種大小的Luterial的文庫，且具有多種大小的Luterial的形態示於圖2中。

實施例2：源自精液的Luterial的分離

將精液以2000-4000rpm離心5-30分鐘，且將上清過濾通過具有2-5μm孔徑的過濾器。過濾的溶液以3000-7000rpm離心5-20分鐘，隨後過濾通過具有0.5-2μm的孔徑的過濾器。由於Luterial是自發螢光和移動的，當過濾的溶液用可見光照射時能夠可視化Luterial顆粒。此時，移動的Luterial顆粒在暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡的觀察下通過移液分離。將分離的Luterial過濾通過具有50nm孔徑的過濾器，並僅將未過濾的部分用PBS洗滌，由此獲得可通過暗視野顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察的Luterial。

實施例3：Luterial的特徵

(1)結構

實施例1中獲得的Luterial中，具有約50-400nm大小的Luterial用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Zeiss)、透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡和共聚焦掃描儀(Leica TCS-SP8)成像。結果是，顯示Luterial還具有多重環樣層的膜結構和不完全的內部嵴結構，與線粒體相似，且在與用於線粒體的波長相同的範圍中觀察。此外，可觀察到Luterial為圓形或橢圓形狀(圖1、1(e)、2(h)、13和14)。

(2)染色特徵

實施例1中獲得的Luterial中，具有約50-800nm大小的Luterial用Mito-tracker、羅丹明123、吖啶橙和Janus綠B染色，並測試它們的陽性染色。結果顯示甚至源自植物的Luterial也通過Mito-tracker、羅丹明123、吖啶橙和Janus綠B染色(圖2(a)、2(b)、2(f)和2(j)，和圖3-6)。

(3)自發螢光

實施例1中獲得的Luterial中，具有約50-800nm大小的Luterial通過螢光圖像分析。結果顯示Luterial對光響應(圖5)。

(4)移動性

實施例1中獲得的Luterial的移動性通過納米追蹤(3i Inc.,USA)分析而測量。具體地，用亮視野顯微鏡觀察Luterial，在Luterial的中心設置追蹤並實施納米追蹤。隨後，記錄Luterial的實時運動軌道並計算Luterial的速度每秒(圖7)。

結果是，根據本發明的Luterial的納米追蹤速度測量為約13-25μm/秒。

(5)Luterial是否包含RNA和DNA的分析

實施例1中分離的具有200-400nm大小的Luterial用原子力顯微鏡成像。如圖2(h)、15、16和17所示，Luterial包含核酸如RNA或DNA。

為從實施例1中分離的具有200-400nm大小的Luterial分離總RNA和DNA，使用了QIAGEN試劑盒(RNeasy Micro Kit:目錄號74004)，隨後使用Experion RNA(DNA)StdSens(Bio-Rad)晶片量化。

Luterial通過離心(以8,000g進行1小時30分鐘)回收，且隨後通過添加與3.5μlβ-巰基乙醇混合的來自試劑盒的50μl裂解緩衝液RLT加(異硫氰酸胍，洗滌劑)裂解，且隨後使其通過裝配了20號(gauge)針頭的注射器5-10次。隨後將樣品裂解緩衝液轉移至AllPrep DNA離心柱，隨後離心(以≥8000g進行15秒)以將殘留在柱上的DNA與經過柱的緩衝液中包含的RNA分離。

接下來，將350μl的70％乙醇添加至相同體積的樣品裂解緩衝液，所述緩衝液穿過柱(RNA)並充分混合。隨後將700μl的混合物轉移至RNease MinElute離心柱並離心(以≥8000g進行15秒)，並去除通過柱的緩衝液。順序用350μl的RW1、500μl的RPE緩衝液和500μl 80％的乙醇洗滌柱。在相同條件下實施如上文所述使用的全部離心步驟(≥8000g進行15秒)。為獲得RNA，將14μl的無RNeasy的溶液添加至柱並隨後離心(以≥8000g進行60秒)，由此分離Luterial RNA。

對於基因組DNA(gDNA)的分離，使用了FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedical)。將分離的Luterial添加至管，隨後添加978μl的磷酸鈉緩衝液和122μl的MT緩衝液。將混合物勻質化40秒，且隨後以14,000g離心10分鐘以收集上清，其後將250μl的PPS(蛋白沉澱溶液)添加至上清並混合10分鐘。以14,000g離心5分鐘後，將上清轉移入15ml管，並重複該步驟兩次。對於DNA結合，將所得上清置於轉子上2分鐘，且隨後置於二氧化矽基質支持物上3分鐘。將600μl上清小心添加至SPIN過濾器並以14,000g離心1分鐘，且隨後丟棄上清，並將500μl的SEWS-M添加至殘留的沉澱並重懸。離心1分鐘後，丟棄上清，並重複離心使得不會殘留任何緩衝液。隨後，將50μl DES(無DNA酶/熱原的水)添加至殘留的材料，隨後以14,000g離心1分鐘，且隨後分離基因組DNA。

使用Experion RNA(DNA)StdSens(Bio-Rad)晶片實施量化。如圖16和17中所示的結果指示Luterial包含RNA和DNA。

(6)16S rRNA測序

16S rRNA(核糖體核糖核酸)是與多種蛋白相互作用以形成核糖體的DNA。由於16S rRNA核苷酸序列的變化速率顯著低於基因組中大多數的其他基因的核苷酸序列的情況，可確認的是16S rRNA序列的相似性反映生物體之間的進化距離。

①源自血液的Luterial

使用FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals,目錄號6560-200)處理實施例1中獲得的Luterial以提取gDNA。使用提取的gDNA，使用PCR-premix(iNtRON Biotechnology,Korea)和SEQ ID NOs:1-23的引物擴增Luterial的16S rRNA。

擴增的PCR產物使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒(Applied Biosystems,USA)和自動化的DNA分析儀系統(PRISM 3730XL DNA analyzer,Applied Biosystems)測序。擴增的PCR產物共有1461個片段。其中，1407個片段顯示與源自變形菌的基因的同源性，20個片段顯示與源自酸桿菌的基因的同源性，且11個片段顯示與源自放線菌的基因的同源性(表4)。

使用SeqMan軟體(DNASTAR)組合具有經分析的核苷酸序列的片段，由此獲得16S rRNA的核苷酸序列。

圖24顯示健康個體Luterial DNA的細菌同源性，如通過源自健康人血液(血液pH:7.2-7.4)的Luterial的16S rRNA測序所確定，且顯示了對多種大小的Luterial實施的分析結果((a):100nm或更小；(b):100-200nm，(c)200-400nm和(d)400-800nm)。Luterial的大小間無顯著性差異，且Luterial全部顯示與源自變形菌、厚壁菌和擬桿菌的基因的同源性。

圖25(c)顯示從具有疾病的患者獲得的Luterial DNA的細菌同源性。使用了源自具有疲勞或疾病狀況的患者的血液(血液pH:7.0或更低)的200-400nm Luterial的16S rRNA測序數據。與健康狀況不同的是，從患者獲得的Luterial基因顯示與源自鏈型植物的基因的同源性。

圖26(a)、26(b)和26(c)顯示了基於源自血液的Luterial的16S rRNA序列的進化樹。

表4

已顯示源自血液的Luterial的16S rRNA片段顯示了與多種細菌的同源性，包括β-變形菌、γ-變形菌、擬桿菌、厚壁菌和鏈型植物。

一般而言，當微生物分類的gDNA的相關性小於70％時，將微生物認作獨立種系。此外，通過統計學分析證明了當16S rRNA序列的同源性小於97％時，gDNA的相關性小於70％。因此，分析了與Luterial的16S rRNA片段具有97％或更大同源性的細胞。如下文表5-7所示，源自血液的Luterial顯示了與γ-變形菌100％的同源性、與厚壁菌97.53％的同源性和與擬桿菌97％或更高的同源性。

同時，如表8所示，異常酸性Luterial顯示與鏈型植物99％或更高的同源性。

表5:通過16S rRNA Seq的Luterial的特徵

表6:厚壁菌

表7:擬桿菌

表8:鏈型植物

(2)源自精液的Luterial

根據上文所述的方法將實施例2中獲得的源自精液的Luterial用於gDNA的提取、PCR擴增和測序。圖25顯示Luterial DNA的細菌同源性，如通過源自正常狀況和疲勞或疾病狀況(精液pH:7.0或更低)的患者的精液的Luterial的16S rRNA測序確定的。分析用多種大小的Luterial實施((a):100nm或更小，(b):100-200nm和(d)400-800nm)。

正常的源自精液的Luterial顯示了與源自變形菌、厚壁菌和擬桿菌的基因的同源性，如源自血液的Luterial般。具體地，Luterial顯示與源自脊索動物的基因的同源性。

源自精液的Luterial的DNA在異常酸性條件下顯示與源自鏈型植物的基因的同源性。

(7)ATP含量的測量

將包括對照、Luterial、Luterial及SSH(12小時)和Luterial及SSF(12小時)的四種介質每種10mL置於管中，並向其添加葡萄糖(100mg/mL)和ADP底物(1mM)，隨後在37℃的水浴中培養。開始培養後的30分鐘間隔，收集100μl樣品，置於管中，並用900μl蒸餾水稀釋10倍。隨後，將10μl的樣品轉移至新鮮的管中，並向其添加100μl包含在ATP試劑盒中的螢光素酶試劑，且使用光度計立即實施5次測量。

如圖18所示，相比無Luterial的對照介質，包含Luterial的介質顯示了ATP濃度的增加。這些結果表明Luterial具有產生ATP的能力。在比較SSH和SSF介質間的結果中，SSF添加組中的ATP濃度高於SSH添加組(圖18)。

實施例4:Luterial的培養

(1)實施例1中獲得的Luterial中，添加PBS後用IR光照射具有約50-200nm大小的Luterial，且隨後在18-30℃培養約3小時。在用IR光照射後立即約1小時的間隔，用顯微鏡測量Luterial的大小。約1-6小時後，培養前具有約200nm大小的Luterial生長至約500nm的大小。因此，將水添加至源自血液的Luterial(其隨後在用IR光照射下於18-30℃培養)時，Luterial可生長至約500nm的大小。一致地，當額外培養Luterial時，其生長至數百μm的大小且還在額外培養的過程中破裂(圖22)。

(2)在實施例1中獲得的Luterial中，添加PBS後用IR光照射具有約400-800nm的大小的Luterial，且隨後在18-30℃培養約3小時。在用IR光照射後立即1小時的間隔，Luterial的大小和狀態用顯微鏡測量。約1-6小時後，顯示了培養前具有約400-800nm大小的Luterial經歷分裂而不生長。

此外，觀察到當進一步培養具有800nm或更大尺寸的突變體Luterial時，其變為在癌症患者血液中所見的突變體Luterial(圖23)。

實施例5：Luterial的抗癌效果

為了測量Luterial對兩種卵巢細胞系(SKOV3和A2780)生長的抑制效果，實施了四唑黃MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物)測定法。MTT測定法是用於測量活細胞生長的方法，且基於當添加黃色水溶物質MTT時活細胞線粒體中的脫氫酶產生紫色甲(formazan)的原理。已知紫色甲的產生與具有代謝活性的活細胞數目基本成比例，且因此在測量細胞的生長和分化中十分有效。

具體地，將100μl培養的癌細胞以5x104細胞/ml的濃度添加至96孔板並在加溼培養箱(5％碳和95％氧)中於37℃培養24小時，且隨後用具有100-800nm大小的多種濃度的Luterial處理。培養48小時後，將15μl在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的MTT溶液(5mg/ml)添加至每孔，隨後培養4小時。確認甲形成後，完全去除介質，並將100μl的二甲基亞碸(DMSO)添加至每孔以溶解在孔底形成的甲此後，使用酶標儀(GEMINI,Stratec Biomedical)測量在560nm處的吸收，且計算了通過Luterial相對於100％的對照細胞的細胞生長抑制率。

結果，SKOV3和A2780細胞系的Luterial的IC50值分別為30μg/ml和60μg/ml。商業可獲的抗癌藥順鉑的IC50值為100μM(圖27)。對於兩種卵巢癌細胞系，Luterial顯示了比陽性對照藥更強的細胞毒性，且對於正常卵巢細胞顯示了與陽性對照藥物相似的細胞毒性。

工業實用性

如上文所述，根據本發明，可有效分離患者或正常人的體液中存在的未鑑定的納米大小的顆粒Luterial，且可培養分離的Luterial從而生長至一定大小。如此，Luterial可用於疾病的診斷和治療。此外，Luterial顯示針對癌細胞系的強抗癌效果，且因此可用作抗癌劑。

儘管本發明已參照具體特徵詳細描述，對本領域的技術人員顯而易見的是本說明書僅用於優選的實施方案且不限制本發明的保護範圍。因此，本發明的實質範圍會通過所附的權利要求及其等同物限定。