用於確定Rh血型基因型的診斷方法與試劑盒的製作方法

2023-06-06 20:25:11 7

專利名稱：用於確定Rh血型基因型的診斷方法與試劑盒的製作方法
背景技術：
本發明涉及一種確定Rh血型基因型的方法。更具體地說，本發明涉及一種直接確定與D/D，D/d，和d/d狀態相關的Rh接合性以及伴隨的CcEe基因型的分子遺傳學方法。
人紅細胞Rh(恆河猴)抗原形成了在臨床醫學中最重要的血型系統中複雜的一種(參考文獻1)。在Rh抗原中，D抗原免疫原性最強並以刺激同種免疫而著稱。根據D抗原在其紅細胞膜上的有無，個體依其表型分為RhD陽性和RhD陰性(也用d表示)亞型。 Rh D/d不相容性及母體對D抗原的同種免疫是新生兒溶血症的最常見也是最嚴重的原因(參考文獻2)。受到嚴重影響的(貧血的)胎兒可能甚至需要子宮內輸血，這是一種危險的侵入性治療措施。其它常見且臨床上重要的Rh抗原包括C，c，E和e(也統稱為「非D」)抗原。雖然在Rh陽性或陰性狀態分類中並未考慮這些抗原，但在美國遇到的胎兒/新生兒溶血症中，C，c，E和e抗原已成為相對較常見的原因。這是因為先期帶有Rh致敏的移民家庭在目前Rh病案中佔了相當大的比例。
所有這些Rh抗原或特異性歸屬於一非糖基化但棕櫚醯基化的跨膜蛋白，稱為RhD，C/c和E/e多肽家族(參考文獻3-5)。兩個有關的結構基因D和CeEe編碼攜帶這些抗原的紅細胞膜蛋白。儘管C/c和E/e被認為是等位基因的抗原產物，但D抗原沒有血清學可檢測到的對映的「d」抗原(參考文獻6)。在大多數情況下，D-陰性表型伴隨著D基因的完全缺乏。在極少情況下，d表型可由部分缺失的D基因或表達缺陷的靜息D基因導致。
從遺傳學來看，所有D和非D抗原都以常染色體共顯性方式表達，且它們以八種不同的Rh單倍型，即DCe，DcE，Dce，DCE，dCe，acE，dce和dCE，整個遺傳(參考文獻6)。這些組織構架的頻率不是隨機的，而是隨著人種群體的不同而明顯不同。(見表1，在本文別處詳細說明)。
Rh單倍型的結構基礎在Fisher對從人群研究中收集到的遺傳證據進行分類綜合後並未立即顯現出來(參考文獻6)。許多年後，從不同角度提示RH基因座的組成包括1-3個結構基因的一些概念模型被提出來以解釋Rh抗原的遺傳(參考文獻6-7)。兩個不同形式的Rh cDNA的分離(參考文獻8-12)提供了在分子水平分析這些模型必要的信息。Southern印跡和轉錄測序分析表明在Rh-陽性受檢者中存在兩個基因，D和CeEe(非D)，但在Rh-陰性受檢者中只存在一個基因(CcEe)(參考文獻12-14)。這個發現提供了支持Rh基因座雙基因模型的強有力的證據(參考文獻7)。雖然如此，基因組圖譜與Rh單倍型構架間無相關性是可能的，因為無法分離極度同源的D和非D基因(參考文獻12，13)。
歷史上，主要受檢測與識別紅細胞膜上Rh抗原表達的方法的局限，Rh基因型的確定只能間接進行。這些血清學方法中使用了能識別Rh蛋白或其部分並能與之相互作用的抗體或其它化合物。例如，已鑑定出許多對特定Rh抗原有特異性的抗體。檢測Rh蛋白和其它血型抗原的凝集反應方法在美國專利Nos.5,324,479，5,302,512，5,213,963，4,560,647，4,403,042，4,358,436，和4,148,607中均有描述。許多描述這些傳統的凝集反應型檢測的出版物均可購得，例如Walker RH等編的《技術手冊》(Teckmcal Manual)，第11版，美國血庫聯盟，Arlingto，Virginia(1993)，其全部內容在此引入作為參考(參考文獻15)。
這些傳統的血清學方法的局限是它們只提供了有關表達蛋白的外形方面的信息，而不能確定受檢者Rh抗原的分子結構或分子遺傳組成。為了推知Rh基因的遺傳，這些方法通常不僅需要受檢者的血樣，而且需要其他家庭成員的血樣。而且，在分析胎兒的表型時，獲取血樣使用了具有潛在危險的方法，在該方法中胎兒對出血敏感並可能死亡。總之，所有這些傳統方法作為診斷工具是有缺陷的，因為沒有一種方法提供了能確定Rh基因型的任何手段。
有人建議用限制性片段長度多態性(RFLPs)結合血清學試驗以提高對血型基因及其遺傳的認識(參考文獻16)。這個建議的嚴重局限是它需要研究不是血型基因本身而又與特異的血型基因緊密連鎖的DNA標記。通常這樣的仍需被鑑定的側翼DNA標記不表現出與結構基因完全的連鎖不平衡。因此，它們不能用於精確地確定Rh基因型。但可發展成為用於連鎖分析的分子工具。
發生在Rh基因座的某些多態性的分子基礎已被揭示(參見，例如文獻10，17-18)。許多技術已用於這些研究，包括聚合酶鏈反應(PCR)。分子克隆方法，RFLPs等。然而在已報導的研究中還沒有一種提出或建議了能同時確定Dd和CcEe基因型，並直接確定與D/D，D/d，和d/d狀態相關的Rh接合性的任何方法。確實，這些研究中的許多已認識到Rh系統在抗原水平表現出極強的多態性，而這種多態性與mRNA水平巨大的異質性相關聯(參考文獻18)。從而，逐漸清楚了目前對Rh系統的認識從基礎上還不完整。
已有的知識還不足以建立一種精確可靠的確定Rh基因型的方法。例如，已有的研究曾產生了一種利用DNA擴增確定RhD基因型的方法(參考文獻19-20)。該方法利用PCR技術和一組獨特的引物來擴增RhD基因的外顯子10。但是其引物對限制了該方法只能確定D/D，或d/d基因型，而不能區分D/d及相關的CcEe基因型。而且已發現該方法在某些情況下並不可靠，因為基因擴增所評定的僅僅是Rh基因的一小部分，即外顯子10。具體地說，該方法在某些受檢者中使用時產生異常的DNA擴增片段，導致假陰性或假陽性結果(參考文獻21-23)。因此，該方法既未完全涉及主要的Rh抗原，而且其準確性也不足以使其成為為患者提供建議或治療的常用方法。
因此，需要有一種安全，方便並能精確地檢測包括D與非D基因型的Rh基因型的方法。尤其也需要提供一種無須獲取血樣就能確定胎兒Rh基因型的方法。一種以從羊膜細胞提取的DNA樣品為基礎的檢測可使臨床醫師避免傷害胎兒的危險並能更精確地預測新生兒由抗Rh引起的溶血症的可能性。
發明概述本發明提供了一種用於直接確定Rh血型基因型的診斷方法。更具體地，本發明提供了一種區分RhDd及相關的CcEe基因型的方法。
在一個實施方案中，本發明提供了一種確定受檢者Rh基因型的診斷方法。該方法包括選擇性斷裂基因組DNA以提供Rh基因片段，其量足以提供鑑定Rh基因型的信息。優選本發明中的診斷方法包括選擇性斷裂基因組DNA以提供鑑定八種常見的Rh單倍型的Rh基因片段。更優選該方法能使Rh基因片段的量足以使RhD與RhCc和E/e基因區別。再優選本發明的方法提供能選擇性鑑定或識別與RhD和/或RhCcEe基因相關的Rh基因型的一個或多個方面的片段。本發明的方法也能夠鑑別某種Rh基因型，或提供能用於其它檢測或試驗的信息，以更全面地鑑定作為Rh抗原表達基礎的遺傳藍圖。
優選地本發明的方法包括利用能選擇性或差別性切斷DNA樣品(優選包括基因組DNA)以產生D基因和/或CcEe基因獨有的片段的限制性酶來分析Rh基因。優選選擇限制性酶使其消化DNA樣品以提供鑑定或區別D/d基因型和/或C/c和E/e基因型的Rh基因片段。更優選限制性酶消化根據Rh結構基因內含子區的多態性有差別地切斷基因組或其它DNA。最優選限制性酶將產生這樣的Rh DNA片段，它能特異地鑑定或區分單獨的Rh基因從而能夠精確地確定它們的組成，即Rh基因型。根據本發明使用的高度優選的限制性酶是SphI。也可使用SphI與其它限制性酶的有益組合。
在另一個實施方案中，本發明中的診斷方法包括擴增來自受檢者的DNA以產生多拷貝的所需DNA，在本申請中為Rh DNA。優選這樣的擴增在Rh DNA選擇性切斷之前完成。擴增可用本領域熟知的方法完成，例如聚合酶鏈反應或連接酶鏈反應，或二者合用。
通常，DNA擴增通過擴增Rh DNA的一個寡核苷酸引物或一套引物完成。擴增後的Rh DNA然後用限制性酶處理，即消化，以產生RhDNA片段，其量足以提供有關受檢者Rh基因型的信息。
在本發明的方法中，可能用到一種或多種擴增Rh DNA的寡核苷酸引物。但是，優選使用與Rh DNA選擇性雜交並擴增Rh DNA的引物。更優選地，希望該一種或多種引物特異地與Rh DNA雜交並擴增之，而對非Rh DNA基本上不雜交和擴增。
本發明的方法可使用一組擴增Rh DNA不同區段的引物。例如，本發明的方法可使用差別擴增RhD DNA和/或RhCcEe DNA的引物。例如，該引物組包括一些引物的組合，其中至少一組能選擇性或特異擴增RhD DNA，而且至少一組能選擇性或特異擴增RhCcEe DNA。用這種方法，可獲得能有差別地確定D/d及其相關的CcEe基因型的信息。
本發明的方法通常還包括檢測Rh DNA片段以獲得辨別Rh基因型的一個或多個方面的信息。這樣的辨別需要鑑定那些通常，優選一貫代表部分或全部特異的等位基因或單倍型的特定片段。已知有許多方法能獲得足夠的信息以完成這樣的差異辨別。例如，本發明的方法可包括根據分子量，電泳遷移率，色譜遷移率等分離Rh DNA片段。由於限制性酶將DNA切割成特定大小的分離的片段，這些片段的分離將揭示片段帶型。一旦被分離，一些或所有這些片段可根據已知的方法特異或非特異地鑑別。例如，Rh DNA片段可被非特異地染色，根據其自身的片段帶型可推導出基因型信息。或者，利用包括一條或多條能與一個或多個片段雜交的寡核苷酸探針的雜交探針組合物可鑑別一個或多個片段。這樣的雜交可用於專一地或選擇性地鑑定特定的片段。利用接上了可被檢測的成分的探針可完成探針雜交的鑑定。
該方法可獲得鑑定，優選特異性鑑定或區分Rh基因型的不同方面的信息。該方法有利於使技術人員獲得鑑定RhDd基因型，RhCc基因型，RhEe基因型，RhCcEe基因型，RhDCcEe基因型及其組合的信息。
本發明的方法可包括確定上述的Rh基因型，以及確定涉及受檢者其它的，非Rh基因的基因型。或者，該方法可包括確定受檢者特定基因型的信息。例如，在一特別優選的實施方案中，Rh表型的確定有利於提供Rh基因型確定的確證的或補充的證據。這樣的基因型確定可通過血清學檢測進行。
在另一個實施方案中，為使用本發明的Rh基因型確定方法提供了一診斷試劑盒。在這個實施方案中，本發明的診斷試劑盒可通過檢測靶核酸序列，如RhD和/或RhCcEe基因特異的序列確定Rh血型基因型。該試劑盒中含有一能有差異地切斷DNA樣品從而產生能提供有關Rh基因型信息的Rh DNA片段的限制性酶。該試劑盒可含有一擴增引物或引物組，即可用於通過序列特異性結合到D和/或CcEe DNA或引起其延伸的寡核苷酸。通常，引物在第一試劑容器中提供，而限制性酶在第二試劑容器中提供。
該試劑盒還可進一步包括其它的容器設備，例如多孔微量滴定板。在這種情況下，該試劑盒可包括微量滴定板，其上附有與D和/或CcEe靶序列基本上互補的寡核苷酸捕獲探針。
另外，該試劑盒可包括其它的成份如試劑，稀釋液，緩衝液，以及對照樣品。該試劑盒也可包括檢測工具，例如核酸染料或寡核苷酸探針。試劑盒可以任何能夠實施本發明方法中特定實施方案的形式構成和出售。通常，例如，每種試劑盒均以獨立的容器提供。這些試劑盒還可進一步包括從受檢者獲得紅細胞組織樣品的工具，從組織樣品中提取DNA的工具，檢測Rh DNA的工具等，沒有限制。
在另外一個實施方案中，本發明提供了一確定受檢者Rh基因型的診斷組合物。在這個實施方案中，該組合物包括鑑定受檢者所有或部分Rh基因型的DNA片段。該特徵性DNA片段由受檢者DNA樣品的選擇性斷裂產生。
因此，作為本發明的結果，提供了一種安全方便地區分患者Rh基因型的診斷方法。具體地，可選擇性地或彼此結合併與其它基因型信息一起確定RhDd和RhCcEe基因型。現在提供了一種確定子宮內胎兒Rh基因型的方法，該方法甚至無需提取血樣即可進行。以從獲自諸如羊水或絨膜絨毛的組織樣品的DNA中確定Rh基因型，具體為Dd和/或CcEe基因型，為基礎的檢測，現在可使臨床醫師降低被測胎兒的風險程度。而且，新的診斷方法能夠精確地預見新生兒抗Rh引起的溶血症的可能性。
本發明的這些或其它的優點將從此後詳述及實施例中看出。詳述及實施例可加深對本發明的理解，但並不意味著限制本發明的範圍。
附圖簡述本發明中的優選實施方案選出來為了詳細解釋與描述，而不意味著以任何方式限制本發明的範圍。本發明中某些方面的優選實施方案在附圖中說明，其中

圖1是一說明根據本發明方法使用的一組Rh基因探針間關係的圖，這些探針一起橫跨Rh cDNA從5′到3′的非翻譯區。
圖2顯示用根據本發明的方法從八個無親緣關係的個體中製備的基因組DNA的Southern印跡。
圖3是一完全的Rh多肽基因SphI限制性圖譜，包括D與非D基因中外顯子分布的圖示說明以及SphI RFLPs與Rh單倍型的關係。
圖4顯示了用根據本發明的方法製備的來自4個攜帶有不同的Rh單倍型的家族的基因組DNA的Southern印跡，以及每個家族的譜系。
圖5示意說明在一個單獨家族中Rh單倍型從父母傳遞給孩子。
圖6顯示了用本發明中的方法製備的15個無關隨機個體的基因組DNA的Southern印跡。
圖7顯示了用本發明中的方法製備的15個表現出不同Rh基因型的無親緣關係個體的基因組DNA的Southern印跡。
圖8顯示了用本發明中的方法製備的6個非人靈長類動物的基因組DNA的Southern印跡。
圖9顯示了用本發明中的方法製備的來自有同種免疫風險的胎兒羊水基因組DNA的Southern印跡。
發明詳述如上已詳述，Rh基因型的確定，尤其是Dd和CcEe基因型的確定，具有重要的臨床意義。但是，至今Rh遺傳學的複雜性仍是一個尚未有效克服的難點。儘管存在這樣的問題，現在仍意外地證明能夠非常精確地鑑定Rh基因型。
本發明提供了一種區分Rh基因型的方法，該方法以存在於並精確描述所有主要Rh結構基因即D和CcEe的一組RFLPs為基礎。外顯子特異的cDNA和寡核苷酸探針被用於繪製主要Rh基因的圖譜並確定內切核酸酶切割位點的位置。已篩選出一組限制性內切核酸酶試圖鑑別一組可提供確定Rh基因型所必需信息的限制性片段。意外地發現用單一內切核酸酶可產生一組可直接並特異地鑑定RhDd和RhCcEe基因型的限制性片段。
在能提供大量信息的家族中對限制性片段長度多態性的分離方式進行跟蹤並檢測了它們在無關人群中的分布。發現特定的RFLP標記與不同的Rh單倍型一起共傳遞。考慮到以前要完全確定主要Rh基因的努力，這個不尋常的發現是出乎意料的。新的RFLP標記與不同Rh單倍型的共傳遞不僅建立了基因型與相應血型表型的聯繫，而且為確定與Rh陽性或陰性狀態(DD，Dd或dd)，以及與RHCcEe狀態(CCEE，CCEe，CcEE，CcEe，CCee，Ccee，ccEe，ccEE或ccee)相關的Rh接合性提供了直接的方法。這些特徵使得本發明的方法可用於確定Rh基因型，並可望在Rh同種免疫的遺傳學建議及產前評定中起越來越重要的作用。
為了更清楚準確地描述本發明，在下面的討論中採用了一些術語性的慣用語，這些慣用語力圖為幫助本發明的描述提供實用的工具，但並不是加以限制，熟練的技術人員可意識到還含有其它和額外的解釋。
例如，在本發明中，術語「D基因」指編碼Rh D蛋白的基因。術語「D蛋白」指帶有D特異性或抗原決定簇的蛋白。D/d基因型指基因組中D基因存在或缺乏(或靜息)的結果，D蛋白表達的有或無決定了D/d表型。應當指出術語「d」或「d」不能理解為指等位基因的存在，而是指可檢測到的D蛋白或D基因的缺乏。實際上，如在此以外已提到的，尚未發現血清學可檢測到的d抗原，也未鑑定出編碼d蛋白的基因。
相形之下，術語「CcEe基因」指編碼CcEe蛋白的基因。而術語「CcEe蛋白」指帶有C/c和/或E/e抗原特異性的蛋白。因此，個體的CcEe基因型被認為是由其基因組中CcEe等位基因的特異配對決定，而個體的CcEe表型被認為是由CcEe蛋白的表達和表達的C/c和E/e決定簇的組合決定。
應當指出名稱「D」和「CcEe」可用於描述蛋白、肽、抗原、核酸、寡核苷酸等，它們與D和CcEe基因和蛋白有關或相關。但是通常，應當清楚與Rh相關或基於Rh的染色體DNA(包括外顯子，內含子和其部分)，核酸模板，核酸轉錄本，以及cDNA，用斜體註明，例如，「D」和「CcEe」。這種用法在本領域中是常用的。
「多態」或「DNA多態性」是指在同一雜種繁殖的群體中同一特異DNA序列同時存在兩種或更多變體的現象。多態差別為由於諸如點突變，基因重排或可變剪接等事件造成的胺基酸序列的差別所致。儘管在同一基因的兩個譯本的核苷酸序列間存在差異，但除非能帶來胺基酸序列的改變，否則這樣的差異不會帶來表型的多態性。雖然如此，如果沒有相應胺基酸的改變但可檢測到核苷酸序列的差異，那麼仍存在著基因的多態性。具體地說，如果核苷酸序列的改變導致了限制性酶切割位點的生成或消失，那麼可用限制性片段長度多態性來進行分析。通常，即使在一單個基因中鑑定這樣的RFLPs也是困難的。因此，現在發現僅用一種限制性酶就使RFLPs能夠確定與兩個基因有關的基因型是非常意外的。本發明的方法利用限制性片段多態性可分別或一起確定RhD和RhCcEe基因型。
作為本發明的結果，現在能夠設計包含可用於檢測Rh基因多態性的核酸寡聚體或寡核苷酸的探針和/或引物。適於這種目的的探針或引物優先與特定的包含Rh基因限制性位點的限制性片段或區域雜交或對其有特異性。優選引物能擴增含有一限制性多態性位點的DNA。由於限制性切割位點的有或無，擴增的DNA可被有差別地消化，從而可確定Rh基因型。通常，但不一定，這樣的限制性多態性包含這樣一個位點或區域，其中核苷酸序列上的一個點改變導致了Rh基因產物的改變。儘管如此，即使限制性位點改變並不帶來表型多態性，這樣的改變一貫與能帶來這樣的表型多態性的另一個突變相關聯。因此，在探針或引物中包括那些與較高頻率的等位基因雜交以及那些與較低頻率的等位基因雜交的探針或引物。
因此，如果能識別Rh DNA上一個確定的區域，如編碼D或CcEe多態性基因座的區域，可以說本發明中的探針與Rh DNA結合或與其雜交。如果能與Rh DNA上的一個確定的區域結合或通過其導致延伸，可以說本發明中的引物擴增Rh DNA。因此，如果優先擴增全部或部分D基因座或全部或部分CcEe基因座，該引物擴增D DNA或擴增CcEe DNA。而且，本發明還考慮了「Rh引物」或對D DNA和CcEeDNA都非特異性擴增的引物的使用。由於在D和CcEe基因間存在著巨大的同源性，這樣的引物是可能的。另一方面，如果一個引物僅特異地擴增與D基因相關的DNA，這樣的引物對特定的基因或等位基因是特異的，例如D(「D引物」)，而對CcEe特異的引物(「CcEe引物」)僅特異地擴增CcEe DNA。
通常優選能區分僅有不超過一個核苷酸修飾差異的兩個等位基因的探針或引物。本領域已知可通過選擇性地構建探針和引物以及通過調整雜交或其它實驗條件來控制雜交的特異性。但是，可能存在這樣的情況，需要用到雜交特異性稍低的探針。因此，在特定的上下文中，根據本發明的探針或引物可說是與特異的Rh序列「基本上互補」。也就是說，如果某種情況需要高的精確性，如果寡聚體與特異的靶序列以外的其它序列結合的可能性非常小，探針或引物與靶序列為基本上互補。在另一種情況下，如果獨特雜交的概率基本上小於1.0，那麼探針或引物可被認為是與靶序列基本上互補。因此，如果根據所需的方法參數的嚴格性，本發明中的探針或引物與靶區域或是嚴格地互補，或是僅部分互補，該探針或引物對靶區域可以是「基本上互補」。
因此，本發明用到了與一個或兩個Rh基因的片段雜交的探針和引物。當兩個Rh基因或其轉錄本需要被鑑定時，這樣的探針是很有用的。而且，本發明提供了含有染色體DNA上Rh基因座中一個或多個內含子的部分或全部的探針和引物。當需要鑑定Rh基因本身或需要獲得特定個體中有關該基因的其它信息時，這樣的探針很有用。這在本發明的高度優選實施方案中均適用。例如，由於在Rh cDNAs中未發現有SphI切割位點，因此SphI酶的使用需要Rh內含子片段的擴增。
本發明的探針或引物中也含有與靶序列鄰接或鄰近的任何區域基本上不互補的區域作為其核苷酸序列的一部分。因此，在本發明的任何探針或引物中，至少有一部分探針或引物與靶片段是基本上互補的。
本發明中的核酸寡聚體可用作探針或引物，通過與靶序列結合或雜交來鑑定靶核酸片段，例如D和/或CcEe片段的存在。因此，這樣的核酸寡聚體可通過與可檢測的標記成分，例如螢光標記物，電子緻密物質，報導成分，特異或非特異結合成分，或其它本領域熟知的可檢測成分相連而被可檢測地標記。本發明中的寡聚體還可含有可與靶核酸序列交聯的反應活性成分。而且，本發明中的寡聚體可與一些底物，例如與凝膠或樹脂相聯以固定寡聚體。
本發明中的分子遺傳學方法通常涉及從生物樣品中獲得DNA，優選哺乳動物受檢者，通常為人類患者的紅細胞組織樣品。一般本方法用於分析血樣，但其它含紅細胞的組織的樣品也是有用的。在特別優選的實施方案中，本發明提供了一種確定胎兒Rh血型基因型的方法。在這個實施方案中，優選的組織樣品包括羊水或絨膜絨毛樣品。可以理解這樣的樣品也可從樣品庫或組織庫如血庫，或從法庭證據等中獲取。因此，本方法可用於獨有的或不可替代的樣品上，也可用於篩查大量的樣品。
在此描述的分子遺傳學方法可方便地用於從羊膜的胎兒細胞和/或絨膜絨毛細胞中獲得的DNA樣品並用於確定胎兒的Dd和/或CcEe基因型。這種檢測可幫助鑑定那些有由於Rh同種免疫而造成新生兒溶血症危險的妊娠。
一旦得到了組織樣品，就需要從樣品細胞中抽提出核酸。這可用本領域熟知的任何方法來達到目的。例如參見Sambrook等的方法。(參考文獻24)。純化的核酸部分可直接用於Rh基因型確定，或可貯存至需要時。
在本發明的方法中，核酸樣品用本領域熟知的方法選擇性擴增，得到擴增的核酸產物，其中佔極大比例的是與Rh有關的核酸。依照本發明中方法的「擴增」指以指數增長方式擴增模板核酸序列用於檢測痕量特異核酸序列的任何分子生物學技術。具體來說，合適的擴增技術包括如PCR和連接酶鏈反應(LCR)技術。PCR以高靈敏度技術著稱，用途廣泛。LCR以高特異性著稱，可用於檢測點突變。在某些情況下需要結合這兩種技術來提高檢測的精確性。PCR是非常著名的技術，例如在Innis等的文獻中有描述。(參考文獻25)。LCR是近年來發展起來的，在Landegren等(參考文獻25)和Barany等(參考文獻27)的文獻中有描述。LCR試劑盒可從Stratagene購得。依據本發明中的方法預計也可使用其它擴增技術。
不考慮本發明的方法中用到的精確的擴增技術，用到了一條或多條引物。在此用到的「引物」指一段寡核苷酸，或是天然的，合成的，或是半合成的。它能通過某種擴增技術啟動靶或模板核酸序列以指數方式擴增的DNA合成。對於PCR，在互補於一條核酸鏈的引物延伸產物的合成被誘發的情況下，即在合適的緩中液中存在四種不同的核苷三磷酸及聚合反應試劑(即DNA聚合酶或反轉錄酶)以及合適的溫度條件下，引物作為DNA合成的起始點。對於LCR，引物可與靶核酸退火併與鄰接的引物連接作為擴增的模板。同樣為了LCR的目的，引物通常包含能與單鏈靶分子退火併連接在一起的成對的鄰接互補的寡核苷酸組。對於DNA的LCR擴增，引物包括兩套鄰接互補的寡核苷酸。
為了最大效率地擴增，引物優選單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸，但也可為雙鏈。如果為雙鏈，在用於製備延伸產物前，引物通常要先處理使其鏈分開。通常，LCR引物為雙鏈。引物的精確長度依賴許多因素，但通常的範圍在15～25核苷酸之間。短引物分子往往需要較低的溫度以便於與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引物不一定要反映模板的準確序列，但必須足夠的互補以與模板雜交。
在此用到的「引物」可以指不止一個引物，尤其在待擴增的靶區域的一端或兩端的信息還存在一些疑問的情況下。例如，如果核酸序列是由蛋白質序列推導而來，「引物」實際上是含有代表所有可能的因遺傳密碼的簡併性而出現的密碼子變體的引物寡核苷酸的集合。在這個集合中的一個引物寡核苷酸將與靶序列的末端同源。同樣，如果一「保守」區在人群中表現出顯著水平的多態性，就可以製備可擴增相鄰序列的引物混合物。
如果需要，通過摻入可用光譜，光化學，生化，免疫化學或化學手段檢測的標記物可標記引物或探針。例如，可用的標記物包括32P，螢光染料，電子緻密試劑，報導分子如酶(常用於ELISAs)，生物素，或可得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原或蛋白質。根據本發明熟練的技術人員也可用其它的標記物。標記物也可用於「捕獲」引物，從而能促使引物或擴增的DNA固定到一固體支持物上。
「寡核苷酸」或「核酸寡聚體」指引物，探針，待測核酸片段，核酸對照，和未標記的封閉寡聚體，被定義為含兩個或更多脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。本發明中的核酸寡聚體可為脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的單鏈寡聚體。寡核苷酸的確切大小將依賴於許多因素和寡核苷酸的最終功能或用途。寡聚脫氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸可用已知的方法從天然來源中獲得或衍生。另外，寡核苷酸也可根據本領域熟知的方法合成產生。這樣的方法包括，例如合適序列的克隆和限制性消化以及直接化學合成法，例如Narang等的磷酸三酯法(參考文獻28)；Brown等的磷酸二酯法(參考文獻29)，Beaucage等的二乙基磷醯胺法(參考文獻30)；與美國專利No.4,458,066的固相支持物法。優選寡聚體至少基本上純化以避免在基因型確定方法中帶來假象。
本發明中的方法也需要利用限制性內切核酸酶對Rh核酸進行消化，該酶是一種通常來自細菌，僅在確定的位點切割或斷裂雙鏈DNA的酶。由於這些酶表現出如此高精確性的對DNA的切割，一給定的限制性酶在任何時候用於切割DNA的相同區域都將得到片段的特徵性帶型。在DNA中的某一變化導致切割位點或「限制性位點」缺失或產生新位點的情況下，消化物的總量和「限制性片段」的分布可發生變化。因此，術語「限制性片段長度多態性」或「RFLP」指隨機分布在整個基因組上的DNA核苷酸序列的差異，並且在用限制性內切核酸酶消化基因組DNA後該差異將導致對不同的個體有不同的限制性片段帶型。
用已知的方法可完成限制性酶消化過程。優選的消化過程僅用一種限制性酶。如果能有效產生具有信息的和/或實用的限制性片段，可將這樣的酶組合使用。一種特別優選的限制性酶是SphI，在下面將可看出，它非常適合於進行本發明中的方法。
根據本發明分析限制性酶消化以推出或獲得有關Rh基因型的信息。所需信息的類型和範圍將影響限制性酶的選擇。例如，如果想得到RhDd和RhCcEe基因型的信息，發現SphI酶非同一般地有用。當不需要獲得如此完整的信息時其它的酶可被選擇。熟練的技術人員將意識到本發明中的方法可用其它方式修改以適合Rh基因型具體試驗的實際需要。
一種限制性酶或這樣幾種酶組合的效果可用分離所得限制性片段的方法確定。已知有許多這樣的方法可提供有用的結果。本領域中一種優選方法是用聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)法進行片段分離。在下面描述的實施例中用到了這種方法。
限制性片段可用特異的探針鑑定。適用於本發明目的的鑑定技術在本領域是熟知的。例如，這樣的檢測可用斑點印跡法完成，在該方法中未標記的擴增樣品結合到膜上，然後在合適的雜交條件下膜與標記的探針溫育。通過洗滌除去未雜交的探針，然後檢測膜上標記探針的存在。另一合適的方法可根據PAGE的前後排列完成，這種方法中分開的片段用核酸染色物質如溴化乙錠進行非特異的染色。例如在Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》第二版，冷泉港實驗室出版，NY(1989)(參考文獻24)中描述了這樣的方法。那些熟練的技術人員還可採用其它適合的方法。
本發明中的方法也可進一步包括與通過Rh血清學表型的推論來確定Rh基因型相關的步驟。例如，為了避免誤導或錯誤的結果，可能需要用傳統的血清學檢測來補充或證實從基因組檢測中得到的信息。另外，根據本發明可能用到某些產生有些含糊的結果的限制性酶，因為所得到的限制性片段的集合，可能不能明確地說明每一種基因型。在這種情況下，用血清學分析結合用限制酶進行的基因組分析有可能得到每種基因型特有的信息。這種血清學檢測可在指定的基因組檢測之前進行，也可平行進行或在其之後進行。而且，可根據那些排除或暗示了例如某種罕見基因型的可能性的初步不完整結果來安排檢測方案。與本發明的鑑定Rh基因型的方法一道進行其它標記或血型的基因型檢測也是理想的。例如，與Kell基因型的確定有關的1994年11月10日提交的美國申請系列No.08/337，268或1995年6月7日提交的申請系列No.08/484，570所述的鑑定基因型的方法可與本發明的方法一道進行，以提供有關妊娠更廣泛的可能困難的建議。
本發明中的Rh基因型確定方法尤其適用於確定胎兒的該基因型，以避免新生兒溶血症。不過，本發明中的方法也適用於許多其它需要獲得有關某人分子遺傳信息的情況。例如，本發明中的方法可用於需要獲得有關從法庭樣品中識別某一個體的情況。另外，本發明中的方法可用於在親子關係有疑問或爭議的情況下獲取能確認親子關係的遺傳信息。另外，本發明中的方法可用於確定輸血中受血者的Rh基因型，以及用於對貯存血液進行Rh基因型篩查，以避免輸血不相容性。熟練的技術人員還可意識到本發明中的方法的其它應用。
下面的實施例用來幫助進一步了解本發明。所用的具體材料和條件用來進一步說明本發明而非限制其合理的範圍。
實施例對於在此描述的每一個實施例，所用到的分子生物學技術通常按本領域承認的方法進行。參見，例如Sambrook等(參考文獻24)和Innis等(參考文獻25)的文獻，其內容在此引入作為參考。受檢人如以下更詳細的說明，共研究了86個受檢者。其中，71人正常，而15人帶有低發生率的Rh抗原變體或Rh缺陷綜合症。正常受檢者中包括38個高加索人，16個黑人，12個亞洲人(中國人，日本人和印度人)，3個土著美洲人和2個黑人-亞洲人混血者。受檢者或隨機挑選，或是根據已知的Rh表型選出(例如Rh陰性個體的選擇)。另外，受檢者或是無親緣關係的個體，或是相關的家庭成員。
血樣的Rh抗原特異性(表型)由標準的凝血試驗確定。在正常受檢者中，48人確定為Rh陽性，23人為Rh陰性。其D，C，c，E，和e血型表型總結如下Rh陽性17D+C+c+E-e+，10D+C-c+E-e+，8D+C+c-E-e+， 7D+C+c+E+e+，3D+C+c-E+e，2D+C-c+E+e-，和1D+C-c+E+e+；和Rh陰性11D-C-c+E-e+，5D-C-c+E+e+，2D-C-c+E+e-，2D-C+c+E-e+，2D-C+c-E-e+，和1D-C+c+E+e+。
關於Rh基因變體，所有15個受檢者是不相關的。其中5人表現出非D抗原缺乏(3D--，1DCw-，和1Dc-)，3人表現出Rh缺陷(2人Rhnull，1人Rhmod)，剩餘的人帶有低發生率的抗原。基因組DNA的製備在下面的實施例中，或用總細胞裂解法(參考文獻31)，或用順序細胞裂解法(參考文獻32)，從人或非人靈長類動物外周血白細胞中分離高分子量的基因組DNA。基因組探針的製備用於下面Rh基因分析的核酸探針包括cDNA，基因組DNA，和寡核苷酸探針。包含有5′區(外顯子1-4)和3′區(外顯子4-9)的Rh cDNA探針用反轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)合成。RT-PCR是使用選自公開序列(參考文獻8-9)的引物按已有描述的方法(參考文獻33)進行。外顯子特異的探針通過使用熱穩定DNA聚合酶(參考文獻34)的PCR擴增產生。含5′區和外顯子1(記作Ex1)的一部分的基因組探針從純化的Rh噬菌體克隆(參考文獻33)中擴增。檢測其它外顯子，包括外顯子2至外顯子10，的探針從Rh cDNAs中選擇性擴增。所有DNA探針均用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)按傳統的方法純化。
圖1顯示了這些研究中所用的外顯子探針的大小和核苷酸位置。如圖所示，橫跨5′到3′非翻譯(UT)區的全長Rh cDNA的序列分為10個外顯子。起始和終止密碼子的位置如圖示。單個外顯子特異的cDNA探針如垂直線所示，也指明了它們相對密碼子ATG第一個殘基的核苷酸位置。用於這些實施例的所有探針與D和非D Rh多肽基因都交叉雜交。寡核苷酸探針(25～27聚體)在380A自動DNA合成儀上合成並用含7.0mol/L脲的15％PAGE純化。這些寡聚體主要用於證明外顯子作圖的結果(見下)。通過Southern印跡和直接凝膠雜交對外顯子作圖基因組DNA用限制性內切核酸酶消化完全，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳並用標記的DNA探針進行Southern印跡(參考文獻35)或直接的凝膠雜交(參考文獻36)。按隨機引物延伸法(參考文獻37)用α-32P-dCTP標記DNA探針。利用T4多核苷酸激酶正向反應用γ-32P-ATP標記合成的寡聚體探針(參考文獻24)。如前所述(參考文獻31，36)，按照需要調整洗脫條件以確保與探針進行特異的雜交。
實施例1與D和非D基因關聯的RFLPs的鑑定利用Rh cDNAs作為探針，分析了來自不相關個體的基因組DNAs以鑑定可能與Rh基因連鎖的RFLPs。根據傳統的方法(參考文獻31，33)檢測了一組限制性內切核酸酶(BamHI，EcoRI，HindIII，PstI，和SphI)。發現酶SphI能提供獨特的信息，因為它是該組中唯一能使D和非D基因片段容易區分開的限制性核酸內切酶。
圖2顯示了8個帶有常見單倍型(4個Rh陽性和4個Rh陰性)的無關個體的SphI RFLPs的帶型。基因組DNA用SphI消化，印跡到濾膜上，與指定的探針雜交。泳道1～7代表提供給定單倍型純合子信息的個體。泳道8為dCE/dce雜合子，而dCE/dCE純合子在人群中是非常罕見的。也應注意到dCe/dCe純合子帶有D基因的部分缺失。DNA大小標記物註明在圖2的左邊，而D和非D基因限制性片段的來源註明在右邊。注意有三條含外顯子10的分離的片段，在Rh陰性(即Rhd)中缺失的帶為D基因(D10)的外顯子10。根據大量的分析，在包含外顯子4到外顯子7的基因組區域中的4個SphI RFLP構架被認為與不同的Rh單倍型的存在相關(表1)。
在由Ex4-7檢測的5條帶中，8.9和1.2kb的帶僅在帶有Rh陽性單倍型的個體中發現。這暗示這些片段最可能來自D基因。而7.3，5.4和1.9kb的片段在Rh陽性和Rh陰性個體中均可觀察到，表明這些片段源自非D基因。
與Rh陽性單倍型中的D特異的帶相比，來自ce，cE，Ce和CE的等位基因片段大小不同。而且，它們出現的頻率明顯與D或d(表1)的連鎖狀態有關。特別是，當ce基因以Dce形式出現時發現它能產生一條或兩條帶，但在dce單倍型中只有一條帶。不考慮它們與D或d的連鎖，cE和CE基因與7.3kb片段的存在相關。第四種情況，即Ce基因當相對D為順式時總是產生兩條帶。但是，當d相對Ce為順式時，Ce基因可產生一條或兩條帶(表1)。所有其它的探針，包括Ex1和Ex10(圖2，小圖1和5)，由於非D基因片段的共遷移作用而缺乏判別力。
實施例2D基因和非D等位基因的全面SphI圖譜序列研究表明Rh cDNA中沒有SphI切割位點。也就是說如果有的話，SphI僅在內含子區中切割Rh相關DNA。因此，這意味著用SphI切割產生的每一個限制性片段中應包含至少一個外顯子。利用這個特點確定了不同SphI帶中的外顯子成分，並如圖3A所示推導出主要Rh基因的全面的限制性圖譜。註明了位於每一外顯子片段側翼的SphI(S)切割位點的位置及近似距離(以kb計)。外顯子的排布是根據Rh陽性和Rh陰性個體的平行分析以及在ace，dcE，dCE單倍型中D基因完全缺乏的事實(圖2)。這些利用外顯子特異的探針獲得的結果(圖1)，進一步用合成寡核苷酸的直接凝膠作圖(結果未顯示)得到證實。
圖3A說明D的結構組織與非D基因的結構組織非常相似(參考文獻38)。然而D外顯子中的大部分(10個中除外顯子3和8外的8個)由於SphI切割位點的不對稱分布而與非D基因的外顯子有所區別。儘管源自兩個基因不同區域的一些片段存在共遷移，但根據外顯子成分它們仍能方便地區分開來。
已知對於所有Rh基因，儘管它們的內含子4和6缺乏SphI識別序列，但內含子1，2，3，7，8和9中每個至少含有一個切割位點。在內含子5中，D基因中存在唯一的一個SphI位點，而對於非D等位基因則具有多態性(圖3A)。SphI切割位點的這種分布可充分解釋在8個Rh單倍型中觀察到的帶型(圖2)，並因此在SphI RFLP構架和Rh單倍型間建立了聯繫(圖3B)。
實施例3家族中SphI RFLPs與Rh單倍型的傳遞為了探究SphI RFLPs是否能夠用於確定Rh基因型，在幾個家族中跟蹤了它們的傳遞。這種跟蹤使基因型與表型間的關係得以建立(表2)。
圖4顯示了4個家族(A-D)的基因組DNA的Southern印跡。每個家族中的每一個體都編上號。由於不能獲得血樣，某些家族成員沒有檢測(在家族樹上註明為NT)。基因組DNA用SphI消化，並與Ex4-7雜交。凝膠泳道與家族譜系相匹配，並顯示了推斷出的基因型。每一SphI帶的大小都註明，並在小圖4的右邊用兩個箭頭標明了D特異的帶。
在家族A中，所有成員均為D+C+c-E-e+表型。在有親緣關係的個體中這樣單一形式的表型可能由兩個基因型DCe/DCe或DCe/dCe產生。用本發明中的方法，基因組印跡顯示出家族成員A1，A3和A4為DCe/DCe純合子，而A2和A5為DCe/dCe雜合子(圖4，小圖1)。在後兩受檢者中D特異帶降低的強度也支持了這一結論。
在家族B中，兩個基因型(Dce/dce和dce/dce)的推斷更簡單。如上所述，Dce和dce單倍型由不同的RFLP構架確定(表1)。因此，帶有Dce/dce表型的個體應表現出與那些帶有Dce/Dce或dce/dce基因型的個體不同的SphI帶型(圖2)。這對家族B來說確實是個理由，家族B中成員B1和B4可明確地確定為Dce/dce雜合子(圖4，小圖2和表2)。這些結果清楚說明了與Rh陽性或陰性狀態(D/D，D/d或d/d)相關的Rh接合性的直接確定方法。
家族C的基因型確定由於多Rh表型的表達而變得複雜，多Rh表型可由3個或6個單倍型的組合限定(表2)。然而，發現D基因帶中強度無降低(圖4，小圖3)排除了所有含d的單倍型。因此，C1應帶有DCe/DCe基因型，其他成員應帶有DCe/DcE或者DCE/Dce基因型。如果C2帶有DCe/EcE(這是最可能的情況)，C3和C4都將從C1遺傳到DCe而從C2遺傳到DcE(表2)。
圖5顯示了從圖4，小圖4所示的SphI帶型推斷出的Rh單倍型在家族D中的遺傳。與D1相比，D2在D基因帶上表現出降低的強度。因此，D1是帶有DCe/Dce基因型的D/D純合子，而D2是帶有Dce/dce基因型的D/d雜合子。由於D1和D2中的Dce單倍型由不同的構架限定，父母Rh單倍型的隨機分配造成在孩子中有三個不同的基因型，它們與SphI帶型(圖4，小圖4)以及按類型劃分的血型情況相匹配(表2)。
實施例4無關個體中SphI RFLPs的分布為了評價在未獲得家族資料時Rh基因型能否確定，我們檢測了許多Rh表型已由血清學方法鑑定的無關個體。圖6顯示了代表這個分析的凝膠放射自顯影圖片，包括7個Rh陰性和8個Rh陽性個體。用SphI消化基因組DNA，並用Ex4-7探測。泳道1-6和10為Rh陰性受檢者，泳道1，6，10為高加索人，2為印度人，3，5為黑人，4為日本人。其它泳道(7-9，1-15)為Rh陽性高加索人，他們中除泳道7為DCe/DCe純合子外，其餘均為D/d雜合子。在總共被檢測的23名Rh陰性受檢者中，除了兩個dCe/dCe純合子外，都可檢測到7.3 kb的帶，而且該帶的出現與個體的種族無關(圖6)。而且，關於DCe/dce和DcE/dce基因型的雜合性可直接確定。直接區分這些基因型的能力非常重要，因為DCe/dce，和DcE是高加索人中最常見的三種單倍型(參考文獻6)。
實施例5SphI RFLPs與Rh遺傳變體的相關與分離如上面所提到的，Rh系統具有高度的多態性，含有許多低出現率的抗原和不同的表型(參考文獻6，39)。為了描述這些低出現率的抗原與SPhI RFLPs的關係，我們檢測了15個無關個體，每人都帶有不同的Rh遺傳變體。這個分析揭示了SphI片段複雜的帶型，該帶型表明在不同的遺傳背景下具有Rh表型的多樣性。
圖7顯示了帶有不同Rh表型的15個無關受檢者的基因組DNA的Southern印跡，基因組DNA用SphI消化並用Ex4-7探測。泳道1和2為DCCee和dccee對照。應指出泳道1-5和6-17在不同的瓊脂糖凝膠上進行電泳。因此，各帶的遷移率在兩張圖中有所不同，但在泳道5和6之間註明了帶的對應位置。不同帶的大小在圖的右邊註明。Rhnull(A)和(R)分別指Rhnull無效等位基因和調節基因類型。
在5個變異體中，非D抗原(泳道3-7)D--或類似於DCW-，或缺失了非D片段，或與靜息的Ce基因相關聯。Dc-受檢者明顯帶有Dce/dce基因型，而e抗原不表達。對於Rh缺陷綜合症(泳道8-10)，Rhnull的無效等位基因和調節基因類型分別與Rh陰性和DCe單倍型相關聯，而Rhmod與D基因的增多相伴隨。與Rhmod類似，在基因組印跡中Rh40產生所有5條SphI帶，但其伴隨著Ce的增加而不是D的增加(泳道11)。在Rh33和Rh-32，-46的情況中，都只表現出7.3kb的帶，說明它們在Rh陰性背景中出現(泳道12和13)。另一方面，Rh32，-46出現在DCe背景中並伴隨著8.9kb帶強度的降低(泳道14)。rGr變體缺乏D基因片段但含有ce和Ce片段(泳道15)，表明標記物抗原G由Ce背景引起。至於E/e系列的變體(泳道16和17)，EW載體明顯為DcEW/ace雜合子，最可能在cE基因上帶有一細微的改變。相反，hrS-hrB+可能為與DCe單倍型伴隨的e的變體。綜合起來，這些結果表明多種分子機制在決定Rh抗原基因的等位基因多樣性中起作用(表3)。
實施例6人和非人靈長類動物SphI帶型的比較為了從進化的角度理解SphI構架的來源，分析了來自6種非人靈長類動物的基因組DNA並確定了它們的SphI帶型。如圖8所示，在非常嚴格的洗脫條件下利用與人Ex4-7探針的交叉雜交鑑定了所有非人靈長類動物的Rh樣基因，表明在整個靈長類進化中具有高度的保守性。然而，每一物種具有不同的SphI帶型，其範圍從狒狒的一條帶到大猩猩的五條帶。在更高等的靈長類中，黑猩猩與大猩猩就Dce或DCe單倍型來說似乎最類似於帶有構架I的人(表1)。這個觀察與這兩個物種紅細胞上類D和類C抗原的表達(參考文獻40)和其基因組中2個或3個Rh樣基因的存在(參考文獻41)相符合。其它四種物種每個似乎帶有單個Rh樣基因，因為它們僅顯示出一條或兩條相應於人1.9，5.5和8.9kb對應帶的SphI帶。但是，被檢的6個靈長類物種中沒有一個顯示出了表明Rh陰性單倍型(dce，dcE和dCE)的人7.3kb帶。
實施例7具有同種免疫風險的胎兒的產前評定為了說明SphI構架在具有Rh同種免疫風險的胎兒的產前評定中的用途，平行分析了從白細胞和羊膜細胞(妊娠婦女羊水中的細胞)中分離出的基因組DNA，並確定了胎兒Rh基因的遺傳組成。圖9顯示了根據本發明的方法按在此處描述的技術製備的基因組Southern印跡。這項分析證明不用血清學分型的預先確定，胎兒的D/D，D/d，或d/d狀態就可明確地確定。
在該分子檢測中，兩位母親被發現為dce/dce純合子，而她們每人都懷有一Dce/dce雜合的D陽性胎兒(圖9，中間和右邊的小圖)。這一發現意味著可能發生母胎Rh同種免疫。在第三個例子中，母親與胎兒均為DCe/DCe純合子，因此排除了新生兒溶血症的發生(圖9，左圖)。
若不拘泥於理論，我們現在描述了決定D，C，c，E和e血型抗原表達的人Rh多肽基因的作圖與遺傳。Rh在1號染色體短臂上的位置原來已用細胞遺傳學分析確定(參考文獻42)，最近又用Rh cDNA探針的原位雜交證實(參考文獻43-44)。然而，此處所述的全面的限制性圖譜的構建利用了Rh基因固有的但以前未知的特徵在其外顯子中不存在SphI切割位點，而在包括內含子序列的非編碼區中這些位點呈不對稱分布。這種直接的基因組作圖分別揭示了D和非D基因以及染色體組間相似(若不完全相同的話)的結構組織以及從Rh基因組克隆分析中得到的D的部分EcoRI圖譜和CE的BamHI/XhoI圖譜(參考文獻12，38)。
在產生本發明的過程中已知一組SphI RFLPs與Rh結構基因緊密連鎖。利用外顯子特異的探針，我們已將SphI多態性位點定位在包含外顯子4到外顯子7的基因組區域上。在涵蓋了這4個外顯子的5個SphI限制性片段中，1.2和8.9kb的帶屬D基因，而其它的屬包括ce，cE，Ce和CE等位基因在內的非D基因。可提供信息的常見Rh單倍型純合的個體的分析表明，這些SphI片段以組成4個主要組織構架的不同帶型出現。DNA水平的家族研究進一步證明了這樣的Rh構架以孟德爾共顯性方式整體遺傳，每一個代表了D(或d)與一個非D基因的等位基因的一個不同組合。這些結果提供了Rh單倍型的分子解釋並建立了Rh基因型與血型表型間的遺傳關係。
Rh系統含有近50個不同的抗原和許多不同的表型，因此是所有已知紅細胞血型多態性中最複雜的一種(參考文獻6，39)。關於SphIRFLPs與天然存在的Rh變體連鎖的本研究證明了根本的遺傳異質性，提示了基因結構和/或調節機制的改變。如在此所示，一些變體(即D--，DCW-，和rGr)與新的SphI帶型相伴隨，而其它變體出現於現存的單倍型背景。儘管至今我們的分析仍限於僅15個不同的個體，但結果有力地說明Rh基因座的多樣性主要基於群體水平的等位性。這類似於其它的已鑑定清楚的人基因家族，如主要組織相容性複合物基因(參考文獻45)和MNSs血型系統(參考文獻46)的情況。
Rh系統的臨床重要性源自其抗原強烈的免疫原性以及人群中Rh陰性表型的高頻度(參考文獻1)。儘管親水性模型預見D和非DRh多肽類似地形成多跨膜結構域，但D，C，c，E，和e表位的潛在抗原性仍不清楚(參考文獻8-10)。至於Rh陰性單倍型，在高加索人和黑人中dce出現的頻度最高也最普遍(見表1)。在此所示的Rh陰性基因組DNA的大量圖譜確認了d是D基因缺失或發生改變的結果，與以往的研究結果一致(參考文獻13，47)。另外，本研究表明d單倍型可分為兩個不同的構架。具體地說，儘管dCe或與7.3kb或與1.9和5.4kb的帶相伴隨，但dce，dcE和dCE總是與7.3kb的片段相伴隨。是否這種連鎖不平衡的差異反映了在Rh陰性單倍型進化中兩個獨立的事件以及是否dce的高出現率與種族限制是因一個最初的影響而造成，是仍需提出的問題。正是本發明的方法使得現在能進行這樣詳細的分析。
由Rh血型不相容導致的胎兒母親間的同種免疫仍是新生兒溶血症的重要原因。我們觀察到的四個SphI構架中的每一個與不同的Rh單倍型關聯，可立即用作確定有危險的胎兒基因型的分子方法。如此處已證明的，SphI帶型加上血清學分型能夠真實地確定所有常見的Rh基因型。儘管觀察到了SphI帶型的改變(見上)，但它們僅代表了非常罕見的遺傳變體。因此，這些改變不應成為Rh基因型確定中的主要限制因素。目前，胎兒D分型方法完全依賴於用PCR擴增對D特異的基因組序列的檢測(參考文獻19-20)，這種方法可能對大量的病例造成誤診(參考文獻21-23)。與這些方法相比，SphI構架在Rh基因型確定中的應用優點在於(1)可直接區分與D/D，D/d和d/d狀態有關的Rh接合性以及(2)由非D等位基因組成的基因型可同時推導出來。這種新的直接的基因型確定方法將極有利於Rh同種免疫的遺傳學建議和產前評定。
本發明進一步提供了診斷和實驗試劑盒，其中包括能使本發明的方法以精確，準確無誤以及可重複的方式進行的方法。本發明的試劑盒可包括能用於擴增Rh DNA的一條或一組引物。該試劑盒可包括一種或一組適於產生有關Rh基因型信息的限制性酶。該試劑盒還可進一步包括陽性和/或陰性對照試劑以及其它將本發明的方法用於所需的具體實驗和/或診斷技術的試劑。該試劑盒含有一個或更多的容器以容納引物和/或限制性酶，以及容納試劑盒中任何其它的試劑。
因此，儘管已描述的是目前被認為是本發明中優選的實施方案，本領域的技術人員將意識到在不背景本發明精神的情況下能產生另外的和進一步的實施方案。所有這些進一步的修飾或改變都在本文列出的權利要求合乎原則的範圍之內。
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權利要求
1.一種確定受檢者Rh基因型的診斷方法，包括選擇性切割從受檢者獲得的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定Rh基因型。
2.權利要求1的診斷方法，包括選擇性切割所說的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定RhDd基因型。
3.權利要求1的診斷方法，包括選擇性切割所說的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定RhCc基因型。
4.權利要求1的診斷方法，包括選擇性切割所說的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定RhEe基因型。
5.權利要求1的診斷方法，包括選擇性切割所說的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定RhCcEe基因型。
6.權利要求1的診斷方法，包括選擇性切割所說的DNA樣品以產生Rh基因片段，其量足以鑑定RhDd和RhCcEe基因型。
7.權利要求1的診斷方法，其中選擇性切割步驟包括用基於Rh多態性而有差別地切割Rh基因的一種限制性酶來消化所說的DNA樣品。
8.權利要求7的診斷方法，其中選擇性切割步驟包括用基於一個或更多Rh內含子區的多態性而有差別地切割Rh基因的一種限制性酶來消化所說的DNA樣品。
9.權利要求8的診斷方法，其中選擇性切割步驟包括用含SphI的限制性酶來消化所說的DNA樣品。
10.權利要求1的診斷方法，進一步包括在選擇性切割步驟前選擇性擴增所說的DNA樣品。
11.權利要求10的診斷方法，其中選擇性擴增步驟包括用聚合酶鏈反應，連接酶鏈反應或其組合來擴增所說的DNA樣品。
12.權利要求10的診斷方法，其中選擇性擴增步驟包括用至少一種擴增RhD DNA的引物來擴增所說的DNA樣品。
13.權利要求10的診斷方法，其中選擇性擴增步驟包括用至少一種擴增RhCcEe DNA的引物來擴增所說的DNA樣品。
14.權利要求10的診斷方法，其中選擇性擴增步驟包括用至少一種擴增RhD DNA的引物和至少一種擴增RhCcEe DNA的引物來擴增所說的DNA樣品。
15.權利要求10的診斷方法，其中選擇性擴增步驟包括用一種擴增RhD DNA和RhCcEe DNA的引物來擴增所說的DNA樣品。
16.權利要求1的診斷方法，其中所說的DNA樣品包括基因組DNA。
17.權利要求1的診斷方法，進一步包括從Rh DNA片段中獲得鑑定Rh基因型的信息。
18.權利要求17的診斷方法，其中獲得步驟包括獲得鑑定Rh基因型的信息，其中Rh基因型選自RhDd基因型，RhCc基因型，RhEe基因型，RhCcEe基因型，RhDCcEe基因型及其組合。
19.權利要求17的診斷方法，其中獲得步驟進一步包括分離Rh DNA片段以獲得Rh片段帶型，其中Rh片段帶型提供了特異性鑑定受檢者Rh基因型的信息。
20.權利要求19的診斷方法，其中獲得步驟進一步包括檢測Rh片段帶型中一些或所有的Rh DNA片段。
21.權利要求20的診斷方法，其中檢測步驟包括用非特異的探針組合物標記Rh DNA片段。
22.權利要求20的診斷方法，其中檢測步驟包括用雜交探針組合物標記一個或更多Rh DNA片段。
23.權利要求22的診斷方法，其中標記步驟包括用含一種對RhDDNA片段特異的雜交探針的雜交探針組合物來標記一個或更多RhDNA片段。
24.權利要求22的診斷方法，其中標記步驟包括用含一種對RhCcEeDNA片段特異的雜交探針的雜交探針組合物來標記一個或更多RhDNA片段。
25.權利要求1的診斷方法，進一步包括確定受檢者的非Rh基因型。
26.權利要求1的診斷方法，進一步包括確定受檢者的Rh表型。
27.權利要求26的診斷方法，其中確定步驟包括用血清學檢測來確定受檢者的Rh表型。
28.權利要求1的診斷方法，進一步包括從受檢者獲得DNA樣品。
29.權利要求28的診斷方法，其中獲得步驟包括從含受檢者紅細胞(erythroid)組織的生物樣品中獲得DNA樣品。
30.權利要求29的診斷方法，其中生物樣品包括羊水或絨膜絨毛且受檢者為子宮中的胎兒。
31.權利要求29的診斷方法，其中生物樣品包括血樣。
32.一種用於確定Rh基因型的診斷試劑盒，包括(a)含有擴增Rh DNA的引物的第一試劑容器；和(b)含有切割Rh DNA以提供鑑定Rh基因型的Rh DNA片段的限制性酶的第二試劑容器。
33.權利要求32的診斷試劑盒，其中引物包括擴增RhD DNA和RhCcEe DNA的引物。
34.權利要求32的診斷試劑盒，其中引物包括擴增Rh DNA的引物，Rh DNA選自RhD DNA，RhCc DNA，RhEe DNA，RhCcEe DNA，RhDCcEe DNA及其組合。
35.權利要求32的診斷試劑盒，其中限制性酶基於Rh多態性有差別地切割Rh DNA。
36.權利要求35的診斷試劑盒，其中限制性酶基於一個或更多Rh基因內含子區的多態性有差別地切割Rh DNA。
37.權利要求36的診斷試劑盒，其中限制性酶為SphI。
38.權利要求32的診斷試劑盒，其中試劑盒進一步包括分離RhDNA片段的工具。
39.權利要求38的診斷試劑盒，其中分離工具包括以分子量，電泳遷移率，或色譜遷移率為基礎分離Rh DNA片段的工具。
40.權利要求32的診斷試劑盒，其中試劑盒進一步包括檢測RhDNA的工具。
41.權利要求32的診斷試劑盒，其中試劑盒進一步包括檢測Rh表型的工具。
42.權利要求41的診斷試劑盒，其中Rh表型檢測工具包括用血清學方法確定Rh表型的工具。
43.權利要求32的診斷試劑盒，其中試劑盒進一步包括從受檢者獲得生物樣品的工具。
44.一種確定Rh基因型的診斷組合物，包括鑑定Rh基因型的DNA片段，其由一種限制性酶選擇性切割來自受檢者的DNA樣品獲得。
全文摘要
本發明提供了一種通過Rh多態性的分子基礎的鑑定而確定Rh基因型的診斷方法。具體地說,本發明提供了一種直接確定Dd以及伴隨的CeEe基因型的高準確度的方法,該方法克服了傳統的血清學定型法中存在的缺陷,並可對D/D,D/d,和d/d遺傳狀態進行直接的辨別。該診斷方法可對胎兒進行遺傳分型以評估由Rh同種免疫引起溶血症的風險,並可對夫婦進行遺傳學上的指導和/或化驗以預見涉及Rh不相容的妊娠的結果。本發明中的方法優選使用Rh核酸序列的擴增,還用到了RhD－,RhCc－,和/或RhEe－特異的核酸序列經限制性內切酶切出的不同斷裂。另外,還提供了用於確定Rh基因型的診斷試劑盒。
文檔編號C12N15/09GK1200767SQ96197958
公開日1998年12月2日 申請日期1996年10月28日 優先權日1995年11月6日
發明者黃承漢 申請人:紐約血液中心有限公司