具有經改變的受體結合特性的神經營養因子的製作方法

2023-06-06 19:24:51 2

專利名稱：具有經改變的受體結合特性的神經營養因子的製作方法
技術領域：
本發明提供了經修飾的受體親和力和生物特性的，神經生長因子族中的突變型神經營養性因子。本發明部分上是以對於合理設計神經營養性因子的類似物和嵌合體為有用的模型體系的發展為基礎的。
對細胞生長和分化的控制需要特定的因子，這些因子通過與應答細胞表面上的受體相互作用而發揮其作用。儘管已被發現和表徵過的生長和分化因子的數目正在增加，但與結合和生物活性有關的準確結構以及構成多種受體的活化基礎的有關聯和成因果關係的分子活動尚鮮為人知。
神經生長因子(NGF)是一種118胺基酸多肽，該多肽控制交感神經系統，以及部分感覺和中樞神經系統的生存、發育和分化(Levi-MontalciniandAngeletti，1968;ThoenenandBarde，1980;WhittemoreandSeiger，1987;Thoenenetal.，1987)。生物活性形態的NGF是一種相同亞單位組成的二聚物，其中，每一亞單位都是由母體分子得到的(AngelettiandBradshaw，1971;Angiettietal.，1973)。首次在小鼠中分離出NGF的cDNA克隆(Scottetal.，1983)。其後，在一系列其它物種中，包括某些哺乳動物、鳥類、爬行動物和魚類中，該NGF基因已得以表徵(Schwarzetal.，1989;Hallbǒǒketal.，1991)。
NGF屬於一個結構上和功能上相關的分子族，總稱為神經生長因子族的促神經激素，該族至少包括三個其他成員，腦的衍生的神經營養性因子(BDNF)(Bardeetal.，1982;Leibrocketal.，1989)、促神經激素-3(NT-3)(Hohnetal.，1990;Maisonpierreetal.，1990;Rosenthaletal.，1990;Ernforsetal.，1990)和促神經激素-4(NT-4)(Hallbǒǒketal.，1991;lpetal.，1992)。
NGF與神經和非神經源兩者的各種細胞類型上所表達的低親和力受體相互作用(Ernfors et al.，1988;Yan and Johnson，1988;Heuer et al.，1990;Hallbook et al.，1990)。該神經生長因子族的其他三種促神經激素也能與低親和力NGF受體結合(Rodriguez-Tebar et al.，1990;Ernfors et al.，1990;Squinto et al.，1991;Hallbook et al.，1991)。以10-9M Kd結合了NGF的約75000道爾頓橫跨膜糖蛋白代表了這一受體(P75NGFR)(Johnson et al.，1986;Radeke et al.，1987)。然而，局限於P75NGFR-陽性細胞亞群的高親和力結合(Kd＝10-11M)對傳遞NGF的生物作用是必需的(Banerjee et al.，1973;Herrup and Shooter，1973;Sutter et al.，1979;Richardson et al.，1986)。儘管兩種受體狀態之間的分子關係不完全清楚，但某些報導已指出，對高親和力結合和信號轉導而言，需要沒有結構特徵的P75NGF的胞質範圍，而這些結構特徵對在其他受體中傳遞信號轉導是已知的(Hempstead et al.，1989;Yan et al.，1991;Berg et al.，1991)。
最近已經證明，原始致癌基因trk將NGF的功能受體編碼(Kaplan et al.，1991a;Klein et al.，1991)。此trk原始致癌基因的產物是140000道爾頓的蛋白質(P140trk)，該蛋白質是橫跨膜受體的酪氨酸激酶族的一員(Martin-Zanca et al.，1991)。儘管已假定，該蛋白質參與了NGF的主要信號轉導機制，但關於NGF的P140trk的平衡結合常數仍有相當大的爭議。另一方面Klein等(1991)曾報導P140trk以低和高兩種親和力結合了NGF，Kaplan等(1991)和Hampstead等(1991)報導P140trk以類似於P75NGFR結合的親和力結合了NGF，以及對此二受體而言，為產生高親和力結合需要合併表達。
最近已表明trk原始致癌基因產物構成了NGF的功能受體編碼(Kaplan et al.，1991a;Klein et al.，1991)。與P140trk結合的NGF導致這一分子的快速磷酸化並刺激其酪氨酸激酶的活性(Kaplan et al.，1991a;Kaplan et al.，1991b;Klein et al.，1991)。
相反，P75NGFR在信號轉導中的作用仍然是難以捉模的。最近報導，這一受體的胞質範圍與傳遞神經元分化有關(Yan et al.，1991)並與在PC12細胞中NGF誘導酪氨酸磷酸化有關(Berg et al.，1991)。然而，其他最新的研究已表明，抗P75NGFR的多克隆抗體消除NGF對這一分子的結合和及某些高親和力結合，但不會抑制對NGF的生理反應(Weskamp and Reichardt，1991)。使用表達P140trk細胞系的最新報導已證明，當存在NGF時，這一受體分子可沒有在P75NGFR時作為引起纖維細胞的存活和有絲分裂的增殖的媒介(Cordon-Cardo et al.，1991)。這些研究不能排除在神經元和神經元狀細胞系中對P75NGFR的結合作為引起NGF反應的媒介是很重要的這一可能性。最近還表明了trk原始致癌基因可奪回突變型NGF非反應PC12細胞系中的NGF反應能力(Loeb et al.，1991)。然而，這些細胞仍然表達大量的P75NGFR，從而難於評估，是否存有這類對被觀察的功能效果而言是必需的分子。
通過研究結構-功能關係和具有改變性能的NGF突變體的產生，提供了對NGF藉以發揮其生物效應的分子機理的更好了解。在這一方向上的最初研究已分析了在雛雞NGF中高度保守的胺基酸殘基的功能重要性(lbànez et al.，1990)。更近的是，對NGF和BDNF之間嵌合分子的分析已描繪出與確定這兩種因子生物特性有關的區域(lbànez et al.，1990a)。比較來自不同物種的NGF基因，展現了在所有不同族的脊椎動物中高度保守的胺基酸殘基(參見

圖1，該圖證明在來自不同物種的NGF中和不同促神經激素的同源區域中胺基酸殘基25-36是保守的(單字母代碼))。圖1A示出了來自大鼠(Whittemore et al.，1988)、小鼠(Scott et al.，1983)、人(Ullrich et al.，1983)、牛(Meier et al.，1986)、豚鼠(Schwarzetal.，1989)，雛雞(Ebendaletal.，1986;Meieretal.，1986)，爪蟾屬(參考文獻)和蛇(Selbyetal.，1987)NGF的胺基酸殘基25-36的列線。圖1B示出了來自大鼠NGF的和大鼠BDNF的(Maisonpierreetal.，1990)、大鼠NT-3的(Maisonpierreetal.，1990;Ernforsetal.，1990)和爪蟾屬NT-4(Hallbǒǒketal.，1991)的同源殘基的殘基25-36列線。
在這些保守的部分中間，掃過殘基25-36的區域是最親水的，從而看來會存在於NGF分子的表面上(Meieretal.，1986;Ebendaletal.，1989)。已表明由這一序列設計的合成肽抑制試管內的NGF的生物活性(Longoetal.，1990)。
本發明提供了神經生長因子族的突變型神經營養性分子，這些分子與其親本分子比較具有新的受體結合親和力和特性。本發明部分地是基於將NGF用作確定該分子與P75NGFR和P140trk兩種受體結合時的特定胺基酸的模型體系。本發明基於一種進一步的發現當使用這種模型體系時，可對NGF進行修飾，以導致該分子與P75NGFR結合的能力下降，而同時保持該分子與P140trk結合的能力並且顯示出有可與野生型分子相比的生物活性。在不同的實施方案中，對NGF以及對神經生長因子族其他成員相應區域所作的修飾產生具有對trk信號轉導受體更大特性的神經營養性因子。
圖1.來自不同物種的NGF中胺基酸殘基25-36(單字母代碼)的比較。
圖2.COS細胞中親本和突變NGF的穩定性。
圖3.E35A突變對前肽處理時的影響。
圖4.親本(野生型)及突變體NGF的競爭性受體結合和生物活性。
圖5.低親和力受體結合不足的和NGF突變體親本NGF在PC12細胞中的生物活性。
圖6.親本NGF和NGF突變體的競爭性受體結合。
圖7.K95A突變體對NGF與在不同細胞類型上的受體的受體結合的影響。
圖8.親本NGF和與P75NGFR結合不足的NGF突變體在交感神經元中的生物活性。
圖9.NGF與P75NGFR的受體結合的位點的功能剖析。
神經生長因子(NGF)，與許多其他生長因子和激素一樣，與在應答細胞上的兩種不同受體分子結合。原始致癌基因trk的產物P140trk是一種當前已被鑑定為NGF信號轉導受體的酪氨酸激酶受體。在信號轉導中，低親和力NGF受體，P75NGFR的作用還不夠清楚。儘管涉及受體結合和生理活性的結構仍是未知的，但最近已確定了NGF的晶體結構。
與結合及生物分析相聯的位點-定向誘變提供了評價與神經營養性因子的結合有關的胺基酸殘基功能重要性的有用工具。與鑑別NGF的三維晶體結構相聯的這些研究(McDonaldetal.，1991)能對具有改變了受體結合性能的神經營養性因子作合理設計。
因此，本發明的目的是針對新的，突變型神經營養性因子，這些因子是通過修飾一種或多種屬神經生長因子族中的親本或野生型神經營養性因子的胺基酸而產生的。所選擇的這些修飾足以在保持該因子與trk受體結合能力的同時，降低該因子與低親和力NGF受體的結合。
如本申請中所預期的，對特定胺基酸殘基的修飾改變了NGF的特性。基於NGF的三維結構，已確定，這些胺基酸殘基的改變是在NGF二聚物的外臂處露出的β-髮夾環中(McDonald et al.，1991)。如本文所述，在這一區域內的帶有正電荷側鏈的殘基似乎是與對NGF和P75NGFR之間的主接觸應答的。
申請人已發現，在這些部位上突變的NGF不與P75NGFR結合，但仍保持與trk原始促癌基因的結合和活性。這些結果提示P140trk單獨，至少在培養物中已足以傳遞神經元細胞中NGF的生物活性。使用突變體的NGF所進行的實驗表明了，對早期基因如C-fos表達的誘導或對PC12細胞的神經元的分化都不需要與P75NGFR的結合。此外，無論是表達P75NGFRmRNA和蛋白質(Ernfors et al.，1988;Yan and Johnson 1988)和trk mRNA(G.Barbany，unpublished)的經培養的交感神經元的軸突贅疣抑或神經元的存活均不受與P75NGFR的結合下降的影響。這些結果首次表明，trk原始致癌基因產物足以單獨向培養過的神經元細胞中的NGF傳遞一種應答，從而開闢了闡明在傳遞NGF生物活性中P75NGFR和P140trk兩者的作用以及產生具有改善結合特性的獨特神經營養性因子的獨特的可能性。
儘管有可能在本文所述的突變體中，NGF通過不同的結合位點與由P75NGFR和P140trk的雜二聚物所產生的新囊結合(Hempstead et al.，1991)或另一方面，游離的P75NGFR仍能接觸複合體NGF-P140trk並以這一方式在信號轉導中共同作用，但在可以檢測P75NGFR或P140trk同型二聚體的條件下(Meakin and Shooter，1991)無論是以PC12細胞抑或以感覺神經元所進行的交聯實驗均不能檢測出P75NGFR-P140trk複合體。本發明的突變分子保持著與P140trk結合的事實，有力地支持了所觀察到的生物活性是被這一受體分子單獨傳遞的事實。
本文所主張的，但不是為了限定的是，在神經生長因子族中的某些促神經激素中，即在NGF、NT-3和NT-4中，在β髮夾環30-40中的荷正電的胺基酸在該分子與P75NGFR結合的能力方面起重要作用。因而，按照本發明的一個實施方案，使這些胺基酸中的一種或幾種進行變換，以使這一區域的全部電荷改變，從而降低該分子與P75LNGF結合的能力，同時保持該分子與其相應的trk受體結合的能力。此處所使用的，胺基酸殘基1是成熟蛋白質中第一胺基酸。
在這樣一個實施方案中，賴氨酸32(Lys32)的帶正電荷側鏈被例如丙氨酸(Ala)的甲基所取代。這樣的變換作用將該分子與P75NGFR的結合減少至親本MGF與之結合時所觀察到的該結合的5%(表2和圖6)。在另一實施方案中，賴氨酸32(Lys32)轉變成丙氨酸(Ala)使之與A875的結合減少至親本的結合程度的55%。在另一個實施方案中，還採用將賴氨酸32(Lys32)、賴氨酸34(Lys34)和穀氨酸35(Gln35)同時被丙氨酸取代以完全消除該突變分子與P75NGFR的結合。在這此突變體中的每一個的場合下，儘管降低或沒有與P75NGFR的結合，但這些分子在交感神經節的外殖體上仍保持野生型生物活性。
在又一個實施方案中，根據在第二β-髮夾環中的胺基酸95周圍的荷正電的胺基酸可以與賴氨酸32(Lys32)和賴氨酸34(Lys34)相互作用以形成與結合P75NGFR有關的帶正電荷界面這一發現設計突變型神經營養因子。同時用兩種賴氨酸(賴氨酸34(Lys34)或賴氨酸95(Lys95))中的任一個對賴氨酸32(Lys32)的修飾導致與P75NGFR結合的喪失。儘管缺乏與P75NGFR結合，當以PC12細胞的神經元分化和經培育的交感神經元的存活率測量時，這些突變體仍能與P140trk結合併保持其生物活性。
由於其他三種已知的促神經激素也可與低親和力NGF受體結合(Rodriguez-Tebar et al.，1990;Ernfors et al.，1990;Squinto et al.，1991;Hallbook et al.，1991)，因此可預期到在相應的胺基酸中的類似變化會導致結合特性的類似改變，同時不影響這些分子與其有關的信號轉導trk受體結合的能力。賴氨酸95(Lys95)在迄今所述的全部四種蛋白質中是保守的(在爪蟾屬NT-4中，位置95的胺基酸是賴氨酸(Lys)，而在人體NT-4中位置94和96中為荷正電的胺基酸穀氨醯胺和精氨酸)。另外，在NT-3和NT-4中，賴氨酸32(Lys 32)被精氨酸(Arg)所取代。賴氨酸34在NT-4中也是保守的。因此，本發明預料到，任意這些荷正電的胺基酸的變化(例如以中性，.或荷負電的胺基酸取代荷正電的胺基酸)會降低與P75NGFR的結合。
本發明也包括對賴氨酸95(Lys95)周圍的β-環區進行過其他修飾而改變了的分子。例如，在BDNF中，賴氨酸32(Lys32)和賴氨酸34(Lys34)分別被絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)所取代。有意義的是，BDNF中殘基93-96的立體上封閉的環具有可以補償缺少有賴氨酸32(Lys32)和34(Lys34)的三個連串的荷正電的殘基(兩個賴氨酸和一個精氨酸)。具有被BDNF中相應殘基取代的殘基23-35(可變化區1)的嵌合NGF分子(Lbànez et al.，1991a)顯示出與PC12細胞的低親和力結合降低10倍。該低親和力結合在含有變化區1和來自BDNF的殘基94-98(變化區V)的另一嵌合分子中被恢復，這表明了BDNF中位置95、96和97處的三個荷正電殘基可補償有賴氨酸32(Lys32)和賴氨酸34(Lys34)的缺乏。儘管NGF和BDNF兩者都顯示出對P75NGFR有同等競爭力的結合，但在BDNF的場合下，這一受體也可識別由正協同作用和較慢的分解動力學所反映出的兩種配合體之間的區別(Rodriguez-Tebar et al.，1990)。從而顯得BDNF和NGF可被類似但結構不相同的P75NGFR所識別。本文所述的這些結果對所觀察到的NGF和BDNF之間的區別提供了結構上的解釋並提示其它促神經激素可以通過相同的區域與P75NGFR相互作用。
在本文被具體體現的是對親本神經營養性因子的修飾增強其穩定性。如本文所述，對一個或多個產生於神經生長因子族的神經營養性因子的胺基酸25和36之間的胺基酸殘基的選擇性修飾，顯得改變這些因子的穩定性。因此，本發明設想改變這些胺基酸，隨後測量所改變分子的穩定性和生物活性，以選擇與親本分子相比，仍保持其生物活性，但具有增強了的穩定性的那些因子。
涉及由神經營養性因子，如NGF、BDNF、NT-3和NT-4衍生的第二代因子的本發明可以與親本因子相同的方式被用於治療疾病。例如，它們可用以治療可能與神經營養性因子模型表達改變有關的或可能因在神經營養性因子中的暴露的神經系統的疾病和紊亂。
就按照本發明製得的，不與P75NGFR結合的因子而論，這些分子可具有針對靶細胞的提高了的特性並從而以較低劑量使用是有效。另外，這些分子產生的副作用比與較廣泛分布的神經元細胞系類結合的親本分子所產生的副作用小。姑且被認為是由P75NGFR所傳遞的逆向輸送可通過使用突變的促神經激素而被防止並由此可在表達其高親和力受體的腦的規定區域中(如在腦損傷後的海馬中)產生突變的促神經激素的局部效應。
材料和方法本文所述的全部實驗的使用如下實驗步驟。
DNA克隆和位點-定向誘變將含有來自大鼠NGF基因的前-原NGF編碼序列的770鹼基對EcoRⅠ片段(Whittemoreetal.，1988)克隆成PBSKS+(Stratagene)。使用來自這一質粒的單股DNA作為如Kunkel等.，(1985)所述以及為lbaNez等.，(1990)詳述的以低核苷酸為基的位點-定向誘變的樣板。以鏈-終止法進行的核苷酸序列分析(Sangeretal.，1977)證實這類轉換。為了蛋白質表達，然後將含有所需轉換物DNA插入物在pXM中亞克隆(Yangetal.，1986)。
重組體蛋白質的製備和數量利用葡聚糖-氯奎程序(LuthmanandMagnusson，1983)將生長至70%合生的COS細胞轉染25μg質粒DNA/100mⅢ。為了校正由不同構造製得的重組體蛋白質數量的差別，將平行轉染的35mmⅢ在有100μcl/ml35S-半胱氨酸存在下生長(Amersham)。然後通過SDS/PAGE分析條件培養基的等分試樣並在如上所述的相應放射自顯影照片的光密度計掃描後平衡不同試樣的重組體蛋白質的量(lbanez et al.，1991b)。利用提純的小鼠NGF的標準樣品通過條件培養基的定量免疫印跡和通過測量經培養的交感神經節中的生物活性分析親本NGF蛋白質的絕對量(lbànez et al.，1990;lbanet et al.，1991b)。然後利用由這些分析所得到的數據測定含突變體蛋白質的試樣中該蛋白質的濃度。
脈衝追蹤和免疫沉澱在轉染後48小時，將細胞在無半胱氨酸的培養基中培育4小時。然後用1mCi/ml35S-半胱氨酸在15分鐘內對這些細胞作脈衝標記。通過用加了2mg/ml冷半胱氨酸的完全培養基取代標記培養基進行此追蹤。在不同時間收穫平行的井並用抗小鼠NGF的多克隆兔抗血清(兔no.30)使細胞提取物和條件培養基免疫沉澱(Ebendal et al.，1989)並通過在如前所述的還原條件下(lbànez et al.，1990;lbànez et al.，1991b)用SDS/PAGE對其進行分析。
結合試驗通過氯胺-T法用125Ⅰ將小鼠NGF標記至平均比放射性為3×107cpm/μg。以2-10×106細胞/ml使用大鼠PC12細胞(Greene and Tischler，1936)，人A875細胞(Buxser et al.，1983)和小鼠rtrk-3T3細胞(Kaplan et al.，1991a)使用1.5×10-9M125Ⅰ-NGF連續稀釋的含有相等量親本的或突變的NGF蛋白質的條件培養基，於37℃進行競爭試驗測定穩態結合。以相同時間添加所有組分並在達到平衡後(1-2小時培養)通過離心分離收集這些細胞。使用得自偽轉染COS細胞的培養基進行的對比實驗表明，在條件培養基中存在的其他蛋白質對125Ⅰ-NGF與細胞的結合沒有任何效果。在向其中添加至少過量1000倍摩爾的未標記NGF的平行培養中測定非特性結合。對全部結果進行這一非特性結合的校正，該結合總是小於總結合的10%。測定得到50%結合(IC50)的各種突變體和野生型NGF的濃度。使用關係式(突變體IC50/野生型IC50)×100計算相對的結合。
生物試驗對含有相等量重組體蛋白質(範圍為0.2-20ng/ml)連續稀釋的條件培養基在如上所述的人工培植的9天期小雞胚胎交感神經節上進行生物活性試驗(Ebendal，1984;Ebendal，1989)。通過與從提純的小鼠NGF得到的標準樣品比較，以生物單位(BU)的半定量標度計算纖維贅疣，對其而言1BU相當於約5ng/ml。測定每種以這一標度而給出的0.5BU的NGF蛋白質的濃度，並用以計算與以親本NGF所得到活性相比而成的相對活性。
用連續稀釋的含有相等量重組體蛋白質的條件培養基培養將塗在覆以聚-D-酪氨酸的35mm井中的細胞進行培養。用顯微鏡在不同時間間隔測定帶有長於二個細胞直徑的纖維的細胞的百分數。
通過對來自含有相等量重組體親本和突變體NGF的條件培養基稀釋物處理過的PC12細胞的全部mRNA進行定量Northen印跡分析，測量C-fos mRNA的誘導。按如上所述(lbànez et al.，1990)提取全部RNA。在含有0.7%甲醛的瓊脂糖凝膠中將10μg總RNA電泳，然後轉移入硝化纖維膜上。然後用α-32P-αCTP放射性標記的大鼠C-fos基因片段(Curran et al.，1987)與濾料雜交並嚴格地洗滌。通過放射自顯影照相的光密度計掃描測定C-fos mRNA的量。
在35mm塗覆聚-D-酪氨酸的井中以30000細胞/井的密度培養得自出生後一天大鼠的上頸神經節的離解的神經元。按塗覆時間添加順次稀釋的含有相等量重組體蛋白質的條件培養基並在72小時後通過相差顯微鏡測定神經元的存活率。
實施例1和與PC12細胞受體結合有關的β-髮夾環30-34中的胺基酸基團實驗與結果使用含有等量突變體NGF蛋白質的條件培養基從其在NGF應答嗜鉻細胞瘤細胞系PC12上的受體中置換125Ⅰ-NGF。用這樣一種濃度的125Ⅰ-NGF(～1.5nm)進行競爭性結合試驗在該濃度下80%與該細胞相關的放射性標記配體與低親和力NGF受體相結合。(Sutter et al.，1979)。計算從PC12細胞(IC50)中置換出50%125Ⅰ-NGF所需的親本的和突變型蛋白質濃度(表1)。精氨酸(Arg)對賴氨酸25(Lys25)的保守置換或任意這三種殘基(26、27和29)被丙氨酸(Ala)置換都不會影響該蛋白質對PC12細胞上的受體的親和力(表1)。然而，當修飾天冬氨酸30(Asp30)或異亮氨酸31(He31)時，觀察到親和力降低3-4倍(見實施例2，表1和圖4A)。此外，通過用甲硫氨酸(Met)(在BDNF中這一位置上產生的基團)(Leibroketal.，1989)和用纈氨酸(Val)置換進一步測試異亮氨酸的重要性。有意義的是，只有最保守的變更(131V)才可使結合親和力類似於親本NGF(表1)。在用丙氨酸(Ala)置換賴氨酸32(Lys32)後可觀察到受體結合的顯著降低，在該場合下，與親本NGF相比降低約6倍(表1和圖4A)。用丙氨酸(Ala)置換賴氨酸34(Lys34)和用亮氨酸(Leu)置換纈氨酸36(Val)分別將結合降低到50和45%(重量)(表1和圖4A)。出乎意料的是，未經完全處理的E35A突變體顯示接近於親本的結合親和力(表1和圖4A)，這表明了NGF生物合成的中間體可與NGF受體象成熟細胞一樣有效地結合。
討論NGF二聚物的晶體結構(McDonaldetal.，1991)展現了一種由三對不平行的股和四個環區所組成的新型結構，所述環區包含幾乎所有可在不同NGF相關分子間見到全部可變殘基。這些環中的一個相應於在本發明的研究中所分析的殘基團並包括一個β-髮夾轉折(基團30-34)。我們的結果表明，區域25-36中的這些殘基對NGF分子的穩定性、受體結合和生物活性是重要的(圖9A)。
由於只有密切相關的精氨酸(Arg)，而不是丙氨酸(Ala)或穀氨醯胺(Gln)可在這一位置置換賴氨酸(Lys)形成穩定的蛋白質，因此表明了賴氨酸25(Lys25)起一種重要的結構作用。按照這一觀點，該晶體結構展示了賴氨酸25(Lys25)使側鏈氫與穀氨酸55(Glu55)結合，這對NGF蛋白質的正確摺疊是重要的(McDonaldetal.，1991)。丙氨酸28(Ala28)的缺失阻止了NGF蛋白在條件培養中累積，而該累積是表明這一位置的結構作用的。
穀氨酸35(Glu35)置換丙氨酸(Ala)導致產生了23-34K範圍的未完全處理多肽，該多肽顯示了具有與經完全處理的親本分子類似的受體結合親和力和生物活性。在試管內合成的35K全長NGF母體早就表明具有非常低的生物活性這一事實提示了去除某些氨基終端序列對激活NGF母體可能是重要的(Edwardsetal.，1988)。我們的結果也證明，除了NGF前肽中的保守範圍外(Suteretal.，1991)，成熟分子中的殘基也在完全處理的成熟NGF的生物合成中起作用。
用亮氨酸(Leu)置換纈氨酸36(Val36)上的非極性側鏈也顯出將影響與PC12細胞的受體結合。與異亮氨酸31(11e31)相反，纈氨酸36(Val36)深埋在NGF單聚物中並似乎與形成NGF亞單位的疏水芯有關(McaDonaldetal.，1991)。是亮氨酸(Leu)，而不是丙氨酸(Ala)可在這一位置置換纈氨酸(Val)的事實表明了纈氨酸36(Val36)對該分子芯疏水作用的重要性並提出了，纈氨酸36(V36L)突變體結合的降低可能反映了為在這一位置容納較大的亮氨酸(Leu)側鏈所需的結構上的重新安排。
實施例2
Asp30和Ile31的修飾實驗及結果首先通過檢測該突變性NGF蛋白的刺激出自E9小雞交感神經節的軸突贅疣的能力來研究其特有的生物活性(Levi-Montalcini and Angeletti 1968);Ebendal 1984;Ebendal 1989)。與其從PC12細胞中置換125Ⅰ-NGF的能力一致，該突變體K25R、T26A、T27A及T29A的生物活性都與親本NGF的該活性相似(表1)。為檢測在單個地改變時的Thr殘基可對其修飾作出補償的可能性，在三個Thr殘餘同時被Ala取代的場合下產生一個三重突變體。然而，該突變體未能在轉染細胞介質中以可檢測的程度積累起來(表1)。
通過與其相應的受體結合親合性(表1)相關的D30N和131A突變體(表1及圖4B)看到生物活性下降了4倍。為消除因這些突變體分子穩定性的降低(圖2C)而使活性下降的可能性，在PC12細胞中檢測C-fosmRNA的誘發。資料證明，在這些細胞中的C-fosmRNA誘發的最大值發生在暴露NGF後的30-45分鐘之內(Milbrandt，1986;Gizang-GinsbergandZiff，1990)，時間周期比這些分子的估計半存留期短20-30倍，在PC12細胞暴露於親本NGF(圖4C)30分鐘後，測到C-fosmRNA中的峰。D30N和131A兩種突變體在30分鐘後誘發出最大量的C-fosmRNA，然而，該值比從親本NGF(圖4C)所獲得的最大值小4倍。
有意義的是，具有降低了的，對PC12細胞(131M、K32A、K34A及V36L)的結合親合性的四種突變體顯示出親本水平的生物活性(表1及圖4B)。因此，對K32A突變體而言，結合力降低了6倍並不影響其在交感神經節中的生物活性(比較圖4A和B)。儘管事實上E35A突變體僅含約5%的經正確處理的成熟蛋白(表1和圖4B)，根據受體結合力數據，它仍顯示出親本水平的生物活性。
討論某些重要的氫鍵合側鏈掩蓋在該NGF亞單位中，包括Asp30中(McDonaldetal.，1991)。這些結果表明，當被Ala，一種不使所推薦的氫鍵成為在Lys34處結合到該主鍵的Asp30側鏈的殘基取代Asp30時，該NGF分子的半留期縮短了約20倍。D30N突變體的這一降低了的回收率及半存留期表明，Asn可在這一位置起作用，雖然該作用的效率較低。另一方面，去除Gly33或用丙氨酸取代Gly33導致NGF蛋白回收率的減少，可能這是由於該分子的穩定性下降的緣故。在該位置甘氨酸可因有一超出帶有側鏈的胺基酸允許範圍的主鏈扭轉角而形成一個轉折(Sibandaetal.，1989)。綜合起來，因Asp30及Gly33突變體帶來的這一結果暗示，這些殘基對β-髮夾環30-34的穩定起了結構性的作用，以及通過改變該環的結構而使它們的修飾具有功能性的效果(圖9A)。這些部位在NGF族其它成員中的高度保守暗示著這些殘基在其它三種促神經激素中也起著類似的作用。
由於在30-34處的轉折，該疏水的Ⅰle31就暴露在分子的表面上。Ala對這一殘基的取代降低了在PC12細胞中的受體結合力和生物活性。有意義的是，在取代成Met後，僅生物活性而不是受體結合力被奪走，而變成Val後可見到野生型的結合和生物活性。另外，初步結果表明與131A突變體中的P140trk的結合降低了5倍，而在131M中的這一結合為親本水平。綜合看來，這些結果暗示了Ⅰle31非極性側鏈在與P140trk結合相關生物活性及低的親合結合兩方面的作用(圖9A)。
實施例3以Ala同時取代Lys32、Lys34及Glu35其中每單個突變對生物活性不產生影響的三個帶電殘基Lys32、Lys34及Glu35被Ala同時取代，從而在這些位置消除該帶電側鏈。有意義的是儘管事實上這種突變蛋白含有E35A突變(圖3A)，但它仍能作為充分處理過的蛋白完全回收。該三重突變將這些蛋白對PC12細胞的結合降低到小於對親本分子所觀察到的這一結合的1%(表1及圖4A)。在添加125Ⅰ-NGF前在該細胞用該突變蛋白將這些細胞預培養2小時時，得到同樣的結果(未示出)。然而，該三重突變體在交感神經節中的生物活性與親本NGF活性很接近(表1及圖4B)。
檢查PC12細胞中的神經贅疣以檢測與這些細胞中的生物活性相關的結合是否減少(圖5A)。
單個Lys32、Lys34及Glu35改變成Ala並未明顯地改變這些蛋白刺激神經贅疣的能力，儘管它們與這些細胞上的NGF受體的親合力不同。此外，該三重突變體(K32A+K34A+E35A)還具有親本活性，雖然它對PC12細胞的低親合力結合大大減小(圖5A)。
由於受體間較慢的降解而在結合和生物活性間觀察到明顯不同的可能性也經受檢查。如以其它的經受受體間內吞作用的肽激素(如胰島素)所能看到的，當經過長時間的檢查時，降低的結合親合力不是總能解釋成一種降低了的生物活性。由於這一結合的下降，突變體分子可有一較低的受體間的降解率，導致較慢的，但時間延長的，在積累一段時間後能達到親本水平的生物活性。為調查這一可能性，研究了PC12細胞中的早期的(C-fosmRNA誘導)和晚期(刺激軸突贅疣)的應答動力學。儘管它們的結合親合力下降，但K32A和該三重突變體均以與親本分子相同的時間過程和強度誘導了C-fosmRNA和軸突贅疣(圖5B和C)。
實施例4Lys32及Lys34的突變對NGF結合的影響對PC12細胞所作的受體結合試驗是用高濃度125Ⅰ-NGF完成的，在這一濃度下，大部分觀察到的這種結合是低親合力類型的(Sutter et al.，1979)。然而，由於PC12細胞表達P75NGFR和P140trk這兩種受體(Herrup and Thoenen，1979;Hosang and Shooter，1985;Kaplan et al.，1991b)，所以這些結果不能清楚地區分NGF與這兩種分子中的任一種的結合。因此，將突變體K32A、K34A、E35A和三重突變體K32A+K34A+E35A對A875，即一種僅表達高量P75NGFR的人類黑素瘤細胞系(Buxser et al.，1983)的結合親合力與對rtrk-3T3細胞，即一種表達大鼠P140trk的成纖維細胞系(Kaplan et al.，1991a)的結合親合力進行比較。
用Ala的甲基取代Lys32的帶正電荷的側鏈使該分子對P75NGFR的結合降低到親本NGF所觀察到的這種結合的5%(表2及圖6)。Lys34改變成Ala使A875細胞的結合降低到親本水平的50%。然而Lys32、Lys34及Glu35的同時取代則完全消除了該突變體分子對P75NGFR的結合(表2及圖6)Glu單獨改變成Ala對與A875細胞的結合親合力沒有影響(表2及圖6)，這表明，對該三重突變體所觀察到的這種結合的減少是由於修飾了帶正電荷殘基Lys32及Lys34的緣故。
儘管其對P75NGFR的結合下降了20倍，但K32A突變體在對表達在rtrk-3T3細胞上的P140trk的結合方面仍難與親本NGF區分(表2，圖6)。類似的是，K34A和E35A突變體也顯示出與親本一樣的對P140trk的親合力(表2及圖6)。有意義的是，未從P75NGFR中取代125Ⅰ-NGF的該三重突變體仍保留對P140trk的明顯的結合，程度為對親本NGF所觀察到的這種結合的約55%(表2及圖6)。再者，在另一涉及NGF分子的實施方案中，Lys32、Lys34及Lys95形成一種關係到對P75NGFR結合的正電荷界面。用兩種其它的賴氨酸中的任一種修飾Lys32導致了對P75NGFR結合的下降。儘管缺少對P75NGFR的結合，當通過PC12細胞的神經元分化及經培養的交感神經的存活率進行測量時，這些突變體仍保留對P140trk的結合以及生物活性。
實施例525-36區域中殘基的修飾改變NGF分子的穩定性應用丙氨酸-掃描誘變(CunnighamandWells，1989)以描繪在大鼠NGF的胺基酸殘基25和36之間區域中結構和功能上重要殘基的圖形。這一區域在不同的脊椎動物的物種中高度保守(圖1A)，並且在NGF族中的其它成員中保守50-60%(圖1B)。突變型蛋白被瞬時地在COS細胞中表達。為使用於受體結合的生物分析的突變蛋白的量標準化，用在規定的轉染細胞的條件培養基中的經代謝標記的多肽的SDS-PAGE來評估突變型蛋白的產率。如在表1中所示，突變型NGF蛋白在整個一段10倍的範圍內變化。五種該突變型蛋白(K25A、A28△、D30A、G33△及V36A)未在該培養基中以可測出的水平積累。有意義的是，這些殘基相應於來自在NGF族不同成員中嚴格保守的這一範圍中的五個位置(圖1B)。在Lys25或Gly33分別變成更類似的胺基酸殘基Gln和Ala後均未檢測到蛋白(表1)。相反，D30A和V36A突變體可因分別被取代成Asn和Leu而被奪走，儘管減少的程度低於對野生型(wt)蛋白所觀察到的這一程度(表1)。Lys25也變成在這一位置最可能保守取代的Arg。這種突變得以以約50%的親本蛋白水平測到NGF蛋白(表1)。
在突變型蛋白的量上所觀察到的變化可反映出COS細胞中各單獨的多肽的蛋白合成、穩定性或分泌方面的差別。為區別這些可能性，進行脈衝追蹤實驗，然後再進行免疫沉澱和SDS-PAGE。15分鐘的脈衝後，可從細胞提取物中免疫沉澱出佔優勢的23K親本NGF前體蛋白。經充分處理，追蹤30分鐘後測到突變體13KNGF，而3小時後幾乎全部細胞內NGF均已消失。細胞內NGF的消失與追蹤後6小時呈峰值狀態的，而且在該水平保持至少14小時以上的，在該培養基中出現的NGF有關(圖2B)。所產生的比親本NGF低3-4倍的131A突變體(表1)在該轉染細胞中累積到與親本蛋白相類似的程度(圖2A)。然而，在該培養基中檢測到較低量的131A突變體，而在追蹤後最後17小時發現下降了50%(圖2B)，這表明131A蛋白的穩定性下降。類似的是，在3小時追蹤後以比親本NGF低10倍的量產生的D30N突變型蛋白(表1)明顯減少(圖2C)。另外，追蹤3小時後還可看到含量非常低的D30A突變蛋白，然而在以後的12小時後它們下降到測不出的程度(圖2C)。131A、D30N和D30A突變型蛋白的經縮短的半存留期分別估計為18、12和3小時，這表明這些突變體產率下降的原因是由於這些蛋白在條件培養基中的穩定性較低的緣故。追蹤3小時後在D30N和D30A突變體中所見到的大大下降的峰值暗示，在此情況下蛋白合成也受到影響(圖2C)。
實施例6Glu35取代Ala在條件培養基中，檢測到含量相應於親本NGF的5%的經充分處理的，成熟的E35A突變型蛋白(表1)。然而，經免疫沉澱後，某些在該親本NGF樣品中僅被極微弱地測到的分子量較高的多肽(在20-34K的範圍內)觀察到(圖3A)。在70℃，有1%SDS和1.5MNaCl存在，在免疫沉澱之前的條件培養基的預處理不影響從E35A突變體中免疫沉澱出該多肽的模式(未示出)，這表明分子量較高的多肽不代表與E35A突變體共沉澱的不相關的蛋白。反之，這些多肽的尺寸暗示它們代表未經完全處理的，在E35A蛋白生物合成中的中間體。用此突變體所作的脈衝追蹤實驗表明這一蛋白質未經完全處理的及成熟的兩種形式在條件培養基中是非常穩定的(圖2C及3B)。
實施例7Lys95中的改變對P75NGFR結合的影響實驗及結果以Lys32、Lys34和三重突變體所取得的結果暗示，這二種帶正電荷的殘基構成3NGF和P75NGFR之間的接觸點。計算機圖形所作的NGF結晶結構實驗表明另一帶正電的殘基，Lys 95在立體形態上接近於Lys32及Lys34。當在其它兩種殘基的情況下時，Lys95也被充分暴露，而且不參與二次相互作用。為檢測Lys95也能參加與P75NGFR分子接觸的可能性，用Ala取代這種殘基，還產生了二重突變體K32A+K95A及一種四重突變體K32A+K34A+E35A+K95A。K95A突變體與親本NGF相比顯示出為與PC12細胞結合的65%(圖÷)。然而K95A與K32A或與K32A+K34A+E35A的結合將與PC12細胞的結合急劇地降至親本水平的0.7%(圖7)。對PC12細胞的低親合力結合的下降是與表達在A875細胞上P75NGFR結合的下降相關(表2及圖7)。在四重突變體的情況下，未能測到IC50。然而，儘管它們沒有與P75NGFR結合的能力，但這些突變體保留了從表達在成纖維細胞上的P140trk中取代125Ⅰ-NGF的能力(表2及圖7)並以明顯的程度助長來自交感神經元的軸突贅疣(圖8A)。
三重突變體K32A+K34A+E35A及二重突變體K32A+K95A提供了檢驗在神經元存活中P75NGFR的作用的可能性。檢測經培養3天後，自大鼠上頸部神經節中分離出的交感神經元的存活率。當與親本NGF或提純的小鼠NGF比較時，不到5%的這種細胞在有得自經模擬轉染的細胞的介質存在時，或在正常的介質中存活(圖8B)。然而，在用突變型NGF處理過的培養液中，神經元存活的這一程度與對親本蛋白所觀察的這一程度相同(圖8B)。
討論NGF的晶體結構表明暴露出帶正電荷側鏈的基團群接近於並環繞β-髮夾環30-34(圖9B和C)(McDonald et al.，1991)。對P75NGFR所觀察到的高的，總共的負電荷(估計為4Pl)(Radeke et al.，1987)可能需來自這一區域中的高鹼性NGF二聚物(Pl 9.3)的輔助離子相互作用。這裡提到的結果對這樣一種概念提供了強有力的支持，即這些帶正電的胺基酸殘基起著NGF和P75NGFR間的主接觸點的作用。一系列證據支持這一假說首先，如為結晶結構所表明的那樣，Lys32、Lys34和Lys95被高度暴露(50-70%的側鏈溶劑可達性)，而且其側鏈在該分子中無結構作用(McDonald et al.，1991)。其次，如本文所示，用Lys32取代Ala將該突變體對在低親合力結合條件下結合在PC12細胞上的受體的親合力降低了6倍。第三，Lys32、Lys34和Glu35的同時取代進一步將對PC12細胞的低親合力結合降低到對親本NGF所觀察到的這一結合的1%以下。這不歸因於E35A的突變，因為用Glu35取代Ala並未改變結合的親合力。第四，當與K32A結合時，取代Lys95有一種協同效應，它將對PC12細胞的結合降低到幾乎測不出的程度。第五，在所有的情況下，對PC12細胞的低親合力結合的下降與對表達在A875的細胞上P75NGFR的結合的下降相關。在三重突變體K32A+K34A+E35A及二重突變體K32A+K95A的情況下，與P75NGFR的結合完全消失或分別下降150倍。第六，儘管對P75NGFR的結合減少，但所有的突變型NGF仍保留對P140trk的結合及生物活性，這進一步證實，低親合力結合的減少不歸因於該類突變型蛋白結構中的劇烈變更。
對該多重賴氨酸突變體所觀察到的這種協同效應表明這些帶正電的P75NGFR殘基在形成與P75NGFR結合的界面時起配合作用(圖9B及C)。Lys32看來似乎是形成這種最強的接觸，再加上Lys34，它們可能是這種在K32A突變體中觀察到的殘基結合的主要原因。另外的帶正電的殘基，如先前研究過的Arg100和Arg103(Ibànez et al.，1990)及可能有的Lys88也會對該結合界面產生影響(圖9B和C)。K32A+K34A+E35A及K32A+K95A突變體中的對P75NGFR的結合的減少說明在NGF的表面上需要有最小數量的正電荷，以提供與P75NGFR的穩定接觸。這種模式不排除這樣的可能性即，其它類型的接觸，例如疏水殘基Ⅰle31也會有助於使NGF和P75NGFR間的結合穩定。
其它三種已知的促神經激素也可與該低親合力NGF受體結合(Rodriguez-Tebaretal.，1990;Ernforsetal.，1990;Squintoetal.，1991;Hallbooketal.，1991)。Lys95被保守在迄今所述及的所有四種蛋白中，而在NT-3和NT-4中，Lys34被Arg，另外的帶正電的胺基酸殘基所取代。Lys34還保守在NT-4中，然而，在BDNF中，Lys32和Lys34分別被Ser和GLy取代。有意義的是，BDNF中的殘基93-96的立體封閉環有三個可補償Lys32和Lys34缺乏的連續的帶正電荷殘基。為支持這種假說，具有被BDNF中相應殘基取代的殘基23-35(可變區Ⅰ)的嵌合NGF分子(Ibànez et al.，1991a)顯示降低10倍的對PC12細胞的低親合力結合。該低親合力結合在另外的，得自BDNF的，包含可變區Ⅰ和殘基94-98(可變區Ⅴ)的嵌合分子中被恢復，這表明在BDNF中的位置95、96和97的這三個帶正電殘基確實可補償Lys32和Lys34的缺乏。雖然NGF和BDNF在與P75NGFR的結合上不相上下，但這種受體也能識別該二種配位體間的區別，在BDNF的情況下這類區別是以正的協同性和較慢離解動力學反映出來的(Rodriguez-Tébar et al.，1990)。因此，很明顯BDNF和NGF雖然類似但結構不同還是可被P75NGFR所識別。這些結果對在NGF和BDNF間所觀察到的區別作了結構上的解釋，並說明其它的促神經激素可通過同一區域與P75NGFR相互作用。
本發明不限於本文所述的特定實施方案的範圍。實際上對本技術領域中的普通技術人員而言從上面的敘述及附圖將很清楚除本文上述的內容之外，本發明有多種的變化。這些變化用來進入所附的權利要求書的範圍中。
表1野生型和突變型NGF蛋白質的相關產率、與PC12細胞受體結合和特定生物活性。
突變型蛋白a產率b受體結合c生物活性c野生型野生型的(%)wild type100100100K25A---K25Q---K25R50130100T26A40100100T27A4612063A28△---T29A187174T26A+T27A+T29A---D30A---D30N112523I31A283025I31M5035100I31V34130100K32A7616100G33△---G33A---K34A5350100E35A 5d85e85eK32A+K34A+E35A65165V36A---V36L513390
a.以野生型(wt)殘基(單個胺基酸標記)，再以其密碼子號及該突變體殘基縮寫這些突變體，△表示被刪去的相應的殘基。
b.代謝標記的條件培養基的SDS-DAGE後算出的穩態程度。短線表示突變型蛋白量低於可測出程度(＜2%(wt)NGF)。
c.得自劑量-應答實驗的數據，它們在本文報導的平均值的±10%的範圍內變化。
d.基於充分處理形式的數據(詳見主文)。
e.基於經處理及未經處理形式的數據(詳見主文)。
表2野生型和突變型NGF蛋白質與A875和rtrk-N1H3T3細胞的相關受體結合。
突變型蛋白與A875與rtrk-NIH細胞的結合3T3細胞的結合野生型的(%)野生型100100K32A5100K34A5590E35A100100K32A+K34A+E35A no IC5055K95A5580K32A+K95A140K32A+K34A+E35A+K95A no IC5040得自三個單獨實驗的數據，它們在本文報導的平均值的×10%的範圍內變動。
權利要求
1.一種突變型神經營養性因子，所述因子包括一種具有對一個或多個胺基酸修飾而致使最終的該突變型神經營養性因子保持對irk受體的結合能力，但降低對低親合力NGF受體的結合能力的親本營養性因子。
2.權利要求1的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子系選自由神經生長因子、腦引發神經營養性因子、NT-3和NT-4所組成的組中。
3.權利要求2的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾由以不帶電的或帶負電的胺基酸在胺基酸30-34或胺基酸93-98取代至少一個帶正電的胺基酸所構成。
4.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾是取代Lys95。
5.權利要求4的突變型神經營養性因子，其中所述的Lys95被Ala取代。
6.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子是神經生長因子。
7.權利要求6的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾是取代Lys32。
8.權利要求6的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾是取代Lys34。
9.權利要求7的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾還包括取代Lys34。
10.權利要求7的突變型神經營養性因子，其中所述的修飾還包括取代Lys95。
11.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子是NT-3，而所述的修飾是取代選自由Arg32、His34、Asn93及Asn94所組成的組中的一種或多種胺基酸。
12.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子是BDNF，而所述的修飾是取代選自由Lys95、Lys96及Arg97所組成的組中的一種或多種胺基酸。
13.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子是NT-3或NT-4而所述的修飾是取代Arg32。
14.權利要求3的突變型神經營養性因子，其中所述的親本神經營養性因子是NT-4而所述修飾是取代Glu94或Arg96。
15.改變神經營養性因子的受體結合特性的方法，它包括修飾所述因子以降低該因子對低親合力NGF受體的結合能力。
16.權利要求15的方法，其中所述的修飾包括以相對來說不帶電的胺基酸取代帶正電的胺基酸。
17.權利要求15的方法，其中所述的修飾由以一個不帶電的或帶負電的胺基酸在胺基酸30-34或胺基酸93-98取代至少一個帶正電的胺基酸。
18.增強神經營養性因子穩定性的方法，它包括改變產生於該因子的胺基酸25-36間的胺基酸殘基，通過與親本分子比較測量此經改變的分子的穩定性和生物活性，及選擇那些證實生物活性與親本分子基本相同，穩定性較親本分子增強了的因子。
全文摘要
述及一種改變受體結合特性及神經營養性因子穩定性方法。陳述了具有經改變的受體結合特性的突變形神經營養性因子。特定的實施方案包括結trk受體但不與低親合力NGF受體結合的神經營養性因子。
文檔編號C07K14/48GK1079992SQ93104050
公開日1993年12月29日 申請日期1993年3月6日 優先權日1992年3月6日
發明者哈肯·本特·佩爾松, 卡洛斯·費爾南多·伊班奈茲·莫林納 申請人:哈肯·本特·佩爾松, 卡洛斯·費爾南多·伊班奈茲·莫林納