治療與氧化應激有關的病症的試劑和方法

2023-06-07 12:06:06 2

專利名稱：治療與氧化應激有關的病症的試劑和方法
技術領域：
本發明涉及與氧化應激有關的病症例如神經退行性病變(neurodegenerative disorders)的治療方法。本發明還涉及在與氧化應激有關的病症的治療中使用的新型化學個體，更具體地，涉及二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA)類似物和它們在神經退行性病變治療中的應用。
背景技術：
自由基是相當活潑的會對生物系統造成明顯破壞的化學物類。自由基與生物分子不加選擇的反應會造成細胞和細胞組分(例如線粒體)的損壞，由此使細胞喪失其結構和/或功能以致影響生理過程。
在生物系統中，自由基通常被稱作「活性氧類」(ROS)。ROS是由內源通過含氧物類的代謝生成的，或由毒素和大氣汙染物之類的外源生成的。
ROS對生物分子的侵襲被稱作「氧化應激」。氧化應激已經被認為是許多與衰老有關的退化性疾病，例如帕金森氏症、阿爾茨海默氏症、運動神經元疾病(Motor Neuron Disease)的致病因素，也被認為是亨廷頓氏舞蹈病(Huntinton’s Chorea)、糖尿病和弗裡德萊西氏共濟失調症(Friedreich’s Ataxia)以及不特定的隨年齡增長累積的損傷的致病因素。它還與中風和心臟病發作時以及在器官移植和手術過程中的發炎和缺血再灌注組織損傷(ischemic-reperfusion tissue injury)有關。
在ROS過量和/或抗氧化水平降低時產生氧化應激。因此，可以使用幹擾ROS生成或清除ROS的試劑來治療許多與神經退化有關的病症(神經退行性病變)，例如阿爾茨海默氏症和帕金森氏症。例如，維生素E之類的自由基清除劑(FRS)已經表現出可以減少神經退化並延長患有運動神經元疾病的轉基因鼠的壽命。
在整篇說明書中，可以引用文獻以描述本發明各個方面。然而，我們並沒有承認本說明書引用的任何參考文獻構成現有技術。具體而言，應該理解的是，本文對任何文獻的引用並不是承認這些文獻中的任何一篇在澳大利亞或任何其它國家構成該領域常識的一部分。對這些參考文獻的論述指出了其作者主張的內容，本申請人保留對本文引用的任何文獻的正確性和相關性提出質詢的權利。
發明概述本發明源於發明人對一類新型抗氧化化合物的發現。這些化合物可用於需要預防或降低ROS的生成的應用領域。這些應用領域包括對動物或植物進行治療以預防或治療由氧化應激引起的病症。對人類和其他動物的神經退行性病變的治療是這些化合物一種此類應用的示例。此外，ROS介導的細胞損壞與衰老有關，因此，本發明的化合物的抗氧化性可以用作化妝品中的抗老化劑。另外，還存在其它需要防止底物氧化的工業領域(例如化學工業)，因此本發明的抗氧化劑可用於與這些工業相關的應用。
因此，本發明提供了一種防止或降低氧化應激對底物的影響的方法，該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理該底物的步驟 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分(sugarmoiety)的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和
R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
優選地，R5的化學式如下 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本發明還提供了一種預防或降低氧化應激對生物系統的影響的方法，該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理該生物系統的步驟 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
優選地，R5的化學式如下 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本發明的方法可用於治療人類或動物與氧化應激有關的病症或病況。對於特定的形式，該方法可用於預防或治療神經退行性病變。任選地，神經退行性病變的治療可以包括與另一種治療神經退行性病變用的試劑(例如，利魯唑(Riluzole)、反義DNA(antisense DNA)或其類似物(例如肽核酸)、神經營養因子(例如白血病抑制因子)、神經營養素(NGF、BDNF、NT-3、NT4/5)、神經膠質源性神經營養因子(GDNF)、硫辛酸或菸鹼衍生物)協同施用本發明的抗氧化化合物。
化學式為(I)的抗氧化化合物也可以用於製備治療與氧化應激有關的病狀用的藥劑。
對驅動與缺血、損傷和神經退行性病變有關的神經退化過程的確切觸發物和一連串分子變化(molecular cascades)的了解極少。然而，本發明提出，許多神經系統失調是由Ca2+體內平衡的調節障礙和氧化應激途徑引發的。因此，本發明還提供了與鈣毒性和氧化應激有關的病狀的治療方法，該方法包括施用治療有效量的自由基清除劑和鈣緩衝劑的步驟。
優選地，與鈣毒性和氧化應激有關的病狀是一種神經退行性病變，例如中風、癲癇、帕金森氏症、亨廷頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化、衰老、缺血和阿爾茨海默氏症。
該方法可以包括施用作為自由基清除劑的第一試劑和作為鈣緩衝劑的第二試劑。合適的自由基清除劑包括硫辛酸、2，3-二氫-1-苯並呋喃-5-酚、苯並二氫吡喃-4-酮、trolox(維生素E類似物)、丁基羥甲苯(BHT)和維生素E。合適的鈣緩衝劑包括15-冠-5、18-冠-6、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、環己烷-1，2-二胺四乙酸(CDTA)和二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA)的衍生物。然而，該方法優選包括施用一種既是自由基清除劑又是鈣緩衝劑的單種試劑。最優選地，該單種試劑是化學式為(I)的化合物。
本發明的發明人已經製備出化學式為(I)的二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA)的衍生物，這些衍生物已經顯示出可以作為自由基清除劑和鈣緩衝劑。因此，本發明還提供了化學式為(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽 其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。
R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
化學式為(II)的化合物也可以是金屬鹽的形式，例如鹼金屬(Na+)和鹼土金屬(Ca2+)配合物。
本發明的發明人發現化學式為(II)的化合物也具有抗氧化性。因此，本發明還提供了一種預防或降低氧化應激對底物的影響的方法，該方法包括用化學式為(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理底物步驟。
化學式為(I)或(II)的化合物可以通過清除自由基來預防或降低氧化應激對底物的影響。因此，本發明還提供了一種清除自由基用的配方物，該配方物含有有效量的化學式為(I)或(II)的化合物。
本發明還提供了含有化學式為(II)的化合物和一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。該藥物組合物可用於治療神經退行性病變。
本發明還提供了製備化學式為(II)的化合物的方法和/或製備含有化學式為(II)的化合物的組合物的方法。
發明綜述整篇說明書中使用的各種術語的涵義是本領域普通技術人員公知的。然而，為了便於查閱，現在對其中一些術語進行定義。
整篇說明書中使用的術語「底物」是指生物系統(例如細胞、皮膚)或化學底物(例如易氧化的化學物質)。
整篇說明書中使用的術語「生物系統」是指任何細胞或多細胞系統，並包括單獨的細胞至整個生物體。例如，生物系統可以是受氧化應激影響的動物或人類對象的組織、或受氧化應激影響的整個動物或人類對象。
整篇說明書中使用的術語「神經退行性病變」是指以神經元細胞的過早死亡或功能喪失為特徵的病變。退化過程引起的神經元細胞死亡或功能喪失是人類許多神經系統失調的主要病理特徵。神經元細胞死亡的產生可以是包括外傷、缺血、癲癇、神經退行性病變(例如，帕金森氏症、亨廷頓氏症、阿爾茨海默氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、多發性硬化、中風、或外傷)在內的各種病況引發的後果，也可以是組織生長和維持的正常組成部分。一些遺傳病症產生後期發作的神經元缺失，其中每種對於具體的神經元細胞類型都具有高度特異性。
整篇說明書中使用的術語「烷基」是指優選含有一至二十個碳原子，更優選含有一至是個碳原子的支鏈或直鏈無環單價飽和烴基。
整篇說明書中使用的術語「烷氧基」是指基團「烷基-O-」。優選的烷氧基包括，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1，2-二甲基丁氧基，及類似物。
整篇說明書中使用的術語「烯基」是指含有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和烴基，並包括直鏈、直鏈和環狀基團。
整篇說明書中使用的術語「氨基」是指任選被一個、兩個或三個取代基取代的氮。
整篇說明書中使用的術語「芳基」是指含有一個單環(例如苯基)或兩個稠環(例如萘基)的芳族單價碳環基團，其任選在芳環上的一個或多個位置被取代。
整篇說明書中使用的術語「雜芳基」是指在環中含有至少一個雜原子(例如氮、氧或硫)的芳族單價單環或多環基團，其中該芳環任選在芳環上的一個或多個位置被取代。
整篇說明書中使用的術語「醯基」是指基團烷基-C(O)-、取代烷基-C(O)-、環烷基-C(O)-、取代環烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-和雜環-C(O)-。
整篇說明書中使用的術語「滷」或「滷素」是指氟基、氯基、溴基或碘基。
整篇說明書中使用的術語「聚烯氧基」是指含有一個或多個重複-(烷基-O)-基團的聚烷基醚基團，其中烷基優選含有2或3個碳原子。
整篇說明書中使用的術語「糖類部分」是指直鏈或環狀糖類，尤其是戊糖或己糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖或它們的衍生物。
整篇說明書中使用的術語「藥學上可接受的鹽」是指化學式為(I)和(II)的化合物的藥學上可接受的鹽，這些鹽衍生自本領域中公知的各種有機和無機抗衡離子，並包括，僅僅作為例子，鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨及類似物；而且當該分子含有鹼性官能時，有機或無機酸的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽及類似物可用作藥學上可接受的鹽。
如果需要，可以通過任何合適的分離或提純方法例如過濾、萃取、結晶、柱色譜法、薄層色譜法、厚層(製備)色譜法、蒸餾或結合使用這些方法來實現本文所述的化合物和中間體的離析和提純。參考下文的實施例可以得到對合適的分離和離析方法的具體闡釋。另外，也可以使用其它效果相當的分離或離析方法。
合成符合化學式(I)或(II)的1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA)的衍生物，並發現其具有自由基清除性能。這些衍生物可以用作BAPTA生理活性酸或鹽的前體藥物。不受關於化學式為(I)或(II)的化合物作用模式的具體理論的束縛，本發明的發明人假設這些化合物用作BAPTA可滲透細胞膜的共價共軛物。當受到細胞內酶的作用時，共軛物中的一個或多個的共價鍵斷裂，從而釋放出活性物類，其被認為是BAPTA或其鹽。
盡發明人所知，先前還沒有研究或確認化學式為(I)或(II)的化合物的自由基清除性能。因此，這些化合物是一種可用於治療與氧化應激有關的神經和其它病症的新型的自由基清除或抗氧化化合物。
已經發現大量醫學病況與氧化應激有關。氧化應激很可能在與衰老過程伴生的慢性、退化性病症或病況中起著尤為重要的作用。這些病症包括神經退行性病變(例如阿爾茨海默氏、帕金森氏、亨廷頓氏等等)、腫瘤性疾病、中樞神經系統失調、血管病、糖尿病併發症、衰老和缺血組織損傷之類的病況。
運動神經元中自由基清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)的遺傳或翻譯後變異幹擾其功能並導致運動神經元易於受到自由基的侵襲。自由基清除劑例如維生素E的此前已經表現出能夠降低神經退化並延長患有神經元疾病的轉基因鼠的壽命。因此，化學式為(I)或(II)的自由基清除化合物可用於治療神經系統失調和神經系統外傷。
如前所述，本發明提供了一種預防或降低氧化應激對底物的影響的方法，該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理底物的步驟
其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本發明還提供了一種預防或降低氧化應激對生物系統的影響的方法，該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理生物系統的步驟 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
對這兩種方法而言，在化學式為(I)的化合物中，R2優選為-CH2CH2O-R5，R3優選為-CH2C(O)R6，R4和R6優選為-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一個或多個。
或者或此外，對這兩種方法而言，R5優選具有如下化學式 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
已經合成出表1所示的化學式為(I)和(II)的化合物，而且它們都表現出具有使用本文所述方法評估的抗氧化性能。
表1
在本發明的另一具體實施方案中，化學式為(I)的化合物具有如下化學式 其中R1和R2獨立地選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；和R3選自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖類部分、-聚烯氧基、和水增溶基團。
此外，在本發明的方法中也可以使用化學式為(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽。
其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。
R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
在某些情況下，優選增加本發明的化合物的水溶性。對於水溶應用，優選至少一個R基團(例如化學式為(I)的化合物中的R4或化學式為(II)的化合物中的R3/R4)包括水增溶基團，例如磺酸根、硫酸根、羧酸根、羥基、氨基、銨、糖、直鏈或環狀糖類、抗壞血酸根、被-OH在任何位置取代的烷基鏈、乙二醇(包括聚乙二醇)、聚醚、硼化物及類似物，以提高控制劑的溶解性或遷移性。
測量試驗化合物對溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)的還原，使用該方法測定該特定化合物清除自由基的能力。
或者，或此外，在存在測試化合物的情況下用過氧化氫氧化亞油酸，在此過程中測量測試化合物的效力，以此測定該特定化合物清除自由基的能力。結果表明化學式為(I)和(II)的化合物作為有效的抗氧化劑具有與維生素E(已知的抗氧化劑)相同的效力。在該測定中加入各種濃度的鈣離子時，獲得相似的結果。
除了所述的BAPTA類似物的自由基清除活性外，這些化合物還可以充當鈣緩衝劑。因此，這些類似物具有雙重作用它們既可以清除自由基，也可以緩衝鈣。
除氧化應激途徑外，還有大量證據表明興奮毒性(excitotoxic)途徑也會導致神經退化。神經元和突觸活性的功能很強地依賴於鈣離子。過度刺激離子移變受體的過量穀氨酸觸發興奮毒性，生成過量Ca2+。超載的鈣激活了導致神經元死亡的蛋白酶和核酸酶。內源的Ca2+緩衝蛋白質無法應對病理性的細胞內Ca2+負載，由此導致神經元特別容易受到鈣毒性侵襲。多種病症，例如與缺血有關的病症、損傷和神經退行性病變，都是由Ca2+體內平衡的調節障礙引發的。
此外，來自嚙齒類動物的證據表明，神經元鈣體內平衡的改變一般與大腦的老化同時產生，而且可能與認知功能隨年齡的衰退有關。實驗證據表明，在老化的神經元中，改變了的鈣體內平衡可能是某些由老化引起的記憶缺陷的影響因素。按照本發明，可以對動物或人類施用治療有效量的自由基清除劑和鈣緩衝劑以治療與鈣毒性和氧化應激有關的病狀。為此，可以使用任何合適的給藥規程，施用化學式為(I)或(II)的化合物。
化學式為(I)或(II)的化合物(或其藥學上可接受的鹽)可以與藥學上可接受的賦形劑、載體、稀釋劑、滲透增強劑、增溶劑和佐劑一起製成藥物組合物。合適的藥學上可接受的賦形劑包括能夠與化學式為(I)或(II)的化合物共同施用以利於發揮其預期功能的溶媒或載體。這種介質在藥學上活性物質中的應用是本領域已知的。
合適的賦形劑的部分例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、無菌鹽水、糖漿和甲基纖維素。配方物還可以含有潤滑劑例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤溼劑；乳化和懸浮劑；防腐劑例如苯甲酸甲酯和苯甲酸丙基羥酯；甜味劑；和調味劑。這些組合物可以配製成在病人服藥後提供活性成份的快速、持續或延遲釋放。
一種或一種以上化學式為(I)或(II)的化合物可以單獨施用或者與其它治療劑(例如，治療神經退行性病變用的其它試劑)、載體、佐劑、滲透增強劑及類似物一起施用。可以使用如『Remington’sPharmaceutical Sciences』，Mace Publishing Co.，Philadelphia，Pa.第17版(1985)和『Modern Pharmaceutics』，Marcel Dekker，Inc.第3版(G.S.Banker C.T.Rhodes，Eds.)中描述的那些傳統技術配製這些組合物。可以使用配製化學領域的技術人員已知的標準程序製備化學式為(I)的化合物的藥學上可接受的鹽。
化學式為(I)或(II)的化合物可以通過治療劑的任何公認的給藥形式進行給藥，例如通過口服、腸胃外給藥、通過吸入噴霧、吸附、吸收、局部給藥、直腸給藥、經鼻子給藥、頰內給藥、陰道給藥、心室內給藥、通過含傳統無毒藥學上可接受的載體的藥劑的植入儲藥，或通過任何其它方便的劑型進行給藥。最合適的途逕取決於被治療病況的性質和嚴重程度。本文所用的術語腸胃外包括皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、鞘內、心室內、膜內和顱內注射或輸液方法。對於腸胃外給藥，該組合物可以是無菌注射溶液和無菌套裝粉劑的形式。
口服給藥時，該組合物通常使用本領域已知的傳統設備和技術配製成單位劑型如藥片、扁膠劑、粉劑、粒劑、珠狀、咀嚼錠劑、膠囊、液體、水懸浮液或溶液，或類似的劑型。這些配方物中典型地包括固體、半固體或液體載體。示例性載體包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、礦物油、可可脂、可可油、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、糖漿、甲基纖維素、聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及類似物。
這些組合物優選以物理上分離的單位配製成單位劑型，該單位劑型是適合作為人類對象和其它哺乳動物使用的單位劑量，每個單位含有預定量的活性物質以產生所需的治療效果，還含有合適的藥學上可接受的賦形劑。
以治療有效量施用化學式為(I)或(II)的化合物或它們的藥學上可接受的鹽。醫師根據相關情況，包括被治療的病況、所選給藥途徑、實際施用的化合物及其相應的活性、每個患者的年齡、體重和反應、患者症狀的嚴重程度以及類似情況，確定實際施用的化合物量。
化學式為(I)或(II)的化合物可以以1至50毫克/千克的劑量進行施用。每星期通過腹腔施用1、10、100和1000毫克/千克的劑量。還設想可以口服含化學式為(I)或(II)的化合物的配方物。
化學式為(I)或(II)的抗氧化化合物可以用作抗老化劑，因此含有一種或一種以上這些化合物的組合物可用於化妝或局部塗敷。在局部施用時，這些組合物可以是含例如多達5wt％活性化合物的乳狀液、霜、膠、溶液、軟膏的形式。
除了用化學式為(I)或(II)的化合物進行治療，本發明的方法還包括施用作為自由基清除劑的第一試劑和作為鈣緩衝劑的第二試劑。合適的自由基清除劑包括類胡蘿蔔素、類檸檬素(limonoids)、植物甾醇類、類黃酮、花色素、兒茶素、異黃酮、寡聚原花色素(oligomericproanthocyanidin)、異硫氰酸鹽、雙硫醇硫酮(dithiolthione)、蘿蔔硫素(sulforaphane)、類異戊二烯、生育三烯酚、生育酚(例如維生素E)、硫辛酸、輔酶Q、抗壞血酸鹽(例如維生素C)、2，3-二氫-1-苯並呋喃-5-酚、苯並二氫吡喃-4-酮、C60和trolox。合適的鈣緩衝劑包括15-冠-5、18-冠-6、EDTA和BAPTA的衍生物。
附圖簡要說明

圖1是在存在本發明的抗氧化劑的條件下進行的亞油酸氧化在234nm處的時間和吸收率關係圖。圖中所用的「MJM羧酸」是指化合物(4)，而「MJM酯」是指化合物(3)。
圖2是暴露在百草枯(paraquat)中由氧化應激引起的新生鼠成纖維細胞的細胞死亡圖。用剛製備的百草枯或過亞硝酸鹽處理細胞(5×103/孔)過夜。檢定孔中培養基的乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，並作為細胞毒性的標記。高劑量的百草枯而非過亞硝酸鹽引起明顯的細胞死亡。數值表示三個相同孔的平均值±SEMs，與未處理的細胞差異*P＜0.05。X軸代表百草枯和過亞硝酸鹽的濃度，單位為μM。
圖3表示(S)-5-fluorowillardiine(「(S)-5-FW」)對NSC-34D運動神經元細胞系的存活(MTT還原)產生的影響。這些細胞以1×104細胞/孔在含有1％(v/v)FCS的DMEM/F-12中培養48小時，然後用各種濃度的(S)-5-FW處理72小時。在培養基中加入MTT溶液(0.5毫克/毫升)2小時，將細胞增溶，確定MTT還原量，表示為處理後細胞的百分比。使用單向ANOVA(*P＜0.05，***P＜0.001)確定與對照物(不含(S)-5-FW)在統計學上的明顯差別。可以看出，(S)-5-FW以受濃度控制的方式引起明顯的細胞死亡，其在1000μM[(S)-5-FW]濃度時作用最大。
圖4表示用化合物(3)共處理的SODI693A轉基因鼠的體重。在溶媒(vehicle)(A)組中，出生後116天時觀察到與肌肉萎縮有關的統計學上明顯的體重降低(星號)。在其餘組別，即LIF+(3)(B)、PNAG3+(3)(C)和LIF+PNAG3+(3)(D)中，這一現象延遲到出生後130天。每組有10隻老鼠(5隻雄鼠，5隻雌鼠)，平均值+SEM*P＜0.05。
圖5是在溶媒(VEH)、LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)組中(n＝10個/組)的SODI693A轉基因鼠的運動表現和存活情況圖。直方圖『A表明LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)組與溶媒組的明顯差別。在這三組之間沒有明顯差別。在bar grab測試(B)中，也觀察到這三個處理過的組有相似的明顯改進。處理過的老鼠的Kaplan-Meier存活曲線也表明，與溶媒組(C)相比，LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)組中壽命有明顯提高。
本發明優選實施方案的描述現在提供具體實施本發明的上述一般原理的實施例。但是，需要理解的是，下列描述並不限制上述說明的普遍性。
化學式為(I)或(II)的化合物的合成實施例1二[2-(二-乙氧基羰基甲基)氨基苯氧基]乙烷(「化合物(3)」)和二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(BAPTA)(「化合物(4)」)使用文獻方法(參看Tsien，R.Y.，J.Am.Chem.Soc.，1980，19，2396-2404和Grynkiewicz，G.；Poenie，M.和Tsien，R.Y.，J.Biol.Chem.，1985，260(6)，3440-3460)製備二[2-(二-乙氧基羰基甲基)氨基苯氧基]乙烷(3)和二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸(4)。
實施例2N，N-二(乙酸)鄰甲氧基苯胺(6) N，N-二(乙氧基羰基甲基)鄰甲氧基苯胺(5)的合成將0.92毫升(8.12毫摩爾)的鄰甲氧基苯胺與1.2當量的Proton Sponge(2.09克)、0.14當量的碘化鉀(189毫克)和2.4當量的溴化乙酸乙酯(2.16毫升)在無水乙腈中混合，並回流過夜。將反應混合物用甲苯稀釋並過濾，並將濾出物用2M HCl(×2)和H2O洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑。通過柱色譜法(30％EtOAc/己烷)將粗製品提純，得到1.10克(3.69毫摩爾)黃色油(5)(45％產率)。1H NMRδ(300MHz，CDCl3)6.88，m，4H，Ar-H；4.18，q，4H，J7.17Hz，-O-CH2-CH3；4.13，s，4H，N-CH2-；3.80，s，3H，-O-CH3；1.25，t，6H，J7.17Hz，-O-CH2-CH3。13C NMRδ(75MHz，CDCl3)171.2，C＝O；151.2，C1；138.6，C2；122.2/120.8/119.0/111.9，C3/C4/C5/C6；60.6，-O-CH2-CH3；55.5，-O-CH3；54.0，N-CH2-；14.3，-O-CH2-CH3。MS(ESI，+ve)m/z 296.1[M+H]+，318.1[M+Na]+，613.3[2M+Na]+。
N，N-二(乙酸)鄰甲氧基苯胺(6)在空氣中，將200毫克(0.677毫摩爾)(5)溶於最少量的溫乙醇(7毫升)中，並用2.1當量的濃氫氧化鉀(80毫克)水溶液進行處理。溫和地加熱15分鐘，減壓去除乙醇並將殘餘物再溶於H2O(20毫升)並在冰浴中冷卻。緩慢加入濃HCl至pH2。加入HCl時沒有形成沉澱，因此將產物萃取到EtOAc中，並減壓去除溶劑。粗製品從EtOAc/己烷(×2)中重結晶，得到40毫克(0.207毫摩爾)淺褐色固體(6)(31％產率)。1H NMRδ(300MHz，CDCl3/DMSO)6.77，m，4H，Ar-H；3.90，s，4H，N-CH2-；3.68，s，3H，-O-CH3。13C NMRδ(75MHz，CDCl3/DMSO)173.5，C＝O；151.5，C1；138.0，C2；122.9/120.7/119.7/111.7，C3/C4/C5/C6；55.5，-N-CH2-；55.3，-O-CH3。MS(ESI，+ve)m/z 240.1[M+H]+，262.1[M+Na]+。
實施例34-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙醯乙酯(10)和4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酸(11)的合成4-硝基-1，2-二甲氧苯(8)的合成 在鄰二甲氧基苯(7)(2.5毫升，19.6毫摩爾)和二氯甲烷(50毫升)的溶液中加入濃硝酸(2毫升)，並將其在室溫下攪拌24小時。然後用水(3×50毫升)清洗有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑。將離析出的產物放置固化，得到3.5克黃色固體(8)(0.02摩爾，98％產率)。
熔點90-94℃(文獻熔點97-98℃)29。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ7.92(dd，1H，J8.9Hz，J2.6Hz，Ar-H)；7.75(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.91(d，1H，J8.9Hz，Ar-H)；3.98(s，3H，[C2]-OCH3)；3.97(s，3H，[C1]-OCH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ153.6，(C4)；147.9，(C2)；140.6，(C1)；116.8，(C5)；108.9，(C6)；105.5，(C3)；55.5，([C2]-OCH3)；55.3，([C1]-OCH3)。IR(Nujol)1568，m；1500，m；1500，s；1345，s；1280，s；804，m。質譜(ESI，+ve)m/z 183.8[M]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯(9)的合成 將4-硝基-1，2-二甲氧苯(8)(1.03克，5.62毫摩爾)溶於95％(v/v)乙醇(60毫升)並在炭載鈀(0.11克)上用水合肼(30毫升)氫化。將該反應回流24小時。將熱溶液濾過C鹽，並減壓去除溶劑。加入水，並將產物萃取到二氯甲烷中，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑，得到粘性液體，然後將其置於冰上，得到0.80克白色粉末(9)(5.22毫摩爾，93％產率)。
熔點82-85℃(文獻熔點83-87℃)30。分解溫度205℃。1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.66(d，1H，J8.4Hz，Ar-H)；6.26(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.18(dd，1H，J8.4Hz，2.6Hz，Ar-H)；3.77(s，3H，[C1]-OCH3)，3.76(s，3H，[C2]-OCH3)，3.38(br s，2H，NH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ148.9，(C1)；141.1，(C2)；139.8(C4)；112.3(C6)；105.5(C5)；99.8，(C3)；55.7([C1]-OCH3)；54.7([C2]-OCH3)。IR(Nujol)3380，br s；1596，m；1514，s；11463，s；1236，s；849，m。質譜(ESI，+ve)m/z 153.8[M]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙醯乙酯(10)的合成
在氮氣氛下，將4-氨基-1，2-二甲氧苯(9)(0.15克，0.95毫摩爾)、碘化鉀(0.32克)和溴化乙酸乙酯(0.5毫升)的混合物在無水乙腈(5毫升)中回流48小時。然後將溶液冷卻，用甲苯(5毫升)稀釋並過濾。用2M鹽酸(2×20毫升)和水(2×20毫升)清洗收集到的濾液，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑，得到0.14克棕色油(10)(0.43毫摩爾，45％產率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.74(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.34(d，1H，J2.8Hz，Ar-H)；6.20(dd，1H，J8.7Hz，2.8Hz，Ar-H)；4.21(q，4H，J7.1Hz，-O-CH2-CH3)；4.12(s，4H，-N-CH2-)；3.81(s，3H，[C1]-O-CH3)，3.77(s，3H，[C2]-O-CH3)，1.25(t，6H，J 7.1Hz，-O-CH2-CH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ169.9，(C＝O)；148.8，(C1)；141.7，(C2)；141.6，(C4)；112.0，(C6)；104.4，(C5)；98.7，(C3)；60.2，(-O-CH2-CH3)；55.6，([C1]-OCH3)；54.9，([C2]-OCH3)；53.5，(-N-CH2-)；13.3，(-O-CH2-CH3)。IR(Nujol)2978，m；2853，w；1744，s；1520，s；1189，s。質譜(ESI，+ve)m/z 326.3[M]+；348.3[M+Na]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酸(11)的合成 通過溶於溫乙醇(10毫升)並加入氫氧化鉀的稀釋水溶液(0.2克/20毫升)(5毫升)，由此將酯化合物(10)皂化成其各自的鉀鹽。將該溶液溫熱5分鐘並減壓去除乙醇。攪拌同時逐滴加入6M鹽酸，由此獲得羧酸。將該產物萃取到乙酸乙酯(20毫升)中，並減壓去除溶劑，得到30.2毫克暗紅/棕色固體(11)(0.11毫摩爾，24％)。
1H n.m.r(300MHz，d6-DMSO)δ6.79(d，1H，J8.8Hz，Ar-H)；6.21(d，1H，J2.9Hz，Ar-H)；6.01(dd，1H，J8.8Hz，3.0Hz，Ar-H)；4.07(s，4H，-N-CH2-)；3.70(s，3H，[C1]-OCH3)，3.62(s，3H，[C2]-OCH3)。13C n.m.r(75MHz，d6-DMSO)δ172.1，(C＝O)；149.1，(C2)；142.5，(C1)；140.5，(C4)；113.8，(C6)；102.8，(C5)；97.9，(C3)；56.0，([C1]-OCH3)；54.9，([C2]-OCH3)；52.9，(-N-CH2-)。
4-氨基[N，N-二乙醯乙酯]苯並-18-冠-6(15)和4-氨基[N，N-二乙酸]苯並-18-冠-6(16)的合成4-硝基苯並-18-冠-6(13)的合成 在攪拌中的苯並-18-冠-6(12)(0.25克，0.81毫摩爾)的二氯甲烷(15毫升)溶液中，加入濃硝酸(0.25毫升)。將該溶液在室溫下攪拌24小時。用水(3×30毫升)清洗有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑。將離析出的油狀產物放置固化，得到0.28克黃色結晶固體(13)(0.78毫摩爾，96％產率)。粗製品的1H n.m.r表明產物和二氯甲烷的存在情況。再將該產物乾燥24小時，然後用於隨後的反應。
熔點82-83℃(文獻熔點80-81℃)31。分解溫度312℃。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ7.88(dd，1H，J8.9Hz，2.6Hz，Ar-H)；7.74(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.89(d，1H，J8.9Hz，Ar-H)；4.24(m，4H，OCH2)；3.95(m，4H，OCH2)；3.77(m，4H，OCH2)；3.72(m，4H，OCH2)；3.68(s，4H，OCH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ154.3，(C4)；148.4，(C2)；141.3，(C1)；117.9，(C5)；111.2，(C6)；108.1，(C3)；70.99，(OCH2)；70.98，(OCH2)；70.8，(OCH2)；70.7，(OCH2)；70.60，(OCH2)；70.57，(OCH2)；69.23，(OCH2)；69.17，(OCH2)；69.1，(OCH2)。IR(Nujol)1587，m；1520，s；1464，s；1338，s；1276，s；1128，s，864，w。質譜(ESI，+ve)m/z 358.1[M]+；381.1[M+Na]+。
4-氨基苯並-18-冠-6(14)的合成 將4-硝基苯並-18-冠-6(13)(0.40克，1.11毫摩爾)溶於95％(v/v)乙醇(25毫升)，並在炭載鈀(40毫克)上用水合肼(12毫升)氫化。將反應回流24小時。將熱溶液經C鹽過濾，並減壓去除溶劑。加入水，並將產物萃取到二氯甲烷中，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑，得到粘性液體，然後將其置於冰上，得到0.28克白色粉末(14)(0.86毫摩爾，84％產率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.74(d，1H，J8.4Hz，Ar-H)；6.29(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.21(dd，1H，J8.4Hz，2.6Hz，Ar-H)；4.09(m，4H，OCH2)；3.89(m，4H，OCH2)；3.73(m，8H，OCH2)；3.68(s，4H，OCH2)，3.46(br s，2H，NH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ149.0，(C1)；140.7，(C2)；140.4，(C4)；115.5，(C6)；106.1，(C5)；101.5，(C3)；69.7，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.5，(OCH2)；69.0，(OCH2)；68.8，(OCH2)；68.6，(OCH2)；67.5，(OCH2)。IR(Nujol)3585，m；3362，m；1622，m；1594，m；1100，s。質譜(ESI，+ve)m/z 328.1[M]+；351.1[M+Na]+。
4-氨基[N，N-二乙醯乙酯]苯並-18-冠-6(15)的合成 在氮氣氛下，將4-氨基苯並-18-冠-6(14)(0.28克，0.84毫摩爾)、碘化鉀(0.28克)和溴化乙酸乙酯(0.2毫升)的混合物在無水乙腈(6毫升)中回流48小時。將溶液冷卻，用甲苯(10毫升)稀釋，並過濾。用2M鹽酸(3×20毫升)和水(2×20毫升)清洗收集到的濾液，經硫酸鈉乾燥，過濾並減壓去除溶劑，得到84毫克棕色油(15)(0.17毫摩爾，20％產率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.79(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.29(d，1H，J2.9Hz，Ar-H)；6.16(dd，1H，J8.7Hz，2.7Hz，Ar-H)；4.20(q，4H，J7.1Hz，-OCH2-CH3)；4.10(m，4H，OCH2)；4.08(s，4H，N-CH2-)；3.89(m，4H，OCH2)；3.72(m，8H，OCH2)；3.67(s，4H，OCH2)，1.26(t，6H，J7.1Hz，-OCH2-CH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ170.0，(C＝O)；148.7，(C1)；142.7，(C2)；140.7，(C4)；115.3(C6)；104.7，(C5)；100.5，(C3)；69.7，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.5，(OCH2)；69.5，(OCH2)；68.7，(OCH2)；68.6，(OCH2)；67.8，(OCH2)；60.1，(-O-CH2-CH3)；53.1，(N-CH2-)；13.3，(-O-CH2-CH3)。IR(Nujol)2876，m；2362，w；1744，s；1615，m；1520，s；1452，m；1183，m。質譜(ESI，+ve)m/z 500.4[M]+；522.5[M+Na]+。
4-氨基[N，N-二乙酸]苯並-18-冠-6(16)的合成 通過溶於溫乙醇(10毫升)並加入氫氧化鉀的稀釋水溶液(0.2克/20毫升)(5毫升)，由此將酯化合物(15)皂化成其各自的鉀鹽。將該溶液溫熱5分鐘並減壓去除乙醇。攪拌同時逐滴加入6M鹽酸，由此獲得羧酸。然後將該產物萃取到乙酸乙酯(20毫升)中，經硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓去除溶劑，得到12.5毫克黃色固體(16)(0.03毫摩爾，21％產率)。
1H n.m.r(300MHz，d6-DMSO)δ6.83(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.25(d，1H，J2.4Hz，Ar-H)；6.03(dd，1H，J8.7Hz，2.8Hz，Ar-H)；4.07(s，4H，N-CH2-)；4.01(m，4H，OCH2)；3.77(m，4H，OCH2)；3.58，(m，8H，OCH2)；3.55(s，4H，OCH2)。
化學式為(I)或(II)的化合物的應用實施例5化學式為(I)或(II)的化合物在活體外的抗氧化性測定加入自由基清除劑(FRS)，更常稱作抗氧化劑，通常可以預防類脂氧化。它們的作用是將活潑而且有害的分子例如羥基、硝醯基、超氧化物自由基轉變成可以被生物過程忽略或改造的無害分子。造成細胞死亡的主要途徑之一是氧化應激。氧化應激是由這些有害自由基對細胞壁和膜的作用產生的，這種作用引起細胞壁和膜的破損。在氧化評測(反應方案1)中，使用AAPH作為生成自由基引發劑的超氧化物，並根據存在和不存在自由基清除劑時，亞油酸的氧化產生的氫過氧化共軛二烯的生成來計算其效力。氫過氧化共軛二烯酷似對細胞壁施加的細胞氧化應激的產物。抗氧化劑可以在反應的任何階段通過與適當的自由基反應(反應方案1)來產生作用以停止或減緩共軛二烯的生成。
一種方便的測定水溶液系統中抗氧化劑效力的試驗是使用2，2-偶氮二(2-脒丙烷).2HCl(AAPH)作自由基引發劑(反應方案1)的設計。使用Cary 100 UV-Vis分光光度計在234nm處監測亞油酸於37℃在水溶液系統中的氧化產生的氫過氧化共軛二烯(LOOH)的生成情況，監測持續15分鐘。由抗氧化劑抑制自由基並由此使亞油酸的氧化減緩或停止的能力測定其效力。
反應方案1
測定標準情況(即不存在抗氧化劑時自由基的生成情況)下的效果。然後使用下述方程式計算效力效力(％)＝1-[K2/K1]×100其中K1＝標準情況(無氧化劑)下的氧化速率＝[吸收率之差]/[時間(秒)]K2＝氧化劑的氧化速率＝[吸收率之差]/[時間(秒)]所述方法是一種仿生方法，其被設計成產生一些與活體產生的自由基相同的自由基。氧化並不是通過加入過氧化氫產生的。
在測試本發明的化合物的效力之前，對許多公知的抗氧化劑，包括維生素E和抗壞血酸進行測試。對維生素E和抗壞血酸進行的每個測試都得出與現有文獻中相似的結果。測試了許多其它變量，包括抗氧化劑、底物(亞油酸)和引發劑(AAPH)的量。最理想的量如下所示2.78毫升0.05M磷酸鹽緩衝劑pH7.430微升亞油酸分散原料10微升0.01M抗氧化劑原料150微升40mM AAPH原料抗氧化劑 濃度 最終濃度 效力維生素E 0.01M 33.3μM 93％抗壞血酸 0.01M 33.3μM 74％(3)*0.01M 33.3μM 20％(4)*0.01M 33.3μM 83％(5)*0.01M 33.3μM 47％(6)*0.01M 33.3μM 43％*編號對應於本文提供的合成反應方案中使用的編號結構在存在和不存在Ca2+時測試本發明的化合物的效力時，使用經HEPES緩衝過的鹽水取代標準的磷酸鹽緩衝劑並使用CaCl2作鈣離子源。
溶劑(％) 不含鈣的HBS(％)含鈣的HBS(％)效力維生素E甲醇(33％) 67％ -90％(4)*DMSO(33％) 67％ -93％(6)*DMSO(33％) 67％ -46％維生素E甲醇(33％) - 67％ 94％(4)*DMSO(33％) - 67％ 93％(6)*DMSO(33％) - 67％ 35％*編號對應於本文提供的合成反應方案中使用的編號結構實施例5在活體外對神經元存活情況的研究在被溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑(MTT)還原反應損傷的24小時後，測定NSC34細胞(成神經細胞瘤×脊髓細胞系)的細胞存活能力(參看Cheung NS等人(1998)Neuropharmacology 37，1419-1429)，一種對線粒體功能的測定，線粒體功能在受損細胞中受到損害(參看Kroemer等人，(1998)Ann Rev Physiol 60，619-642)。MTT用神經細胞在37℃培養30分鐘，並從置於20％十二烷基硫酸鈉和40％二甲基甲醯胺中的細胞中溶解出還原的甲臢(formazan)產物，並在590nm處讀取吸收率(Ceres UV900C；微孔板讀數儀(microplate reader)；Biotek Instruments，USA)。用過量過氧化氫或Triton X-100處理的培養基被認定為100％細胞死亡，並將其結果表示為溶媒對照物百分比。
實施例6在活體外對神經元存活情況的研究我們研發了兩種可用於保護(screen)具有下述功能的藥物的細胞培養系統所述藥物預防由氧化應激(圖3，模型A)和興奮毒性(圖4，模型B)引起的細胞死亡。在模型A中，我們採用培養過的成纖維細胞，其用在10μM時引起明顯死亡的百草枯進行處理(參看圖3)。在模型B中，我們採用NSC-34運動神經元細胞系，使用特定的激動劑fluorowillardine即FW經由穀氨酸興奮毒性途徑可使其退化(圖4)。
實施例7在活體內對神經元存活情況的研究測定化合物與肽核酸(本文稱作PNAG3並具有結構N-TCC GTGAGA ATG-C或N-GTG AGA ATG-C)和白血病抑制因子(LIF)共同治療時這些化合物的容許劑量和療效。進行這些實驗測定與化合物(3)共同治療是否通過化合物(3)的抗氧化和鈣緩衝作用產生增效作用。SOD1G93A鼠經受VEH、PNAG3+化合物(3)、LIF+化合物(3)和PNAG3+LIF+化合物(3)治療而沒有對行為和體重減輕產生明顯的負作用(圖5)。在所有組別中，觀察到預期的由與疾病有關的肌肉萎縮引起的體重下降。使用Rotarod裝置(圖6A)和bar grab task(圖6B)進行的運動行為分析表明，與VEH組相比，PNAG3+化合物(3)、LIF+化合物(3)和PNAG3+LIF+化合物(3)組表現出明顯的改進。這些老鼠的存活情況表示在圖6C和表1中。這些數據表明在存活方面有所改進。
表1在Rotarod試驗中運動缺陷的發作和使用MND的老鼠的平均存活情況的表格式表示。在Rotarod試驗(A)和平均存活天數(B)方面，所有三組接受治療的組與溶媒組相比，都有統計學上的差異。在表格中，VEH＝溶媒，(3)是本文列出的合成反應方案中的化合物(3)，LIF＝白血病抑制因子，PNAG3是N-TCC GTG AGA ATG-C或N-GTGAGA ATG-C。
(A)在Rotarod試驗中的運動缺陷發作
(B)平均存活天數
最後，應該意識到，對於本領域技術人員而言，在不背離本發明的範圍和精神的前提下，本發明的所述方法和組合物的各種修改和變體是顯而易見的。儘管已經根據具體的優選實施方案對本發明進行描述，應該理解的是，要求保護的本發明不應該不適當地限於這些具體實施方案。實際上，本發明的所述實施方式的各種改動對本領域技術人員而言是顯而易見的，且應當認為其在本發明的範圍之內。
權利要求
1.一種預防或降低氧化應激對底物的影響的方法，該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理所述底物從而的步驟 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
2.如權利要求1所述的方法，其中R5具有下列分子式 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
3.如權利要求2所述的方法，其中在化學式為(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一個或多個。
4.如權利要求1所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
5.如權利要求1所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
6.如權利要求1所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
7.如權利要求2所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
8.如權利要求1所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2獨立地選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3選自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖類部分、-聚烯氧基、和水增溶基團。
9.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其中底物是生物系統。
10.如權利要求9所述的方法，其中該方法用於預防或治療神經退行性病變。
11.如權利要求10所述的方法，其中神經退行性病變是中風、癲癇、帕金森氏症、亨廷頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化或阿爾茨海默氏症。
12.如權利要求11所述的方法，其中神經退行性病變的治療還包括施用治療神經退行性病變用的第二試劑。
13.如權利要求12所述的方法，其中第二試劑是肽核酸。如權利要求13所述的方法，其中肽核酸是N-TCC GTG AGAATG-C或N-GTG AGA ATG-C。
14.如權利要求12所述的方法，其中第二試劑是神經營養因子。
15.如權利要求15所述的方法，其中神經營養因子是白血病抑制因子。
16.化學式為(I)的化合物在與氧化應激有關的病狀的治療藥劑的製備中的應用 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
17.如權利要求17所述的化合物的應用，其中R5具有下列分子式 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
18.如權利要求18所述的化合物的應用，其中在化學式為(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一個或多個。
19.如權利要求17所述的化合物的應用，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
20.如權利要求17所述的化合物的應用，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
21.如權利要求17所述的化合物的應用，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
22.如權利要求18所述的化合物的應用，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
23.如權利要求17所述的化合物的應用，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2獨立地選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3選自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖類部分、-聚烯氧基、和水增溶基團。
24.如權利要求17至24中任何一項所述的化合物的應用，其中與氧化應激有關的病狀是神經退行性病變。
25.如權利要求25所述的化合物的應用，其中神經退行性病變是中風、癲癇、帕金森氏症、亨廷頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化或阿爾茨海默氏症。
26.一種治療與鈣毒性和氧化應激有關的病狀的方法，該方法包括施用治療有效量的自由基清除劑和鈣緩衝劑的步驟。
27.如權利要求27所述的方法，其中與鈣毒性和氧化應激有關的病狀是神經退行性病變。
28.如權利要求28所述的方法，其中神經退行性病變是中風、癲癇、帕金森氏症、亨廷頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化或阿爾茨海默氏症。
29.如權利要求29所述的方法，其中該方法包括施用作為自由基清除劑的第一試劑和作為鈣緩衝劑的第二試劑的步驟。
30.如權利要求30所述的方法，其中自由基清除劑是硫辛酸、2，3-二氫-1-苯並呋喃-5-酚、苯並二氫吡喃-4-酮、維生素E類似物或維生素E。
31.如權利要求31所述的方法，其中鈣緩衝劑是15-冠-5、18-冠-6或二(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N』，N』-四乙酸。
32.如權利要求30所述的方法，其中第一和第二試劑是既是自由基清除劑又是鈣緩衝劑的相同的化合物。
33.如權利要求33所述的方法，其中單種試劑是化學式為(I)的化合物 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分(sugarmoiety)的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
34.如權利要求34所述的方法，其中R5具有下列分子式 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
35.如權利要求35所述的方法，其中在化學式為(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一個或多個。
36.如權利要求34所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
37.如權利要求34所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式
38.如權利要求34所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
39.如權利要求35所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
40.如權利要求34所述的方法，其中化學式為(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2獨立地選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3選自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖類部分、-聚烯氧基、和水增溶基團。
41.一種化學式為(II)的化合物，或其藥學上可接受的鹽 其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
42.如權利要求42所述的化合物，其中化學式為(II)的化合物是金屬鹽或鹼土金屬配合物的形式。
43.一種預防或降低氧化應激對底物的影響的方法，該方法包括用化學式為(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理所述底物的步驟 其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
44.如權利要求44所述的方法，其中底物是生物系統。
45.如權利要求45所述的方法，其中該方法用於預防或治療神經退行性病變。
46.如權利要求46所述的方法，其中神經退行性病變是中風、癲癇、帕金森氏症、亨廷頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化或阿爾茨海默氏症。
47.一種用於清除自由基的配方物，該配方物含有有效量的化學式為(I)或(II)的化合物 其中R1是一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基(單-、雙-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一個或多個選自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖類部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5選自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6獨立地選自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基，和 其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
48.含有化學式為(II)的化合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物 其中R1和R2都獨立地選自一個或多個選自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-滷素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2獨立地是每個芳環上的四、三、二或單取代基。R3和R4都獨立地選自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖類部分、-聚烯氧基、水增溶基團、抗氧化劑；R5和R6獨立地選自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每個N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都獨立地選自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
全文摘要
本發明提供了一種預防或降低氧化應激對底物的影響的方法。該方法包括用化學式為(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽處理該底物的步驟，其中R
文檔編號A61K38/00GK1668575SQ03817337
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月27日 優先權日2002年5月27日
發明者S·S·切瑪, S·蘭福德, N·S·張, P·M·貝爾特, K·J·麥克法蘭, M·馬爾凱爾 申請人:莫納什大學