Exendin-4衍生物的複合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-12 12:08:26

專利名稱：Exendin-4衍生物的複合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種修飾的Exendin-4衍生物，確切的說，涉及一種單甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的複合物及其製備方法和應用，屬於肽或蛋白質的修飾複合物及其製備的技術領域。
背景技術：
糖尿病是一組由於胰島素分泌缺陷及其生物學作用障礙引起的以高血糖為特徵的代謝性疾病。目前我國糖尿病的患病率和病死率正在呈快速上升趨勢，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之後的另一個嚴重危害人民健康的慢性非傳染性疾病，其中90%以上為II型糖尿病。目前，人們主要應用磺醯脲類和雙胍類等藥物來治療II型糖尿病，但是這些藥物的副作用較大，限制了其的臨床應用。Exendin-4是希拉毒蜥進食後由唾液腺產生的一種39肽的內分泌激素，與哺乳動物胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)有53%的胺基酸序列重疊。Exendin-4與GLP-I有許多共同的糖代謝調節作用，包括葡萄糖依賴性促進胰島素分泌和抑制胰高血糖素過多分泌作用、 延緩胃排空、減少食物攝取等，Exendin-4與GLP-I相比的最大優點是抗二肽醯基肽酶IV降解。但是Exendin-4在體內也存在半衰期較短的問題，目前Exendin-4治療糖尿病的研究方向之一是通過對Exendin-4的結構進行改變，得到Exendin-4衍生物，用該衍生物治療糖尿病，達到延長藥物在體內的藥效時間的目的。
背景技術：
已經提出一種Exendin-4衍生物及其製備方法，見申請號和發明名稱分別為「200910045187. 6」和「一種Exendin-4衍生物及其固相化學合成」的發明專利，該Exendin-4衍生物的體內降血糖活性較天然的Exendin-4 已有所提高。而本發明製備所得的Exendin-4衍生物的複合物在體內的有效降血糖活性要顯著高於Exendin-4衍生物。蛋白/多肽類藥物普遍存在體內半衰期短、穩定性差、易被各種蛋白酶降解等特性，使得這些藥物需要在一天之內多次注射，給病人帶來痛苦和不便。研究表明，從血漿中清除Exendin-4幾乎全部通過腎臟濾過而不是主要通過蛋白酶降解，因此對Exendin-4或其衍生物進行聚乙二醇化或其它修飾以增加分子大小是一種降低腎臟清除率的方法。目前對Exendin-4的修飾大都是多點修飾，產物存在多態性，分離純化產物較為困難，並且修飾產物的生物學活性有所降低。鑑於Exendin-4及其衍生物存在體內的降血糖活性的時間有待進一步延長，且普通聚乙二醇修飾產物不均一等問題，因此迫切需要研製體內降血糖時間更長，分離純化快速簡便且易於臨床應用的新型單點修飾的Exendin-4衍生物複合物產品。

發明內容
本發明的目的是提出一種Exendin-4衍生物的複合物，該複合物由Exendin-4衍生物與經馬來醯亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41, Xaa42, Xaa31, Xaa32 或 Xaa33 分別是 Cys，Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一個胺基酸；所述經活化的單甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量為5 40kD ；所述複合物是通過Exendin-4衍生物中的游離巰基和mPEG-MAL基團的雙鍵形成的硫醚鍵連接而成。本發明Exendin-4衍生物的複合物中的Exendin-4衍生物可以是以下六種結構之任何一種Exendin-4 (1-39) _Xaa40 (Seq ID No. 2)，Exendin-4 (1-39) _Xaa40_Xaa41 (Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42 (Seq ID No. 4)； Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq IDNo. 6)，Exendin-4(1-30)_Xaa31_Xaa32(Seq-ID-No. 7)和 Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa40 和 Xaa31 是 Cys，Xaa41， Xaa42, Xaa32 和 Xaa33 分別是 Cys，Ala, Gly, His, Set 或 Thr 中的任何一個胺基酸。更進一步地，該複合物中的Exendin-4衍生物可以是以下四種結構之任何一種 Exendin-4 (1-39)-Xaa40_Xaa41(Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Se q ID No. 4) ；Exendin-4 (1-30)-)(aa31-)(aa32(^5q-ID-No· 7)和 Exendin-4 (1-30)-Xaa31_Xa a32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa41 和 Xaa32 是 Cys，Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分別是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個胺基酸。更進一步地，該複合物中的hendin-4衍生物可以是以下兩種結構之任何一種E xendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41_Xaa42(Seq ID No. 4) ；Exendin-4(1-30)-Xaa31_Xaa32_Xaa 33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa42 和 Xaa33 是 Cys，Xaa40, Xaa41, Xaa31 和 Xaa32 分別是 Cys， Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個胺基酸。本發明所涉及的「Exendin-4」 包括 Exendin-4 (1-39)。其序列(Seq ID No. 1)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser0本發明所涉及的「Exendin-4」還包括Exendin-4的截短形式Exendin (1-30)，其序列(Seq ID No. 5)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la_Val_Arg_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_Lys_Asn_Gly_Gly0上述Exendin-4衍生物，見本申請人的發明專利申請申請號為 「200910045187. 6」，發明名稱為「一種Exendin-4衍生物及其固相化學合成」中提出的 Exendin-4 衍生物。本發明提供的Exendin-4衍生物的複合物，其中，經活化的單甲氧基聚乙二醇是 mPEG-MAL,其分子量為5 40kD ；該Exendin-4衍生物的複合物是通過Exendin-4衍生物中游離巰基(-SH)和單甲氧基聚乙二醇-馬來醯亞胺mPEG-MAL基團的末端雙鍵進行加成反應形成的硫醚鍵連接而成(結構如下圖所示)。該Exendin-4衍生物中游離巰基(-SH) 可以實現mPEG-MAL的定點修飾，從而得到均一的修飾產物。
權利要求
1.一種Exendin-4衍生物的複合物，其特徵在於，該複合物由Exendin-4衍生物與經馬來醯亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq IDNo. 3，Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 Seq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41，Xaa42， Xaa31,Xaa32或Xaa33分別是Cys，Ala, Gly，His, Ser或Thr中的任何一個胺基酸；所述經活化的單甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量為5 40kD ；所述複合物是通過Exendin-4 衍生物中的游離巰基和mPEG-MAL基團的雙鍵形成的硫醚鍵連接而成。
2.如權利要求1所述的Exendin-4衍生物的複合物，其特徵在於，所述Exendin-4衍生物為 Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8 ；其中，Xaa41 和 Xaa32 是 Cys ；Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分別是 Cys, Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一個胺基酸。
3.如權利要求2所述的Exendin-4衍生物的複合物，其特徵在於，所述Exendin-4衍生物為 Seq ID No. 4 或 Seq ID No. 8 ；其中，Xaa42 和 Xaa33 是 Cys ；Xaa40,Xaa41,Xaa31 和 Xaa32分別是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個胺基酸。
4.如權利要求1所述Exendin-4衍生物的複合物的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下第一步，將Exendin-4衍生物溶解於磷酸鹽緩衝液中；第二步，再加入mPEG-MAL ；第三步，在4 40°C，pH3. O 9. O條件下進行mPEG修飾反應0. 5 M小時；第四步，置於_20°C終止上述mPEG修飾反應，製得所述Exendin-4衍生物的複合物的粗品溶液；第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl緩衝液稀釋，ikpharose Q XL層析柱，梯度洗脫，收集穿透峰和洗脫峰的洗脫溶液；第六步，將以上洗脫液用截留分子量為1 IOkD的超濾管濃縮，冷凍乾燥，得到產物即所述Exendin-4衍生物的複合物的純品，所述產物的分子量介於8. 5 44. 3kD。
5.權利要求1所述的Exendin-4衍生物的複合物在製備治療糖尿病的藥物中的用途。
6.一種組合物，其特徵在於，所述組合物含有有效量的權利要求1所述的Exendin-4衍生物的複合物，以及藥學可接受的成分。
全文摘要
本發明公開一種Exendin-4衍生物的複合物及其製備方法和應用，該Exendin-4衍生物的複合物是由Exendin-4衍生物與經馬來醯亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，該Exendin-4衍生物的複合物的生物穩定性高，體內半衰期長，生物利用度高。其製備方法操作簡便，原料易得。
文檔編號A61P3/10GK102234331SQ20101016845
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者勞勳, 吳自榮, 張洪丹, 楊燕, 蔣子威, 黃靜 申請人:華東師範大學