mTOR途徑治療診斷學的製作方法

2023-06-12 21:45:51 2

專利名稱：：mTOR途徑治療診斷學的製作方法mTOR途徑治療診斷學本申請要求2005年10月18日提交的美國臨時申請No.60/727,510的權益，其公開內容通過參考整體併入本文。
背景技術：
：人腫瘤依賴於基於有缺陷蛋白質的細胞信號轉導過程來生長、存活和轉移，所述細胞信號轉導過程由翻譯後修飾(例如蛋白質磷酸化)驅動。這些信號轉導網絡也是大多數現有及計劃中的分子靶向抑制劑的靶標。一個例子是HERCEPTIN---種可以阻斷乳腺癌中超活性表皮生長因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)信號轉導系統的藥物。只有此信號轉導途徑過表達且活化的患者對該治療有反應。病人護理中一個迫切的重要需求是鑑別將會對標準治療有反應的患者以及鑑定將需要更具攻擊性的治療措施的患者。這些更具攻擊性的措施幾乎總是伴隨著發病率的提高，因此不會在未確證時先驗性地選擇使用。例如，患有淋巴結陰性乳腺癌並且其腫瘤上具有雌激素受體的女性適合進行他莫昔芬治療。但是，有約30-40%的女性對他莫昔芬治療無反應，她們需要更具攻擊'性的治療(例如芳香酶抑制劑(aromataseinhibitor,AI))。但是，芳香酶抑制劑與中度至重度的骨損失有關，因此給予所有女性AI治療是不可接受的。可以對治療的結局和反應進行區分的生物標記對於這類例子將非常有益。這一難題對於幾乎所有其它的人類癌症均普遍存在將對標準護理會產生反應的人群和預後較差的人群區分開來。基因表達分析已經顯示出了產生針對結局的預後特徵的能力；但是，這些終點僅限於簡單的分類。所述特徵無法告訴醫師如何治療無反應者組；它僅能用於判斷誰將會有反應而誰將不會有反應。相反，蛋白質-信號轉導鐠分析可提供預後特徵，並且重要的是，可提供有關採用何種療法來治療無反應者組的信息。這是因為蛋白質組圖是基於藥物靶標本身構建的。另外，基因表達分析中對許多基因進行分析是很複雜的，通常包括使用算法和廣泛的計算機分析，並且不反映蛋白質藥物靶標的活化狀態或功能狀態。基因表達與信號途徑蛋白質的磷酸化無關。圖l顯示了橫紋肌肉瘤樣品組的特徵。(圖1A)通過反相蛋白質微陣列評價兩個獨立的研究組(1A組和1B組)，以得到細胞信號轉導蛋白質狀態的譜圖。(圖1B)橫紋肌肉瘤研究組1A和1B的存活分析。通過Kaplan-Meier存活估計顯示，來自兩個不同類研究組的總存活(Overallsurvival,OAS)和無復發存活(recurrencefreesurvival,RFS)均無顯著差異(OAS對數秩(log-rank)p=0.2111，RFSp=0.5824)。(圖1C)組織學分型未顯示研究組之間的顯i差異(Kaplan-MeierOAS對數秩p=0.4103,RFSp=0.4312)。圖2顯示了橫紋肌肉瘤研究組1A的探索性數據分析。(圖2A)歸一4匕蛋白質終點的無參照(unsupervised)Bayesian聚類分鬥斤(歹1)表明有兩個主要的腫瘤聚類(行)。在(圖2B)中，這些聚類顯示出與臨床參數無關。通過Fisher精確檢驗對所述兩個聚類進行比較，p>0.05。圖3顯示了橫紋肌肉瘤樣品組1A的反相蛋白質微陣列激酶途徑譜分析結果。(圖3A)4EBP1和4EBP1Thr37/46證明了研究組1A中非存活者與存活者狀態的分離的統計學顯著相關性。(4EBP1威爾科克森單因素卡方0.0064,df=l，n=32)，非存活者平均值4EBP1=82.4，平均值標準誤=11.48;存活者平均值4EBP1=145.61，平均值標準誤=14.89;(4EBP1Thr37/46卡方0.0135,df=l,n=33))。(圖3B)決策樹分析表明4EBP1是研究組1A中存活的鑑別物，因此，計算了對於4EBP1的Kaplan-Meier存活估計。Kaplan-Meier曲線表明，相比於4EBP1水平相對低的樣品(黑線)，相對高水平的4EBP1(灰線)與總存活(對數秩p〈0.0177，11=32[—個樣品的數據不可用)和無復發存活(p=0.0370)具有顯著的統計相關性。圖4顯示了橫紋肌肉瘤樣品組IB的反相蛋白質微陣列激酶途徑鐠分析結果。(圖4A)在IB組中通過對數秩分析對AktSer473(OASp<0.001，RFSp<0.0009)、(圖4B)elF4GSerl108(OASp<0.0017，RFSp<0.0072)、(圖4C)4EBP1Thr37/46(OASp<0.0110,RFSp<0.0106)以及(圖4D)p70S6Thr389(OASp<0.0085,RFSp<0.0296)進行的Kaplan-Meier存活分析顯示了總存活和無復發存活均具有統計學顯著的相關性。灰線表示所示蛋白質終點相對高的水平，黑線表示相對低的水平。(圖4E)通過反相蛋白微陣列對橫紋肌肉瘤樣品組1B評價的蛋白質終點(n存活者狀態，B非存活者狀態)。通過威爾科克森單因素分析發現4EBP1Thr37/46(p<0.0348)、GSK3a/pTyr279/216(p<0.0348)、elF4GSer1108(p<0.0196)、AktSer473(p<0.0227)、Bak(p<0.0321)以及p70S6Thr389(p^饋迴路均通過IRS-1ser612調控IRS-1。(圖5B)樣品組1B中IRS-l/Akt/mTOR途徑蛋白質的非^^lt分析(表1B)。對於樣品組1B所評價的所選促存活和凋亡信號轉導蛋白的SpearmanRho表。(圖5C)相比於來自非存活者狀態的患者的腫瘤(p=0.7358)，SpearmanRho非#^分析顯示了來自存活者狀態患者的肺瘤中IRS-1Ser612與mTORSer2448之間的相關性(p=0.0027)。(圖5D)相比於來自非存活者狀態患者的肺瘤樣品(p=0.1827)，在來自存活者狀態患者的肺瘤樣品中發現了IRS-1Ser612與p70S6Thr389之間類似的相關性(p=0.00004)。圖6顯示小鼠異種移植物模型中力鏡紋肌肉瘤胂瘤生長的CCI-779抑制。(圖6A)異種移植物處理模型的胖瘤組織中mTOR途徑下遊底物磷酸化的時間依賴性CCI-779抑制。與肌動蛋白相比，CCI-779在無關肌肉和腫瘤組織中均抑制mTOR途徑底物pS6Ser235/236和4EBP1Thr70的磷酸化。(圖6B)CCI-779在Rh30和RD小鼠異種移植物模型中抑制腫瘤生長。將來自Rh30腺泡狀細胞系或RD胚胎型細胞系的0.2ml總體積中2xl(^個細胞/小鼠原位(orthotopically)注射到SCID褐色小鼠模型的左後J3^f腸肌內。一周後，將小鼠分配至對照(n=8)或CCI-779處理組(11=8)。對於Rh30和RD異種移植物而言，CCI-779處理組中遊標卡尺所測量的紳瘤體積均小於僅^f吏用載體的組，-▲-RD對照，J-Rh30加CCI畫779，——Rh30對照，隱-X—RD加CCI-779,(RDp=0.00008;Rh30p=0.0002，Student'st檢驗)。(圖6C)在30天中每三天以20mg/kg/IP施用CCI-779。將來自Rh30和RD小鼠異種移植物肺瘤或無關肌肉的蛋白質提取物用CCI-779或載體處理30天，通過Western印跡分析S6和4EBP1砩酸化。CCI-779在Rh30和RD的肌肉和腫瘤細胞中均抑制4EBP1的蜂酸化。圖7顯示肺腺癌腫瘤樣品的劃分分析(partitionanalysis)。圖8顯示對肺癌進行的通過p4EBPl切點(cutpoint)進行分組的分析物關聯存活擬合。圖9顯示對肺癌進行的通過p4EBPlpAKTser473切點進行分組的分析物關聯存活擬合。圖10顯示對乳腺癌進行的通過p4EB-Pl切點進行分組的分析物關聯存活擬合；存活者僅來自LN-亞組。圖11顯示對乳腺癌進行的LN+A^的劃分分析，表面以p70S6作為主要的分離組分。圖12顯示對乳腺癌進行的來自所有病例(LN-和LN+)的存活曲線。
發明內容本發明提供例如用於治療癌症的組合和方法，其基於評估一個或多個mTOR信號轉導途徑成員的活化狀態以及與此途徑互聯(interconnect)的基因及其編碼產物的活化狀態。因為本發明的診斷測定僅需要測定少數蛋白質的磷酸化狀態，所以該測定易於實施，不需要複雜的基於計算機的分析。本發明涉及例如預測受試者對化療劑的反應和/或受試者預後的方法，和/或用於在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其包括在來自該受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量至少一個mTOR途徑成員和/或至少一個互聯多肽途徑成員相比於基線值的磷酸化狀態，其中所述磷酸化狀態水平相比於基線值的升高表明該受試者是所述化療劑的無反應者和/或預後差。本文所使用的"對化療劑的反應"指對常規化療劑(例如本文其它地方所列舉的)的反應。此術語不包括對本文所述新類型癌症抑制劑(mTOR途徑或本文所述的互聯途徑之一的抑制劑)的反應。本文所使用的"受試者"包括任何患有癌症的動物。合適的受試者(患者)包括實驗動物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農場動物和家養動物或寵物(例如貓或狗)。非人靈長類以及優選地人患者也包括在內。蛋白質的"磷酸化狀態"指所述蛋白質的磷酸化程度(總量)。這包括蛋白質中發生磷酸化的位點(例如合適的Ser、Thr或Tyr胺基酸殘基)數以及在胺基酸鏈上任意給定受體位點的磷酸化水平。本文所使用的"基線值，，指同一蛋白質在正常的非癌症或未刺激受試者中的磷酸化水平。蛋白質磷酸化量的增加可反映該蛋白質中發生磷酸化的合適胺基酸殘基(例如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)數量的增加或者特定胺基酸殘基磷酸化頻率的提高。例如，基線值包括參照標準，其中預定的閾值(或閾值範圍)確定所測量的磷蛋白(phosphoprotein)量或該蛋白質的磷酸化狀態是否高於"正常"值。在本文中，術語閾值水平和基線值可互換使用。對於每個已測定磷酸化水平的蛋白質，該值可對細胞中的總蛋白進行歸一化；或者對組成型表達的蛋白質(來自看家基因)例如肌動蛋白的量進行歸一化；或者可將磷蛋白的量與其非磷酸化對應物的量進行比較。"互聯"多肽途徑可以來自Akt途徑、IRS途徑，或者它可以是另一個互聯多肽，例如pRb,Akt的底物(例如GSK3)，或者凋亡調節物(例如Bak)。可以測量所述途徑之一的任何個體成員或者其組合的砩酸化狀態。例如，如果至少一個mTOR途徑成員代碼為"A"，至少一個Akt途徑成員代碼為"B"，至少一個IRS途徑成員代碼為"C"，那麼所測定的罅酸化狀態可以是A;B;C;A+B;A+C;B+C;或A+B+C。所述途徑成員可以為如Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、elF隱4E或elF-4G、PTEN、PDKl、GSK3p、TSCl/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或者CHK1。本文的其它地方標出了具體的砩酸化殘基。在另一個實施方案中，所述抑制劑結合FKB12。本發明的另一個方面是如上所述的方法，其是一種治療方法，其中進一步地，如果未觀察到該途徑成員的磷酸化狀態相對於其基線值顯著提高，則用常規化療方法治療該受試者。本發明的另一個方面是如上所述的方法，其是一種治療方法，其中進一步地，其中如果觀察到該途徑成員的磷酸化量相對於其基線值顯著提高，則對該受試者施用mTOR途徑或互聯多肽途徑的抑制劑。本文所使用的"顯著"提高意為使用本領域公知的適當統計學方法獲得的統計學顯著變化，通常其概率值小於由隨機變異導致的變化的小於5%。本文所使用的單數形式包括複數形式，除非另外明確指出。例如，如上文所使用的"所測試途徑的成員"包括該途徑的2個、3個、4個、5個或更多成員。類似地，"所述途徑的抑制劑"包括多個抑制劑。在本發明的一些實施方案中，常規化療劑可與所述抑制劑組合施用於受試者。常規化療劑可以與mTOR成員或互聯途徑成員的抑制劑一起(同時)施用；或者在mTOR/互聯途徑成員的抑制劑施用後的適當時間施用(例如在磷酸化水平降低到"正常"水平之後)。在本發明的一些方面中，在施用抑制劑之後測量所述途徑成員的磷酸化狀態；和/或所施用抑制劑的量有效降低所述途徑成員的磷酸化量。本發明的另一個方面是使用化療劑在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其改進包括，如果在來自受治受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到mTOR途徑或互聯多肽途徑的成員磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯多肽途徑的抑制劑。本發明的另一個方面是治療化療劑抗性或難治性癌症的方法，其包括如果在來自受治受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到mTOR途徑或互聯多肽途徑的成員磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯多肽途徑的抑制劑。在本發明的一個治療方法中，可在化療之前測量磷酸化，當在來自受治受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到所述途徑的成員的磷酸化提高時，則將該抑制劑與治療劑組合施用以治療癌症。在本發明的治療方法中，可使用針對選自以下的至少一個成員中磷酸化位點的抗體來測量該途徑成員的磷酸化例如PI3激酶、Akt激酶、mTOR、4E-BPl/PHAS-l、p70s6k、elF-4E和elF-4G。所述癌症可以是例如乳腺癌、橫紋肌肉瘤或者肺癌(例如非小細胞肺癌)。在本發明的一些實施方案中，所述樣品包括轉移的細胞；和/或它與PTEN功能的喪失和/或突變和活化的Akt無關。本發明的另一個方面是預測受試者對化療劑反應和/或該受試者預後的方法，其包括在來自受治受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量Akt/mTOR途徑(或互聯基因以及它們編碼的多肽)中至少一個成員的量或磷酸化狀態的變化，其中水平的升高表明該受試者是對該化療劑的無反應者和/或預後差。本發明的另一個方面是在有此需要的受試者中使用化療劑治療橫紋肌肉瘤的方法，其改進包括當在來自所治療受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到4EBP1Thr37/46、elF-4Gserl108和/或p70S6Thr389處磷酸化提高時施用CCI-779。本發明的另一個方面是用於預測受試者對化療劑反應和/或該受試者預後的試劑盒，其包含一種或多種用於檢測mTOR途徑至少一個成員、Akt途徑至少一個成員和/或IRS途徑至少一個成員或者其組合的磷酸化狀態的試劑。所述試劑可以是例如所述蛋白質的磷酸化形式的特異性抗體。所述試劑盒可包含適用於本領域已知的有標籤方法或無標籤方法的試劑，以使用質鐠或電泳遷移來測量罅酸化位點。本發明的另一個方面是用於治療有此需要的受試者的藥物組合物或試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個成員的抑制劑或其組合。藥物組合物包含可藥用栽體。所述藥劑或試劑盒還可包含可與本發明抑制劑^i合施用的化療劑。本發明的另一個方面是用於治療患有化療劑抗性或難治性癌症的受試者的藥物組合物或試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個成員的抑制劑或其組合。所述藥物組合物或試劑盒還可包含可與所述抑制劑聯合施用或依次施用的化療劑。mTOR信號轉導途徑包括任何參與其信號轉導級聯的成員或組分。它們包括但不僅限於mTOR(雷帕黴素的哺乳動物靶標；也稱為FRAP、RAFT1或RAPT1)、RAPTOR(iriTOR的調節相關蛋白)、4E漏BP1/PHAS-1、p70s6k、TSC(結節性硬化複合體)、4E畫BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E、elF-4G和/或elF4E複合體。與mTOR途徑互聯(相互作用)的基因(或其編碼產物)包括但不僅限於Akt途徑的成員[例如Akt、PI3激酶、PTEN(磷酸酶和張力蛋白同系物)和FKBP12；IRS途徑的成員[例如IRS-1和胰島素生長因子(insulingrowthfactor,IGF)受體，包括IGF-R1、IGF-Rp和IGF-Ral;以及其它相關途徑的成員[例如pRb(腫瘤抑制基因，視網膜母細胞瘤蛋白)；Akt的底物例如GSK3;以及凋亡調節物，例如Bak]。本文中這些途徑(包括與mTOR途徑的成員相互作用多肽)有時總稱為"mTOR或互聯多肽途徑。"優選的超磷酸化(例如超過正常)的活化成員及其發生磷酸化的位點包括如4E-BP1Thr37/46;eIF-4Eserll08;AKTser473;p70s6kThr389等等。可才艮據本發明使用它們中的一個或多個。上述基因的核苷酸和M酸序列是公知的，並且可常規地測定和從多種已知資料庫中下載。參見例如www.ncbi.nlm.nih.gov。mTOR或互聯信號轉導途徑的活化可使用任何已知方法測量，例如能夠測量總磷酸化蛋白質或蛋白質磷酸化程度的方法。合適的測定有比色測定、免疫測定(例如免疫組織化學、ELISA等)、基於螢光讀數的測定、懸浮珠測定等許多類型。例如，可使用反相蛋白質微陣列(reversephaseproteinmicroarray，RPMA)進行蛋白質測量(例如測量磷酸化蛋白質)。參閱如Nishizuka等(2003)iVoc.7V"rf爿cfld雄,14229-14239。適用於這些測定的抗體是市售的，或者可常規地製備，包括針對該多肽的磷酸化和非磷酸化形式的抗體。(特別有用的是已經開發成特異性識別激酶底物的磷酸化亞型的抗體。)另夕卜，可使用Western印跡、ELISA測定、免疫沉澱和質譜以及其它一些常規測定來評估(例如mTOR信號轉導途徑成員的)磷酸化水平和/或程度。合適的方法包括可在非常小的樣品中(例如約200個細胞)監測磷酸化蛋白質的方法。或者，可使用適於大樣品(例如約20000-25000個細胞)的方法。當在得自受試者的癌症樣品中觀察到mTOR途徑(或互聯途徑)中至少一個成員的磷蛋白總量或磷酸化程度提高時，可以施用mTOR抑制劑(或互聯途徑的抑制劑)。可常規地測定總蛋白量或磷酸化蛋白量的增加。例如，可使用參照標準，此時預定的閾值(或閾值範圍)確定所測蛋白質的量是否高於"正常"值。本文中這樣的閾值有時稱為基線值。另外，可通過強度來確定該量，此時使用評分強度來確定受試者的Akt/mTOR途徑是否被活化。(例如，使用1至5評分系統，其中5是最高，高於3的強度表示途徑活化)。本發明的一些方面可用作預後和/或診斷，以預測受試者對化療劑的反應和/或預後。這樣的方法可包括在來自所治療受試者的癌組織或自細胞樣品中測定mTOR和/或互聯途徑中至少一個成員的量和/或磷酸化狀態的改變，其中水平的升高表明所述受試者對通常用於治療該癌症的化療劑是無反應者和/或預後差。Akt/mTOR抑制劑包括但不限於以下各項磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3-激酶)抑制劑的實例包括但不限於例如塞來考昔及其類似物，例如OSU-03012和OSU-03013(例如Zhu等(2004)Owic^及^.M(12):4309畫18);3-脫氧-D-肌醇類似物(例如美國專利申請號20040192770;Meuillet等(2004)0w"/.11,513-27，2004)，例如PX-316;2，-取代，3，-脫氧-磷脂醯-肌醇類似物(例如Tabellini等(2004)醜r.義好"e廳^/.126(4),574-82);稠合的雜芳基衍生物(美國專利號6,608,056);3-(咪唑並[l,2-a吡啶-3-基)衍生物(例如美國專利號6,403,588和6,653,320);Ly294002(例如Vlahos等(1994)/C7ie附.269(7),5241-5248);喻喳淋_4-酮衍生物，例如IC486068(例如美國專利申請號20020161014;Geng等(2004)0，4893-99);3-(異)芳氧基取代苯並(b)噻吩衍生物(例如WO04108715;以及WO04108713);綠色木黴素(viridin),包括半合成綠色木黴素，例如PX-866(乙酸(lS,4E，10R，llR,13S,14R)-[4-二烯丙基氨基亞甲基-6-羥基-l-甲氧基甲基-10，13-二甲基-3,7，17-三氧代-1，3,4，7,10，11,12,13，14，15，16，17-十二氫國2-氧雜-環戊[a菲-ll-基酯)(例如Ihle等(2004)Afo/C"""/"T7^r.2(7)，763-72;美國專利申請號20020037276;美國專利5,726,167);和渥曼青黴素及其衍生物(例如美國專利號5,504,103;5,480,906，5,468,773;5,441,947;5,378,725;3,668,222)。Akt激酶(也已知為蛋白激酶B)抑制劑的例子包括但不限於例如Akt-l畫l(抑制Aktl)(Barnett等(2005)必/oc/ie附./，巡(Pt.2)，399-408);Akt-l畫l,2(抑制Akl和2)(Barnett等(2005)丄巡(Pt.2),399-408);API畫59CJ畫Ome(例如Jin等(2004)/C朋c^2i,1808-12);l-H-咪唑並[4,5-c吡啶基化合物(例如WO05011700);吲哚-3-甲醇及其衍生物(例如美國專利號6,656,963;Sarkar和Li(2004)J淑r.1^(12Suppl)，3493S-3498S);艱立福辛(perifosine)(例如幹擾Akt膜定位；Dasmahapatra等(2004)C"/f"r及dM(15)，5242-52,2004);磷脂醯肌醇醚脂質類似物(例如Gills和Dennis(2004)fx/^W."rwgs,込787-97)^曲西立濱(TCN或API-2或NCI標識符NSC154020;Yang等(2004)^，4394-9)。mTOR抑制劑的例子包括但不限於例如FKBP12增強劑；雷帕黴素及其衍生物，包括CCI-779(坦西莫司(temsirolimus))，RAD001(依維莫司(Everolimus);WO940卯10)和AP23573;雷帕黴素類似物(rapalog),例如WO98/02441和WO01/14387中公開的,例如AP23573、AP23464或AP23841;40-(2-羥乙基)雷帕黴素;40-[3-羥基(羥甲基)甲基丙酸酯-雷帕黴素(也稱為CC1779)、40-表-(四唑基)-雷帕黴素(也稱為ABT578)、32-脫氧雷帕黴素、16-戊炔基氧基-32(S)-二氫雷帕黴素以及WO05005434/>開的其它衍生物；在USP5，258，389、WO94/090101、WO92/05179、USP5,118,677、USP5,118,678、USP5,100,883、USP5，151，413、USP5,120,842、WO93/111130、WO94/02136、WO94/02485、WO95/14023、WO94/02136、WO95/16691、WO96/41807、WO96/41807和USP5,256，790中/〉開的衍生物；含有磷的雷帕黴素衍生物(例如WO05016252);4H-l-苯並吡喃-4-酮衍生物(例如美國臨時申請號60/528,340)。IRS途徑抑制劑的例子包括但不限於以下使用中和抗體、拮抗肽或者選擇性激酶抑制劑NVP-ADW742對IGF-1R的特異性抑制已被證明對多種腫瘤細胞類型具有活性。蛋白酶體抑制劑、MG132和乳胞素(lactacystin)抑制IRS-1的磷酸化。蛋白酶體抑制劑可調控IRS-1的酪氨酸磷酸化以及下遊的胰島素信號轉導途徑，引起葡萄糖轉運。誘導型一氧化氮合酶、iNOS和NO供體誘導IRS降解。IRS-1的絲氨酸磷酸化受KB激酶複合體抑制劑的調控。毒胡蘿蔔素(Thapsingargin)下調IRS-1。PKC途徑和Akt抑制劑包括卡弗他丁C(calphostinC)、星形孢菌素(Staurosporine)和LY294002。STI571是與未發明途徑相關的cKit途徑的另一抑制劑。臨床前或臨床應用的化合物實例包括如AP23573、AP23841、CCI-779和RAD001。無論其機制如何，任何腫瘤或癌症均可根據本發明進行治療。這包括任何器官的肺瘤或癌症，所述器官包括但不限於例如結腸、胰腺、乳腺、前列腺、骨、肝、腎、肺、睪丸、皮膚、胰腺、胃、前列腺、卵巢、子宮、頭頸、血細胞、淋巴等。可根據本發明治療的癌症包括但不限於腦瘤、乳腺癌、骨肉瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)、支氣管癌前病變、子宮內膜癌、成膠質細胞瘤、惡性血液病、肝細胞癌、何杰金病、腎瘤、白血病、平滑肌瘤、脂肪肉瘤、淋巴瘤、Lhermitte-Duclose病、惡性神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、轉移癌、多發性骨髓瘤、髓樣化生、骨髓白細胞症候群、非小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌(例如晚期、晚期難治性)、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、皮膚扁平上皮癌。乳腺癌的例子包括但不限於侵襲性導管癌、侵襲性小葉癌、原位導管癌以及原位小葉癌。呼吸道癌症的例子包括但不限於小細胞癌、非小細胞肺癌、支氣管腺癌和胸膜肺母細胞瘤。腦癌的例子包括但不限於腦幹和下丘腦(hypophtalmic)神經膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、髄母細胞瘤、室管膜瘤以及神經外胚層和松果體腫瘤。雄性生殖器官腫瘤包括但不限於前列腺和睪丸的癌症。雌性生殖器官癌症包括但不限於，子宮內膜、宮頸、卵巢、陰道和外陰的癌症以及子宮肉瘤。消化道腫瘤包括但不限於肛門、結腸、結腸直腸、食管、膽嚢、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺的癌症。尿道腫瘤包括但不限於膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管和尿道癌症。眼癌包括但不限於眼內黑色素瘤和視網膜母細胞瘤。肝癌的例子包括但不限於肝細胞癌(帶有或不帶纖維板層變異的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)以及混合型肝細胞膽管癌。皮膚癌包括但不限於扁平細胞癌、卡波西肉瘤、惡性黑色素瘤、默克細胞皮膚癌和非黑色素瘤皮膚癌。頭頸癌包括但不限於喉、下咽、鼻咽和/或口咽癌，以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限於AIDS相關淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、何杰金病和中樞神經系統、淋巴瘤。肉瘤包括但不限於軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限於急性髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓性白血病以及毛細胞白血病。還可從本發明中排除一些癌症，例如與以下相關的癌症PTEN功能喪失；突變和活化的Akt(例如無PTEN的腫瘤和具有ras突變的腫瘤)；或者已鑑定為導致癌症的主要致病基因或多肽的mTOR或互聯抑制途徑中的其它突變。治療方法可包括A:測量肺瘤樣品中mTOR信號途徑和/或互聯的其它信號途徑的活化狀態。可通過調節上遊和下遊信號正調控和負調控的途徑成員的磷酸化(和/或總量)來評估活化。B:基於信號途徑活化模式，施用阻斷所述途徑活化的治療以作為獨立療法或者作為新輔助療法或組合療法方案中的療法。本發明的一個方面是利用mTOR途徑磷酸化蛋白質成員的癌症診斷或預後檢測。分析物實例在本文其它部分討論。已經發現，如實施例中所示，mTOR途徑或互聯途徑的活化可預測接受過當前標準處置的肺癌、乳腺癌和橫紋肌肉瘤患者的結局。例如，磷酸化狀態的蛋白質mTOR、4EBP1、E1F4G、E1F4E和p70S6可與結局相關。未觀察到其它途徑的活化也這樣相關。簡單地說，相比於無mTOR活化的患者，mTOR途徑活化(證據為mTOR下遊底物的磷酸化水平)的患者具有較短的存活期、無疾病間隔或者其它治療成功的度量。這種標準處置將包括手術、化療和雌激素受體療法(乳腺)。因為這些腫瘤類型代表了來自於不同微環境的完全不同的病理譜系(pa仇ologicallineage)，因此預計此發現將可用於其它腫瘤類型或由其產生的肺瘤幹細胞，包括癌癥結腸直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腦癌、甲狀腺癌、腎癌以及肉瘤纖維肉瘤、血管肉瘤和黑色素瘤等。本發明的一些方面還包括治療患有癌症的受試者，所述受試者已變成化療抗性或難治性。後者意為之前對至少一種化療有反應，接觸到該藥劑之後，在使用這些藥劑進行後續治療後顯示沒有或僅有弱抗癌(例如抗增殖反應，例如沒有或僅很弱地抑制肺瘤生長)效果的患者。因此，在成功使用化療劑治療患者之後，後續治療卻顯示沒有或幾乎沒有效果，則所述癌症可描述為該藥劑難治性或抗性。所述方法包括鑑別這樣的患者，然後確定其mTOR途徑活化是否升高。這一群體可通過mTOR抑制劑(或者下遊、上遊、或上下遊互聯途徑的抑制劑)進行治療。在本發明的一個實施方案中，使用靶向mTOR或互聯途徑中特定節點的一種或多種抑制劑(例如mTOR或AKT特異性抑制劑)治療受試者。在另一個實施方案中，可使用抑制劑組合來抑制所述途徑中的多個節點。這有時使得可以施用毒性較低的較低劑量抑制劑，並破壞途徑中的多個點。這樣的方法是有用的，例如在若干蛋白質顯示出磷酸化提高時。患者可變為難治性或獲得抗性的化療劑實例包括如(但不限於此)烷化劑(例如環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、氮丙咬、環氧化物、烷基磺酸酯)、順鉑及其類似物(例如卡鉑、奧沙利賴)、抗代謝物(例如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他濱、阿糖胞苷、吉西他濱、氟達拉濱)、拓樸異構酶相互作用劑(例如喜樹鹼、伊立替康、拓樸替康、依託泊苷、替尼泊苷、多柔比星、柔紅黴素)、抗微管劑(例如長春花生物鹼類，例如長春新鹼、長春鹼和長春瑞濱；紫杉烷類例如紫杉醇和多烯紫杉醇)、幹擾素、白介素-2、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、單克隆抗體、雌激素調節劑(例如他莫昔芬、託瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香酶抑制劑(例如來曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奧曲肽)、奧曲肽、抗雄激素(例如氟他胺、康士得)、激酶和酪氨酸抑制劑(例如伊馬替尼(STI571或Gleevac);吉非替尼(易瑞沙)；和埃羅替尼(特羅凱)等。參閱如Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology,第七版,Devita等,LippincottWilliams&Wilkins，2005，15、16、17和63章。本發明人發現，對具有不同作用機制的多種化療劑具有抗性(難治性)的受試者均顯示mTOR或互聯途徑的活化。因此可以預計，一個抗性的癌症。實施例顯示，在動物異種移植物模型中，施用mTOR抑制劑抑制了mTOR途徑中蛋白質的下遊磷酸化，與對照相比大幅降低了兩種不同RMS細胞系的生長速率。這支持了mTOR抑制劑和互聯基因/蛋白質抑制劑的治療有用性。因此，本發明既是預後特徵也是新的藥物靶標。這當前被稱之為"治療診斷(theranostic)"，其中所測量的分析物同時作為診斷和治療的耙標。目前一個這樣的例子是e-erbB2。在乳腺癌患者中測量此蛋白質(EGF受體家族的一個成員)作為預後差患者的診斷終點，其本身也是藥物乾標-用於HERCEPTIN。因此它可用於分類和靶向治療。可對活檢或者其它組織或細胞樣品(包括血樣和來自轉移部位的樣品)分析下列特異性涉及mTOR(或互聯)途徑活化的終點總mTOR總4EBP1總EIF4G總E1F4E總p70S6褲酸化pAKT磷酸化mTOR褲酸化4EBP1磷酸化EIF4G褲酸化E1F4E磷酸化p70S6這些特定終點或其它途徑成員的強度值的組合可用於將患者分類為接受標準處置或接受mTOR抑制劑(和/或互聯途徑抑制劑)方案，例如但不限於CCI-779，雷帕黴素抑制劑。無論其作用機制如何，所述非磷酸化狀態和磷酸化狀態的蛋白質均可根據本發明使用。因此，儘管相信所述機制是通過mTOR途徑，但是本發明不受任何使診斷治療、治療和/或預後方法獲得成功的機制限制。本文所述抑制劑可製成多種組合物，例如藥物組合物，以用於治療方法。所述藥物組合物可組裝成試劑盒。一般地，本發明的藥物組合物包含抗癌有效量的所述抑制劑。本文所使用的"抗癌有效量"是在合理的時間範圍內足以在個體中至少產生治療反應的量。例如，它可至少在可檢測程度上減輕癌症的症狀，或者可抑制肺瘤生長，等等。所述組合物可包含載體，例如可藥用載體。"可藥用"指不在生物學或其它方面不理想的材料，即該材料可施用於受試者，而不造成任何不期望的生物學效應或者以有害方式與包含它的藥物組合物中任何其它成分相互作用。自然，如本領域技術人員所公知，將選擇栽體以使得活性成分的任何降解最小化，並使得受試者中的任何有害副作用最小化。對可藥用載體及藥物組合物中其它成分的討論可參閱如Remington'sPharmaceuticalSciences,第十八版,MackPublishingCompany,1990。除了mTOR或互聯途徑成員的抑制劑之外，本發明的藥物組合物或試劑盒還可含有其它藥物(例如化療劑)。所述其它化療劑可在患者治療過程中的任意合適時間同時或依次施用.例如，在一個實施方案中，所述其它化療劑可在用本發明抑制劑的治療已顯著降低受試者中mTOR途徑的活化之後施用。在另一個實施方案中，所述其它化療劑與mTOR等的抑制劑同時(共同)施用。在一個實施方案中，所述其它化療劑是上文所提到的受試者可變為難治性或獲得抗性的一種化療劑。在另一個實施方案中，可使用其它化療劑，其代表性實例列於表2。本領域技術人員應理解，具體的劑型將部分取決於所使用的具體的本發明抑制劑或者其它化療劑以及所選的給藥途徑。因此，本發明組合物有多種合適的劑型。表2作用機制烷化劑抗代謝物植物鹼:細胞毒性/抗腫瘤抗生素:拓樸異構酶抑制劑單克隆抗體:M(藥物名)氮芥類(苯丁酸氮芥、氮芥(Chlormethine)、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖)。亞硝基脲類(卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星)。鉬(卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、BBR3464)。白消安、達卡巴噢、氮芥(Mechlorethamine)、丙卡巴肼、替莫唑胺、塞替派、烏拉莫司葉酸(氨甲喋呤、培美曲塞、雷替曲塞)。嘌呤(克拉屈濱、克羅拉濱、氟達拉濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤)。嘧啶(卡培他濱)。阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他濱紫杉烷(多烯紫杉醇、紫杉醇)。長春花(長春鹼、長春新鹼、長春地辛和長春瑞濱)。蒽環族(柔紅黴素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、米託蒽醌、戊柔比星)。博來審素、羥基脲、絲裂黴素拓樸替康、伊立替康、鬼臼屬(J^^gAv〃"附)(依託泊香、替尼泊苷)。阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、吉姆單抗、帕尼單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗光敏劑其它氨基乙醯丙酸、氨基乙醯丙酸曱酯、卟吩姆鈉、維替泊芬阿利維A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬醯胺酶、蓓薩羅丁、硼替佐米、塞來考昔、地尼白介素、埃羅替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羥基脲、伊馬替尼、噴司他丁、馬索羅酚、米託坦、培門冬酶、維甲酸激素他莫昔芬、孕酮類適於經口給藥的劑型可包括液體溶液，例如溶於稀釋劑(例如水、鹽水或果汁)中的有效量藥劑；膠嚢劑、囊劑或片劑，其各包含預定量的活性成分作為固體、顆粒或凍幹單元；水性液體中的溶液或懸液；以及水包油乳劑或油包水乳劑。片劑形式可包括以下的一種或多種乳糖、甘露醇、玉米澱粉、土豆澱粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸以及其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩衝劑、潤溼劑、防腐劑、芳香劑以及可藥用栽體。還可將適於經口給藥的劑型摻入合成及天然聚合物微球或者其它保護本發明藥物以防止在胃腸道中降解的材料中。適於胃腸外給藥(例如靜脈內)的劑型包括水性和非水性等滲無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使該製劑與預期受體的血液等滲的溶質，還包括可含有助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸液。所述劑型可存在於單位劑量或多劑量密封容器中(例如安瓿和管)，並可在凍幹(低溫乾燥)條件下保存，僅需在臨用前加入無菌液體載體(例如水)以用於注射。可由上述類型的無菌粉劑、顆粒劑和片劑製備即用型注射溶液和混懸液。本發明的抑制劑(單獨或者與其它化療劑組合)可製成氣霧劑以通過吸入給藥。這些氣霧劑可置於加壓的可接受推進劑(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等)中。本發明的抑制劑(單獨或者與其它化療劑組合)可製成用於透皮給藥和吸收的適當劑型(Wallace等，1993，如上文)。還可使用透皮電穿孔或離子電滲來促進和/或控制本發明藥劑和/或藥物組合物透過皮膚的全身遞送(例如，參閱Theiss等(1991),Afe仇F/"AC7/w.i^fl簡tfo/.込353-359)。適於局部施用的劑型包括在芳香劑(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中包含活性成分的糖錠劑；在惰性基質(例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)中包含活性成分的錠劑；在適當液體栽體中包含活性成分的漱口劑；或者霜劑、乳劑、混懸劑、溶液劑、凝膠劑、霜劑、骨劑、泡沫劑、潤滑劑、噴霧劑、栓劑等。本領域技術人員會理解，可基於將要進行的具體應用來選擇、改造或開發合適或適宜的劑型。本發明抑制劑的劑量可以是單位劑型，例如片劑或膠嚢劑。本文所使用的術語"單位劑型"指適於作為人和動物受試者單位劑量的物理分離的單元，每個單元含有與可藥用稀釋劑、載體或賦形劑相關聯的預定量的本發明抑制劑(單獨的或與其它化療劑組合)，經計算其量足以產生期望的效果。本領域技術人員可容易地對待使用組合物的確切劑型確定合適的劑量、時間表和給藥方法，以在個體患者中實現期望的該藥劑抗癌有效量或有效濃度。本領域技術人員還可通過直接或間接分析合適的患者樣品(例如血液和/或組織)而容易地確定和使用本發明化合物"有效濃度"的合適指標。在本發明的上下文中，對動物(特別是人)施用的本發明抑制劑或其組合物的劑量應在合理的時間範圍內足以在個體中至少實現治療性反應(抗癌有效量)。劑量的確切量在受試者之間將有所不同，這取決於受試者的物種、年齡、體重和一般狀況、受治疾病的嚴重程度或機制、所使用的具體藥劑或栽體、其給藥模式等等。用於在體內實現期望的抗癌濃度的劑量將由以下因素決定所使用的具體抑制劑的效力、宿主中與該藥劑相關的藥效學性質、所感染個體的疾病狀態的嚴重程度以及(全身給藥時)個體的體重和年齡。劑量的大小還將決定於使用的具體抑制劑或其組合物所伴隨的任何有害副作用的存在情況。一般只要有可能，就期望將有害副作用保持在最小。當給予組合治療時，所述其它化療劑例如可與抑制劑同時施用，或者按照需要交替施用。所述兩種藥物也可組合在組合物中。當用於組合時，每種的劑量可小於它們單獨使用時的劑量。本發明的另一個實施方案是可用於本文所公開的任何方法的試劑盒；這樣的試劑盒包含一種或多種本文所述抑制劑(例如用於診斷或治療方法)。例如，適用於在受試者中治療癌症的試劑盒可另外包含可藥用載體以及任選的容器或包裝材料。本發明的試劑盒還可用於實驗應用等用途。本領域技術人員將會認識到適於實施任何本發明方法的試劑盒組分。任選地，所述試劑盒包含實施所述方法的說明。本發明試劑盒任選的要素包括合適的緩衝劑、可藥用載體等、容器或包裝材料。試劑盒中的試劑可以在容器中，在其中所述試劑是穩定的，例如是凍幹形式或穩定的液體。所述試劑還可以是單次應用形式，例如單劑量形式。在前述和下述實施例中，所有溫度以未校正的攝氏溫度表示，除非另外指明，所有份數和百分比均以重量計。實施例實施例I.磷蛋白途徑作圖Akt/mTOR活化與兒童橫紋肌肉瘤存活負相關A.引言橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)由具有骨骼肌特徵的未分化間充質細胞引起。RMS是兒童中最常見的軟組織肉瘤，其包括三個組織學亞型-腺泡狀、胚胎型和葡萄狀。儘管最近在組合化療上以及腺泡狀RMS中t(2;13)(q35;ql4)和t(1;13)(p36;ql4)易位的分子認識上有所進展，但是患兒童橫紋肌肉瘤的所有患者的總存活仍停留在60-70%。在幾個發表的RMS治療方案研究中，總體無疾病存活率只有67%。不幸的是，無論疾病分期或組織學亞型如何，都沒有方法鑑別出33%的最初治療將註定失敗的兒童。另一方面，對標準治療有反應的60-70%兒童進行得非常好，這些患者中的絕大多數目前均無疾病存活。因此，一個迫切的臨床目標是鑑定與30-40%無反應者RMS受試者相關的功能重要的分子網絡，以開發對於這一組受試者的新治療策略。B.材料與方法1.樣品和患者數據。所有樣品(n=59)及相關臨床數據獲得自具有適當IRB許可的兒童癌症組織(Children'sOncologyGroup,COG)的組間橫紋肌肉瘤研究(IntergroupRhabdomyosarcomaStudy,IRS)IV，D9502和D9803研究。所有樣品在液氮中速凍並保存至治療前。樣品集分為兩組，IA和1B(圖1A)。圖1B顯示兩個研究組的存活特徵。在最終數據分析之前，樣品就臨床存活結局而言是匿名且盲的。代表研究組1A的樣品(圖1A)由9個速凍手術樣品和來自病理學診斷為橫紋肌肉瘤的33個不同患者的290個冷凍切片組成。此處所用的所有患者在研究開始前均患有3期(腫瘤""/H，3614-3621;Liotta等(2003)CW/2,317-325;Sheehan等(2005)A/o/CW/屍ro^附/cs4，346-365)所產i的顯微切割細胞進行裂解，並使用全細胞蛋白^裂解液如上文Sheehan等(2005)所述一式二份印製反相蛋白質微陣列。簡言之，使用裝備有500jim針的GMS417陣列儀(Affymetrix，SantaClara，CA)將所述裂解液印在背面為玻璃的硝酸纖維素陣列栽玻片上(FASTSlidesWhatman,FlorhamPark,NJ)。將每種裂解液以代表原液、1:2、1:4、1:8、1:16和陰性對照稀釋液的稀釋曲線印在載玻片上。在免疫染色之前，使用乾燥劑(Drierite，W.A.Hammond,Xenia，OH)將所述載玻片保存在-2ox:。3.蛋白質微陣列免疫染色。在自動化載玻片染色儀上按照製造商的i兌明(AutostainerCSAkit，DAKO，Carpinteria，CA)實施免疫染色。將每個載玻片與單種第一抗體在室溫下孵育30分鐘。多克隆第一抗體為GSK3a/(JTyr279/216(Invitrogen-Biosource,Carlsbad,CA)、BCL-2、HIF畫la(BD,FranklinLakes，NJ)、4EBP1、FKHRser256、elF4E、elF4Eser209、elF4G、elF4Gserll08、IGFR-p、IRS畫l、IRS國2、IRS畫lser612、SGK、Bak、Bax、BAD、BADserl12、BADserl36、BADserl55、B-Raf，mTOR、mTORser2448、p70S6Thr389、p70S6激酶、p70S6ser371、S6激酶ser240/244、Akt、Aktser473、AktThr308、4EBP1ser65、4EBP1ser70、和4EBP1Thr37/46(CellSignalingTechnology,Danvers，MA)。將陰性對照栽玻片與抗體稀釋液孵育。第二抗體是山羊抗兔IgGH+L(1:5000)(VectorLabs,Burlingame，CA)。4.用於微陣列分析的生物信息學方法。掃描每個陣列，分析點強度，對數據進行歸一化，對陣列上的每個樣品產生標準化的單一數值(ImageQuantv5.2，GEHealthcare,Piscataway，NJ).在固定區域上求點強度的積分。用未印點的鄰近載玻片背景對每個點計算局部區域背景強度。這對每個樣品得到單個數據點，用於與陣列上每一其它點進行比較。使用JMPv5.0(SASInstitute,CaryNC)進行用於雙因素分級聚類的Ward法。使用威爾科克森雙樣品秩和檢驗來比較兩組之間的數值。小於0.05的P值被i人為是顯著的。當我們不能推測變量的正態分布時，我們使用非參數方法。我們使用Kaplan-Meier(對數秩)存活估計進行單變量存活分析。5.體內異種移植物腫瘤模型。根據國家衛生研究院動物管理及使用委員會的指導進行動物研究。雌性4-6周齡褐色-SCID小鼠購自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)。將0.2ml稀釋劑(5%吐溫80，5%聚乙二醇400(Sigma,St丄ouis，MO))中收穫自Rh30";到左後肢的腓腸肌中，1周後將小鼠隨機分配至對照組(n=8)或CCI-779治療組(n=8)。在連續30天中每3天使用20mg/kg/IP的CCI-779(DevelopmentalTherapeuticsProgram,NationalCancerInstituteandWyeth，Madison,NJ)或僅使用載體腹膜內處理小鼠。每3天4吏用遊標卡尺測量腫瘤生長，通過式V(mm3)-axbH十算腫瘤體積，其中a是最長的腫瘤軸，b是最短的腫瘤軸。通過C02窒息處死所有小鼠，進行屍檢以確認腫瘤生長。將腫瘤切下並速凍在-80t:直至分析。C.鑑定mTOR途徑的有用成員將來自34名患者的腫瘤研究組用於鑑定mTOR途徑中能夠用於以近乎完美的準確性區分這34個樣品組的成員。為了驗證這些發現，通過反相蛋白質微陣列技術分析了來自(結局和對治療的反應不同的)26個患者的獨立且盲的腫瘤組，所述技術一次分析多個信號轉導事件。能夠基於結局區分第一組中患者的特定蛋白質也能夠區分第二個獨立組，示於下文表3:表3.來自對非轉移性3期橫玟肌肉瘤樣品(n=26)的反相蛋白質微陣列的個體蛋白質終點的統計數據非轉移性3期^f黃紋肌肉瘤樣本11=26，d何結局的單因素分析(總存活)存活分析卡方卡方蛋白質終點終點類型卡方概率〉卡方FFSOAS4EBP1總蛋白2.08640.14860.50800.7319化肌T7w37/"磷酸化蛋白汰柳汰柳6汰WM4EBPlThr37/46:4EBP1比值1.63270.20130細30.78874EBP1ser65磷酸化蛋白1.77780.18240,07850.15904EBP1ser65:4EBPl比值0.37350.5411NDND4EBP1Thr70磷酸化蛋白3,15380.07580.64540.9806鬥EBP1Thr70:4EBPl比值O.0Q3I0.9557NDNDe!F4E總蛋白2.77780.0956汰,6eEF4Eser209磷酸化蛋白2.53610.11130.60330.2294eEF4Eser209:elF4E比值1.63830.20060.45560.2224mTOR總蛋白2.940.08640.20230,0568mTORser2448磷酸化蛋白1.50.22070.00790.0037mTORser2448:mTOR比值0.03370.85420.55450.4884p70S6總蛋白3.15380.07580.83630.6118磷酸化蛋白"35汰卿5p70S6Thr389:p70S6比值0.01670.89730.38090.3862p70S6ser371磷酸化蛋白2,5350.1113NDNDp70S6ser371:p70S6比值01.0000NDNDGSK3卩總蛋白4細00.04550.08270,0496磷酸化蛋白汰悅S0.08270.0496GSK3a/卩Tyr279/216:比值3.16050.07540.21200.0629GSK3J3Akt總蛋白4.00000.0455汰肌6汰組2磷酸化蛋白5J柳汰0"7汰。,汰卯7Aktser473:Akt比值2.41980.11980.38450.1774AktThr308磷酸化蛋白2.08640.14860.14590.0773AktThr308:Akt比值0.04940.8241NDNDelF4G總蛋白0.30590.58020.0711磷酸化蛋白沃卿7elF4Gserll08:elF4G比值0.54000,46240.99420.9403S6ser240/244磷酸化蛋白U1660.2卯7汰WW總蛋白45柳0.27630.0771Bax總蛋白2.34380.1258NDNDSGK總蛋白1.35380.2446NDNDBCL-2總蛋白3.36110馬8NDND總蛋白3.26130扁9汰柳30.0525BADserl12磷酸化蛋白0.84380.35830,60130.3275BADserll2:BAD比值0.03380.85410.43560.1696BADserl36磷酸化蛋白0.00370.95120.79950.7251BADserl36:BAD比值0.03380.8541NDNDBADserl55磷酸化蛋白3.3750.06620,58080.1999BADserl55:BAD比值0細00.8065NDNDB-Raf總蛋白0.1350.71330.64580.2437磷酸化蛋白1.77780.18240.1839汰W"總蛋白"柳汰W汰柳5汰柳2IRS-1ser612磷酸化蛋白2.73380細20.32250.0991IRS-1ser612:IRS-l比值0.35640.55050.29500.5065鵬-2總蛋白5.術P汰W790.05440.1843IRS-1ser612:IRS-2比值0.08580.76960.54020,7813總蛋白"572汰組50親7IRS-1ser612:IGFR-p比值0.21730.64110.05780.1192性能最佳的預測物均屬於mTOR途徑。D.RMS腫瘤組1A的探索性數據分析分析前通過雷射捕捉顯微切割(LCM)來富集腫瘤細胞，以確保用於分析的細胞來自癌細胞群內，而不被非癌細胞汙染(Petricoin等(2005)，如上文；Emmert-Buck等(1996)5W騰g274,998-1001)。對於研究組1A(n=33)首先選出15個特異性信號轉S白(圖2A)用於反相蛋白質微陣列分析。15個蛋白質終點的無參照分級聚類分析顯示了兩個主要的腫瘤類別一個聚類具有Akt/mTOR活化/磷酸化，另一個聚類具有相對低水平的信號(圖2A)。從COG獲得臨床結局數據之後，根據患者年齡、性別、原發部位、組織學、侵襲和淋巴結累及特徵通過Fisher精確檢驗來比較這兩個聚類(圖2B)。儘管沒有任何特徵達到p<0.05的統計學顯著性，但是患有腦膜旁(parameningeal，PM)頭頸原發部位腫瘤的患者包含62%的聚類l，而聚類2具有27%的PM原發腫瘤患者(Fisher精確檢驗p=0.06)。另外，聚類2含有73%的腺泡狀肺瘤，而聚類1具有62%的胚胎型腫瘤(Fisher精確檢驗p一.06)。通常，患有眼眶或非腦膜旁部位的胚胎型RMS腫瘤的患者具有最佳的預後。這兩個聚類與通常公認的RMS相關的預後/臨床因素無統計學差異。我們接著將蛋白質分析物值與COG提供的研究組IA的無疾病存活和總存活臨床結局數據進行關聯分析。在從COG獲得臨床結局數據之後，出現了明確的腫瘤劃分。對三種蛋白質4EBP1、磷酸化4EBP1Thr37/46和elF4E(均為Akt/mTOR途徑的組分)的決策樹分衝斤將用標準療法治療後持續完全好轉的患者從復發和死亡的患者中劃分出來。在這些終點中，通過威爾科克森單因素分析發現4EBP1和4EBP1Thr37/46各自與存活顯著相關，4EBP1(p<0.0064)和4EBP1(p<0.0135)(圖3A)。對數秩單變量存活分析(Kaplan-Meier)支持了研究組1A中4EBP1與總存活及無復發存活結局的關聯(圖3B)(OASp=0.018，RFSp=0.0370)o對於研究組1A中的無復發存活，4EBP1水平(P2=0.0074;HR=7.44;CI:1.71-32.36)顯示出作為重要的預後因素。因此，對於研究組1A(圖1-3)，Akt/mTOR途徑中的個體成員看來與存活相關。E.橫紋肌肉瘤患者的無疾病存活和總存活與Akt和mTOR途徑的磷酸化組分相關。基於研究組1A中的發現，從COG獲得一組獨立的樣品(n=26)(1B組，圖1A)，用於分析與Akt/mTOR途徑相關的擴展蛋白質集合。兩個不同類樣品組(1A組和1B組)的單變量對數秩分析顯示，樣品組(OASp-0.2111,RFSp=0.5824)或組織學(OASp=0.4103，RFSp=0.4312)在總存活或無復發存活上均未顯示顯著差異(圖IB和C)。我們《象1A組中那樣通過LCM和反相蛋白質微陣列分析了1B組。我們將終點數擴展到27個，以將Akt和mTOR上遊和下遊的其他信號轉導蛋白包括在內用於獨立評價途徑活化。在數據解盲之後，研究組IB的結果(圖4)證明，無疾病存活和總存活與Akt-mTOR途徑的磷酸化組分顯著相關。高水平的AktSer473、4EBP1Thr37/46、elF4GSerl108和p70S6Thr389都與總存活差及無疾病存活差顯著相關(AktSer473(OASp<0.001，RFSp<0.0009)，4EBP1Thr37/46(OASp<0.0110，RFSp<0.0106)，elF4GSerl108(OASp<0.0017，RFSp<0.0072)，p70S6Thr389(OASp<0.0085，RFSp<0.0296)(圖4A-D)。還對27種組分中的每一個單獨評價了存活與非存活狀態的統計學相關性。6個終點(仍均為Akt/mTOR網絡的成員)(4EBP1Thr37、AktSer473、elF4GSerl108、p70S6Thr389、Bak和GSK3a/pTyr279/216)獨立地與存活相關(威爾科克森單因素分析4EBP1Thr37/46(p<0.0348)，GSK3a/pTyr279/216(p<0.0348)，elF4GSerl108(p<0.0196)，AktSer473(p<0.0227)，Bak(p<0.0321)，p70S6Thr389(p<0.0373))(圖4E)。F.IRS-l/Akt/mTOR反饋迴路在非存活者組中失調酪氨酸磷酸化的胰島素受體底物-l(InsulinReceptorSubstrate-1,IRS-1)通過PI3K活化Akt/mTOR信號轉導，而mTOR和p70S6對IRS-l612位絲氨酸的絲氨酸磷酸化下調IRS-1酪氨酸活化。因此，IRS-1應答於Akt/mTOR活化而受到負反饋調控(圖5A)。我們通過反相蛋白質微陣列對研究組IB(n=26)中的肺瘤檢測了IRS-l/Akt/mTOR反饋迴路的磷酸化成員的水平。儘管IRS-1Ser612的水平在存活者和非存活者之間沒有差異，但是在存活者組中IRS-1Ser612的磷酸化與mTOR在Ser2448處的磷酸化強相關(Spearman，sRho非參數p<0.0027)，提示了這兩個信號轉導事件之間的聯繫(圖5B)。相反，在非存活者組中相同的這兩個信號轉導蛋白的磷酸化不相關(Spearman'sRho非參數p=0.7358)(圖5B-C)。這種與IRS-1Ser612磷酸化相關性的缺乏也存在於mTOR下遊組分elF4ESer209(存活者p=0.0006，非存活者p=0.1017)和p70S6Thr389(存活者p=0.00004，非存活者p=0.1827)中(圖5B和D)。因此，在存活差的患者胂瘤中，mTOR途徑的蛋白質對IRS-1活性的負反饋調控可能是斷開的(disconnected).相反，在長期存活患者的腫瘤中IRS-1信號轉導似乎表現出完好的負反饋調控(圖5A-D)。G.蛋白質磷酸化與非磷酸化狀態的研究磷酸化是一種重要的翻譯後修飾，其作為途徑活化狀態的讀出物和激酶抑制劑靶標而具有潛在的重要性。為了進一步研究IRS-l/Akt/mTOR途徑中潛在的重要細胞信號轉導蛋白質，我們將我們的分析擴展至包括以下其他終點BAD、elF4G、IRS-1、IRS-2、IGFR-p和S6ser240/244。我們對關鍵蛋白質終點的磷酸化蛋白質、總蛋白質形式以及磷酸化形式與總形式的比值進行了威爾科克森單因素分析和Kaplan-Meier存活分析(圖5B)。結果清楚地證明，相比於分析物蛋白的非磷酸化總形式，Akt-mTOR和相關途徑中蛋白質終點的特定磷酸化形式與存活相關(p<0.05)(4EBP1Thr37/46p<0.03，p70S6Thr389p<0.0373，GSK3apY279/216p<0.348，Aktser473p<0.0227，elF4Gserl108p<0.0196)。這是一個重要的區別，因為信號途徑節點的總蛋白質群很可能與磷酸化形式相比是過量的。磷酸化形式構成了總蛋白質中活躍參與信號轉導的一個亞群。H.在小鼠異種移植模型中mTOR途徑的抑制降低肺瘤生長為了驗證我們的IRS-l/Akt/mTOR網絡分衝斤在功能上的重要性，我們使用了雷帕黴素類似物(已充分表徵的mTOR蛋白激酶途徑抑制劑)，其中採用小鼠異種移植物處理模型。將RD胚胎型細胞或Rh30腺泡狀細胞原位注射進褐色SCID小鼠的後肢。將這兩種不同的細胞系用於確定mTOR抑制在不同組織學肺瘤分類中的作用。雷帕黴素類似物CCI陽779(Wyeth,Madison，NJ)劑量是20mg/kg，這對應於目前在I期和II期臨床試驗中施用於人的劑量(Raymond等(2004)，JC7/"il，2336-2347;Smolewski等(2006)JWc"歸rDm^12，487-494)。施用經證實抑制mTOR下遊靶標磷酸化的CCI-779劑量極大程度地降低了橫紋肌肉瘤異種移植物的生長，如在SCID-褐色小鼠模型中所測量的(Rh30異種移植組p-0.0002;RD異種移植組p=0.00008，兩組均為n=8)(圖6A-C)。通過測量4EBP1和S6核糖體蛋白(已確定的mTOR下遊靶標)的褲酸化來監測mTOR途徑的抑制。在來源於Rh30腺泡狀和RD胚胎型異種移植物的腫瘤中，CCI-779均抑制這些下遊把標的磷酸化，相應地阻斷mTOR信號轉導。I.討論在本實施例中，使用兩個十二年隨訪數據可用的獨立RMS腫瘤研究組，對治療或存活採取盲法進行蛋白質信號轉導途徑的分析。接著根據最近完成的IRSIV研究、COGD9502或進行中的COGD9803研究治療患者。從冷凍樣品庫中隨機獲得兩個獨立的研究組(圖1A，表1A和1B)。每個研究組代表多種治療方式、組織亞型和腫瘤部位。這兩個組中腺泡狀與胚胎型組織學形態樣品的比例不同(圖1)(3，4)。儘管所述樣品組是異質的，但兩個樣品組之間在總存活或無復發存活上無統計學顯著差異(總存活p-0.2111,無復發存活p=0.5824)(圖IB)。目前用於診斷為橫紋肌肉瘤患者的預後指標是年齡、分期、分組、組織學和原發部位，患有來自眼眶或非腦膜旁頭頸部位的胚胎型RMS的l-8歲患者具有最佳的預後(15)。使用無參照聚類分析，我們試圖確定是否有蛋白質信號轉導特徵與組織學亞型相關。對於第一研究組，首先選擇十五種特異性信號轉導蛋白(圖2A和3A)，因為它們構成了多種促存活相關事件的廣泛研究。對所選磷酸化狀態進行的多重測量提供了選定的驅動細胞生長或存活的網絡中正在進行的激酶活性事件的平均模式。最初的無參照聚類分析不與組織學顯著相關，但是所述樣品清楚地劃分為兩個聚類，其中一個聚類顯示Akt/mTOR蛋白質的活化(圖2A)。因此，從COG獲得臨床結局數據，以進一步研究所述蛋白質終點與臨床數據之間的相關性。1A組的結果顯示了存活與Akt/mTOR(雷帕黴素的哺乳動物靶標)信號轉導途徑相關蛋白質的活化/抑制之間統計學顯著的相關性(圖3A)。基於1A組的結果，我們將此探索性分析擴展到第二獨立樣品組的27個終點(圖1A，表1B)。將第二研究組中看來與存活或死亡相關的蛋白質與Akt/mTOR激酶途徑連接在一起(13、27、28)。發現IRS-1(胰島素受體底物)、Akt、mTOR、4EBP1(延伸結合因子))、GSK3a/p(糖原合酶激酶-3)和p70S6的磷酸化組分與結局相關(圖4)。IRS-1、Akt和GSK3卩與細胞生長、存活、胰島素應答和葡萄糖代謝相關。mTOR、4EBP1和p70S6是蛋白質翻譯的必要組分，其中4EBP1的磷酸化將4EBP1從elF4E上釋放，激活帽依賴性翻譯。已知這些途徑參與促存活調控和一組對細胞周期和凋亡具有重要性的蛋白質的翻譯，所述重M白質包括數個已知的癌基因，例如細胞周期蛋白D、c-myc和Hif-la。Akt/PKB(蛋白激酶B)在多種細胞功能中起中心作用，所述細胞功能包括糖原合成、細胞周期調控以及細胞維持存活和凋亡。儘管對於研究組1B，AktSer473與存活(p<0.02)相關，但是在1A組中它不與存活相關(p=0.2460)。這可能是由於兩個組中腫瘤組織學相對組成和原發部位的差異造成的(圖1A)。多種自分泌和旁分泌剌激(包括激素、生長因子、絲裂原、細胞因子和G蛋白偶聯受體激動劑)引發4EBP1的超磷酸化以及伴隨的mTOR途徑中elF4E結合活性的喪失。磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)或者下遊效應物激酶Akt的活化導致4EBP1的超磷酸化，影響它從elF4E上的釋放。4EBP1在多個位點上的磷酸化與胰島素受體途徑和PI3K途徑的連接相關。4EBP1上已鑑定出六個磷酸化位點。在胰島素刺激後，Thr37、Thr46、Ser65和Thr70變為磷酸化，這樣的磷酸化可被雷帕黴素(mTOR抑制劑)和渥曼青黴素(PI3K抑制劑)阻斷。已經顯示，mTOR自身以及mTOR相關激酶直接磷酸化4EBPl上的位點。Gingras等確定了磷酸基首先加到Thr37和Thr46上。這種引發磷酸化是結合所需其它位點的磷酸化所必需的。因此，由多種激酶觸發的由Thr37/46引發的多重磷酸化事件參與了4E-BP1從elF4E上的釋放。酪氨酸礴酸化的胰島素受體底物-1(IRS-1)通過PI3K活化Akt/mTOR信號轉導，mTOR和p70S6對IRS-1(612位絲氨酸)的絲氨酸磷酸化下調IRS-1酪氨酸活化。因此，已經提出，IRS-1應答於通過p70S6進行的Akt/mTOR活化而受到負反饋調控(圖5A)。我們通過非參數相關性研究了IRS-1反饋迴路與Akt和mTOR途徑的相互關係(圖5B-D)。對IRS-1絲氨酸612和多個可能的相互作用蛋白的研究提供了評估與參與IRS-1負反饋調控的實際磷酸化位點的蛋白質相互作用的方法。好結局和差結局患者的胂瘤IRS-1ser612的平均水平無統計學差異(圖4E)，提示IRS-1的上遊活性水平類似。儘管好結局和差結局病例中IRS-1磷酸化平均水平相似，但是在這兩種表型中每個肺瘤的個體IRS-1磷酸化水平與Akt和mTOR途徑蛋白質磷酸化水平之間的相關性極為不同。另一方面，在兩組中Bax、FKHRser256和4EBP1Thr70都顯著相關(圖5B)。如圖5所示，在好結局的胂瘤中IRS-1ser612與mTORser2448(p=0.00269)以及與p70S6Thr289(p=0.00004)強正相關(圖5B-D)。這提示了與mTOR與IRS-1之間反饋迴路一致的關聯性，並且它可能在體內狀態下存在於具有好結局的胂瘤中。這些數據支持了在差結局的腫瘤中所述反饋迴路的選擇性斷開。存活者與非存活者中IRS-Akt-mTOR互聯性的這些差異的意義是雙重的。首先，IRS-l和mTOR之間表面上缺乏互聯可破壞正常的負反饋調控。這可導致如我們在差結局的患者腫瘤中所注意到的Akt磷酸化提高，如圖5A所示。其次，用於攻擊性腫瘤(其中所述負反饋迴路不起作用)的mTOR抑制劑療法將無法引起Akt磷酸化提高。在攻擊性腫瘤中(其中mTOR通過IRS-1的負反饋調控被破壞)磷酸化Akt和mTOR的基線水平可升高，導致肺瘤的持續生長和存活。已鑑定的4E-BP1磷酸化位點已知被雷帕黴素處理特異性抑制。為了驗證我們揭示好治療結局患者中所觀察到的mTOR途徑抑制的網絡分析的功能重要性，我們利用了已有的雷帕黴素類似物，它們是已良好表徵的mTOR蛋白激酶途徑抑制劑。這些類似物中的一些目前處於成人癌症患者的I期和II期臨床試驗(Raymond等(2004),如上文;Smolewski等(2006)如上文)。通過測量4EBP1和S6激酶的磷酸化狀態來監測mTOR途徑的抑制，所述激酶是已良好確立的mTOR下遊底物(13、27、28、30、31)。在來源於Rh30腺泡狀或RD胚胎型細胞的異種移植物腫瘤中，CCI-779抑制下遊乾標的預計磷酸化，相應地阻斷mTOR信號轉導(圖6)。總之，對治療前獲得的顯微切割人RMS臨床樣品進行的蛋白質途徑分析顯示，在此初步探索性分析中Akt/mTOR途徑的活化與差結局強相關。發現這一觀察在兩個獨立分析的臨床研究組之間一致。另夕卜，使用特異性靶向抑制劑CCI-779在SCID-褐色RMS異種移植物模型中抑制腫瘤生長，驗證了IRS-l/Akt/mTOR途徑活化在RMS中的功能重要性。這些數據支持了這一推論，即在這一腫瘤類型中使用雷帕黴素類似物作為將差預後患者調控為較長存活結局患者的潛在方法。組合治療策略可以著眼於同時阻斷上遊信號轉導因子活化和下遊mTOR信號轉導，作為增強標準細胞毒性RMS治療的方法。實施例II.使用反相蛋白質微陣列進行的肺癌磷蛋白組分析；mTOR途徑在決定非小細胞肺癌(最常見的肺癌類型)結局中的重要性A.材料與方法1.樣品。二十個早期肺腺癌手術樣品。肺手術切除物收集自患者，並且在手術時冷凍。(根據國家死亡指數(NationalDeathIndex)確認患者存活)2.冷凍切片。在矽烷化栽玻片上製備8nm冷凍組織切片。3.雷射捕捉顯微切割(LCM)。4吏用MolecularDevices'Pixcell或Veritas設備獲得純肺瘤細胞群.4.反相蛋白質微陣列被印在WhatmanSchleicher和SchuellFAST栽玻片上，其中使用AffymetrixGMS417針和環型陣列儀(一式二份印製樣品，每個點印10下)5.免疫染色。在Dako自動染色儀上，使用Dako催化信號擴增化學(辣根過氧化物酶介導的生物素化酪胺沉積)通過發色檢測(DAB)來檢測微陣列上的特定蛋白。B.劃分分析用ImageQuantver5.2實施微陣列點強度分析，將JMP軟體用於雙因素分級聚類(Ward法)和劃分分析。結果示於下文表4和圖7。表4.用於將反相蛋白質微陣列免疫染色的抗體探針tableseeoriginaldocumentpage39C，根據Kaplan-Mier存活曲線的RPMA分析在這個組中，基於主成分分析，通過反相陣列分析對IO名長期存活患者和10名短期存活患者進行分析。表示為Kaplan-Mier存活曲線(圖8和9)的結果再次顯示，AKT/mTOR途徑的組分被發現是結局的主要驅動者。同樣地，p4EBPl和pAKT升高的患者具有顯著更短的總存活時間。實施例III.使用反相蛋白質微陣列進行的乳腺癌磷蛋白組分析在此實施例中，通過使用反相蛋白質微陣列的分子網絡分析來分析取自ER+淋巴結陰性和淋巴結陽性乳腺癌患者的腫瘤研究組，所示患者至少隨訪10年，並且均使用他莫西芬單一療法進行治療。在所分析的55個磷酸化終點中，結局區分的大部分主成分屬於mTOR途徑。重要的是，不論淋巴結狀態怎樣，mTOR途徑組分(主要是pEBPl，還有p70S6)均可區分結局。圖10顯示才艮據p4EB-Pl分組的乘積相關存活擬合；存活僅來自LN-亞組。圖11顯示LN+群的劃分分析，其顯示p70S6為區分的主成分。圖12顯示了來自所有病例(LN-和LN+)的存活曲線。結論數據明確支持以下結論，即患有ER+乳腺癌(無論淋巴結狀態如何)並使用他莫西芬單一療法的女性的復發時間與mTOR途徑特定組分的磷酸化狀態強相關。這一信息可以是以下決定的基礎a)決定誰應該接受他莫西芬療法和/或b)給預測為差存活的患者亞組施用第二療法。合適的這些第二治療劑在本文別處有討論。從上述描述中，本領域技術人員能夠容易地確定本發明的必要特徵，並可在不脫離其構思和範圍的情況下對本發明作出改變和修改，以使之適應多種應用和條件，以及以最完整的範圍應用本發明。上述優選的具體實施方案應理解為僅用於說明，而不以任何方式限制本發明的範圍。上文和附圖中引用的所有申請、專利以及出版物(包括2005年10月18日提交的美國臨時申請號60/727,510)的全部公開內容均通過參考整體併入本文。權利要求1.一種預測受試者對化療劑的反應和/或該受試者的預後的方法，和/或用於在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其包括在來自該受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量mTOR途徑至少一個成員和/或互聯多肽途徑至少一個成員相比基線值的磷酸化狀態；其中所述磷酸化狀態相比於基線值的水平升高表明該受試者是該化療劑的無反應者和/或預後差。2.權利要求l的方法，其中所述互聯多肽途徑成員來自Akt途徑。3.權利要求l的方法，其中所述互聯多肽途徑成員來自IRS途徑。4.權利要求1的方法，其中所述互聯多肽途徑成員來自除Akt或IRS途徑之外的途徑。5.權利要求l的方法，其中所測量的磷酸化狀態是mTOR途徑的至少一個成員、Akt途徑的至少一個成員、或者IRS途徑的至少一個成員或其組合的磷酸化狀態。6.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是mTOR途徑的至少一個成員的磷酸化狀態。7.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是Akt途徑的至少一個成員的磷酸化狀態。8.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是IRS途徑的至少一個成員的磷酸化狀態。9.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是mTOR途徑至少一個成員和Akt途徑至少一個成員的磷酸化狀態。10.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是mTOR途徑至少一個成員和IRS途徑至少一個成員的磷酸化狀態。11.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是IRS途徑至少一個成員和Akt途徑至少一個成員的磷酸化狀態。12.權利要求5的方法，其中所測量的磷酸化狀態是mTOR途徑至少一個成員、IRS途徑至少一個成員和Akt途徑至少一個成員的磷酸化狀態。13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所測量的磷酸化狀態反映該多肽特定的磷酸化模式。14.權利要求l的方法，其中所述mTOR和/或互聯多肽途徑成員是Akt激酶、mTOR、4E國BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E或elF-4G、PTEN、PDK1、GSK3p、TSC1/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或備CHK1。15.權利要求1-14中任一項的方法，另外，其中如果未觀察到所述途徑成員的磷酸化狀態相比於基線值的顯著提高，則用常規化療方法治療該受試者。16.權利要求1-14中任一項的方法，另外，其中如^J見察到所述途徑成員的磷酸化狀態相比於基線值的顯著提高，那麼對該受試者施用mTOR途徑或互聯多肽途徑成員的抑制劑。17.權利要求16的方法，其中所述抑制劑結合FKB12。18.權利要求16的方法，另夕卜，其中將常規化療劑與所述抑制劑組合施用於該受試者。19.權利要求18的方法，其中所述常規化療劑與所述抑制劑同時施用。20.權利要求18的方法，其中所述常規化療劑在施用所述抑制劑之後的合適時間施用。21.權利要求16的方法，其中在施用所述抑制劑之後測量該途徑成員的磷酸化狀態。22.權利要求16的方法，其中所施用抑制劑的量有效降低該途徑成員的磷酸化量。23.—種使用化療劑在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其改進包括如果在來自所治療受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到mTOR途徑或互聯多肽途徑成員磷酸化的顯著提高，則施用mTOR途徑或互聯多肽途徑成員的抑制劑。24.—種治療化療劑抗性或難治性癌症的方法，其包括如果在來自所治療受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到mTOR途徑或互聯多肽途徑成員磷酸化的顯著提高，則施用mTOR途徑或互聯多肽途徑成員的抑制劑。25.—種在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其包括通it^U'j要求1-14中任一項的方法測量mTOR途徑至少一個成員和/或互聯多肽途徑至少一個成員相比於基線值的砩酸化狀態；並且如果測量到顯著量的磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯多肽途徑成員的抑制劑。26.權利要求14或16-25中任一項的方法，其中在化療之前測量磷酸化，並且如果在來自所治療受試者的癌組織或癌細胞樣品中測得所述途徑成員的磷酸化顯著提高，則與化療劑組合施用所述抑制劑以治療該癌症。27.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述途徑成員的磷酸化使用針對選自以下的至少一個成員的磷酸化位點的抗體來測量PI3激酶、Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E和elF畫4G、PTEN、PDK1、GSK3p、TSC1/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或ic服l。28.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述癌症是乳腺癌。29.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述癌症是橫故肌肉瘤。30.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述癌症是肺癌。31.權利要求30的方法，其中所述肺癌是非小細胞肺癌。32.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述樣品包括轉移細胞，33.權利要求1-26中任一項的方法，其中所述癌症與PTEN功能的喪失和/或Akt的突變和活化無關。34.權利要求17-32中任一項的方法，其中所述抑制劑是針對mTOR途徑、Akt途徑或IRS途徑的成員或其組合。35.權利要求17-32中任一項的方法，徑的成員。36.權利要求17-32中任一項的方法,的成員。37.權利要求17-32中任一項的方法，的成員。38.權利要求17-32中任一項的方法，IRS途徑之外的互聯途徑的成員。39.權利要求17-32中任一項的方法,徑的成員和Akt途徑的成員。40.權利要求17-32中任一項的方法，徑的成員和IRS途徑的成員。41.權利要求17-32中任一項的方法，的成員和IRS途徑的成員。其中所述抑制劑是針對mTOR途其中所述抑制劑是針對Akt途徑其中所述抑制劑是針對IRS途徑其中所述抑制劑是針對除Akt或其中所述抑制劑是針對mTOR途其中所述抑制劑是針對mTOR途其中所述抑制劑是針對Akt途徑42.權利要求17-32中任一項的方法，其中所述抑制劑是針對mTOR途徑的成員、Akt途徑的成員和IRS途徑的成員。43.權利要求17-42的方法，其中所測量的磷酸化狀態反映該多肽的特定磷酸化模式。44.一種預測受試者對化療劑的反應和/或該受試者的預後的方法，其包括在來自所治療受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量mTOR途徑至少一個成員和/或互聯多肽途徑至少一個成員的磷酸化狀態的變化，其中水平的升高表明該受試者是該化療劑的無反應者和/或預後差。45.—種使用化療劑在有此需要的受試者中治療橫紋肌肉瘤的方法，其改進包括，如果在來自該受試者的癌組織或癌細胞樣品中測量到4EBP1Thr37/46、elF-4Gserl108和/或p70S6Thr389磷酸化提高，則施用CCI-779。46.—種用於預測受試者對化療劑的^^應和/或該受試者的預後的試劑盒，其包含用於檢測mTOR途徑至少一個成員和/或Akt途徑至少一個成員和/或IRS途徑至少一個成員或者其組合的磷酸化狀態的一種或多種試劑。47.—種藥物組合物，其包含mTOR途徑至少一個成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個成員的抑制劑或者其組合，還包含可藥用載體。48.權利要求47的藥物組合物，其還包含可以與權利要求47的抑制劑聯合施用的化療劑。49.一種用於治療患有化療劑抗性或難治性癌症的受試者的試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個成員的抑制劑或者其組合。50.權利要求49的試劑盒，其還包含可與以下抑制劑聯合施用的化療劑mTOR途徑至少一個成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個成員的抑制劑或者其組合。全文摘要本發明涉及，例如預測受試者對化療劑的反應和/或該受試者預後的方法，其包括測量來自該受試者的癌組織或癌細胞樣品中mTOR途徑的至少一個成員和/或互聯多肽途徑的至少一個成員(例如Akt途徑的成員或IRS途徑的成員)相對於基線值的磷酸化狀態，其中所述磷酸化狀態相對於基線值的水平升高標誌著所述受試者是該化療劑的無反應者和/或預後差。本發明還描述了在有此需要的受試者中治療癌症的方法，其中所述受試者表現出磷酸化狀態水平的升高，所述方法包括施用mTOR和/或互聯途徑的一種或多種抑制劑。文檔編號G01N33/68GK101421625SQ200680047736公開日2009年4月29日申請日期2006年10月18日優先權日2005年10月18日發明者蘭斯·A·廖塔,埃馬努埃爾·F·彼得裡科因三世,維吉尼亞·埃斯皮納申請人:喬治梅森智慧財產權公司