使用樹枝狀聚合物抑制毒物或毒性物質的製作方法

2023-06-28 12:10:06 2

專利名稱：使用樹枝狀聚合物抑制毒物或毒性物質的製作方法
技術領域：
本發明涉及抑制毒素和其它毒物或毒性物質的方法，且更具體地說，本發明涉及樹枝狀聚合物作為毒性肽類、蛋白質或聚胺類和其它毒物或毒性物質的結合劑的用途。
國際專利申請號PCT/AU95/00350(WO 95/34595)和PCT/AU97/00447(WO 98/03573)中公開了諸如帶有多個端基的聚醯氨基胺或聚賴氨酸樹枝狀聚合物這樣的樹枝狀聚合物，其中至少一個端基帶有與之結合或連接的含陰離子或陽離子的部分。將這些公開的國際專利申請的內容引入本文作為參考。
本發明提供了樹枝狀聚合物在抑制毒物或毒性物質中的用途，其中所述的毒物或毒性物質包括但不限於毒素或毒性肽類諸如來自蛇、蠍子、蜘蛛和蜂毒這樣的毒素或毒性肽類以及在細菌或病毒感染過程中釋放的毒性肽類或其它毒物或毒性物質。
發明概括本發明提供了一種預防性或治療性抑制人體或非人體的動物體患者體內毒物或毒性物質的方法，該方法包括對所述患者給予有效量的帶有多個端基的樹枝狀聚合物的步驟，其中至少一個所說的端基帶有與之結合或連接的含陰離子或陽離子的部分。
用於本發明方法的特別優選的化合物是帶有下列與其端基連接的部分的樹枝狀聚合物含磺酸的部分、含羧酸的部分、含磷酸和膦酸的部分、含硼酸的部分、含神經氨酸或唾液酸的部分或含修飾的神經氨酸或唾液酸的部分；含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分；含鈲鹽的部分；含脒鎓(amidinium)的部分；含苯酚的部分；具有酸性或鹼性氫的雜環；含兩性離子的部分或上述部分的混合物。
將用於本發明方法的化合物在本文中稱作聚離子型樹枝狀聚合物並將該術語在本說明書的上下文和權利要求中使用，它不僅包括樹枝狀聚合物本身，而且包括其藥物上或獸藥上可接受的鹽，例如諸如鈉、鉀或鈣鹽這樣的鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽以及諸如氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、檸檬酸根、乙酸根、對甲苯磺酸根等這樣的藥物上可接受的陰離子。發明詳述用幹本發明的優選化合物包括通式Ⅰ的聚離子型樹枝狀聚合物 其中I是引發劑核；
Z是內部支化單元；n是代表樹枝狀聚合物代數的整數；且A是可以通過任選的連接基團X與內部支化單元Z連接的含陰離子或陽離子的部分。
樹枝狀聚合物是大分子的多支化合物，它通過從最初的核分子開始經添加在連續「代(generation)」的連續層或階段的重迭代反應順序來構成三維高度有序的聚合物化合物。樹枝狀聚合物具有下列特徵ⅰ引發劑核(I)可以帶有一個或多個反應部位並且是點樣或顯著大小以便獲得最終的樹枝狀聚合物拓撲結構；ⅱ支化重複單元(Z)層與引發劑核連接；ⅲ官能端基(諸如A部分)任選地通過連接基團(諸如連接基團X)與樹枝狀聚合物表面結合。本發明使用樹枝狀結構作為連接離子部分的構架；本發明並不限於本文具體描述的球形樹枝狀聚合物，而可以以任意樹枝狀結構為基礎。各種形狀或結構的樹枝狀聚合物對本領域技術人員來說是眾所周知的。
樹枝狀聚合物的製備方法是眾所周知的且例如通過美國專利4289872和4410688(描述以多層賴氨酸單元為基礎的樹枝狀聚合物)以及美國專利4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329(描述以包括聚醯氨基胺或PAMAM樹枝狀聚合物在內的其它單元為基礎的樹枝狀聚合物)來描述。這些美國專利中所公開的樹枝狀聚合物被描述為適用於在製備紙中作為諸如作為表面修飾劑、作為金屬螯合劑、作為反乳化劑或油/水乳劑、溼強度劑和適用於作為改變諸如漆這樣的含水劑粘度的試劑。在美國專利4,289,872和4,410,688中還提示了可以將以賴氨酸單元為基礎的樹枝狀聚合物用作製備藥物劑型的基質。
國際專利公開號WO 88/01178、WO 88/01179和WO 88/01180公開了將樹枝狀聚合物與另一種諸如攜帶的藥物或農業物質這樣的物質接合或連接的接合物。此外，國際專利公開號WO 95/24221公開了由至少一種與可以是生物反應修飾劑的載體物質連接的樹枝狀聚合物和任選的靶物定向劑組成的樹枝狀聚合物接合物。這些專利公開以及上述美國專利中包括廣泛公開的各種樹枝狀聚合物及其製備方法並將這些公開文獻中每一篇的內容均引入本文作為參考。
在最廣義的意義上理解本文所用的術語「樹枝狀聚合物」且在其範圍內包括如專利公開號WO 88/01178、WO 88/01179和WO 88/01180中所公開的這些樹枝狀聚合物的所有形式和組合物。該術語還包括在這些專利公開文獻中所公開的連接或橋連的樹枝狀聚合物。
本發明優選的樹枝狀聚合物包括與至少兩個樹枝狀分支共價結合的多價核且優選通過至少兩代擴展。特別優選的樹枝狀聚合物是聚醯氨基胺(PAMAM)樹枝狀聚合物、PAMAM(EDA)樹枝狀聚合物、聚(丙烯亞胺)(poly(propyleneimine))(PPI)樹枝狀聚合物和聚賴氨酸樹枝狀聚合物。
根據本發明，樹枝狀聚合物表面上端基中的至少一個且優選顯著數量的端基帶有與之結合的含陰離子或陽離子的部分。樹枝狀聚合物的分支可以在氨基或其它反應性官能基諸如OH、SH等上封端，隨後這些基團與陰離子或陽離子部分反應。如果樹枝狀聚合物的端基是胺基，那麼含陰離子或陽離子的部分可以通過包括醯胺和硫脲鍵在內的各種官能基與該樹枝狀聚合物連接。可以與樹枝狀聚合物端基結合的優選的含陰離子或陽離子的部分包括含磺酸的部分、含羧酸的部分(包括含神經氨酸和唾液酸的部分和含修飾的神經氨酸和唾液酸的部分)、含硼酸的部分、含磷酸和膦酸的部分(包括含酯化的磷酸和膦酸的部分)和含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分、含鈲鹽的部分、含脒鎓的部分、含苯酚的部分、具有酸性或鹼性氫的雜環、含兩性離子的部分或上述部分的混合物。
可以與氨基或其它端基結合或連接的合適的含陰離子和陽離子的部分包括例如下列基團(其中n是0或正整數，更具體地說，n是0或1-20的整數)-NH(CH2)nSO3--(CH2)nSO3--Ar(SO3-)n-CH2CH(SO3-)COOH -CH(SO3)CH2COOH -ArX(CH2)nSO3-X=O,S,NH -ArXP(=O)(OR)2X=O,CH2,CHF,CF2R=烷基，芳基，H,Na-ArXP(=O)(OR1)(NR2R3)X=O,CH2,CHF,CF2R1=烷基，芳基，H,Na R2,R3=烷基，芳基-Ar[p(=O)(OR)2]nR=烷基，芳基，H,Na n=1-3-Ar[B(OH)2]nn=1-3 -Ar[COOH]nn=1-3 R=烷基或芳烷基；R1、R2、R3(可以相同或不同)=烷基或芳烷基 除上述之外，各種含神經氨酸或唾液酸的部分或含修飾的神經氨酸或唾液酸的部分可以與本發明的樹枝狀聚合物結合或連接。這些部分包括各種N-和O-取代的神經氨酸衍生物，特別是諸如N-乙醯基、O-乙醯基和N-乙醇醯衍生物這樣的N-和O-醯基衍生物以及神經氨酸基被修飾的部分。適當修飾的神經氨酸基團包括4-位上被氨基、醯氨基、氰基、疊氮基或胍基所取代的基團以及不飽和神經氨酸基團。這些部分可以通過2-、7-、9-或5-NAc位與樹枝狀聚合物連接。
優選的情況是，在通式Ⅰ的聚離子型樹枝狀聚合物中，n是1-20或以上的整數；更優選1-10。另外優選的情況是，樹枝狀聚合物至少包括3個或更多個端基。
可以起樹枝狀聚合物與A部分之間間隔基作用的任選的連接基團可以由烷基鏈(任選地被取代或分支)、烷氧基、聚烷氧基、烷硫基或聚烷硫基鏈(可以被取代或不被取代)或鏈烯基、多個鏈烯基、炔基或多個炔基鏈(可以被取代或不被取代)組成。合適的間隔基鏈包括式-(CH2)m-Z-(CH2)m-的基團，其中Z是-CH2-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-或-S-，且m是1-15的整數。
通過本領域技術人員眾所周知的標準化學方法可以製備本發明的陰離子型或陽離子型樹枝狀聚合物。合適的方法例如下列實施例中的描述。
如上所述，已經發現本發明的陰離子型或陽離子型樹枝狀聚合物可抑制毒物或毒性物質。本文所用的術語「毒物或毒性物質」特別用來指來源於生物(動物、植物、微生物或病毒)的毒素，包括但不限於諸如來自蛇、蠍子、蜘蛛和蜂毒這樣的毒素或毒性肽類、毒性聚胺類以及在細菌感染(諸如細菌內毒素或外毒素)、原生動物、真菌或病毒感染過程中釋放的毒性肽類或其它毒物或毒性物質。
本文所用的術語「抑制」在最廣泛的意義上包括對人體或非人體的動物體患者體內毒物或毒性物質的毒性作用的完全或部分抑制或壓製作用。該術語還用於包括預防性和治療性的治療。
因此，本發明在另一個方面中提供了一種用於預防性或治療性抑制人體或非人體的動物體患者體內毒物或毒性物質的藥物組合物或獸藥組合物，它包括如上述概括的樹枝狀聚合物以及至少一種藥物上或獸藥上可接受的載體或稀釋劑。
這類組合物的製劑對本領域技術人員來說是眾所周知的。合適的藥物上可接受的載體和/或稀釋劑包括任意和所有的常用溶劑、分散介質、填充劑、固體載體、水溶液、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和延緩吸收劑等。這類介質和試劑在活性物質中的應用在本領域中是眾所周知的且通過《Remington氏藥物科學》(Remington’sPharmaceutical Sciences)第18版，Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA中的實例來描述。除任意常用介質或試劑與活性組分不相容外，所關注的是它們在本發明藥物組合物中的應用。還可以將補充的活性組分混入組合物。
特別有利的是配製給藥方便和劑量均勻的單位劑型形式的組合物。本文所用的單位劑型指的是適合作為所治療的人受治療者的單位劑型的物理上可分散的劑型；含有預定量活性組分與所需藥物上可接受載體和/或稀釋劑的各劑型適合於產生所需的治療作用。對本發明新型單位劑型的說明由下列因素來決定並直接取決於下列因素(a)活性組分的獨特特性和所獲得的特定治療作用和(b)化合這類用於特定療法的活性組分的領域中固有的限制。
在另一個方面中，本發明提供了如上述概括的有效量的樹枝狀聚合物通過抑制毒物或毒性物質而預防性或治療性治療人體或非人體的動物體患者或在製備用於預防性或治療性治療人體或非人體的動物體患者的藥劑中的用途。
可利用各種給藥途徑。當然，所選擇的特殊方式取決於所治療的特定疾病和達到治療功效所需的劑量。一般來說，使用醫療上可接受的任意給藥方式、即產生本發明活性成分的治療水平而不會導致臨床上不可接受的不良反應的任意方式可以實施本發明的方法。這類給藥方式包括口服、直腸、局部、鼻部、吸入、經皮或非腸道(例如皮下、肌內和靜脈內)途徑。用於口服給藥的製劑包括諸如膠囊、片劑、錠劑等這樣的分散單位。其它途徑包括直接進入脊髓液的鞘內給藥、諸如通過本領域技術人員眾所周知的導管和氣囊血管成形術裝置直接導入和經實質內注入靶向區域。
可以方便地將所述的組合物製成單位劑型且可以通過藥物學領域中眾所周知的任意方法來製備它們。這類方法包括使活性成分結合入構成一種或多種輔助組分的載體的步驟。一般來說，通過均勻而緊密地使活性成分結合入液體載體、粉碎的固體載體或兩者中且然後如果需要使產物成形來製備所述的組合物。
可以將適合於口服給藥的本發明組合物製成諸如膠囊、扁囊劑、片劑或錠劑這樣的分散單位、在脂質體中含有預定量活性成分的各種劑型或製成諸如糖漿、酏劑或乳劑這樣的含水液體或非水液體形式的混懸液。
便於非腸道給藥的組合物包括優選與受體血液等滲的活性成分的無菌含水製劑。可以使用那些合適的分散劑或溼潤劑和懸浮劑、按照公知的方法來配製這種含水製劑。這種無菌注射劑也可以是無菌注射用無毒性非腸道可接受稀釋劑或溶劑的溶液或混懸液，例如製成聚乙二醇的溶液。在可接受的載體和溶劑中，可以使用水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，可便利地將無菌固定油用作溶劑或懸浮介質。為了這一目的，可以使用任意緩和的固定油包括合成的單或二酸甘油酯類。此外，諸如油酸這樣的脂肪酸類應用於製備注射劑。
還可以將活性成分配製成用於通過鼻內或通過吸入給予活性成分的轉運系統，例如製成含有活性成分的精細分散的氣溶膠噴霧劑。
其它轉運系統可以包括緩釋轉運系統。優選的緩釋轉運系統是那些可以以緩釋丸粒或膠囊形式釋放本發明活性成分的系統。可以利用許多類型的緩釋轉運系統。它們包括但不限於(a)活性成分包含在基質內的浸蝕性系統；和(b)活性成分以受控速率透過聚合物的擴散系統。此外，可以使用以泵為基礎的金屬構件轉運系統，它們中的某些適用於移植。
以預防或治療有效量給予活性成分。預防或治療有效量指的是至少部分獲得所需作用或延緩所治療特定疾病的發作或發展發作、抑制它們發展或使兩者均停止所必需的量。當然，這樣的量取決於所治療的特定疾病、所述疾病的嚴重程度和包括年齡、身體情況、高矮、體重和同時進行的療法在內的個體患者參數。這些因素對本領域技術人員來說是眾所周知的且僅根據常規實驗就可以確定它們。一般優選使用最大劑量，即根據聲音醫療判斷的最高安全劑量。然而，本領域技術人員可以理解可以因醫療因素、心理因素或實際上任意其它因素而給予較低的劑量或耐受性劑量。
一般來說，活性成分的每日口服劑量約為0.01mg/kg/天-1000mg/kg/天。開始可以給予小劑量(0.01-1mg)，隨後使劑量增加到約1000mg/kg/天。在這種受治療者在該劑量下的反應不充分的情況中，甚至可以將劑量使用到患者耐受性所允許的較高的程度(或通過不同的更加集中的轉運途徑的較高有效劑量)。所關注的是用於獲得化合物的合適全身濃度的每日多重劑量。
本發明的活性成分還可以製成適用於獸藥組合物的形式，例如，可以通過本領域中常用的方法來製備它們。這類獸藥組合物的實例包括適合於下述給藥的組合物(a)口服給藥、外用，例如浸漬液(例如含水或非水溶液或混懸液)；片劑或藥丸；用於含有飼料的混合物的粉劑、顆粒或丸粒；施用於舌頭的膏劑；(b)例如通過皮下、肌內或靜脈內注射的非腸道給藥，例如製成無菌溶液或混懸液；或(如果合適)通過乳房內注射給藥，其中將混懸液或溶液經乳頭導入乳房；(c)局部施用，例如製成施用於皮膚的霜劑、軟骨或噴霧劑；或(d)陰道內給藥，例如製成陰道栓、霜劑或泡沫。
除非上下文中另有說明，將貫穿於本說明書和權利要求中的術語「包括」或諸如「包括」或「含有」這樣的變化術語理解為包括所述的整體或整體組，但不排除任何其它的整體或整體組。
從下列為例舉而包括但並不用來限定本發明的實施例中可以明顯得出本發明的進一步特徵。在下列實施例中，PAMAM樹枝狀聚合物指的是以美國專利4,507,466、4,558,120、4,568,737和4,587,329中具體描述的氨核為基礎的聚醯氨基胺樹枝狀聚合物；PAMAM(EDM)樹枝狀聚合物指的是以乙二胺核為基礎的聚醯氨基胺樹枝狀聚合物；且BHAlysxlysylysz樹枝狀聚合物指的是以如美國專利4,289,872和4,410,688中所述的二苯甲基胺核和賴氨酸支化單元為基礎的不對稱聚賴氨酸樹枝狀聚合物。如美國專利4289872、4410688、4507466、4558120、4568737和4587329以及國際專利公開號WO 88/01178、WO88/01179、WO 88/01180和WO 95/24221中所述製備的聚醯氨基胺樹枝狀聚合物PAMAM1.0、PAMAM2.0、PAMAM3.0、PAMAM4.0、PAMAM5.0或更高的代、PAMAM4.0(EDA)以及聚賴氨酸樹枝狀聚合物BHAlyslys2、BHAlyslys2lys4、BHAlyslys2lys4lys8和BHAlyslys2lys4lys8lys16、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64或更高的代，如上所述。
實施例1樹枝狀聚合物與2-丙烯醯氨基-2-甲基丙磺酸反應生成磺酸封端的樹枝狀聚合物A PAMAM1.0將固體碳酸鈉(0.13g；1.0mmol)緩慢加入攪拌的2-丙烯醯氨基-2-甲基丙磺酸(0.41g；2.0mmol)的水(3ml)溶液中。在氣體停止放出後，該溶液的pH為8.0。然後將PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的水(1ml)溶液加入到上述溶液中，隨後加入4滴40％的苄基三甲基氫氧化銨水溶液。接著在60℃下和氮氣環境中將該溶液加熱3天且然後濃縮。使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex G10；水)純化且然後凍幹至得到磺酸化的PAMAM1.0樹枝狀聚合物、為一種灰白色固體(0.51g)。1H和13C nmr光譜證實是二烷基化和一烷基化的PAMAM1.0樹枝狀聚合物(約70∶30)的混合物。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.6,51.5,53.1,53.4,55.6,56.2,61.2,61.5,178.3,179.0,179.8.B PAMAM2.0如上所述使PAMAM2.0與2-丙烯醯氨基-2-甲基丙磺酸反應。使粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G10；水)純化且然後凍幹至得到一種灰白色固體(0.51g)。1H和13C nmr光譜證實是二烷基化和一烷基化的PAMAM2.0樹枝狀聚合物(約65∶35)的混合物。
13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,37.1,37.7,41.3,48.7,51.5,53.4,55.6,56.2,61.2.61.5,178.4,179.0,179.1,179.6.
當重複上述反應時，略去苄基三甲基氫氧化銨獲得了類似的結果。C PAMAM3.0BRI2783除使用稍過量的碳酸鈉且不使用苄基三甲基氫氧化銨外，如上所述使PAMAM3.0與2-丙烯醯氨基-2-甲基丙磺酸反應。1H和13C nmr光譜證實是二烷基化和一烷基化的PAMAM3.0樹枝狀聚合物(約50∶50)的混合物。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,36.9,37.4,41.1,48.6,51.5,53.4,55.7,56.2,61.1,61.5,178.2,178.9,179.0,179.8.D PAMAM4.0BRI2784如對PAMAM3.0所述使PAMAM4.0與2-丙烯醯氨基-2-甲基丙磺酸反應。1H和13C nmr光譜證實是二烷基化和一烷基化的PAMAM4.0樹枝狀聚合物(約35∶65)的混合物。13C nmr(D2O):δ31.0,31.1,36.9,37.3,41.1,48.5,51.5,53.5,55.7,56.2,61.1,61.5,178.1,178.9,179.0,179.8.
實施例2磺基乙醯胺鈉封端的樹枝狀聚合物的製備A PAMAM1.0將4-硝基苯基溴乙酸酯(0.40g；1.5mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入攪拌的PAMAM1.0(0.18g；0.5mmol)的DMF(3ml)溶液中。當茚三酮試驗為陰性時，將所得的黃色溶液在室溫下攪拌20分鐘。將該溶液濃縮(30°/0.1mmHg)至得到黃色油。使該油分配在水與氯仿之間並分離出水層且用氯仿(2X)洗滌並且最後用乙酸乙酯洗滌。將該水溶液濃縮(35°/25mmHg)至得到溴乙醯化的PAMAM 1.0樹枝狀聚合物、為一種黃色油(0.36g；100％)。13C nmr(D2O):δ32.8,33.3,43.0,43.5,54.4,174.5,176.4.
將亞硫酸鈉(0.2g；1.6mmol)的水(1ml)溶液加入到上述溴乙醯化的PAMAM1.0樹枝狀聚合物(0.36g；0.5mmol)的水(5ml)溶液中並在室溫下使該溶液保持穩定11天。將黃色溶液濃縮至得到一種淡黃色固體(0.60g)。13C nmr(D2O):δ34.4,43.1,43.4,54.0,61.7,171.3,177.2.
通過簡單地將亞硫酸鈉溶液加入到獲自第一次反應的水的粗提取物中可以進行上述反應過程而不需分離溴乙醯化的樹枝狀聚合物。B PAMAM2.0方法1將4-硝基苯基溴乙酸酯(0.18g；0.7mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入攪拌的PAMAM2.0(0.10g；0.1mmol)的DMF(3ml)溶液中。當茚三酮試驗為陰性時，將所得的黃色溶液在室溫下攪拌20小時。然後在渦旋條件下將該溶液加入水(150ml)中並用氯仿(3X)和乙酸乙酯提取該混合物。將亞硫酸鈉(0.1g；0.8mmol)的水(1ml)溶液加入到粗溴乙醯化的樹枝狀聚合物溶液中並在室溫下使該混合物保持穩定3天。接著將淡黃色溶液濃縮至得到黃色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到磺基乙醯胺鈉封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物(103mg)。13C nmr(D2O):δ33.0,35.7,36.0,37.7,40.3,43.0,43.2,53.4,53.7,56.0,61.6,171.2,1 74.6,178.5.方法2將固體乙醯硫乙酸琥珀醯亞胺酯(67mg；0.33mmol)加入到PAMAM2.0(52mg；0.05mmol)的無水DMF(2ml)溶液中並將所得的溶液在室溫下攪拌2天。然後將該混合物濃縮(30°/10-3mmHg)至得到一種油狀殘餘物。使該殘餘物分配在水和氯仿之間並分離出水層且濃縮至得到粘性油(117mg)。1H和13C nmr證實所述的油是乙醯化樹枝狀聚合物和N-羥基琥珀醯亞胺的混合物。凝膠過濾(Sephadex G10；水)產生了乙醯硫基乙醯胺封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物的純樣品(29mg)。13C nmr(D2O):δ34.0,34.2,37.3,43.0,43.1,43.3,53.5,54.0,56.3,175.4,177.2,177.5.
然後將上述官能化的樹枝狀聚合物溶於40％水性甲酸(7ml)所得到的溶液加入到新近製備的冰冷的過甲酸(1.6mmol)的甲酸(2ml)溶液中。在0°下將該混合物攪拌1小時且然後在室溫下攪拌20小時。接著加入少量活性炭以便分解任何過量的過酸，將該混合物攪拌30分鐘且然後過濾並濃縮至得到一種粘性油。
將粗產物溶於水、用碳酸氫鈉水溶液將pH調節至9.0並通過Sephadex G10柱使該物質脫鹽。在凍幹後獲得一種白色固體(20mg)，使其進行基本上與方法1獲得的物質相同的分光光度法。13C nmr(D2O):δ33.0,38.7,42.9,43.0,43.1,53.9,54.3,56.5,61.6,171.2,176.4,177.0.
實施例3磺基琥珀醯胺酸鈉封端的樹枝狀聚合物的製備A PAMAM1.0將固體馬來酐(0.11g；1.1mmol)加入到攪拌的PAMAM1.0(0.12g；0.33mmol)的無水DMF(3ml)溶液中。該混合物變成稍溫和淺棕色溶解的酸酐並將所得的溶液在室溫下攪拌過夜。然後將該溶液濃縮(30°/10-4mmHg)至得到一種粘性油。1H和13C nmr(D20)證實PAMAM1.0完全轉化成三醯胺以及一些馬來酸。13C nmr(D2O):δ33.1,42.8,43.1,54.3,135.0,137.1,169.1,171.9,173.3.
然後將三醯胺粗品溶於水(4ml)並加入固體亞硫酸鈉(0.20g；1.6mmol)。使所得的溶液在室溫下保持穩定4天且然後濃縮。1H和13Cnmr(D2O)證實是1∶1的區域異構體磺基琥珀醯胺酸鈉封端的PAMAM1.0樹枝狀聚合物與一些磺基琥珀酸的混合物。使粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G10；水)純化而得到磺基琥珀醯胺酸鈉封端的PAMAM1.0樹枝狀聚合物樣品(107mg)。13C nmr(D2O):δ33.3,39.6,40.0,42.9,43.1,54.0,67.9,69.4,173.8,176.3,177.6,181.8.B PAMAM2.0如上所述製備區域異構體磺基琥珀醯胺酸鈉封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物的混合物。13C nmr PAMAM 2.0磺基琥珀醯胺酸衍生物(D2O):δ32.8,33.0,38.7,42.9,53.8,54.3,56.5,135.2,136.8,169.2,171.9,173.5,174.6.
13C nmr PAMAM2.0磺基琥珀醯胺酸鈉衍生物(D2O):δ37.0,40.1,41.1,43.0,43.2,43.9,53.0,53.3,55.5,68.0,69.4,173.8,177.6,179.1,179.5,179.8,182.3.C PAMAM4.0BRI6038將固體馬來酐(60mg；0.6mmol)加入到攪拌的PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的無水DMF(2ml)溶液中。開始該混合物變渾濁，而不久即得到澄清溶液，將其在室溫下攪拌過夜。然後將該溶液濃縮(35°/10-4mmHg)至得到一種粘性油。1H和13C nmr(D2O)證實PAMAM4.0完全轉化成聚醯胺以及一些馬來酸。然後將聚醯胺粗品溶於水(2ml)並加入亞硫酸鈉(126mg；1.0mmol)的水(2ml)溶液。使所得的溶液在室溫下保持穩定2天且然後濃縮。1H和13C nmr(D2O)證實是區域異構體磺基琥珀醯胺酸鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物與一些磺基琥珀酸的混合物。使粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到由24個位置異構的磺基琥珀醯胺酸基團封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物樣品(90mg)。1H nmr(D2O):δ2.4-2.6；2.7-3.1；3.2-3.4；3.9-4.0.13C nmr(D2O):δ36.2；39.8；40.5；43.0；43.2；53.5；55.8；68.1；69.5；173.8；177.4；177.6；178.7；182.3.
實施例4N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺鈉封端的樹枝狀聚合物的製備a N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺酸四丁銨的製備將固體琥珀酐(0.5g；5.0mmol)加入到攪拌的2-氨乙基磺酸四丁銨(1.83g；5.0mmol)的無水二氯甲烷(30ml)溶液中。琥珀酐緩慢溶解並將所得的渾濁溶液在室溫下攪拌過夜。將所得的混合物過濾並將濾液濃縮至得到一種粘性油(2.41g)。13C nmr證實完全轉化成所需的單胺以及少量琥珀酸。通過將二氯甲烷溶液逐滴加入到大量過量的乙醚來重複沉澱產物而得到N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺酸四丁銨、為一種白色固體(1.762g；76％),mp125-127℃。1H nmr(CDCl3):δ0.86(t,12h,4xCH3),1.28(m,8H,4xCH2),1.50(m,8H,4xCH2),2.33(m,2H,CH2COOH),2.44(m,2H,CH2CONH),2.76(m,2H,CH2NHCO),3.12(m,8H,4xCH2N),3.50(m,2H,CH2SO3-),7.53(brt,1H,NH).13C nmr(CDCl3):δ13.5,19.5,23.8,30.1,30.9,35.6,50.0,58.5,172.0,174.1.b 4-硝基苯基N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺酸四丁銨的製備將二環己基碳化二亞胺(45mg；0.22mmol)的無水二氯甲烷(1ml)溶液加入到攪拌的N-(2-磺乙基)琥珀醯胺酸四丁銨(94mg；0.20mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中並將該混合物在室溫下攪拌過夜。將所得的混懸液過濾並將濾液濃縮至得到活性酯的粗品，不需進一步純化而使用它。A N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺鈉封端的PAMAM樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI2786將粗品4-硝基苯基N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺酸四丁銨(0.30mmol)的無水DMF(1ml)溶液加入到攪拌的PAMAM4.0(51.5mg；0.01mmol)溶於50％DMF水溶液(3ml)所得到的溶液中並將所得的黃色溶液在室溫下攪拌過夜。然後該將該混合物濃縮(35°/10-5mmHg)並使黃色殘餘物分配在水與氯仿之間。分離出水層、用氯仿(2X)和乙酸乙酯洗滌且然後濃縮至得到黃色油(134mg)。將粗產物通過Amberlite IR120(Na)柱轉化成鈉鹽而得到85mg的物質。將該物質進一步通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)過濾而得到N-(2-磺乙基)琥珀醯胺鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物(45mg)。13C nmr(D2O):δ33.2,33.6,35.5,39.0,39.5.42.8,43.2,53.8,54.1,54.4,56.6,176.5,176.9,177.2,178.9,179.4.
按照類似方法製備相應的用N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺鈉基團封端的PAMAM1.0和PAMAM3.0(BRI2785)樹枝狀聚合物。13C nmr PAMAM3.0衍生物(D2O):δ33.4,35.5,39.0,39.5,42.9,43.2,53.8,54.1,54.3,56.5,176.4,176.9,177.4,178.9,179.4.13C nmr PAMAM1.0衍生物(D2O):δ34.9,35.5,39.5,42.9,43.1,53.7,54.1,179.0.179.1,179.3.B N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺鈉封端的聚賴氨酸樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2789
將三氟乙酸(lml)加入到BHAlyslys2lys4lys8DBL16(36.5mg；5.0μmol)的無水二氯甲烷(1ml)混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘物溶於無水DMSO(2ml)並用三乙胺將pH調節至8.5。接著逐滴加入粗品4-硝基苯基N-(2-磺乙基)琥珀醯胺酸四丁銨(約0.2mmol)的DMSO(1ml)黃色溶液並在室溫下將該混合物攪拌過夜。然後將黃色溶液濃縮(50°/10-5mmHg)並使黃色殘餘物分配在水和氯仿之間。分離出水層、用氯仿(3X)和乙酸乙酯洗滌且然後濃縮至得到一種油(99mg)。將粗產物通過Amberlite IR120(Na)柱轉化成鈉鹽而得到81mg的物質。將該物質進一步通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到N-(2-磺乙基)琥珀醯胺鈉封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹枝狀聚合物(39mg)。13C nmr(D2O):δ27.0,32.3,35.2,35.3.35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.5,132.0,133.3,145.1,177.8,178.0,178.4,178.8,178.9,179.2,179.7,179.8.
按照類似方法製備相應的用N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺鈉基團封端的BHAlyslys2、BHAlyslys2lys4(BRI2787)、BHAlyslys2lys4lys8(RRI2788)13C nmr BHAlyslys2lys4lys8衍生物(D2O):δ26.9,32.3,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.5,54.1,58.5,131.6,131.9,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.2,177.2,177.8,177.9,178.0,178.2,178.3,178.6,178.7,178.8,178.9,179.2,179.3,179.7,179.8.13C nmr BHAlyslys2lys4衍生物(D2O):δ26.9,32.3,35.1,35.4,35.7,35.8,39.5,43.5,54.1,58.5,61.8,131.7,132.0,132.2,132.3,133.2,133.3,145.0,145.1,177.3,178.0,178.3,178.4,178.7,178.9,179.0,179.3,179.7,179.8.13C nmr BHAlyslys2衍生物(D2O):δ26.9,27.1,32.2,32.3,34.7,34.8,35.1,35.3,35.6,35.7,39.5,43.4,54.1,58.6,61.8,131.7,131.9,132.2,132.3,133.3,144.9,145.0,177.7,178.4,178.8,179.0,179.3,180.0.
實施例54-磺基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備A PAMAM4.0BRI2791將固體4-磺基苯基異硫氰酸鈉一水合物(500mg；1.96mmol)加入到PAMAM4.0(300mg；0.0582mmol)的水(10ml)溶液中並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使黃色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並凍幹至得到4-磺基苯基硫脲鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物、為一種鬆散的白色固體(370mg)。1H nmr(D2O):δ2.28；2.52；2.69；3.15；3.27；3.60；7.32(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz).13C nmr(D2O):δ36.9；41.1；43.1；48.3；53.6；55.8；129.0；131.1；144.4；178.5；179.1；184.4.
按照類似方法製備相應的分別用3、6、12和48個4-磺基苯基硫脲鈉基團封端的PAMAM1.0、PAMAM2.0(BRI2790)、PAMAM3.0和PAMAM5.0(BRI2991)樹枝狀聚合物。B PAMAM4.0(EDA)BRI6045將固體4-磺基苯基異硫氰酸鈉一水合物(130mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(4ml)溶液中並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並凍幹至得到用32個4-磺基苯基硫脲鈉基團封端的PAMAM4.0、為一種鬆散的白色固體(136mg)。
1H nmr(D2O):δ2.30；2.50；2.70；3.18；3.62；7.35(d,J=9Hz)；7.72(d,J=9Hz).13C nmr(D2O):δ36.8；41.0；43.1；48.4；53.6；55.7；128.9；131.0；144.3；178.5；179.0；184.5.C BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2792在氮氣環境中將三氟乙酸(4ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8DBL16(0.73g；0.1mmol)的無水二氯甲烷(4ml)混懸液中。觀察到有短時間的劇烈的氣體放出並將所得溶液在室溫下攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘的糖漿狀物溶於水(5ml)、使該溶液通過Amberlite IRA-401(OH)柱並將濾液濃縮至得到BHAlyslys2lys4lys8lys16、為一種粘性油(0.49g)。將該油重新溶於水(5ml)並加入N,N-二甲基-N-烯丙基胺緩衝液(pH9.5；3ml)。然後加入固體4-磺苯基異硫氰酸鈉一水合物(1.30g；5.1mmol)並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使淺棕色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分、過Amberlite IR120(Na)柱並凍幹至得到4-磺基苯基硫脲鈉封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹枝狀聚合物、為一種鬆散的白色固體(374mg)。1H nmr(D2O):δ1.40；1.72；3.08；3.42；4.24；4.60；7.30；7.40(d,J=9Hz)；7.78(d,J=9Hz).13C nmr(D2O):δ27.3；32.5；35.9；43.7；48.9；58.6；63.3；128.8；131.0；143.7；144.7；145.1；177.7；178.1；183.8；185.2.
按照類似方法製備相應的分別用16、64和128個4-磺基苯基硫脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8、BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32(BRI2992)和BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64(BRI2993)樹枝狀聚合物。
實施例63,6-二磺基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備A PAMAM4.0BRI2923將固體3,6-二-磺基萘基異硫氰酸鈉(160mg；0.41mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使棕色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並濃縮至得到3,6-二磺基萘基硫脲鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物、為一種棕色固體(73mg)。
1H nmr(D2O):δ2.30；2.60；2.74；3.20；3.57；7.75；7.86；8.28.13C nmr(D2O):δ35.0；39.9；43.1；48.1；53.8；56.1；128.4；128.6；129.3；131.0；131.3；136.0；136.8；138.2；145.5；146.0；177.2；177.8；185.5.
按照類似方法製備相應的用3,6-二磺基萘基硫脲鈉基團封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物。B PAMAM4.0(EDA)BRI6046將固體3,6-二磺基萘基異硫氰酸鈉(220mg；0.57mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(4ml)溶液中並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使淺棕色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並濃縮至得到用32個3,6-二磺基萘基硫脲鈉基團封端的PAMAM4.0、為一種褐色固體(148mg)。
1H nmr(D2O):δ2.30；2.80；3.20；3.54；7.74；7.85；8.25.13C nmr(D2O):δ36.0；40.8；43.1；48.3；53.6；55.9；128.5；129.4；131.0；131.3；136.0；136.8；138.3；145.5；146.0；178.2；185.6.C BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2999在氮氣環境中將三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8DBL16(73mg；0.01mmol)的無水二氯甲烷(2ml)混懸液中。觀察到有短時間的劇烈的氣體放出並將所得溶液在室溫下攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘的糖漿狀物溶於水(5ml)、使該溶液通過Amberlite IRA-401(OH)柱並將濾液濃縮至得到BHAlyslys2lys4lys8lys16、為一種粘性油。將該油重新溶於水(5ml)並加入N,N-二甲基-N-烯丙基胺緩衝液(pH9.5；3ml)。然後加入固體3,6-二磺基萘基異硫氰酸鈉(234mg；0.60mmol)並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使淺棕色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分、過Amberlite IR 120(Na)柱並凍幹至得到用32個3,6-二磺基萘基硫脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16、為一種鬆散的灰白色固體(119mg)。1H nmr(D2O):δ1.0-2.0；3.18；3.43；4.31；7.22；7.80；7.89；8.25.13C nmr(D2O):δ27.2；32.4；35.3；43.7；49.0；58.5；63.6；128.4；129.1；131.4；136.1；136.6；138.6；139.0；145.1；145.6；178.4；184.8；186.7.
實施例7
4-磺基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI2997將固體4-磺基萘基異硫氰酸鈉(180mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中並將該混合物在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。在減壓條件下從所得的混懸液中蒸餾出水並使黃白色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並凍幹至得到4-磺基萘基硫脲鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物、為一種鬆散的白色固體(60mg)。
1H nmr(D2O):δ2.20；2.60；3.14；3.48；7.23；7.47；7.56；7.77；7.93(d,J=6Hz)；8.56(d,J=6Hz).13C nmr(D2O):δ35.8；40.5；43.1；48.4；53.6；55.9；127.6；128.6；130.3；131.9；132.5；133.5；134.7；140.5；142.7；177.8；178.0；185.4.
實施例83,5-二磺基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6039將固體3,5-二磺基苯基異硫氰酸鈉(110mg；0.32mmol)加入到PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)的水(3ml)溶液中並將所得溶液在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該溶液濃縮並使淺棕色固體殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex G25；水)純化。合併純的級分並濃縮至得到用24個3,5-二磺基苯基硫脲鈉基團封端的PAMAM4.0、為一種灰白色固體(110mg)。1H nmr(D20):δ2.53,3.08；3.36；3.66；7.90；7.95.13C nmr(D2O):δ34.8；41.0；43.1；48.0；53.7；56.2；124.1；128.6；143.5；148.8；177.6；185.0.
實施例93,6,8-三磺基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI2998將固體3,6,8-三磺基萘基異硫氰酸鈉(250mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)和N,N-二甲基-N-烯丙基胺緩衝液(pH9.5；1ml)的水(2ml)溶液中並將該混合物在53°下和氮氣環境中加熱2小時且然後冷卻。將該混合物在減壓條件下濃縮至得到橙色固體。將殘餘的固體溶於水(2ml)並使其通過Amberlite IR-120(Na)的短柱。然後將濾液濃縮並使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化。合併純的級分並凍幹至得到3,6,8-三磺基萘基硫脲鈉封端的PAMAM4.0樹枝狀聚合物、為一種灰白色固體(102mg)。
1H nmr(D2O):δ2.65；3.02；3.30；3.66；8.05；8.42；8.59；8.67.13C nmr(D2O):δ33.2；38.7；43.2；43.7；47.8；54.0；54.3；56.7；131.0；131.3；131.9；135.9；138.0；139.6；143.8；144.1；145.6；176.2；176.5；186.0.
按照類似方法製備相應的3,6,8-三磺基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物BHAlys.lys2lys4lys8lys16BRI7011。
實施例104-(磺基甲基)苯甲醯胺鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6040將固體4-(氯甲基)苯甲酸4-硝基苯基酯(200mg；0.68mmol)加入到攪拌的PAMAM4.0(70mg；0.014mmol)的無水DMSO(4ml)溶液中並將所得的黃色溶液在室溫下攪拌2小時。然後將該溶液濃縮(10-4mmHg；40°)並用水和二氯甲烷(1∶1)的混合物提取殘餘物。將剩餘的固體物質溶於DMSO(5ml)並加入亞硫酸鈉(130mg；1mmol)的水(3ml)溶液。使所得的輕度渾濁的混合物保持穩定4天，此後添加過量的水(2ml)而導致形成澄清均勻的黃色溶液。然後將該溶液首先在25mmHg和40°、接著在10-4mmHg和50°下濃縮至得到粗產物。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G25；水)純化而得到用24個4-(磺基甲基)苯甲醯胺鈉基團封端的PAMAM4.0(24mg)。1Hnmr(D2O):δ2.25；2.66；3.08；3.20；3.33；3.38；4.01；7.40(br d)；7.62(br d).13C nmr(D2O):δ36.7；40.9；43.0；43.6；53.5；55.5；61.0；131.6；135.0；137.2；140.4；174.5；178.6；179.2.
實施例114-磺基苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)BRI6116將固體N-羥基琥珀醯亞胺基4-磺基苯甲酸鉀(100mg；0.3mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(35mg；0.005mmol)溶於0.1M、pH8.5的硼酸鹽緩衝液(5ml)所得到的溶液中並將該溶液在室溫下攪拌2小時。在該階段產生的乳白色溶液具有的pH為4.5。然後加入1M碳酸鈉溶液(1ml)而得到一種澄清溶液，將該溶液濃縮至得到粗產物、為一種白色固體。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G25；水)純化而得到用32個4-磺基苯甲醯胺鈉基團封端的PAMAM4.0(EDA)(47mg)。1H nmr(D2O):δ2.25；2.42；2.63；3.05；3.18；3.31；3.38；7.72(d,J=8Hz)；7.78(d,J=8Hz).13C nmr(D2O):δ36.0；40.4；43.0；43.7；53.7；55.8；130.2；132.2；140.4；150.1；173.6；178.0；178.5.
實施例12N-(4-磺基苯基)丙醯胺鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)BRI6117將固體N-(4-磺基苯基)丙烯醯胺鈉(250mg；1mmol)和固體碳酸鈉(106mg；1mmol)依次加入到攪拌的PAMAM4.0(EDA)(78mg；0.011mmol)的水(4ml)溶液中。在所得溶液在氮氣環境中攪拌4天且然後凍幹至得到一種鬆散的白色固體。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個N-(4-磺基苯基)丙醯胺鈉基團封端的PAMAM4.0(EDA)(206mg).13C nmr證實了有極微量轉化成了一烷基化的末端氨基。1H nmr(D2O):δ2.10；2.48；2.58；2.79；3.20；7.42(d,J=7Hz)；7.65(d,J=7Hz).13C nmr(D2O):δ36.5；37.9；41.1；53.4；55.6；124.8；130.9；143.0；144.2；177.4；178.5.
實施例134-磺基苯基脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)BRI6115將磺胺酸鈉(195mg；1mmol)的無水DMSO(3ml)溶液逐滴加入到N,N』-二琥珀醯亞胺基碳酸酯(530mg；2mmol)的無水DMSO(4ml)溶液中並將所得的淺棕色溶液在室溫下攪拌20小時。加入PAMAM4.0(EDA)(75mg；0.011mmol)的無水DMSO(1ml)溶液並將該溶液進一步攪拌18小時。然後在高度真空(10-5mmHg；35°)下將該溶液濃縮至得到一種淺黃色半固體。將該粗產物溶於DMSO(4ml)並將該溶液加入到200ml的經充分攪拌的乙酸乙酯中。通過過濾收集沉澱的白色固體並用乙酸乙酯(2X)和乙醚(2X)洗滌，然後乾燥至得到一種白色粉末(275mg)。使該物質進一步通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用32個4-磺基苯基脲鈉基團封端的PAMAM4.0(EDA)(106mg)。1H nmr(D2O):δ2.31；2.55；2.75；3.19；7.32(d,J=9Hz)；7.63(d,J=9Hz).13C nmr(D2O):δ36.3；40.7；43.3；43.8；53.7；55.7；123.3；130.9；140.9；146.0；161.4；178.2；178.6.
實施例14N,N,N-三甲基甘氨醯胺氯化物封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16BRI2922將三氟乙酸(4ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8DBL16(220mg；30μmmol)的無水二氯甲烷(2ml)混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後冷卻。將殘餘物溶於無水DMSO(5ml)並用三乙胺將pH調節至8.5。然後加入固體4-硝基苯基N,N,N-三甲基甘氨酸氯化物(0.50g；1.8mmol)並將該混合物在室溫下攪拌過夜。接著濃縮渾濁的溶液(50°/10-5mmHg)並使殘餘物分配在水與二氯甲烷之間。分離出水層、用二氯甲烷(3X)和乙酸乙酯洗滌且然後濃縮至得到一種油(1.128g)。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到N,N,N-三甲基甘氨醯胺封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16樹枝狀聚合物(116mg)。13C nmr(D2O):δ25.5,30.5,30.8,33.4,42.1,56.5,57.1,67.5,68.1,166.7,167.0,167.1,176.0,176.2.
實施例154-三甲銨苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6043將1,1』-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入到4-三甲銨苯甲酸碘化物(154mg；0.5mmol)的無水DMF(4ml)溶液中並將所得混合物在室溫下和氬氣環境中攪拌2小時。在此期間，從該溶液中析出白色固體。然後加入PAMAM4.0(58；0.011mmol)的無水DMF(2ml)溶液並將該混合物在室溫下攪拌過夜。此後大部分沉澱已經溶解且溶液的茚三酮試驗呈陰性。將該混合物濃縮(10-4mmHg；30°)至得到一種白色固體殘餘物。使該粗產物進一步通過凝膠過濾(Sephadex LH20；10％AcOH)純化而得到用24個4-三甲銨苯甲醯胺基團封端的PAMAM4.0、為乙酸鹽(89mg)。1H nmr(D2O):δ1.96；2.65-2.85；3.25-3.55；3.64；7.92.13C nmr(D2O):δ25.8；33.1；33.5；38.7；43.1；43.5；53.5；54.1；56.4；61.2；124.8；133.6；139.9；153.2；173.2；176.3；176.8；182.6.
按照類似方法製備相應的用6個4-三甲銨苯甲醯胺基團封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物。
實施例164-(三甲銨甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6044將固體4-(氯甲基)苯甲酸4-硝基苯基酯(150mg；0.5mmol)加入到攪拌的PAMAM4.0(52mg；0.01mmol)的無水DMSO(3ml)溶液中。當茚三酮試驗呈陰性(pH約為8.5)時，將所得的黃色溶液在室溫下攪拌20小時。然後濃縮該溶液(10-5mmHg；40°)並將殘餘物與水和二氯甲烷(1∶1)的混合物一起振搖。通過過濾收集不溶性的凝膠樣物質、用水(2X)和二氯甲烷(2X)洗滌且然後風無水。將4-(氯甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物粗品溶於25％的三乙胺水溶液(20ml)並使黃色溶液保持穩定過夜。然後將該溶液濃縮、將殘餘物溶於水(5ml)並使該溶液過Amberlite IRA-401(OH)柱。將無色濾液濃縮至得到一種粘性油，使其通過凝膠過濾(Sephadex G10；10％AcOH)純化而得到用24個4-(三甲銨甲基)苯甲醯胺基團封端的PAMAM4.0(90mg)。1H nmr(D2O):δ1.88；2.65-2.80；2.98；3.10-3.60；7.52(br d,J=9Hz)；7.72(brd,J=9Hz).13C nmr(D2O):δ26.6；33.4；38.8；43.2；43.5；53.6；53.6；54.1；56.8；62.8；73.0；132.1；135.3；137.5；140.0；176.4；176.9；183.6.
實施例17N-(2-乙醯氧基乙基)-N,N-(二甲銨)甲基羧醯胺(carboxamide)封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0將固體1,1』-羰基二咪唑(85mg；0.52mmol)加入到溴化N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(羧甲基)-N,N-二甲銨(135mg；0.5mmol)的無水DMF(3ml)溶液中並將所得溶液在氮氣環境中攪拌2小時。然後加入PAMAM4.0(60mg；0.012mmol)的DMF(2ml)溶液中，該過程瞬間形成可緩慢再溶解的絮狀沉澱。將該混合物攪拌2天且然後濃縮(10-4mmHg；40°)至得到一種粘性油。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G10；10％AcOH)純化而得到用24個N-(2-乙醯氧基乙基)-N,N-(二甲銨)甲基羧醯胺基團封端的PAMAM4.0(64mg)。1Hnmr(D2O):δ1.93；2.05；2.70；3.10-3.60；3.28；3.93(m)；4.14；4.48(m).13C nmr(D2O):δ24.6；26.2；33.2；38.7；42.8；42.9；53.9；57.4；62.6；67.3；67.5；168.9；176.4；176.8；177.3；183.2.
實施例18胍基封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6042將PAMAM4.0(63mg；0.012mmol)和硫酸甲硫假脲酯(170mg；0.61mmol)的水(5ml)溶液(pH10.5)在80°和氮氣環境中加熱2小時。然後將該溶液濃縮並使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex G10；10％AcOH)純化而得到用24個胍基基團封端的PAMAM4.0、為乙酸鹽(107mg)。1H nmr(D2O):δ2.00；2.80(brt)；3.09(brt)；3.32；3.45(brt)；3.60(brt).13C nmr(D2O):δ25.2；33.2；33.4；38.7；41.2；42.6；43.4；44.7；53.5；54.0；56.3；176.5；176.7；176.9；181.6.
按照類似方法製備相應的用6個胍基基團封端的PAMAM2.0樹枝狀聚合物。
實施例194-([1,4,8,11-四氮雜環十四烷]甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0BRI6041在室溫下使1-(4-羧苯基)甲基-1,4,8,11-四氮雜環十四烷四鹽酸鹽(120mg；0.25mmol)、N-羥基琥珀醯亞胺(60mg；0.52mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(250mg；1.3mmol)溶於pH為7的磷酸鹽緩衝液(10ml)所得到的溶液在室溫下保持穩定1小時且然後加入PAMAM4.0(32mg；0.006mmol)溶於pH7的磷酸鹽緩衝液(10ml)所得到的溶液。使該混合物保持穩定2天且然後濃縮。使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex G10；10％AcOH)純化而得到如1H和13C nmr所測定的用約12個4-([1,4,8,11-四氮雜環十四烷]甲基)苯甲醯胺基團封端的PAMAM4.0(80mg)。接著將該產物溶於水並過Amberlite IRA-401(Cl)樹脂柱且然後濃縮。將殘餘物溶於水(1ml)、加入濃HCl(1ml)並用乙醇(30ml)稀釋該溶液而沉澱出一種白色固體。通過過濾收集該固體。1H和13C nmr再次證實末端氨基基團中約50％官能化。
1H nmr(D2O):δ2.17；2.36；2.50；2.78；2.85；3.25；3.40；3.50；3.60；3.62；4.49；7.63(brd)；7.78(brd).13C nmr(D2O):δ22.7；23.1；33.2；38.8；39.9；40.2；40.3；41.0；41.2；42.0；42.9；43.2；43.6；45.5；46.1；49.1；52.2；53.9；54.3；56.6；62.7；132.5；135.7；137.1；139.7；174.3；176.2；176.3；176.7；177.0；178.2；178.5.
實施例204-羧基-3-羥基苄胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)BRI6119將氰基硼氫化鈉(32mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)、4-甲醯基-2-羥基苯甲酸(83mg；0.5mmol)和碳酸氫鈉(42mg；0.5mmol)的水(4ml)混合物中。將不均勻的橙色混合物在室溫下攪拌4小時。在此期間它變均勻。然後將該橙色溶液濃縮並使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用約32個4-羧基-3-羥基苄胺基團封端的PAMAM4.0(EDA)(91mg)。1H和13C nmr(D2O)證實末端氨基中大部分一烷基化而某些二烷基化，兩種光譜均顯示出寬峰。13C nmr(D2O):δ37.0；41.1；50.9；53.4；55.5；55.8；61.5；120.9；122.2；122.4；132.3；132.7；135.0；135.8；163.5；163.7；169.0；178.6；179.3.1H nmr(D2O):δ2.20；2.35；2.60；3.15；3.30；3.55；4.25；6.68；7.12；7.55.
實施例214-羧基苯基醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體4-羧苯基異硫氰酸酯(86mg；0.48mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。用飽和NaHCO3將所得渾濁溶液的pH調節至9並在室溫下持續攪拌24小時。然後將反應混合物過濾將濾液濃縮至得到一種白色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化且然後凍幹至得到白色鬆散固體產物(68mg)。
實施例223,5-二羧苯基醯胺封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體3,5二羧苯基異硫氰酸酯(112mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(70mg；0.01mmol)的水(5ml)溶液中。用1MNa2CO3溶液將所得渾濁溶液的pH調節至10並在53°下和氮氣環境中加熱2小時。然後將反應混合物過濾將濾液濃縮至得到一種淺棕色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化且然後凍幹至得到淺棕色鬆散固體產物(112mg)。
實施例234-膦醯基氧基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體4-膦醯基氧基苯基異硫氰酸鈉(251mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(20ml)溶液中。將所得溶液(pH9)在室溫下和氮氣環境中攪拌24小時。然後將反應混合物濃縮至得到一種白色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化且然後凍幹至得到白色鬆散固體產物(86mg)。
實施例244-(膦醯基甲基)苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體4-(膦醯基甲基)苯基異硫氰酸鈉(97mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(30ml)溶液中。將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌3天，通過定期添加飽和NaHCO3溶液將pH維持在8。然後將反應混合物濃縮至得到一種白色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化且然後凍幹至得到白色鬆散固體產物(102mg)。
實施例25乙基4-(膦醯基甲基)苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體乙基4-(膦醯基甲基)苯基硫脲異硫氰酸鈉(109mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的DMF(30ml)溶液中。將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌17小時，通過定期添加飽和NaHCO3溶液將pH維持在8。然後將反應混合物濃縮至得到一種白色固體殘餘物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化且然後凍幹至得到白色鬆散固體產物(30mg)。
實施例26Cn-烷基連接的2-硫代唾液酸糖苷(thiosialoside)封端的樹枝狀聚合物的製備通過下列步驟製備[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onate)甲酯。
向5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-2-S-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosonate)甲酯(Hasegawa等，1986)(100mg)的無水二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入8-溴辛酸(41mg)和二乙胺(280mg)並將該溶液在20℃下攪拌17小時。在真空中除去溶劑並使殘餘物分配在乙酸乙酯和5％冰冷的鹽酸之間。將有機層用水洗滌、用硫酸鈉乾燥並蒸發至得到殘餘物(130mg)。將其溶於乙酸乙酯(5ml)並加入N-羥基琥珀醯亞胺(26mg)和二環己基碳化二亞胺(46mg)。將該混合物在20℃下攪拌17小時，然後過濾出白色沉澱。濃縮濾液並通過使用乙酸乙酯洗脫的矽膠閃蒸色譜法純化。合併含有產物的級分並蒸發至得到97mg、71％的白色泡沫。
以類似方式製備下列物質[(11-十一酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；[(乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；[(4-丁酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯；[(4-甲基苯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯。A PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸(α-D-galacto-2-nonulopyranosidoic acid)]32BRI6112在惰性氣體環境中向PAMAM[EDA]4.0(50mg)的無水二甲亞碸(4ml)溶液中加入[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(300mg)並將該溶液在20℃下攪拌60小時。在真空中除去溶劑並將殘餘物溶於甲醇(2ml)。將該溶液在Sephadex LH20上進行大小排阻層析、用甲醇洗脫。在蒸發溶劑時，獲得182mg、93％的產物PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]32、為一種白色粉末。
通過下列方法將其轉化成游離的唾液酸糖苷(sialoside)在20℃下和氬氣環境中向PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-o-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]32(182mg)的無水甲醇(3ml)溶液中加入新近製備的0.19M甲醇鈉的甲醇(7ml)溶液並將該混合物攪拌2.5小時。蒸發溶劑並將殘餘物溶於水(10ml)且攪拌3小時。將該溶液在Sephadex LH20上進行大小排阻層析、用水洗脫。在凍幹時，獲得110mg、77％的產物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32、為一種淺檸檬色粉末。
通過類似步驟製備下列物質PAMAM[EDA]4.0[(11-十一醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6147；PAMAM[EDA]4.0[(乙醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6121；PAMAM[EDA]4.0[(4-甲基苯甲醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6120；BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6169。
在20℃下，將BHAlyslys2lys4lys8lys16(t-Boc)32(20.3mg)溶於三氟乙酸(2ml)和二氯甲烷(2ml)混合物所得到的溶液攪拌2小時，然後在真空中除去溶劑。將殘餘物溶於無水二甲亞碸(1ml)並加入二異丙基乙胺(25mg)和[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)5-乙醯氨基-4,7,8,9-四-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(78mg)。在20℃下和氬氣環境中將該混合物攪拌60小時，然後在真空中除去溶劑。將殘餘物溶於新近製備的0.1M甲醇鈉的甲醇(2.5ml)溶液並在20℃下和氬氣環境中將該混合物攪拌3小時。蒸發溶劑並將殘餘物溶於水(1ml)並攪拌17小時。將該溶液在Sephadex LH20上進行大小排阻層析、用水洗脫。在凍幹後，獲得44mg、86％的產物BHAlyslys2lys4lys8lys16[(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32、為一種白色粉末。
實施例27唾液酸4-位上修飾的樹枝狀唾液酸糖苷(sialoside)的製備通過下列步驟製備4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-2-S-乙醯基-3,4,5,-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯。向4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-2-氯-3,4,5,-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯(Sabesan,1994)(5g)的無水二氯甲烷(150ml)溶液中加入細粉狀的硫羥乙酸鉀(5.8g)並在20℃下將該混懸液劇烈攪拌48小時。將該混合物過濾並蒸發至得到淺棕色泡沫(5.2)。通過製備型反相HPLC[C18,30％乙腈/水]分離所需產物、為一種白色泡沫(3.9g,72％)。
通過下列步驟製備[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯。
向4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-2-S-乙醯基-3,4,5,-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸甲酯(300mg)的無水二甲基甲醯胺(3.5ml)溶液中加入8-溴辛酸(155mg)和二乙胺(1.26ml)並在20℃下將該溶液攪拌17小時。在真空中除去溶劑並使殘餘物分配在乙酸乙酯和10％冰冷的鹽酸之間。將有機層用水洗滌、用硫酸鈉乾燥並蒸發至得到一種黃色泡沫(385mg)。將其溶於乙酸乙酯(20ml)並加入N-羥基琥珀醯亞胺(95mg)和二環己基碳化二亞胺(175mg)。在20℃下將該混合物攪拌17小時，然後過濾出白色沉澱。將濾液濃縮並通過製備型反相HPLC[C18,30％乙腈/水]純化而得到一種白色泡沫(340mg,83％)。A PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-4-疊氮基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6146在惰性氣體環境中向PAMAM[EDA]4.0(72mg)的無水二甲亞碸(5ml)溶液中加入[(8-辛酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯(318mg)並將該溶液在20℃下攪拌60小時。在真空中除去溶劑並將殘餘物溶於甲醇(2ml)。將該溶液在Sephadex LH20上進行大小排阻層析、用甲醇洗脫。在蒸發溶劑時，獲得225mg、81％的產物PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛醯氨基)4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]32、為一種白色泡沫。
通過下列方法獲得游離的唾液酸糖苷(sialoside)在20℃下和氬氣環境中向PAMAM[EDA]4.0[[(8-辛醯氨基)4-疊氮基-5-乙醯氨基-7,8,9-三-O-乙醯基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷]酸甲酯]32(215mg)的無水甲醇(1ml)溶液中加入新近製備的1M甲醇鈉的甲醇(1ml)溶液並將該混合物攪拌3小時。蒸發溶劑並將殘餘物溶於水(2ml)且攪拌17小時。將該溶液在Sephadex LH20上進行大小排阻層析、用水洗脫。在凍幹時，獲得160mg、90％的產物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-4-疊氮基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32、為一種鬆散的白色粉末。B PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-4-氨基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32BRI6149在20℃下使硫化氫氣流緩慢通過PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-4-疊氮基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32(25mg)溶於吡啶(40ml)和水(20ml)的混合物所得到的溶液中5天。然後用氮氣使該溶液發泡2小時以便除去過量的硫化氫。將該溶液蒸發至無水並將殘餘物溶於水(5ml)且通過0.45μm的濾膜過濾以除去硫。在凍幹時，獲得23mg、96％的產物PAMAM[EDA]4.0[(8-辛醯氨基)-4-氨基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸]32、為一種鬆散的白色粉末。
實施例28硼酸封端的樹枝狀聚合物的製備4-羧基苯基硼酸N-羥基琥珀醯亞胺酯向-羧苯基硼酸(500mg)的無水二甲基甲醯胺(5ml)溶液中加入N-羥基琥珀醯亞胺(380mg)和二環己基甲醯胺(680mg)。在20℃下將該混合物攪拌64小時，然後過濾出白色沉澱。在真空中除去溶劑並將殘餘物溶於乙酸乙酯(100ml)。將該溶液用水洗滌、用硫酸鈉乾燥並蒸發至得到一種白色固體，使其從乙腈/水中結晶、為細針狀體(730mg,92％)。PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲醯氨基硼酸]32BRI6160在惰性氣體環境中向PAMAM[EDA]4.0(69mg)的無水二甲亞碸(5ml)溶液中加入4-羧苯基硼酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(130mg)並將該溶液在20℃下攪拌65小時。向該渾濁的淤漿中加入1M碳酸鈉溶液(1ml)並將澄清溶液再攪拌24小時。在真空中除去溶劑並將殘餘物溶於10％的氨溶液(5ml)。將該溶液在Sephadex LH20柱上進行大小排阻層析，用10％氨溶液洗脫。在蒸發溶劑時，獲得110mg、94％的產物PAMAM[EDA]4.0[4-苯甲醯氨基硼酸]32、為一種白色鬆散固體。
實施例293,6-二磺基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg)的無水二氯甲烷(2ml)攪拌的混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘物溶於N,N-二甲基-N-烯丙基胺緩衝液(pH9.5；5ml)且然後加入固體異硫氰酸3,6-二磺基萘基酯(400mg)。接著通過加入1M碳酸鈉將該混合物的pH調節至9.5並在53℃下和氮氣環境中將該溶液加熱3小時。並將該反應混合物濃縮並將殘餘物重新溶於水且使該溶液過Amberlite IR120(Na)柱。將濾液濃縮至得到粗產物，使其通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個3,6-二磺基萘基硫脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、為一種白色鬆散固體(175mg)。
實施例303,5-二磺基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(3ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(300mg；0.02ml)的無水二氯甲烷(3ml)攪拌的混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘物溶於水並使該溶液過Amberlite IR401(OH)柱並將濾液濃縮至得到一種粘性油(187mg)。將該油溶於吡啶/水的1∶1混合物(8ml)並加入異硫氰酸3,5-二磺苯基酯(680mg；2mmol)。將所得溶液在53℃下和氮氣環境中加熱3小時。然後將該溶液濃縮至得到一種白色固體殘餘物。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個3,6-二磺基苯基硫脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、為一種白色鬆散固體。
實施例313,5-二羧基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32BRI6741將三氟乙酸(3ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(300mg；0.02ml)的無水二氯甲烷(3ml)攪拌的混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮。將殘餘物溶於水並使該溶液過Amberlite IR401(OH)柱並將濾液濃縮至得到一種粘性油(186mg)。將該油溶於吡啶/水的1∶1混合物(8ml)並加入異硫氰酸3,5-二羧苯基酯(450mg；2mmol)。將所得溶液在53℃下和氮氣環境中加熱13小時。然後將該溶液濃縮至得到一種白色固體殘餘物。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個3,6-二羧基苯基脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、為一種白色鬆散固體。
以類似方式製備3,5-二羧基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物PAMAM4.0(EDA)BRI 6195。
實施例324-膦醯基氧基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32BRI6181將三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg；0.01ml)的無水二氯甲烷(2ml)攪拌的混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮至得到一種粘性油。將該油溶於N,N-二甲基-N-烯丙基胺(pH9.5；5ml)並加入固體異硫氰酸4-膦醯基氧基苯基酯(250mg)。用1M碳酸鈉將該所得溶液的pH調節至10並在53℃下和氮氣環境中將該溶液加熱3小時。然後將該溶液濃縮至得到一種白色固體殘餘物。將該殘餘物重新溶於水並使該溶液過Amberlite IR120(Na)柱且濃縮濾液。然後使該殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個4-膦醯基氧基苯基脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32、為一種白色鬆散固體(150mg)。
實施例334-膦醯基苯基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32將三氟乙酸(2ml)加入到BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32(147mg；0.01ml)的無水二氯甲烷(2ml)攪拌的混懸液中並將所得溶液在室溫下和氮氣環境中攪拌2小時且然後濃縮至得到一種粘性油。將該油溶於N,N-二甲基-N-烯丙基胺(pH 9.5；5ml)並加入固體異硫氰酸4-膦醯基苯基酯(250mg)。用飽和碳酸氫鈉溶液將該所得溶液的pH調節至9並在53℃下和氮氣環境中將該溶液加熱3小時。然後將該溶液濃縮至得到一種白色固體殘餘物。將該殘餘物重新溶於水並使該溶液過Amberlite IR120(Na)柱且濃縮濾液。然後使殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用64個4-膦醯基苯基脲鈉基團封端的BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32BRI 6196，在凍幹後得到一種白色鬆散固體(152mg)。
實施例344,6-二膦醯基萘基硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0將異硫氰酸4,6-二膦醯基萘基酯(165mg)的水(2ml)溶液加入到PAMAM4.0(51mg；0.01mmol)的水(2ml)溶液中。用飽和碳酸氫鈉溶液將該混合物的pH調節至9.5並將該混合物在室溫下劇烈攪拌1小時且然後在53℃下和氮氣環境中加熱3小時。接著將該混合物過濾並將濾液濃縮至得到一種棕色固體殘餘物。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex G25；水)純化而得到用24個4,6-二膦醯基萘基硫脲鈉基團封端的PAMAM4.0，在凍幹後得到一種棕色固體(81mg)。
實施例35螢光素硫脲封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體異硫氰酸螢光素酯(188mg)加入到PAMAM4.0(EDA)(74mg；0.01mmol)的水(3ml)溶液中。加入飽和碳酸氫鈉溶液將pH調節至9並將所得的均勻溶液在室溫下攪拌過夜且然後濃縮。使橙色殘餘物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用21個螢光素硫脲基團封端的PAMAM4.0(EDA)，在凍幹後得到一種鬆散的橙色固體(193mg)。
實施例36(苯基-3-硼酸)硫脲鈉封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0(EDA)將固體(苯基-3-硼酸)異硫氰酸酯(100mg；0.5mmol)加入到PAMAM4.0(EDA)(69mg；0.01mmol)的水(2ml)溶液中。將1M碳酸鈉加入到溶解的異硫氰酸酯中(pH約為10)。然後在53℃下和氮氣環境中將該混合物加熱2小時、接著過濾並將濾液濃縮至得到一種淺棕色固體殘餘物。使該粗產物通過凝膠過濾(Sephadex LH20；水)純化而得到用32個(苯基-3-硼酸)硫脲基團封端的PAMAM4.0(EDA)，在凍幹後得到一種白色鬆散固體(87mg)。
實施例37十二烷基羧醯氨基吡啶鎓封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM2.0樹枝狀聚合物BRI-6807從0.5ml的MeOH溶液中蒸發出PAMAM2.0代的核(0.0479mmol；50mg)且然後將其重新溶於10ml的水。向該溶液中加入溴化12-十二酸1-N-吡啶鎓(0.14g；0.384mmol)、N-羥基苯並三唑水合物[HOBT](52mg；0.384mmol)、三乙胺(53μl；0.384mmol)和鹽酸1-(3-二乙氨基丙基-3-乙基)碳化二亞胺[EDC](74mg；0.384mmol)。將該反應混合物在室溫下攪拌過夜。在減壓條件下使體積減少至三分之一併使該溶液在LH20柱上進行層析，用水作洗脫劑。收集含有產物的級分並通過凍幹分離出溴化十二烷基羧醯胺吡啶鎓PAMAM2.0、為一種鬆散的白色固體。1H nmr(D20):δ1.15,1.45,1.9,2.15,2.75,2.8,3.15,3.35,3.5,4.55,8.05,8.5,8,8.PAMAM4.0樹枝狀聚合物BRI-6809從1.0mml的MeOH溶液中蒸發出PAMAM4.0代的核(0.05mmol；69mg)且然後將其重新溶於15ml的水。向該溶液中加入溴化12-十二酸1-N-吡啶鎓(0.143g；0.4mmol)、N-羥基苯並三唑水合物[HOBT](77mg；0.4mmol)、三乙胺(56μl；0.4mmol)和鹽酸1-(3-二乙氨基丙基-3-乙基)碳化二亞胺[EDC](77mg；0.4mmol)。
將該反應混合物在室溫下攪拌過夜。在減壓條件下使體積減少至三分之一併使該溶液在LH20柱上進行層析，用1％的三乙胺水溶液作洗脫劑。收集含有產物的級分並通過凍幹分離出溴化十二烷基羧醯胺吡啶鎓PAMAM4.0、為一種鬆散的白色固體。使少量產物與乙酐反應而證實該樹枝狀聚合物核的NH2端基被完全封端。1H nmr(D2O):δ1.10,1.45,1.9,2.1,2.30,2.5,2.7,3.2,4.5,8.00,8.45,8.80.
實施例38糖精封端的樹枝狀聚合物的製備PAMAM4.0樹枝狀聚合物BRI-6157向乙二胺核PAMAM4.0樹枝狀聚合物核(275mg；39.8μM)的無水二甲基甲醯胺(25ml)溶液中加入6-(苯並硫醯亞氨基)異硫氰酸酯(400mg；1.67mM)並將該混合物在室溫下攪拌24小時。通過用碳酸鈉溶液將pH調節至pH10-10.5而使渾濁溶液澄清。將該溶液再攪拌24小時並在旋轉蒸發器上除去揮發性物質。將該溶液在大SephadexLH20柱上進行層析並收集前面的級分。收集剩餘的級分並重新在小柱上進行層析。蒸發合併的前面的級分並凍幹至得到糖精封端的樹枝狀聚合物產物(450mg；78％)、為一種鬆散的白色固體。1H nmr(D2O):δ2.20,2.50 3.23,3.46,3.63,7.52,7.87.
按照類似方式製備糖精封端的BHA.1ys.lys2lys4.lys8.lys16.lys32…樹枝狀聚合物BRI-6189。
實施例39眼鏡蛇毒液和蜂毒毒素的抑制A材料和方法細胞生物傳感器顯微生理測量儀(Cytosensor Mierophysiometer)方案細胞生物傳感器顯微生理測量儀(CytosensorMicrophysiometer)(Molecular Devices Inc.,CA)是一種可用於間接測定體外細胞代謝率的輕便可尋址的以電位傳感器為基礎的裝置(Parce等，1989；McConnell等，1992)。通過測定固定在微量體積流量室內部的細胞產生酸性代謝物的比率(rate)來確定代謝情況。
將人CEM細胞離心並重新懸浮於低緩衝的不含血清/不含碳酸氫鹽的RPMI1640培養基(Molecular Devices，下文稱作「改進的培養基」)中。以60,000-75,000個細胞/莢膜的密度將細胞接種在細胞莢膜盤(Molecular Devices)的聚碳酸酯膜(3μm孔隙度)上。使用瓊脂糖截留培養基(Molecular Devices)固定細胞。將接種的細胞莢膜盤轉入裝有檢測pH改變(和由此細胞代謝情況)的矽傳感器的傳感器室內。用於該組實驗的細胞傳感器系統包括8個獨立的用於測定酸化比例的室。使改進的培養基以100-120μl/分鐘的速率泵壓通過細胞。來自兩個儲蓄器之一的流體供各細胞室用。
為了測定酸化速率，定期中斷流過的改進的培養基以便累積分泌的酸性代謝物(乳酸和CO2)。在該組實驗中，使流量停止30秒，在此期間，計算適合於一段時間內電壓信號改變的最小正方形的斜率即酸化速率(測定為μV/s)。使該速率數據標準化(使用加入化合物前4-5個速率點)以便直接比較來自4個室的信號。每2分鐘進行一次酸化情況的測定。將室保持在37℃。
將基礎酸化速率監測(不進行任何處理)至少30分鐘。此後，使一定濃度範圍的毒液/肽類與細胞接觸達4小時的期限。選擇對細胞顯示出顯著作用而非最大值的毒素濃度來檢測一定濃度範圍的BRI2923對這種毒性的抑制作用。在所有實驗中，使至少一個室不與任意化合物接觸、作為陰性對照。
將BRI2923溶於水並將該溶液的pH調節至7.2。將100μM-1nM的濃度加入到毒液/介質溶液中並培養6分鐘(使用該設備的可能的最低培養期限)至1小時的期限且然後將其引入細胞。重複所有實驗、一式三份。B結果BRI2923抑制眼鏡蛇毒液檢測來自森林眼鏡蛇(Najia Malenoleuca)的毒液粗品。加入到CEM細胞中的眼鏡蛇毒液開始使細胞代謝增加，隨後使細胞死亡(細胞裂解)。眼鏡蛇毒液尤其可以破壞細胞，導致開始的代謝增加約80％，隨後在第一個10分鐘內快速使細胞100％死亡。開始在10、50和100μ/ml下檢測毒液。將來自50μ/ml的次最大反應選作大多數實驗中的檢測劑量。使用兩種BRI2923濃度(10-4和10-5M)。
在所有培養期限時(6、30和60分鐘)，用50μ/ml毒液培養的10-5MBRI2923使開始代謝率的增加從約80％下降至約5％並經過約15-20分鐘延緩了細胞死亡的發作。
用50μ/ml毒液培養的10-4MBRI2923既阻斷了開始代謝率的增加又阻斷了隨後在這種單獨毒液濃度下所觀察到的細胞快速死亡。用100μ/ml毒液培養的10-4MBRI2923也消除了開始的代謝率的增加而在洗滌掉毒液/樹枝狀聚合物溶液後細胞繼續死亡。蛇的毒液由許多毒性成分組成，它們各自具有不同形式的毒性。眼鏡蛇毒液含有以與蜂毒毒素蜂毒肽類似方式導致細胞裂解的細胞毒性肽。分離自NajiaMalenoleuca的細胞毒素的胺基酸序列表明這種毒素是高度鹼性的(陽離子型)且由此可方便地被聚陰離子型化合物諸如BRI2923所失活。作為降低毒性的基礎，這種靜電失活得到了實驗中所發現的結果的支持，所述的實驗結果是6分鐘的培養期與所用的30-60分鐘的較長培養期具有相同結果。BRI2923抑制蜂毒肽(來自蜂毒的主要毒素)將10-5M-10-7M半對數劑量範圍的蜂毒肽加入到CEM細胞中。在開始不激活細胞的條件下兩個最高劑量(10-5M和5×10-6M)在15分鐘內使全部細胞死亡。10-5M使細胞代謝率瞬時增加，隨後細胞裂解，在1小時後完全裂解。5×10-7M使裂解曲線進一步向右移動且10-7M沒有作用。重複這種劑量反應測定並將10-6M蜂毒肽選作所用BRI2923的次最大濃度。用10-6M蜂毒肽將一定濃度範圍的BRI2923培養20分鐘。10-4M和10-5MBRI2923完全抑制了蜂毒肽的毒性作用。10-5MBRI2923完全阻斷了蜂毒肽的毒性約30分鐘且在最後30分鐘的接觸期間代謝率僅比對照細胞下降了約10-15％。10-7M、5×10-7M和10-8M濃度的NRI2923可降低但不能預防毒性。10-9MBRI2923對10-6M蜂毒肽沒有作用。
實施例40HIV(AIDS)毒素的抑制介紹Vpr是人免疫缺陷病毒(HIV-1)輔助基因產物、即14kDa的96-胺基酸蛋白質。該基因vpr在HIV-1、HIV-2中是高度保守的且Vpr基因產物最適宜HIV感染和疾病發展。(由Cullen綜述，1998；EmermanMalim,1998)。在其作用中，Vpr誘導人細胞和酵母內的編程性細胞死亡和致細胞病變(Stewart等，1997；Zhao等，1996；Macreadie等，1996)。
將Vpr蛋白質分級分離並分離了導致編程性細胞死亡的肽序列且將其命名為Vpr P3。已經發現Vpr P3可透過CD4+T淋巴細胞(諸如CEM細胞)並通過編程性細胞死亡而導致其死亡。下列實驗使用了這種毒性Vpr肽級分P3(Arunagiri等，1997)。使用細胞傳感器顯微生理測量儀(Cytosensor Microphysiometer)的方法將人CEM細胞以1400RPM離心7分鐘並重新懸浮於改進的RPMI1640培養基中。然後使用瓊脂糖截留培養基固定細胞並將其點在莢膜盤(Molecular Devices Ltd.,CA.)的聚碳酸酯膜中心。以約43,000-75,000個細胞/莢膜盤的密度接種細胞。將接種的莢膜盤轉入裝有矽傳感器的傳感器室內並給定在顯微生理測量儀上。使改進的培養基以120μl/分鐘的速率泵壓通過細胞。來自兩個儲蓄器之一的流體供各細胞室用，該過程可使用軟體指令來改變。使細胞在所述室內平衡30-60分鐘或直到獲得穩定的代謝率為止。在該組實驗中，使流量停止30秒，在此期間，計算適合於一段時間內電壓信號改變的最小正方形的斜率即酸化速率(測定為μV/s)。使該速率數據標準化(使用加入化合物前4-5個速率點)以便直接比較來自4個室的信號。每2分鐘進行一次酸化情況的測定。將室保持在37℃。
對於所有實驗來說，以相當於這些細胞的早期至中期對數期生長的1.3×105-1.3×106個細胞/ml使用CEM細胞。
將細胞固定在顯微生理測量儀上並在至少30分鐘的平衡期後將Vpr P3灌注入細胞室。所用Vpr P3的濃度範圍是10-5M-2×10-5M。要求Vpr P3與細胞接觸2小時以上以便全部毒性作用明顯出現。
對於檢測由BRI2923抑制Vpr肽毒性的實驗來說，將Vpr P3肽類的培養基溶液製成合適的濃度並加入BRI2923，將溶液混合併在置於細胞傳感器上之前使之平衡20-30分鐘。在進行各抑制實驗的同時，還使含有用於檢測BRI抑制作用的相同濃度的Vpr P3的陽性對照通道以及時間對照通道運轉相同的時間期限。使Vpr P3肽溶液和VprP3/BRI2923溶液與細胞接觸2小時30分鐘的最低期限至4小時的最高期限。此外，在洗滌掉化合物後，對細胞的代謝率進行短期監測(最少6分鐘)。結果在細胞傳感器系統中，對其自身上檢測的VPR P3肽在開始導致代謝率增加，隨後下降且接著因CEM細胞的編程性細胞死亡而導致細胞死亡。
在附

圖1所示的實驗中，在總量為1ml(改進的RPMI培養基)中用10-4M(終體積)化合物BRI2923將VPR肽P3(10-5M)預培養30分鐘。然後將溶液稀釋至最終體積(25ml)並灌注入細胞。由於10-4MBRI2923溶液(酸性)和培養基(中性)的pH差異與BRI2923樹枝狀聚合物本身的內在緩衝作用的結合，所以在BRI2923/Vpr P3室中觀察到了代謝率在開始階段急劇下降。為了解釋這種代謝率的下降，將校正因素用於所有使用BRI2923的結果。所用的校正因素是a)對添加到所有隨後數據點的第一批數據點計算的起始下降和b)在洗滌後以相同方式從所有點中扣除的計算的洗滌作用。
校正的示意圖如附圖2中所示。該結果表明10-4M BRI2923可對由VPR P3在10-5M下誘導的毒性作用(編程性細胞死亡)起到完全的預防作用。重複進行該實驗，一式四份。
測試另外濃度的BRI2923對較高濃度的Vpr P3的作用並將結果表示在附圖3和4中。BRI2923在10-5M下還表現出對2×10-5MVpr P3-誘導的編程性細胞死亡的抑制作用(一式三份的實驗)。10-6MBRI2923表現出明顯使由2×10-5MVpr P3產生的作用降低(一式三份的實驗)。10-7MBRI2923可將2×10-5MVpr P3的毒性減弱至代謝率下降比率較低的程度(一式四份的實驗)。
與時間對照不同，在含有BRI2923的室內的細胞沒有表現出任何與時間相關的代謝率下降。預先的使用BRI2923的細胞傳感器實驗還提示所述的樹枝狀聚合物除可抑制由VPR P3導致的編程性細胞死亡外還可以提供細胞保護性作用。
實施例41測定霍亂毒素抑制作用的鈣黃綠素的釋放試驗材料細胞系·HPC-8人回盲腸癌上皮細胞鈣黃綠素，AM·分子探針，目錄號C-1430·C46H46N2O23，分子量994.87·在小瓶中的100μl試劑級無水二甲亞碸(DMSO)中懸浮1mg至得到10mM的儲備溶液。毒素·霍亂毒素(Sigma目錄號C8052)-由5個B亞單位包圍的亞單位抑制劑樹枝狀聚合物·測試樹枝狀聚合物-BRI2913和BRI2999。方法1．在2PBS(磷酸緩衝鹽水)洗滌後在2ml/75cm2燒瓶中使對數生長期的HCP-8(粘附人回盲腸癌上皮細胞系)進行胰蛋白酶消化(胰蛋白酶EDTA)。
2．將細胞與胰蛋白酶溶液培養5分鐘。
3．將20ml培養基加入到燒瓶中以便使胰蛋白酶失活。
4．將細胞溶液轉入50ml離心管並在室溫(RT)下以1200RPM旋轉7分鐘。
5．在PBS中洗滌細胞並在RT下以1200RPM旋轉細胞7分鐘。
6．將細胞重新懸浮於PBS並計數，然後在RT下以1200RPM旋轉7分鐘並棄去上清液。
7．將細胞重新懸浮於1mlPBS並加入5μl鈣黃綠素且在37℃下培養45分鐘。
8．在PBS(約5-20ml)中洗滌細胞並重新懸浮於PBS以便得到最終數量的5×105個細胞/100μl。
9．將100μl細胞溶液(5×105個細胞/孔)加入到使用的含50μl霍亂毒素(溶於H2O)和50μl樹枝狀聚合物溶液(製成10mM的DMSO儲備溶液並用PBS稀釋)的96孔平板中的各孔中。將各濃度重複四次。
10．在37℃下和5％CO2培養箱中將平板培養2小時。
11．收集上清液並進行螢光測定分析。結果進行預實驗。列出的所有結果是三次重複實驗的平均螢光強度。
抑制％=100-(FI毒素+樹枝狀聚合物/FI毒素×100)參考文獻Arunagiri,C.K.,Macreadie,I.G.,Hewish,D.R.和Azad,A.A.(1997):「HIV-1輔助蛋白Vpr的C-末端結構域涉及人CD+淋巴細胞的透過、線粒體功能障礙和編程性細胞死亡」-《編程性細胞死亡》(Apoptosis)2,69-76；Cullen.B.R.(1998):HIV-1輔助蛋白與垂死細胞發生關係-《細胞》(Cell)93,685-692；Emerman,M.和Malim,M.H.(1998)HIV-1調節/輔助基因不明病毒和宿主細胞生物學的關鍵-《科學》(Science),280,1880-1883；McConnell,H.K.,Owicki,J.C.,Parce,J.W.,Miller,D.L.,Baxter,G.T.,Wada,H.G.和Pitchford,S.(1992)「細胞傳感器顯微生理測量儀(Cytosensor Microphysiometer)矽技術的生物應用」-《科學》(Science),257,1901-1912；Macreadie,I.G.,Arunagiri,C.K.,Hewish,D.R.White,J.F.和Azad,A.A.(1996)「胞外添加含有胺基酸序列基元H(S/F)RIG的HIV-1Vpr結構域可導致細胞膜透化和死亡」-《分子微生物學》(Mol.Microbiol)19(6),1185-1192；Parce,J.W.,Owicki,J.C.,Kercso,K.M.,Sigal,G.B.,Wada,H.G.,Muir,V.C.,Bousse,L.J.,Ross,K.L.,Sikic,B.I.和McConnell,H.M.(1989)「使用矽傳感器檢測影響細胞的活性劑」-《科學》(Science),246,243-247；Stewart,S.A.,Poon,B.Jowett,J.B.M.和Chen,I.S.(1997)「人免疫缺陷l型病毒誘導細胞循環抑制後的編程性細胞死亡」-《病毒學雜誌》(J.Virol.)71,5579-5592；Zhao,Y.,Cao,J.,O』Gorman,M.R.G.,Yu,M.和Yogev,R.(1996)「人免疫缺陷1型蛋白質R(Vpr)基因表達對裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母的基本細胞功能的作用」-《病毒學雜誌》(J.Virol.)70,5821-5826。
權利要求
1．一種預防性或治療性抑制人或非人的動物患者體內毒物或毒性物質的方法，該方法包括對所述患者給予有效量的帶有多個端基的樹枝狀聚合物的步驟，其中至少一個所述端基帶有與之結合或連接的含陰離子或陽離子的部分。
2．一種根據權利要求1所述的方法，其中所述的化合物是樹枝狀聚合物，它包括與至少兩個樹枝狀分支共價結合的多價核並通過至少兩代擴展。
3．一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的樹枝狀聚合物是基於氨核的聚醯氨基胺樹枝狀聚合物。
4．一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的樹枝狀聚合物是基於乙二胺核的聚醯氨基胺樹枝狀聚合物。
5．一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的樹枝狀聚合物是基於二苯甲基胺核或其它合適核的聚賴氨酸樹枝狀聚合物。
6．一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的樹枝狀聚合物是聚(丙烯亞胺)樹枝狀聚合物。
7．一種根據權利要求2所述的方法，其中所述的化合物是下列通式Ⅰ的聚離子型樹枝狀聚合物 其中I是引發劑核；Z是內部支化單元；n是代表所述樹枝狀聚合物代數的整數；且A是可以通過任選的連接基團X與內部支化單元Z連接的含陰離子或陽離子的部分。
8．一種根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其中在所述的化合物中，所述含陰離子或陽離子的部分或多個部分通過醯胺或硫脲鍵與胺、硫氫基、羥基或其它反應性端基結合。
9．一種根據權利要求1-8中任意一項所述的方法，其中在所述的化合物中，所述含陰離子或陽離子的部分選自下列部分組成的組含磺酸的部分、含羧酸的部分(包括含神經氨酸和唾液酸的部分和含修飾的神經氨酸和唾液酸的部分)、含硼酸的部分、含磷酸和膦酸的部分(包括含酯化的磷酸和膦酸的部分)、含伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基的部分、含吡啶鎓的部分、含鈲鹽的部分、含脒鎓的部分、含苯酚的部分、具有酸性或鹼性氫的雜環、和含兩性離子的部分。
10．一種根據權利要求1-9中任意一項所述的方法，其中在所述的化合物中，與樹枝狀聚合物氨基或其它的反應性端基結合的部分或多個部分選自下列基團組成的組，其中n是0或正整數-NH(CH2)nSO3--(CH2)nSO3--Ar(SO3-)n-CH2CH(SO3-)COOH -CH(SO3-)CH2COOH-ArX(CH2)nSO3-X=O,S,NH -ArXP(=O)(OR)2X=O,CH2,CHF,CF2R=烷基，芳基，H,Na-ArXP(=O)(OR1)(NR2R3)X=O,CH2,CHF,CF2R1=烷基，芳基，H,Na R2,R3=烷基，芳基-Ar[p(=O)(OR)2]nR=烷基，芳基，H,Na n=1-3-Ar[B(OH)2]nn=1-3 -Ar[COOH]nn=1-3 R=烷基或芳烷基；R1、R2、R3(可以相同或不同)=烷基或芳烷基
11．一種根據權利要求1-10中任意一項所述的方法，其中所述的化合物選自下列物質組成的組1．烷基磺酸封端的樹枝狀聚合物；2．磺基乙醯胺封端的樹枝狀聚合物；3．磺基琥珀醯胺酸封端的樹枝狀聚合物；4．N-(2-磺基乙基)琥珀醯胺封端的樹枝狀聚合物；5．4-磺基苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；6．3,6-二-磺基萘基硫脲封端的樹枝狀聚合物；7．4-磺基萘基硫脲封端的樹枝狀聚合物；8．3,5-二-磺基苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；9．3,6,8-三-磺基萘基硫脲封端的樹枝狀聚合物；10．4-(磺基甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物；11．4-磺基苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物；12．N-(4-磺基苯基)丙醯胺封端的樹枝狀聚合物；13．4-磺基苯基脲封端的樹枝狀聚合物；14．N,N,N-三-甲基甘氨醯胺封端的樹枝狀聚合物；15．4-三甲基銨苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物；16．4-(三甲基銨甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物；17．N-(2-乙醯氧基乙基)-N,N-(二甲基銨)甲基-羧醯胺封端的樹枝狀聚合物；18．胍基封端的樹枝狀聚合物；19．4-([1,4,8,11-四氮雜環十四烷]甲基)苯甲醯胺封端的樹枝狀聚合物；20．4-羧基-3-羥基-苄胺封端的樹枝狀聚合物；21．4-羧基苯基醯胺封端的樹枝狀聚合物；22．3,5-二羧基苯基醯胺封端的樹枝狀聚合物；23．4-膦醯基氧基苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；24．4-(膦醯基甲基)苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；25．乙基-4-(膦醯基甲基)苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；26．(8-辛醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；27．(11-十一醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；28．(乙醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；29．(4-丁醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；30．(4-甲基苯甲醯氨基)-5-乙醯氨基-3,5-雙脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；31．(8-辛醯氨基)-4-疊氮基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；32．(8-辛醯氨基)-4-氨基-5-乙醯氨基-3,4,5-三脫氧-2-硫-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-nonulo吡喃糖苷酸封端的樹枝狀聚合物；33．4-苯甲醯氨基硼酸封端的樹枝狀聚合物；34．3,5-二羧苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；35．4-膦醯基氧基苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；36．4-膦醯基苯基硫脲封端的樹枝狀聚合物；ⅹⅹⅹⅶ．4,6-二膦醯基萘基硫脲封端的樹枝狀聚合物；ⅹⅹⅹⅷ．螢光素硫脲封端的樹枝狀聚合物；ⅹⅹⅹⅸ．(苯基-3-硼酸)-硫脲封端的樹枝狀聚合物；xl．十二烷基羧醯胺吡啶鎓封端的樹枝狀聚合物；和xll．糖精封端的樹枝狀聚合物。
12．一種根據權利要求1-11中任意一項所述的方法，其中所述的治療包括抑制生物來源的毒素和毒性肽類或在細菌、原生動物、真菌或病毒感染過程中釋放的毒素和毒性肽類。
13．一種用於預防性或治療性抑制人或非人的動物患者體內毒物或毒性物質的藥物組合物或獸藥組合物，它包括如權利要求1-11中任意一項所定義的陰離子型或陽離子型樹枝狀聚合物以及至少一種藥物上或獸藥上可接受的載體或稀釋劑。
14．如權利要求1-11中任意一項所定義的陰離子型或陽離子型樹枝狀聚合物在預防性或治療性抑制人或非人的動物體內毒物或毒性物質，或在製備用於預防性或治療性抑制人或非人的動物體內毒物或毒性物質的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種預防性或治療性抑制人體或非人體的動物體患者體內毒物或毒性物質的方法,該方法包括對所述患者給予有效量的帶有多個端基的樹枝狀聚合物的步驟,其中至少一個端基帶有與之結合或連接的含陰離子或陽離子的部分。
文檔編號A61K31/74GK1323215SQ99812271
公開日2001年11月21日 申請日期1999年9月13日 優先權日1998年9月14日
發明者B·R·馬休斯, G·霍蘭, K·W·馬戴爾 申請人:星藥有限公司