移植物抗宿主疾病的治療的製作方法

2023-05-31 18:52:31

專利名稱：移植物抗宿主疾病的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑。本發明還涉及一種包含間質幹細胞作為活性成分的用於治療急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑。
背景技術：
移植物抗宿主疾病(GVHD)是由於患者機體對同源移植時注入的捐獻者外周血液或骨髓中的T淋巴細胞的免疫反應而引起的疾病。即，它是一種由移植入的活的淋巴細胞引起免疫反應，從而導致肝功能障礙、皮膚損傷、黃疸、腹瀉、發熱、全血細胞減少等，嚴重致死的疾病。 移植物抗宿主疾病可大致分為急性移植物抗宿主疾病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主疾病(cGVHD)。 cGVHD是最主要且最常見的副作用，在血液和骨髓祖細胞移植後存活超過100天的患者中佔20% _70%，並且是移植後死亡的主要原因。因為cGVHD和aGVHD不是連續性的疾病，由於血液和骨髓祖細胞移植治療方法的發展，aGVHD需要不同的途徑而cGVHD則正在成為一個更加重要的問題。 在同種移植的情況下，cGVHD通常發生在移植後4-6個月，而發生在80天內或1年後的並不常見。因此，可以理解同源反應是引起cGVHD的一個主要的必要條件，並且cGVHD的發病會經歷一個較長的潛伏期或者對靶器官的效應緩慢顯現。cGVHD中發現了多種胸腺功能障礙，並且認為如果正常胸腺在移植前治療或通過外周機制產生的同源抗原/自身抗原所引起的損傷中未被切除，病理性的移植T細胞會反應性增加，這種類型的病理性CD陽性的T細胞，作為Th2免疫反應，會引起與自身免疫疾病相似的免疫缺陷，包括細胞溶解攻擊、分泌炎性纖維細胞因子、B細胞激活、以及通過形成自身抗體引起靶器官損傷。
cGVHD的臨床症狀包括皮膚的變化，如紅斑、乾燥、瘙癢、色素沉著變化、以及斑丘疹；毛髮的變化，如毛髮變細和脫髮，以及口腔病變如牙齦炎、黏膜炎、及唇萎縮。除此之外，還包括發生在眼睛、生殖器官、肝、肺、胃腸道、筋膜、骨骼系統、漿膜(serousmembrane)等的各種損傷。 儘管cGVHD通常被定義為骨髓移植100天後發生的GVHD，但對於診斷而言表現出的病症比出現的時間更為重要。依照症狀出現的時間，可將其分為進行性發病(progressive onset),即aGVHD尚未治癒即轉變成為cGVHD ;靜止性發病(quiescentonset)，即在aGVHD完全治癒後發生的cGVHD ;以及初發(DE novo)，即在之前未出現aGVHD的情況下發生的cGVHD。在進行性發病期間的發病率和死亡率最高，其次為靜止性發病期間，而在初發時最低。至於所表現出的症狀，在許多病例中以皮膚和口腔黏膜上的青苔樣疹為最初症狀，而損傷也可能出現在與aGVHD相同的部位，損傷是丘疹樣的，侵襲性的，且覆蓋有白色鱗屑。當從病理組織學角度與aGVHD進行比較時，儘管仍能發現衛星細胞壞死性損傷，但其淋巴細胞浸潤呈現為一條超固結帶(over consolidated band)。除此之外，膽囊
管縮窄，並且可觀察到膽汁的蓄積，但由於有的病例中可能混有與藥物治療或病毒性肝炎相關的損傷，因此存在難以與cGVHD相區分的情況。 發生cGVHD時，由於免疫功能已經下降，因此在治療期間可能出現嚴重感染，這就迫切需要一種新的有效的且副作用很小的治療方法。關於這一點，已有多項研究報導了間質幹細胞具有分化為多種器官細胞的能力，且可通過抑制T細胞來改善移植物抗宿主反應。 儘管間質幹細胞可作為原始中胚層的原始細胞以未分化狀態進行增殖，並且可從多種器官中分離得到，如骨髓、脂肪組織、肝、肌腱、滑膜、臍帶，但尚不存在可以用來精確定義間質幹細胞的單一標記物。然而，CD14、 CD34和CD45是眾所周知的骨髓標記物，而SH-2(CD105) 、 SH-3(CD73) 、 SH_4及Th7_l是眾所周知的間質標記物。間質幹細胞或間質基質細胞(MSC)表達第l類主要組織相容性複合物(MHC)，而MHC類可以通過幹擾素-y (IFN-y)誘發臨床表現，並且由於其不顯示FAS或FAS L(CD40)型共剌激分子，所以不會誘發免疫反應，也不會發生由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷(NK)細胞引起的細胞溶解。此外，儘管間質幹細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)時通過密度依賴抑制T細胞增殖，並且抑制B細胞增殖以及免疫球蛋白的形成，但現在已知MHC相容性對於MSC免疫抑制並不是必需的。此外，還已知MSC的核型或端粒酶的活性在分裂50次時並不發生改變。
然而，由於機體中存在的MSC非常稀少，開發分離MSC的技術非常重要。目前，密度梯度離心分離法、利用Sca-1或STRO-1特異性單克隆抗體的方法，以及依據細胞大小的分離方法是用於分離MSC的已知方法。本發明的發明人之前已開發了一種不需要特定機械設備或試劑的有效MSC分離方法(韓國專利公開第10-0802011號)，上述方法的特徵在於
培養從個體取出的骨髓，並通過將上層培養液重複移入新容器而進一步培養。 關於cGVHD的治療方法，美國專利第6， 544， 506號提供了一種GVHD的預防和治療
方法，其顯著特徵為，通過在器官移植患者體內注射非同種異體反應性抗細胞毒性淋巴細
胞來除去細胞毒性T淋巴細胞。美國專利第6，936，281號披露了一種利用間質幹細胞的
GVHD治療方法。美國專利第7， 173， 016號披露了一種包含注射腺苷脫氨酶抑制劑步驟的
GVHD治療方法。美國專利第6， 328， 960號披露了一種GVHD的治療方法，其顯著特徵為通過
在靶器官移植患者體內以能夠減輕效應細胞針對抗原的免疫反應的量注射間質幹細胞，以
減輕靶器官移植患者體內效應細胞針對異體抗原的免疫反應。美國專利第6， 386， 636號披
露了一種減少由效應細胞引起的免疫反應的方法，包括以能夠減輕針對異體抗原的免疫反
應的注射劑量使效應細胞與間質幹細胞上層培養液相接觸的步驟。 迄今為止，還沒有任何利用間質幹細胞或骨髓幹細胞成功治療cGVHD的案例報導。據此，本專利發明人通過在臨床上驗證了利用亞組分分離培養法分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞可有效治療cGVHD，試圖治療cGVHD完成了本發明。

發明內容
本發明的一個目標是提供用於急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑。
本發明的另一個目標是提供用於急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療方法。
為實現上述目標，本發明提供了一種含有間質幹細胞或骨髓幹細胞的用於治療急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑。 此外，本發明還包括一種用於治療移植物抗宿主疾病的方法，其包括一個在患急性或慢性移植物抗宿主疾病的患者體內注射有效劑量的間質幹細胞或骨髓幹細胞的步驟。
—方面，本發明涉及一種在已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內抑制供者骨髓中T細胞活性的方法，包含對需要該治療的受治療者給予治療有效量的同種克隆性骨髓幹細胞群。每次給藥的幹細胞劑量在1 X 104細胞/kg體重至1 X 108細胞/kg體重之間。這些幹細胞可以利用亞組分分離培養法而分離。所述幹細胞可以表達CD29、CD44及CD105細胞表面抗原，但不表達HLA-DR細胞表面抗原。所述幹細胞可以表達CD29、 CD44、CD73、 CD90、 CD105、及CD166細胞表面抗原，但不表達CD106、 CD119或HLA-DR細胞表面抗原。同種克隆性骨髓幹細胞可以分泌濃度至少約5ng/ml的白細胞介素-10。
另一方面，本發明涉及一種在已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內治療移植物抗宿主疾病症狀的方法，包含對需要該治療的受治療者給予治療有效量的同種克隆性骨髓幹細胞群。移植物抗宿主疾病的症狀可以表現為胃腸道症狀、皮膚硬化、經口進食受限、眼乾、肝症狀、呼吸短促或者上肢或下肢緊縮感。胃腸道症狀可能是每日糞便量的增加或炎性結腸。肝症狀可能為血清中鹼性磷酸酶水平的升高。 另一方面，本發明涉及一種在已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內抑制
供者骨髓中T細胞活性的方法，包含 (A)處理骨髓細胞的生物學樣品，包括 (i)將細胞樣品接種於一個容器中； (ii)將上清液從該容器轉移至另一個容器；以及 (iii)從上清液中分離該樣品中具有相對較低密度的細胞，以獲得同種克隆性骨髓幹細胞群；以及 (B)對需要該治療的受治者給予治療有效量的從(A)中獲得的同種克隆性骨髓幹細胞群。 在上述方法中，該容器可用塗層加以處理。塗層可以是膠原、多聚賴氨酸、纖維蛋白原或明膠。 另外一方面，本發明涉及一種在已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內治
療移植物抗宿主疾病症狀的方法，包括 (A)處理骨髓細胞的生物學樣品，包括 i)將細胞樣品接種於一個容器中； ii)將上清液從該容器轉移至另一個容器；以及 iii)從上清液中分離該樣品中具有相對較低密度的細胞，以獲得同種克隆性骨髓幹細胞群；以及 (B)對需要該治療的受治療者給予治療有效劑量的從(A)中獲得的同種克隆性骨髓幹細胞。 該細胞的劑量可以在IX 104細胞/kg體重至IX 108細胞/kg體重之間。這些細胞可以表達CD29、CD44及CD105細胞表面抗原，但不表達HLA-DR細胞表面抗原。所述細胞可以表達CD29、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105及CD166細胞表面抗原，但不表達CD106、 CD119、或HLA-DR細胞表面抗原。該細胞群可以分泌濃度至少約在5ng/ml的白細胞介素-10。
從本發明的下列描述，參考附圖以及附屬的權利要求，可以更充分地理解本發明的這些以及其他目的。


根據下文給出的詳細說明，將更加充分的理解本發明，所示附圖僅為了舉例示出，而並不是限制本發明，其中 圖1顯示的是利用在本發明中所使用的亞組分分離培養法分離克隆性骨髓幹細胞或間質幹細胞過程的圖解。 圖2顯示的是在通過亞組分分離培養法分離且用於GVHD患者治療的克隆性骨髓幹細胞上細胞表面抗原表位的FACS表型分析結果。 圖3A-圖3B顯示的是在GVHD患者的治療中所使用的克隆性骨髓幹細胞(cMSC-15)以及通過常規的密度梯度離心法分離的對照間質幹細胞所分泌的(A)TGF-P和(B)IL-IO量的圖表。 圖4顯示的是在GVHD患者體內給予克隆性骨髓幹細胞後每日排便量體積及鹼性磷酸酶活性的變化圖表。 圖5A-圖5D顯示的是注射了克隆性骨髓幹細胞的GVHD患者的結腸鏡檢照片。(A)是治療前的照片，(B)是治療10天後所拍的照片，(C)是治療l個月後所拍的照片，以及(D)是治療3個月後所拍的照片。
具體實施例方式
在本申請中，"一個"和"一種"既用來指單個也用來指多個對象。 如本文中所使用的，"身體樣品"指的是從期望從中分離出單一類型細胞的哺乳動
物獲得的任何樣品。這樣的身體樣品包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、及細胞
因子激活的外周血。 如本文中所使用的，"克隆性骨髓幹細胞"指的是來源於單個幹細胞的細胞。該短語可與"多譜系幹細胞"互換，後者是通過亞組分分離培養法獲得的。 如本文中所使用的，"同種"細胞群通常指在該種群內存在相同類型的細胞。基本上同種可指約80%的同種性，或者約85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98 % ， 99 % ， 99. 1 % ， 99. 2 % ， 99. 3 % ， 99. 4 % ， 99. 5 % ， 99. 6 % ， 99. 7 % ， 99. 8 % ，或99. 9 %的
同種性。特別地，細胞的同種性可歸因於單一細胞起源的細胞擴大培養。目前沒有可用的MSC特異性抗原，因此也沒有可用的MSC特異性抗體。理論上，獲得100X同種的MSC群的唯一方法是對後期通過表徵分化和增殖潛能而鑑定為MSC的單個細胞進行擴大培養。"同種幹細胞群"指的是來源於後期通過這些特徵研究鑑定為幹細胞的單個細胞的幹細胞(群)。
如本文中所使用的，"較低密度細胞"指的是那些較樣品中的其他細胞具有較低密度的細胞。較低密度細胞包括，但不限於，多譜系幹細胞、祖細胞、其他骨髓基質細胞。
如本文中所使用的，用於討論細胞來源和治療目的的"哺乳動物"指任何歸類為哺
乳動物的動物，包括人類、家養及農場動物，以及動物園動物、競賽動物、或寵物，如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、大鼠、小鼠、兔等等。優選地，哺乳動物指的是人類。
7
如本文中所使用的，"MLSC"指的是多譜系幹細胞。 如本文中所使用的，"MLSC/PC"指的是多譜系幹細胞或祖細胞。 如本文中所使用的，"MSC"指的是骨髓基質細胞或間質幹細胞，或骨髓幹細胞，這
些術語可以互換。 如本文中所使用的，"細胞樣品"指的是含有不同類型細胞的混合物的任何樣品，
包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、和細胞因子激活的外周血。 亞組分分離培養技術 儘管不限於任何分離MSC、MLSC或MLSC/PC的特定方法，獲取用來治療移植物抗宿 主疾病的細胞的優選方法是"亞組分分離培養法"，該方法被用來從身體樣品或諸如人類骨 髓的來源中分離高度同種的克隆性骨髓幹細胞群或多譜系幹細胞群(MLSCs)。美國專利申 請公開文件US2006/0286669(序列號11/471， 684， 2006年6月19日提交)"多譜系幹細胞 的分離(Isolation of Multi-LineageStem Cells)"中闡述了操作步驟，其全部內容結合 於此以供參考。 已知很難分離得到未受造血細胞汙染的骨髓MSC。為了應用於臨床機構，獲得同種 MSC群以避免由免疫原帶來的問題並正確評價臨床效果都是很重要的。傳統地，同種MSC群 的分離是通過MSC特異性抗體柱純化實現的。然而，由於還是無法獲得完美的MSC特異性 抗體，即使是這種方法也並不適用。 在亞組分分離培養法的操作中，不需要採用任何形式的離心以預先去除任何類型 的細胞，例如從樣品中除去紅細胞或白細胞，因為大多數較重或密度較大的細胞會在最初 兩個2小時的培養步驟中被除去。因此，本發明系統的優點之一即可以避免傳統採用的， 可能將諸如吡啶甲基、聚蔗糖、聚蔗糖-泛影葡胺等汙染引入細胞培養的密度梯度離心法 及單核細胞分離步驟。因此，所發明的亞組分分離培養法是一種簡單、有效，且經濟的從身 體樣品(優選骨髓樣品)中分離出高度同種MLSC的方案。 可替代地，也可以將通過MSC分離的常規密度梯度離心法分離/分級分離得到的 單核細胞接種入D1培養皿以獲得單一細胞來源的克隆，然後分離得到同種幹細胞群或祖 細胞群(圖1)。因此，該亞組分分離培養法可以與通過常規密度梯度離心法分離的單核細 胞一起使用。 本申請描述了所分離的單細胞源性幹細胞系的細胞表面蛋白表達特徵的多樣性， 表明在生物樣品中存在若干種不同類型的多譜系幹細胞或祖細胞，尤其是在所例示的骨髓 樣品中。所分離的MLSC通常表現為CD34、HLA-DR、CD31、CD166、第I類HLA陰性或弱陽性， 而CD44、CD29、CD105強陽性。然而， 一些來自培養皿D4和D5的細胞系表現出獨特的表面 蛋白水平，表明骨髓中可能存在若干種不同類型的多譜系幹細胞或祖細胞(圖1)。這些帶 有不同表面標記物的MSC可能代表該細胞的不同分化潛能。因此，通過亞組分分離培養法 分離單細胞來源的同種幹細胞使得分離組織特異性幹細胞或定向祖細胞成為可能，只要在 骨髓或其他專門分離的身體樣品中存在這些細胞群，且在細胞擴大培養期間培養條件不改 變其潛能。如在本申請中所顯示的，由於能夠通過特定的特性來表徵細胞亞群，從而使MSC 治療的安全性和有效性以及細胞移入過程得到了改進。 由於省去了密度梯度離心法和單核細胞分離 驟，並且不需要使用抗體以分離幹 細胞或特定的酶，因此亞組分分離培養法通過簡單、有效且經濟的操作步驟在樣品中生產出更多的同種MSC或MLSC群，且更安全地應用於治療機構中。 在實現本發明的過程中，優選但不限於利用上述亞組分分離培養法獲得骨髓幹細 胞。此外，優選所獲得的MSC' s表達CD29、 CD44、 CD105細胞表面抗原中的任一種或全部， 且優選MSC' s中不表達HLA-DR細胞表面抗原中的任一種或全部。更優選地，在MSC' s上 表達CD29、 CD44、 CD90、 CD105及CD166細胞表面抗原中的任一種或全部，而在MSC' s上不 表達CD106、 CD119、及HLA-DR細胞表面抗原中的任一種或全部。 優選地，本發明採用的MSC's表達白細胞介素-10(IL-10)。優選地，在治療時，培 養後IL-10表達可超過5ng/ml或10ng/ml。 —方面，本發明涉及利用通過亞組分分離培養法獲得的細胞，包括1)從個體獲 得骨髓的步驟；2)培養骨髓的步驟；3)僅將2)中的上層液體轉移至一個新的容器並進行 培養的步驟；4)僅分離3)中的上層液體並在培養容器中重複培養的步驟，該培養容器可選 地用塗層進行處理。 關於上述亞組分分離培養法，儘管並不限於任何特定的時間，上述步驟4)中的重
復培養可按如下操作，37t:培養1到4小時，然後37t:重複培養2到3次，約12到36小時，
接著37t:培養24到72小時，並且每次均需將上層液體轉移到一個新的培養容器。 另一方面，為了獲得更具粘附性的幹細胞，使用了塗覆有膠原、明膠、纖維蛋白原、
或多聚賴氨酸的培養皿。申請人發現，與未塗覆的培養皿表面相比，任何帶電荷的培養表
面，無論是帶正電還是負電，都利於幹細胞附著到它上。在塗覆有膠原或多聚賴氨酸的培養
皿中，比未塗覆的培養皿有更多的細胞附著，分別達到約2到3倍(數據未示出)。 因此，在一種實施方式中，培養皿的底部可以塗覆有帶正電的胺基酸例如多聚賴
氨酸、多聚精氨酸，或用帶負電的胺基酸例如多聚天冬氨酸、多聚穀氨酸、或它們的組合物，
以協助幹細胞或祖細胞更好地附著在培養皿底部。 優選該培養容器用塗層進行處理，儘管任何能夠改善細胞附著的材料均可採用， 但特別優選的是利用膠原、多聚賴氨酸、纖維蛋白原、或明膠。更優選地，可以使用膠原和多 聚賴氨酸。甚至更優選地，可以使用膠原。此外，在用膠原處理過的培養容器中將細胞重複 培養約3到6次是理想的(期望的)，更加理想的是將細胞重複培養4到5次。
所述治療劑的藥物製劑可以利用該行業中的常規知識來製備。例如，它可以藥用 的非口服的水或滅菌液體溶液形式以及混懸注射液的形式使用。例如，可考慮將藥學製劑 與藥用載體或介質結合，尤其是無菌水或生理鹽水溶液、植物油、乳化劑、混懸劑、表面活性 劑、穩定劑、賦形劑、載體、防腐劑、粘合劑等等，並將其混合於通常認為藥學應用所需的單 位容量形式(皿it c即acity format)中。此外，根據已知利用支持液體(如注射用蒸餾 水)的藥學應用，可以開具滅菌的注射用混合物的處方。 可以共同使用的注射用水性溶液的實例可以是生理鹽水溶液、葡萄糖、或等滲溶 液(包括支持性藥物如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、或氯化鈉)。至於恰當的液化支 持劑， 一個實例可以是醇，特別是乙醇或諸如丙二醇的多元醇，或非離子表面活性劑，如多 山梨醇酯80TM或HC0-50。 對於油劑，可以考慮芝麻油或大豆油，且可以與苯甲酸苄酯或苯甲醇共同使用。此 外，其還可以與緩衝劑如磷酸緩衝液、醋酸鈉緩衝液、或止痛溶液如奴佛卡因，或穩定劑如 苯甲醇、苯酚、或抗氧化劑等聯合使用。製備好的注射液分裝入普遍認可的合適的安瓿中。
通過非口服方式對患者機體給藥是合乎需要的，更具體地，儘管靜脈給藥1或3次 是基本的，但更大的注射量也是允許的。此外，給藥時段可長可短。更具體地，可考慮注射 類型或經皮給藥的類型。作為注射類型的實例，可以通過靜脈內注射、動脈注射，可選擇性 動脈注射、肌內注射、腹膜內注射、皮下注射、腦內注射、顱腦注射、或骨髓注射進行給藥，靜 脈內注射是最理想的。在靜脈內注射的情況中，由於利用常規輸血的移植方法已經成為可 能，患者不需要進行手術，而且由於不需局部麻醉，患者和醫生的負擔都會較輕。考慮到急 診醫學的未來發展，在緊急運送過程中或在關鍵部位進行給藥也是可以考慮的。
此外，本發明提供了一種用於治療患移植物抗宿主疾病患者的方法，包括對上述 患有移植物抗宿主疾病的患者給予有效治療劑量的間質幹細胞或骨髓幹細胞的步驟。
在哺乳動物尤其是人類中，治療GVHD或GVHD症狀的克隆性骨髓細胞每次注射的 有效劑量，可以為1Xl(^細胞/kg體重至1Xl8細胞/kg體重之間；在1Xl(^細胞/kg體 重至1Xl8細胞/kg體重之間；在2Xl(^細胞/kg體重至1Xl8細胞/kg體重之間；在 2. 5 X 104細胞/kg體重至1 X 108細胞/kg體重之間；在2 X 104細胞/kg體重至1 X 107細胞 /kg體重之間；在2. 5X 104細胞/kg體重至IX 107細胞/kg體重之間；在2X 104細胞/kg 體重至3X 106細胞/kg體重之間；在2. 5X 104細胞/kg體重至3X 106細胞/kg體重之間； 在2 X 104細胞/kg體重至2 X 106細胞/kg體重之間；在2. 5 X 104細胞/kg體重至2 X 106 細胞/kg體重之間；在2Xl(^細胞/kg體重至1Xl6細胞/kg體重之間；在2. 5乂104細胞 /kg體重至1Xl6細胞/kg體重之間；在2Xl(^細胞/kg體重至1Xl5細胞/kg體重之 間；或在2. 5X 104細胞/kg體重至IX 105細胞/kg體重之間。 儘管不限於任何特定的給藥方法，但優選的是非口服給藥法。儘管全身或局部給
藥都是可以的，但優選全身給藥，而最為優選的是靜脈內給藥。 移植物抗宿主疾病的治療 本專利的發明人能夠改善急性或慢性移植物抗宿主疾病患者的狀況，這些患者表 現為對通過給予利用2006年6月19日提交的美國專利申請公開第US2006/0286669號"多 譜系幹細胞的分離(Isolation of Multi-Li固ge Stem Cells)"中所披露的方法(圖1) 分離得到的間質幹細胞或骨髓幹細胞進行的治療無應答，該申請的全部內容結合於此以供 參考。 GVHD表現或症狀包括皮膚硬化、經口進食受限、眼乾、胃腸道(GI)症狀如吞咽困 難、食慾減退、噁心、嘔吐、腹痛、或腹瀉，肝症狀如表現為膽紅素升高、鹼性磷酸酶升高、丙 氨酸轉氨酶(ALT)/天冬氨酸轉氨酶(AST)之比(ALT/AST)升高、呼吸短促、和/或上肢或 下肢緊縮感。 受治療者可能會表現出多種症狀，這取決於被移植物抗宿主疾病所影響的組織。 一些患者會出現4-5種症狀而其他的可能為l-2種症狀。因此，本發明旨在治療與GVHD相 關的，表現在受治療者任何組織中的任何和全部症狀。當這些表現或症狀被治癒，就可以認 為GVHD疾病本身也同樣被治癒。 下文的說明提供了本申請中涉及的亞組分分離培養技術的應用以及利用由此獲 得的同種克隆性骨髓幹細胞治療經鑑定出現GVHD症狀個體的詳細內容。雖然沒有理論的 支持，但可以認為所給予的幹細胞在受治療者體內會分泌IL-10，其可以抵消或抑制供者T 細胞的有害作用，從而治療GVHD及GVHD的症狀。
在利用亞組分分離培養法從上述患有移植物抗宿主疾病患者的母親分離得到間 質幹細胞或骨髓幹細胞，並證實為單克隆細胞起源的細胞系後，將其命名為cMSC-15。通過 實質細胞分析來實施細胞表面抗原分析以確定上述細胞系是否是真正的間質幹細胞或骨 髓幹細胞(圖2)。結果顯示，由於其顯示出CD29、CD44、CD90、CD105及CD166細胞表面抗原 表達，而CD106、CD119、及HLA-DR細胞表面抗原沒有表達，因此確認其為間質幹細胞或骨髓 幹細胞而並非造血幹細胞。CD133和STR0-1的表達呈弱陽性。相應地，為了更具體地驗證 上述細胞系的特徵，利用ELISA的方法驗證了 TGF-13和IL-10的表達程度(圖3) 。 TGF-P 的表達與作為對照的通過常規的密度梯度離心法獲得的間質幹細胞不存在較大差異。然 而，與對照相比，IL-10的表達卻至少增加了 5倍。 因此，本專利發明人在將上述已確定的間質幹細胞或骨髓幹細胞培養至足夠用於 治療的量後，將其用在了一名由於慢性移植物抗宿主疾病的發作而處於生命危急狀況的患 者的治療。特別指出，上述患者是一名診斷為患有急性髓細胞白血病的18歲女性，在通過 誘導治療達到緩解後，接受了同種異體骨髓移植。在六個月的免疫抑制劑給藥中斷後一個 月，出現了慢性移植物抗宿主疾病，儘管利用環孢黴素A(CsA)、麥考酚酸嗎乙酯(匪F)、和 甾類化合物進行了治療，但由於持續的便血、膽紅素增加，及皮膚、口和眼睛乾燥，患者的情 況惡化，並且由於治療的副作用和在尿液及血液中均檢測到的BK病毒(由於BK病毒的感 染)，巨細胞病毒活化，因此開始使用西多福韋(Cideforvir)進行治療。
本專利發明人在收到韓國食品藥品監督管理局發出的緊急臨床許可後，通過靜脈 內注射給予一次上述間質幹細胞或骨髓幹細胞。在給藥期間及之後均沒有觀察到不良/負 面反應，且患者的症狀在第l次給藥後出現緩慢改善，3周後進行了第2次給藥。後來，患者 症狀得到了改善，並且在第2次給藥34天後，在停止服用甾類化合物而僅服用免疫抑制劑 的情況下，患者出院。 為了驗證該治療的病理學效應，本專利發明人檢測了移植物抗宿主疾病的主要指 徵，即排便量及血液中的鹼性磷酸酶活性(圖4)。排便量顯著減少，而作為血清學指標的血 液鹼性磷酸酶活性也回落到了正常水平(60-220ng/ml)。此外，還進行了結腸鏡檢查以驗證 症狀是否得到改善(圖5)。從圖5中可以看出，在給予本發明的間質幹細胞或骨髓幹細胞 後，結腸鏡數據顯示潰瘍隨時間得到了顯著改善。 從以上看出，本專利發明人通過臨床試驗證實了利用本發明所述亞組分分離培養
法分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞對治療慢性移植物抗宿主疾病是有效的。 本發明並不限於本文所描述的特定實施例所限定的範圍，實際上，除本文所描述
的實施例之外，本領域的普通技術人員將能夠根據前面的說明和附圖對本發明進行多種改
進是顯而易見的。這些改進也將歸為附屬權利要求的範圍內。下面提供的實施例是用來說
明而並非限制本發明的。 實施例 實施例1-利用亞組分分離培養法分離間質幹細胞或骨髓幹細胞
在對骨髓捐獻者(慢性移植物抗宿主疾病患者治療對象的母親)臀部的一個 區域實施局部麻醉後，通過在髖骨中插入注射針抽取骨髓。將15ml含有20% FBS(胎 牛血清)和1X青黴素/鏈黴素的DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基，GIBCO-BRL， Life-technologies，MD，USA)和2ml來自上述骨髓供者的骨髓提取物加入100mm的培養容
11器中，並在37°C，5% C02的細胞培養箱中培養2小時。培養之後，將培養容器輕微傾斜，以 使得附著在底部的細胞不會脫落，並將培養容器中最大量的上層培養液移至一個新的容器 中。 再次重複相同操作後，將取出的培養液移入一個培養容器中(Becton Dickinson)
並在37t:培養2小時。再次將培養液移入一個新的容器，24小時後移入另一個新的容器，
並在24小時後再次移入一個新的容器。最後，48小時後，目測判定移入新容器後被保留下
來的細胞在培養容器底部附著並生長。可以推斷，能夠經歷多次分層分離進入這一階段的
細胞是那些比其他細胞小的細胞。再經過大約3到5個小時，這些細胞會形成單克隆。用
胰蛋白酶處理單克隆，分離，然後以每孔102至6 X 102的細胞數將細胞轉移到一個6孔培養
容器中。在37°〇，5% C02的細胞培養箱中培養4到5天後，當其生長至80%時，用0.25%
胰蛋白酶/lmM EDTA(GIBCO-BRL)進行處理，收集細胞後，移入一個75cm2的培養容器中繼
代培養。至此獲得了上述單克隆起源的細胞系並將其命名為cMSC-15。 通過顯微鏡觀察上述細胞的形狀的結果是，可以看到起始階段的細胞形狀與成纖
維細胞類似，直至繼代培養的第5代(stage)細胞均未發現形狀的顯著改變。觀察發現細
胞倍增所需的時間為24-36小時，與成纖維細胞無明顯差異。 實施例2-分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞的鑑定 實施例2. 1-利用流式細胞儀分析間質幹細胞或骨髓幹細胞特徵 為了驗證利用上述實施例1中的方法從骨髓中分離的cMSC-15是否是間質幹細胞
或骨髓幹細胞，利用流式細胞儀(BDBiosciences)觀察是否存在具有幹細胞特徵的細胞表
面抗原。 將幹細胞在75cm2培養容器中繼代培養6到7天後，用0. 25%胰蛋白酶處理，並收 集細胞。細胞用1XPBS/0.4XBSA洗滌2次，以除去胰蛋白酶和培養液。用離心分離法收 集細胞並測量細胞數後，將lX10e細胞收集在一個1.5ml管中，並用山羊血清(Vector)在 室溫下封閉1小時。封閉完成後，用1XPBS/0. 4% BSA將細胞洗滌2次，並用分別連接抗 CD14、 CD29、 CD31、 CD34、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105、 CD106、 CD119、 CD133、 CD166、 HLA-DR、第 1類HLA和STR0-1抗體(Serotec Ltd，Kidington， 0X，UK)的藻紅蛋白(PE)進行處理，4。C 反應40分鐘。細胞用1 X PBS/0. 4 % BSA洗滌2次後，懸浮於0. 5ml 1 X PBS/0. 4 % BSA中， 置於流式細胞儀中並進行分析。 CD29(其為一種間質幹細胞的特異性整合素抗原)，以及CD44和CD105(它們為 間質幹細胞的特異性基質受體抗原)均顯示為陽性反應。CD90、 CD166、和第1類HLA細胞 表面抗原均表達，而CD106、 CD119、以及HLA-DR細胞表面抗原均不表達。除此之外，CD31、 CD133、和STR0-1的表達水平顯示為弱陽性(圖2)。這些細胞表面抗原在經歷了 6次繼代 培養的細胞中仍能維持表達。這表明所分離的細胞，即使經過繼代培養，其間質幹細胞的特 異性抗原也將會持續表達。 實施例2. 2-與間質幹細胞免疫抑制相關的細胞因子分泌情況的分析 為了尋找更多利用本發明中所述亞組分分離培養法分離的間質幹細胞的特徵，本
專利發明人分析了與免疫抑制相關的細胞因子的表達水平。 特別地，在對取自同一骨髓捐獻者並利用現有的密度梯度離心法分離的間質幹細 胞或骨髓幹細胞(對照組)以及本發明中利用上述實施例1中描述的方法分離的cMSC-15進行培養後，利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分析了培養液中分泌的TGF-P和IL-10的表 達量。為了進行精確的分析，對上述兩種細胞系進行無血清培養，且上述兩個ELISA檢測均 採用R&D系統(USA)的試劑盒，並按照製造商的說明書操作。 分析結果顯示，儘管TGF-P (的表達)與對照組差異極小，但對於IL-IO，利用亞組 分分離培養法獲得的cMSC-15與對照組相比，顯示出5倍以上的增加表達量(圖3)。這表 明，在移植物抗宿主疾病的治療功效與間質幹細胞或骨髓幹細胞的IL-10表達水平之間存 在關聯。 實施例3-所分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞的臨床應用
實施例3. 1-間質幹細胞或骨髓幹細胞的給藥 患者是一名被診斷為患有急性髓細胞白血病的18歲女性，在通過誘導治療達到
緩解後，接受了同種異體的骨髓移植。在六個月的免疫抑制劑給藥中斷後一個月，出現了慢 性移植物抗宿主疾病，儘管利用環孢黴素A(CsA)、麥考酚酸嗎乙酯(匪F)、和甾類化合物進 行了治療，但由於持續的便血、膽紅素增加、及皮膚、口和眼睛乾燥，患者的情況惡化，並且 由於治療副作用和BK病毒(由於BK病毒的感染，在尿液及血液中均檢測到了BK病毒)引 起的巨細胞病毒活化，因此開始使用西多福韋進行治療。在收到韓國食品藥品監督管理局 發出的緊急臨床許可後，將按照實施例1中描述的方法分離得到的患者母親的間質幹細胞 或骨髓幹細胞在GMP裝置中培養，並採用靜脈內注射給予患者。在給藥期間及之後沒有觀 察到不良/負面反應，且患者的症狀在第1次給藥後出現緩慢改善，3周後以與第1次相同 的劑量進行第2次給藥。後來，患者症狀得到了顯著改善，並且，在第2次給藥的34天後， 在停止服用甾類化合物而僅服用1. 5g/天的作為免疫抑制劑的匪F的情況下，患者出院。
實施例3. 2-治療後疾病指徵的改變 為了驗證利用本發明中的亞組分分離培養法分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞是 否具有療效，本專利發明人檢測了排便量及作為主要指徵的血液中鹼性磷酸酶活性(圖 4)。血液中鹼性磷酸酶的活化利用商品化試劑盒(Sigma Chemical Company,USA)來實現。
結果顯示，作為慢性移植物抗宿主疾病的一個主要指徵的排便量顯著減少，且作 為血清學指標的血液鹼性磷酸酶活性也回落到了正常水平(60-220ng/ml)。此外，還進行了 結腸鏡檢查以驗證症狀是否得到改善(圖5)。結果顯示，在給予間質幹細胞或骨髓幹細胞 後三個月後，結腸鏡檢查認為潰瘍得到了顯著改善。正如所描述的，本專利發明人已通過臨 床試驗證實了利用本發明的亞組分分離培養法分離的間質幹細胞或骨髓幹細胞對治療慢 性移植物抗宿主疾病是有效的。 本發明涉及包括作為活性成分的間質幹細胞或骨髓幹細胞的用於治療急性或慢 性移植物抗宿主疾病的治療劑，本發明的治療劑可以非常有效的治療那些極難治療的移植 物抗宿主疾病，尤其是作為骨髓移植術後作為副作用的頻繁發生的致死性急性或慢性移植 物抗宿主疾病。 本文所引用的參考資料的全部內容均結合於此供參考。
氺氺氺氺氺 本領域的普通技術人員僅利用常規實驗即能夠識別或者能夠確定多種本發明中 特別闡述的特定實施方式的等同替代方式。這些等同替代方式也將包含在權利要求的範圍 內。
1權利要求
一種抑制已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內的供者骨髓T細胞活性的方法，包括給予需要該治療的受治療者治療有效劑量的同種克隆性骨髓幹細胞群。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，每次給藥的幹細胞劑量在1 X 104細胞/kg體重 至lXl8細胞/kg體重之間。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述幹細胞利用亞組分分離培養法進行分離。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述幹細胞表達CD29、 CD44、和CD105細胞表面 抗原，但不表達HLA-DR細胞表面抗原。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述幹細胞表達CD29、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105 和CD166細胞表面抗原，但不表達CD106、 CD119或HLA-DR細胞表面抗原。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述同種克隆性骨髓幹細胞分泌至少約5ng/ml濃度的白細胞介素-io。
7. —種治療已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內移植物抗宿主疾病症狀的 方法，包括給予需要該治療的受治療者治療有效劑量的同種克隆性骨髓幹細胞群。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述移植物抗宿主疾病的症狀為胃腸道症狀、皮 膚硬化、經口進食受限、眼乾、肝症狀、呼吸短促，或者上肢或下肢緊縮感。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中，所述胃腸道症狀為增加的每日排便量。
10. 根據權利要求8所述的方法，其中，所述胃腸道症狀為結腸發炎。
11. 根據權利要求8所述的方法，其中，所述肝症狀為血清中鹼性磷酸酶水平升高。
12. —種抑制已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內的供者骨髓T細胞活性的 方法，包含(A) 處理骨髓細胞的生物學樣品，包括(i) 將所述細胞樣品接種於容器中；(ii) 將上清液從所述容器轉移至另一容器；以及(iii) 從所述上清液中分離該樣品中具有相對較低密度的細胞，以獲得同種克隆性骨 髓幹細胞群；以及(B) 給予需要該治療的受治療者治療有效劑量的從(A)中獲得的同種克隆性骨髓幹細 胞群。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中，所述容器用塗層進行處理。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中，所述塗層為膠原、多聚賴氨酸、纖維蛋白原或 明膠。
15. —種在已確認患有移植物抗宿主疾病的受治療者體內治療移植物抗宿主疾病症狀 的方法，包含(A) 處理骨髓細胞的生物學樣品，包括(i) 將所述細胞樣品接種於容器中；(ii) 將上清液從所述容器轉移至另一容器；以及(iii) 從所述上清液中分離該樣品中具有相對較低密度的細胞，以獲得同種克隆性骨 髓幹細胞群；以及(B) 給予需要該治療的受治療者治療有效劑量的從(A)中獲得的同種克隆性骨髓幹細 胞群。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述細胞的劑量在1 X 104細胞/kg至1 X 108 細胞/kg之間。
17. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述細胞表達CD29、 CD44和CD105細胞表面 抗原，但不表達HLA-DR細胞表面抗原。
18. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述細胞表達CD29、 CD44、 CD73、 CD90、 CD105 和CD166細胞表面抗原，但不表達CD106、 CD119或HLA-DR細胞表面抗原。
19. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述細胞群分泌至少約5ng/ml濃度的白細胞介素-io。
20. —種用於治療急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑，包含作為活性成分的同種 克隆性骨髓幹細胞群。
21. 根據權利要求20所述的治療劑，其是利用亞組分分離培養法來分離的。
22. 根據權利要求20所述的治療劑，其中，所述細胞表達CD29、 CD44和CD105細胞表 面抗原，但不表達HLA-DR細胞表面抗原。
23. 根據權利要求20所述的治療劑，其中，所述細胞表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和CD166細胞表面抗原，但不表達CD106、 CD119或HLA-DR細胞表面抗原。
24. 根據權利要求20所述的治療劑，其中，所述細胞分泌至少約5ng/ml濃度的白細胞 介素-10(IL-10)。
25. 根據權利要求20所述的治療劑，其中，所述細胞比利用密度梯度離心法分離的細 胞分泌大至少約5倍量的IL-IO。
26. —種同種克隆性骨髓幹細胞群，其比利用密度梯度離心法分離的細胞表達大至少 約5倍量的IL-IO。
27. —種同種克隆性骨髓幹細胞群，其比利用密度梯度離心法分離的細胞表達大至少 約5倍量的IL-10，其中所述同種克隆性骨髓幹細胞群是通過下述方法獲得的(i) 將骨髓細胞樣品接種於容器中；(ii) 將上清液從所述容器轉移至另一容器；以及(iii) 從所述上清液中分離所述樣品中具有相對較低密度的細胞。
28. 根據權利要求27所述的同種克隆性骨髓幹細胞群，其中，所述骨髓細胞在37t:培 養約1到3小時，然後在37t:重複培養2到3次，約12到36小時，接著在37。C培養約24 到72小時，且每次培養將上部的培養上清液轉移入一個新的培養容器中。
29. 根據權利要求27所述的同種克隆性骨髓幹細胞群，其中，所述容器用塗層進行處理。
30. 根據權利要求29所述的同種克隆性骨髓幹細胞群，其中，所述塗層為膠原、多聚賴 氨酸、纖維蛋白原或明膠。
31. 根據權利要求28所述的治療劑，其中，所述重複孵育進行約4到5次。
全文摘要
本申請涉及一種利用克隆性骨髓幹細胞(cMSCs)作為活性成分來治療急性或慢性移植物抗宿主疾病的治療劑。
文檔編號A61K35/28GK101754767SQ200880100116
公開日2010年6月23日 申請日期2008年5月27日 優先權日2007年5月25日
發明者宋淳旭, 李文熙, 金喆守 申請人:同種療法有限公司