表現出內皮細胞特異性的啟動子和使用其調節血管生成的方法

2023-05-31 17:01:26

專利名稱：：表現出內皮細胞特異性的啟動子和使用其調節血管生成的方法
技術領域：
：和背景本發明涉及可用於在受試者的特定組織區域中調節血管生成的核酸構建體、藥物組合物和方法。更具體地講，本發明涉及表現出內皮細胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列及其使用方法，再更具體地講，涉及在內皮細胞中表現出增加的活性和特異性的修飾型前內皮素原-1(PPE-1)啟動子以及核酸構建體，它們可用於在特定細胞亞型中激活細胞毒性，由此使得能治療特徵在於異常新血管形成或細胞生長的疾病，或者可用於誘導新血管生長，由此使得能治療局部缺血疾病。本發明進一步涉及PPE啟動子的修飾，所述修飾增強其響應於包括低氧和血管生成在內的生理條件的表達，並涉及新血管生成內皮特異性聯合療法。血管生成指新血管的生長，這是一個主要依賴於毛細血管內皮細胞的運動、增殖和管形成的過程。在血管生成期間，內皮細胞從其靜息狀態擺脫並迅速增殖。儘管尚不知曉負責將細胞轉變成血管生成表型的分子機制，但導致形成新血管的事件次序已有充分的文件記載[Hanahan,D.:Science277,48-50,(1997)]。血管生長需要內皮萌芽[Risau,W.,Nature386,671-674,(1997)]或套疊[Patan,S.等;Microvasc.Res.51,260-272,(1996)]。在第一條途徑中，可發生以下順序的事件(a)血管基底(通常是毛細血管後小靜脈)和間質基質溶解；(b)內皮細胞向刺激物遷移；(c)尾隨前導內皮細胞之後的內皮細胞增殖；(d)在內皮索(army)/芽中形成腔(成管)；(e)通過芽的匯合性吻合形成分支和迴路，以允許血液流動；(f)周細胞(即內皮周細胞和平滑肌細胞)包一皮血管；和(g)在不成熟血管周圍形成基底膜。新血管還可經第二條途徑形成將間質組織柱插入預先存在的血管的腔中。這些柱隨後的生長及其穩定化導致血管腔分隔和局部血管網絡重建。血管生成在低氧濃度(局部缺血和腫瘤轉移等)條件下發生，且因此在新血管形成中可能是一個重要的環境因素。包括促紅細胞生成素、轉鐵蛋白及其受體、大多數葡萄糖轉運和糖酵解途徑基因、LDH、PDGF-BB、內皮素-1(ET-1)、VEGF和VEGF受體在內的幾種基因的表達在低氧條件下被低氧誘導型因子(HIF-1)與調節這些基因轉錄的低氧反應元件(HRE)的特異性結合所誘導。這些基因響應低氧條件的表達，使細胞能夠在低氧條件下發揮作用。血管生成過程受到由腫瘤細胞或正常細胞分泌的血管生成生長因子以及胞外基質組合物和內皮酶活性的調節(Nicosia和Ottinetti,1990,Lab.Invest.,63,115)。在血管生成初期，內皮細胞芽通過預先存在的血管基底膜中的間隙露出(Nicosia和Ottinetti,1990,參見上文；Schoefl,1963,VirehousArch,Pathol.Anat.337,97-141;Ausprunk和Folkman,1977,Microvasc.Res.14,53-65;Paku和Paweletz,1991,Lab.Invest.63,334-346)。當新血管生成時，它們的基底膜經歷複雜的結構和組成變化，這些變化被認為影響血管生成反應(Nicosia等，1994,ExpBiology.164,197-206)。A^^成弄病邏夢有多種血管生成因子掌控血管生成過程。據了解，在病變期間，促血管生成因子和抗血管生成因子之間的精密平衡被破壞，由此引起非自限性的內皮細胞和內皮周細胞增殖。儘管在正常條件下血管生成是高度受調節的過程，但許多疾病(特徵為"血管生成性疾病")由持續不受調節的血管生成引起。在這樣的病狀中，不受調節的血管生成或者可直接引起特定疾病，或者可使現有的病理狀況惡化。例如，眼新血管形成已被指是失明的最主要病因，且是大約20種眼病的病理學基礎。在某些預先存在的狀況如關節炎中，新形成的毛細血管侵入關節並破壞軟骨。在糖尿病中，在視網膜中形成的新毛細血管侵入玻璃體液，從而引起出血和失明。直到最近，對在眼新血管形成疾病、關節炎、皮膚病和腫瘤中出現的血管生成仍難以在治療上進行抑制。不平衡的血管生成以各種病理狀況為典型特徵，且通常支持病理狀態的演進。例如，在實體瘤中，血管內皮細胞以快達正常組織中的那些糹田月包約354咅的速度分裂(Denekamp禾口Hobson,1982Br.J.Cancer46:711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長和轉移所必需的(Folkman,1986CancerRes.46:467-73)。血管內皮細胞增殖在慢性炎症疾病例如類風溼性關節炎、牛皮痺和滑膜炎中也是重要的，其中這些細胞響應於在炎症部位中釋放的生長因子而增殖(Brown和Weiss,1988,Ann.Rheum.Dis.47:881-5)。在動脈粥樣硬化中，血管中內皮細胞的單克隆擴增觸發動脈粥樣硬化斑塊的形成(Alpem-Elran1989,J.Neurosurg.70:942-5)。此外，在糖尿病性視網膜病中，失明被認為是由眼內基底膜變化所引起的，目艮內基底膜的變化刺激不受控的血管生成和視網膜消耗(West和Kumar,1988,Lancet1:715-6)。內皮細胞還參與移植排斥。在同種異體移植物排斥發作中，內皮細胞表達促粘附決定簇，其指導白細胞運輸到移植部位。據認為，白細胞誘導，正如已知在炎性損害中所發生的。口、、'''另一方面，消除的血管生成在疾病發展例如動脈粥樣硬化誘發的冠狀動脈阻塞(如心紋痛)、意外損傷或外科手術後的壞死損害、或胃腸損害如潰瘍中也是一個主要因素。因此，調節或改變血管生成過程在限制該過程促成潛在病狀的病理演進方面以及提供研究其病因學的有價值方法方面可具有重要的治療作用。最近，面已取得顯著進步。例如，施用在置於成年大鼠腹膜腔中的、膠原蛋白包被基質內的PFGF蛋白，導致產生充分血管形成並正常灌注的結構(Thompson等，PNAS86:7928-7932,1989)。據報導，將pFGF蛋白注射到冠狀動脈閉塞期間的成年犬冠狀動脈中，導致心肌功能障礙減輕、心肌梗塞縮小和血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，Science257:1401-1403,1992)。業已才艮道在心肌局部缺血動物;漢型中使用(3FGF蛋白獲得了相似結果(Harada等，JClinInvest94:623-630,1994,Unger等，AmJPhysiol266:H1588-H1595,1994)。然而，對於長期功能性血管的大量形成，需要重複或長期遞送上述蛋白因子，從而限制了它們在臨床情形中的應用。此外，除與血管生成調節因子生產相關的高成本之外，這些因子的有效遞送需要使用待置入冠狀動脈內的導管，從而進一步增加了治療的費用和難度。因此，所有抗血管生成治療的基本目標都是使增殖微血管的病灶回復到其正常靜息狀態，並阻止其再生長[Cancer:Principles&PracticeofOncology,第五版，VincentT.DeVita,Jr.,SamuelHellman,StevenA.Rosenberg編輯，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia.(1997)]。同樣,促血管生成治療不僅涉及恢復所需要的血管生成因子，而且涉及重建它們之間的正確平衡(Dor等，AnnNYAcadSci2003;995:208-16)(關於促血管生成治療和抗血管生成治療的詳盡綜述參見Zhang等，ActaBiochandBiophysCinica,2003:35:873-880，和Mariani等，MedGenMed2003,5:22;和Folkman,Semin.One2002,29:15-18)。鑑於抗血管生成治療可延緩腫瘤生長演進(例如視網膜病、良性的和惡性的血管生成性腫瘤)，其是強有力的臨床方法。一般來說，每一種由不受控毛細血管生長引起的疾病，如糖尿病性視網膜病、牛皮癬、關節炎、血管瘤、肺瘤生長和轉移，都是抗血管生長治療的標靶。例如，超過臨床上潛伏大小(例如幾mm勺的實體瘤的進行性生長需要連續的新血管生成，即已知為胂瘤血管生成的過程。肺瘤生長和轉移是血管生成依賴性的。肺瘤必須連續地刺激新毛細血管的生長，以遞送營養和氧供腫瘤自身生長。因此，抗血管生成腫瘤治療的基礎在於阻止帛最近，已^發出過多抗血管生成劑來治療惡性疾病，其中口一些已處於臨床試驗中(關於綜述，參見Herbst等(2002)Semin.Oncol.29:66-77,和Mariani等，MedGenMed2003;5:22)。研究的大部分腫瘤抗血管生成治療標靶是在人中調節血管生成的主導過程，即血管內皮生長因子(VEGF)與其受體(VEGFR)的相互作用。調節VEGFR的促血管生成作用的試劑包括(i)針對VEGF蛋白本身或其受體的抗體(例如rhuMAbVEGF,阿瓦斯丁(Avastin));(ii)針對VEGFR酪氨酸激酶的小分子化合物(例如，ZD6474和SU5416);(iii)耙向VEGFR的核酶。其它新的血管生成抑制劑包括具有獨特的抗腫瘤和抗血管生成特性的雌二醇的天然代謝物2-曱氧雌二醇(2-ME2),以及分別為纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的蛋白酶剪切片段的制管張素和內皮抑制素。儘管在臨床前模型中有前景，但迄今為止在臨床試驗測試的所有抗血管生成劑的全身施用都顯示出有限的成功率和相當大的毒性，包括血小板減少症、白細胞減少和咯血。這些結果提示，目前的肺瘤抗血管生成劑作為晚期惡性腫瘤療法的用途可能有限。O'Reilly等已經表明，在抗血管生成治療開始至抗肺瘤作用出現之間的潛伏期可能導致在對治療起反應之前的初期胂瘤演進[O'ReillyS等，(1998)ProcAmSocClinOncoll7:217a]。而且，最近的研究提示，毛細血管床之間的血管生成調節可能不同，從而提示抗血管生成治療可能需要基於器官/組織特異性來最優化[Arap等(1998)Science279:377-380]。有趣的是，當對冠狀動脈病患者的心肌局部缺血實施針對平滑肌細胞增殖的抗血管生成療法(例如肝素、肝素-肽治療)時，獲得的效果也不理想[Liu等，Circulation,79:1374-1387(1989);Goldman等，Atherosclerosis,65:215-225(1987);Wolinsky等，JACC,15(2):475-481(1990)]。與利用這些試劑治療心血管疾病有關的各種限制包括(i)對心血管疾病患者產生不可耐受的風險水平的全身毒性；(ii)妨礙外科手術後的血管傷口癒合；(iii)可能損害周圍的內皮和/或其它中間平滑肌細胞。因此，這些以及其它與全身施用抗血管生成因子相關的固有障礙(即基於所需體外不穩定性和高劑量的製造限制；和歸咎於次最佳效應的單次快速靜脈施用的峰動力學)限制了血管生成因子在新血管形成相關疾病治療中的有效使用。^/f辨症#成治#在原發性腫瘤以及轉移中的腫瘤細胞增殖由於營養供應受限導致凋亡速率增加而被抵消。只要發生"血管生成轉變，，和營養供應對肺瘤大小足夠，休眠的原發性或轉移性胂瘤就開始發展成轉移。血管生成轉變可經幾種機制發生1.通過癌基因上調促血管生成基因，例如VEGF和bFGF,或下調血管抑制物(angio-suppressor),例^口血小一反反應蛋白。2.通過腫瘤相關的低氧條件活化低氧誘導型因子-1(HIF-1)。3.腫瘤細胞誘導的腫瘤床成纖維細胞的促血管生成蛋白分泌。4.骨髓內皮先祖(progenitor)運輸入腫瘤。tableseeoriginaldocumentpage20.血管內皮生長因子(VEGF)成纖維細胞生長因子1(FGF1)*成纖維細胞生長因子2(FGF2)*血'J、板衍生生長因子(PDGF)，促血管生成素2*.促血管生成素1**轉化生長因子-P*(TGF-P).月中瘤壞死因子-o^(TNF-oc)*白細胞介素-8(IL-8)血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)'肝細胞生長因子(HGF)*劑量依賴性**弱血管生成活化劑P53血小板反應蛋白-l**血小板反應蛋白-2*組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)，制管張素，內皮抑制素*抗血管生成抗凝血酶III.血管生成抑制性C-X-C趨化因子(PF4、IP-IO、MIG)色素內皮衍生因子(PEDF).白細胞介素-12(IL-12)'幹擾素(INF)-a(3y血管生成的活化劑和抑制劑(參見上文的表1)之間的相對平衡對將腫瘤保持在靜息狀態是重要的。降低抑制劑水平或增加活化劑水平改變了平tf,且導致胂瘤血管生成和腫瘤生長。當腫瘤組織距最近血管的厚度超過150-200jum時，向肺瘤組織的氧擴散是不夠的。所以，根據定義，超過這些尺寸的所有腫瘤已經打開血管生成。腫瘤細胞增殖率與血管供應無關。但是，血管生成轉變一發生，凋亡速率就降低達1/3-1/4(24)。而且，營養供應和分解代謝物釋放並不是血管生成性血管對肺瘤凋亡減退的唯一影響因素。微血管系統內皮細胞還分泌進一步抑制肺瘤細胞凋亡的抗凋亡因子、促分裂原和存活因子，例如b-FGF、HB-EGF、IL-6、G國CSF、IGF誦1和PDGF。腫瘤細胞由於高突變率而在遺傳上不穩定，這為它們提供了超越天然細胞的優勢。例如，p53基因中的突變抑制凋亡率。而且，促血管生成或血管生成抑制劑控制的癌基因改變(例如ras癌基因)可誘導血管生成轉變。但是，高突變率不是癌症遺傳不穩定性的唯一機制。有證據表明胂瘤細胞吞噬"凋亡體"，從而導致非整倍性和遺傳不穩定性的進一步增加。總而言之，癌症依賴於血管生成。由於遺傳不穩定性，癌症可配合促血管生成細胞因子平衡，該平衡抑制其凋亡率並可實現轉移接種。人脈管系統包含一兆(trillion)以上的內皮細胞。正常靜息內皮細胞的壽命超過1000天。儘管參與腫瘤發展的血管生成內皮細胞迅速增殖，但它們因其基因組穩定性、及由此產生的最小的藥物抗性和發展出突變克隆的低可能性而與肺瘤細胞不同。而且，因為腫瘤發展的限速因素是血管生成，所以針對血管生成性內皮細胞的治療能產生高效治療模式。實際上，幾種抗血管生成物質可用作全身治療的潛在候選物。但是，由於這些試劑是蛋白，且其施用因此有賴於頻繁的靜脈內施用，其應用提出了嚴重的生產和保持難題。遞送抗血管生成基因為持續的蛋白分泌提供了潛在的解決方法。隨著調節血管生成過程的新基因的鑑定，人們一直試圖採用體基因治療來突破這些限制。雖然投入了很大的努力致力於開發癌症、心血管和外周血管疾病的基因治療方法，但有效且特異性的基因遞送仍存在很大障礙[關於綜述參見FeldmanAL.(2000)Cancer89(6):1181-94]。通常使用重組病毒載體作為穿梭載體、利用目標基因進行基因治療的主要限制因素是將目標基因特異性地導向靶組織的能力。克服這些限制的努力包括使用綴合至細胞毒性基因的組織特異性啟動子。例如，Jagger等已描述了處於內皮特異性啟動子控制下表達的細胞毒性基因耙向內皮細胞，他們利用KDR或E-選衝奪蛋白啟動子以在內皮細胞中特異性地表達TNFot[JaggarRT.等HumGeneTher(1997)8(18):2239-47]。Ozaki等用von-Willebrand因子(vWF)啟動子將單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-tk)遞送到HUVEC[HumGeneTher(1996)7(13》1483-90]。但是，這些啟動子僅僅顯示出微弱的活性，並且不允許高水平表達。[Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92:7567-571]分離出可賦予組織特異性體內表達的人vonWillebrand因子基因的5'和3'調節序列。然而，這些序列僅可介導一種不均一形式的報告轉基因表達。在轉基因小鼠中處於vonWillebrand調節元件調節之下的細菌LacZ報告基因揭示出在卵黃嚢和成體腦中的內皮細胞亞群中的轉基因表達。然而，在脾、肺、肝、腎、心臟、睪丸和主動脈的血管床中以及在血栓調節蛋白基因座中沒有檢測到表達。KorhonenJ等[Blood(1995)96:1828-35]分離出促進轉基因在小鼠胚胎的整個血管系統中均勻表達的人和小鼠TIE基因啟動子。然而，在成體中的表達局限於肺和腎的血管，而在心臟、腦和肝中沒有檢測到表達。SchlaegerM等獲得了相似的結果，他們分離出TIE-2啟動子的1.2kb5'側翼區，並且表明轉基因表達限於胚胎小鼠的內皮細胞[SchlaegerTM等，(1995)Development121:1089-1098]。因此，這些序列中沒有一個在所有發育階段或成年動物的所有內皮細胞中均一地起作用。此外，這些序列中的一些序列並不局限於內皮。由Kong和Crystal提出了一種替代方法，該方法包括抗血管生成因子的腫瘤特異性表達。然而，迄今為止，儘管在臨床前模型中一些合成的抗血管生成劑與毒性相關，但重組體形式的內源抗血管生成劑的毒性還沒有被證實[Kong和Crystal(1998)J.Natl.CancerInst.90:273-76]。制管張素也已被用作可能的抗血管生成劑(Folkman等，Cell1997Jan24;88(2):277-85),^a由於腫瘤中涉及血管生成調節的因子過多，所以單獨的制管張素治療應非常難以奏效。迄今為止，有前景的臨床實驗已表明，像Avastin⑧或Bay-43906的抗血管生成治療可通過限制腫瘤周圍血管的新生長而減慢轉移進展。但是，在其中需要顯著的抗血管生成作用來破壞大部分或全部現有血管生成性血管並誘導腫瘤壞死的癌症病理學中，抑制新血管生成和/或部分地石皮壞它們可能不足夠。廣屍屍五-/)^動子Masaki等在1988年發現的內皮素(ET)由ET-1、ET-2和ET-3這3個基因組成。內皮素-1(ET-1)為21個胺基酸的肽，首先被描述為有效的血管收縮劑和平滑肌細胞促分裂原，由內皮細胞合成。ET-1在血管內皮中表達，儘管在其它細胞如平滑肌細胞、呼吸道和胃腸上皮、神經元和腎小球繫膜細胞中也有一些表達。其表達在各種病理生理狀況下被誘導，例如^氐氧、心血管疾病、炎症、哮喘、糖尿病和癌症。內皮素-l觸發血管生成因子如VEGF和PDGF的生產並與其相互作用，且因此在血管生成過程中起作用。Hu等鑑別出位於內皮素-l啟動子反義鏈上的低氧反應元件(HRE)。該元件是低氧誘導型因子-1結合位點，是低氧正調節(人、大鼠和鼠基因的)內皮素-l啟動子所必需的。低氧是有效信號，誘導幾種基因表達，包括促紅細胞生成素(Epo)、VEGF和各種糖酵解酶。核心序列(8個鹼基對)在響應於低氧條件的所有基因中都是保守的，且側翼區與其它基因不同。ET-1^氐氧反應元件位於GATA-2和AP-1結合位點之間。Bu等在鼠PPE-l啟動子(mET-l)中鑑別出複雜的調節區，其似乎賦予內皮細胞特異性轉錄活性，並結合局限於內皮細胞的蛋白或蛋白複合物。該區域稱為內皮特異性正轉錄元件，由位於鼠PPE-l啟動子的-364bp至-320bp之間的至少3個功能元件組成。全部3個元件都是完整活性所必需的。當將一個或三個拷貝構建入最小mET-l啟動子中時，內皮細胞中的體外報告基因表達相比於無元件的最小啟動子增加至2-10倍。美國專利5,747,340講述了鼠PPE-1啟動子及其部分的應用。然而，該專利既沒有暗示也沒有證明內皮特異性增強子可用於增加用PPE啟動子實現的表達水平而同時保留內皮特異性。此外，該專利也沒有講述在低氧條件下PPE-1啟動子被誘導至較高的轉錄水平。差^措導^躇#秀治^TGDE屍7V.-該策略也稱為"自殺基因治療"。其包括將惰性前藥在癌細胞中轉變為活性細胞毒性試劑。在GDEPT中最廣泛使用的兩種基因是偶聯更昔洛韋(GCV)施用的單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)和偶聯5-氟胞嘧啶(5FC)施用的大腸桿菌(E.coli)胞嘧啶脫氨酶(CD)。HSV-TK/GCV系統已經歷了廣泛的臨床前評價以及臨床實驗。迄今為止，HSV-TK/GCV系統已表現出不顯著的副作用，例如發熱、GCV全身毒性、骨髓抑制和輕至中度肝毒性。HSV-TK/GCV系統首先由Kmiselburd等在1976年描述。用含HSV-TK的質粒轉染的細胞或用含HSV-TK的載體轉導的細胞對包括阿昔洛韋、更昔洛韋(GCV)、伐昔洛韋和泛昔洛韋在內的藥物超家族正變得敏感起來。鳥苷類似物GCV在基因療法的配置中是最有效的藥物。HSV-TK陽性細胞產生病毒TK，其將GCV磷酸化成單磷酸GCV(GCV-MP)的效力為人TK的3個數量級高。GCV-MP隨後由天然胸苷激酶磷酸化為二磷酸GCV,且最後磷酸化為三磷酸GCV(GCV-TP)。GCV-TP是有效的DNA聚合酶抑制劑，其通過摻入新生鏈導致DNA合成終止，從而終止DNA延伸並最終引起細胞死亡。因為GCV主要影響HSV-TK陽性細胞，所以其副作用最小且罕有，且主要包括血小板減少症、嗜中性白細胞減少症和中毒性腎損害。而且，因為GCV毒性基於DNA合成，所以其主要影響增殖細胞。HSV-TK/GCV系統近來已廣泛用於癌基因治療的臨床實驗。不過，結果令人失望，主要受限於體內低轉導百分率。近期研究已表徵了HSV-TK/GCV細胞的細胞毒性機制。他們揭示細胞周期由於G2-MDNA損傷檢查點的活化而停滯於S晚期或G2期。發現這些事件導致不可逆的細胞死亡以及與細力包死亡相關的旁^見者效應。極度的細胞增大在施用HSV-TK/GCV系統的細胞中是公知的形態學變化。這些形態學變化歸因於特異性細胞骨架重排。應激肌動蛋白纖維和粗中間絲網出現在細胞周期停滯之後。HSV-TK/GCV系統使用稱為"旁觀者效應"的放大潛力。旁觀者效應代表了HSV-TK陽性細胞藉助其誘導HSV-TK陰性細胞殺傷的現象。f麂,妓^:旁觀者效應首先由Moolten等描述，他們發現HSV-TK陽性細胞和HSV-TK陰性細胞分別為1:9的混合物在加入GCV之後導致完全的細胞殺傷。業已描述了旁觀者效應的幾種特徵1.發現旁觀者效應高度依賴於細胞-細胞接觸。2.其程度在不同細胞類型中不同。3.其不限於同質細胞類型，也不限於不同細胞類型的混合物。4.發現較高水平的HSV-TK表達與較高的旁觀者效應相關聯。Culver等首先在體內才莫型中證實了旁觀者效應。他們證實當以不同比率植入HSV-TK陽性腫瘤細胞時腫瘤消退。與體外模型不同，未發現細胞-細胞接觸是體內旁觀者效應必需的。Kianmanesh等通過在不同的肝葉中植入其中僅有一些為HSV-TK陽性的肺瘤細胞證實了遠距離旁觀者效應。HSV-TK陽性和陰性病灶都消退。還在不同來源的細胞之間體內證實了旁觀者效應。總而言之，當在基因遞送系統中實施時，HSV-TK及其旁觀者效應利於肺瘤抑制的有效手段。但是，迄今為止，臨床研究僅證實了有限的結果。因此，對於獲得高度特異性的、可靠的血管生成特異性啟動子和核酸構建體，從而在受試者的特定組織區域中提供有效調節血管生成的新方法，同時避免毒性副作用和表徵現有技術抗血管生成方法的有限成功，存在著廣泛認可的需求，並且將是高度有利的。發明概述按照本發明的一個方面，提供含順式調節元件的分離多核苷酸，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，所述分離的多核苷酸能夠在真核細胞中指導在轉錄上與其連接的多核普酸序列的轉錄。還提供含該分離多核普酸的核酸構建體、含本發明的核酸構建體的細胞以及接種了所述細胞的支架。按照所述優選實施方案的其它特徵，提供還含有處於順式調節元件的調節控制之下的核酸序列的核酸構建體。所述核酸序列還可編碼血管生成調節物。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述核酸序列選自VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述支架由合成聚合物、細胞粘附分子或胞外基質蛋白組成。按照所述優選實施方案的其它特徵，合成聚合物選自聚乙二醇(PEG)、羥基磷灰石(HA)、聚乙醇酸(PGA)、用編織聚-l-交酯加固的s-己內酯和1-乳酸[KN-PCLA]、織物(WV-PCLA)、互連多孔羥基磷灰石《丐陶瓷(IP-CHA)、聚D,L-乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、不飽和聚酯(丙二醇-富馬酸)共聚物(PPF)、交酯-乙交酯共聚物(PLAGA)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)和聚磷腈。按照所述優選實施方案的其它特徵，細胞粘附分子選自整聯蛋白、細胞間粘附分子(ICAM)l、N-CAM、4丐粘著蛋白、生腱蛋白、gicerin和神經損傷誘導蛋白2(ninjurm2)。按照所述優選實施方案的其它特徵，胞外基質蛋白選自血纖蛋白原、膠原蛋白、纖連蛋白、波形蛋白、微管相關蛋白1D、神經突增生因子(NOF)、細菌纖維素(BC)、層粘連蛋白和明膠。按照本發明的再一方面，提供在真核細胞中表達目標核酸序列的方法，該方法通過向受試者施用包含目標核酸序列的核酸構建體實施，所述目標核酸序列處於順式調節元件轉錄控制之下，所述順式調節元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列。按照本發明的又一方面，提供在組織中調節血管生成的方法，該方法通過在所述組織中表達核酸構建體實施，所述核酸構建體包含(a)內皮細胞特異性啟動子；(b)至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示的低氧反應元件；和(c)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列處於所述啟動子和所述低氧反應元件調節控制之下。按照本發明的另一方面，提供在組織中調節血管生成的方法，所述方法通過在所述組織中表達核酸構建體實施，所述核酸構建體含編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列處於順式調節元件調節控制之下，所述順式調節元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，由此在所述組織中調節血管生成。按照所述優選實施方案中的其它特徵，施用通過選自以下的方法實施全身性體內施用、先體外後體內(avm)施用由受試者機體取出的細胞並將細月包隨後再導入受試者體內；以及局部體內施用。按照所述優選實施方案中的其它特徵，所述組織是天然組織或工程化組織。按照所述優選實施方案中的其它特徵，所述核酸序列編碼促血管生成因子，且調節血管生成為上調血管生成。按照所述優選實施方案中的其它特徵，所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且調節血管生成為下調血管生成。按照本發明的再一方面，提供核酸構建體，其包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苦酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)笫二多核普酸區，其編碼能夠在特定組織或細胞中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件。選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於特定組織或細胞中的配體結合，而所述配體與配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的效應物結構域。還提供用本發明的核酸構建體轉化的真核細胞。按照所述優選實施方案中的其它特徵，所述順式調節元件是選自以PPE-l-3x啟動子、TIE-1啟動子、TIE-2啟動子、內皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動"永羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述配體結合結構域是細胞表面受體的配體結合結構域。細胞表面受體可選自受體酪氨酸激酶、受體絲氨酸激酶、受體蘇氨酸激酶、細胞粘附分子和磷酸酶受體。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述細胞毒性分子選自Fas、TNFR和TRAIL。按照本發明的另一方面，提供在受試者組織中下調血管生成的方法，該方法通過給所述受試者施用核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性。所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核普酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件。選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給血管生成細胞亞群的配體結合，且所述配體與配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的效應物結構域，由此下調所述組織中的血管生成。按照本發明的再一方面，提供在受試者組織中下調血管生成的方法，該方法如下實施(a)在受試者的組織中表達i更計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域，其中選擇所述效應物結構域，從其編;馬在血管生成細胞亞群"中^旨導所口述嵌合多肽表達的順式作用調節元件；和(b)給所述受試者施用配體，由此在所述組織中下調血管生成。按照本發明的又一方面，提供在受試者組織中下調血管生成的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的核酸構建體和藥學上可接受的載體，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性。所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核普酸區，其編碼在血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件，其中選擇能夠結合存在於特定組織或細胞中之配體的配體結合結構域，以使所述配體與所述配體結合結構域的結合活化細胞毒性分子的效應物結構域。按照本發明的再一方面，提供治療與過度新血管形成相關的疾病或狀況的方法。該方法通過施用治療有效量的核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苦酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(ii)第二多核苷酸區，其編碼在血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式作用調節元件；且其中選擇能夠結合存在於或提供給血管生成細胞亞群的配胞毒性分子的效應物結構域，由此在所述組織中下調血管生成，並治療與過度新血管形成相關的疾病或狀況。還提供在受試者中治療肺瘤的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於在腫瘤細胞中產生細胞毒性。按照本發明的另一方面，提供治療與局部缺血相關的疾病或狀況的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生血管生成，由此在所述組織中上調血管生成，且治療與局部缺血相關的疾病或狀況。所述核酸構建體包含(i)編碼促血管生成因子的笫一多核苷酸區；和(ii)第二多核苷酸區，其編碼在血管生成細胞亞群中指導促血管生成因子的表達的順式調節元件。按照所述優選實施方案的其它特徵，與局部缺血相關的疾病或狀況選自傷口癒合、缺血性中風(ischemicstroke)、缺血性心臟病和胃腸損害。按照本發明的再一方面，提供在受試者的組織中下調血管生成的方法，該方法如下實施(a)在所述組織中表達設計並構建用於在血管生成細胞中的細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區；和(ii)第二多核苷酸區，其編碼能夠在血管生成細胞中指導所述自殺基因表達的順式作用調節元件；和(b)給所述受試者施用治療量的前藥，所述量在前藥被自殺基因轉變為毒性化合物時足以造成所述組織的細月包凋亡，由此在所述組織中下調血管生成。按照本發明的又一方面，提供在受試者的組織中下調血管生成的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的核酸構建體和藥學上可接受的載體，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞中產生細胞毒性。所述核酸構建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區，所述自殺基因能夠將前藥轉變為毒性化合物；和(b)第二多核苷酸區，其編碼能夠在血管生成細胞中指導所述自殺基因表達的順式作用調節元件。按照本發明的另一方面，提供核酸構建體，其包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區，所述自殺基因能夠將前藥轉變為毒性化合物；和(b)第二多核苦酸區，其編碼能夠在血管生成細胞中指導所述自殺基因表達的順式調節元件。還提供用本發明的核酸構建體轉化的真核細胞。按照本發明的再一方面，提供在受試者組織中下調血管生成的方法，該方法通過給受試者施用核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於在血管生成細胞中產生細胞毒性。所述核酸構建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區；和(b)第二多核苷酸區，其編碼能夠在血管生成細胞中指導所述自殺基因表達的順式調節元件，其中選擇能夠將前藥轉變為能夠引起細胞毒性作用的毒性化合物的自殺基因，由此下調所述組織中的血管生成。按照本發明的又另一方面，提供治療與過度新血管形成相關的疾病或狀況的方法，該方法通過施用治療有效量的本發明核酸構建體實施，所述核酸構建體設計並構建用於血管生成細胞中的細胞毒性，由此在所述組織中下調血管生成，並治療與過度新血管形成相關的疾病或狀況。按照本發明的另一方面，提供治療受試者中的腫瘤的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構建體實施，所述核酸構建體i殳計並構建用於在肺瘤細胞中產生細胞毒性，所述核酸構建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區；和(ii)編碼能夠在肺瘤細胞中指導所述自殺基因表達的順式作用調節元件的第二多核苷酸區，其中選擇能夠將前藥轉變為能夠在腫瘤細胞中引起細胞毒性作用的毒性化合物的自殺基因。按照本發明的另一方面，提供產品，其包含包裝材料、本發明的核苷酸構建體和至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性，其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述自殺基因選自單純皰滲病毒胸苷激酶、水痘帶狀皰滲病毒胸苷激酶和細菌胞嘧啶脫氨酶。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述前藥選自更昔洛韋、阿昔洛韋、1-5-碘尿嘧啶FIAU、5-氟胞嘧咬、6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷及其衍生物。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述自殺基因是單純皰滲病毒胸苷激酶，且所述前藥是更昔洛韋、阿昔洛韋、FIAU或其衍生物。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述自殺基因是細菌胞嘧啶脫氨酶，且所述前藥是5-氟胞嘧啶或其衍生物。按照所述優選實施方案的其他特徵，所述自殺基因是水痘帶狀皰滲病毒胸普基因，且所述前藥是6-曱氧基噤呤阿糖胞苷或其衍生物。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述方法還包括以聯合形式給受試者施用至少一種額外治療模式，選定的額外治療模式能夠以協同方式進一步增強所述細胞毒性。所述至少一種額外治療模式可選自化學療法、放射療法、光線療法和光動力療法、外科手術、營養療法、切除療法、聯合的放射療法和化學療法、臂療法(brachiotherapy)、質子射束療法、免疫療法、細胞療法和質子射束放射外科手術療法。按照下述本發明優選實施方案的其它特徵，所述核酸序列包含含順式調節元件的分離多核苷酸，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO.'16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，所述分離多核普酸能夠在真核細胞中指導在轉錄上與其連接的多核苷酸序列的轉錄。在所述順式調節元件中，至少部分SEQIDNO:15所示序列可位於至少部分SEQIDNO:16所示序列的上遊，或者至少部分SEQIDNO:16所示序列可位於至少部分SEQIDNO:15所示序列的上遊。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述順式調節元件還包含至少一個拷貝的SEQIDNO:6所示序列，或至少兩個拷貝的SEQIDNO:6。至少兩個拷貝的SEQIDNCh6可為連續的。按照所述優選實施方案的其它特徵，至少部分SEQIDNO:15所示序列經接頭多核苷酸序列共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列。接頭多核苷酸序列可為啟動子和/或增強子元件。按照所述優選實施方案中的其它特徵，所述分離多核苷酸包含至少一個拷貝的SEQIDNO:l所示序列。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述分離多核苷酸還包含低氧反應元件，所述低氧反應元件優選包含至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示序列。按照所迷優選實施方案的其它特徵，所述順式調節元件如SEQIDNO:7所示。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述核酸構建體還包含條件複製型腺病毒。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述順式調節元件是選自以下的內皮細胞特異性啟動子或內皮周細胞特異性啟動子PPE-1啟動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-l啟動子、TIE-2啟動子、內皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-1啟動子、FLT-1啟動子、Egr-1啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述方法另外包含給所述組織或所述受試者施用至少一種選擇的能增加腺病毒的拷貝數和/或增強血管生成調節物的表達的化合物。按照所述優選實施方案的其它特徵，其它化合物是皮質類固醇和/或N-乙醯半胱氨酸。按照所述優選實施方案的其它特徵，所迷方法另外包含給所述組織或所述受試者施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強順式調節元件或內皮特異性啟動子的活性。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述至少一種血管生成調節劑是內皮素受體拮抗劑。所述內皮受體拮抗劑可以是雙重A-形式和B-形式內皮素受體拮抗劑，或B-形式特異性的拮抗劑。按照所述優選實施方案的其它特徵，B-形式特異性的內皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述內皮受體拮抗劑是除波生坦以外的內皮素受體拮抗劑。應當理解，包含順式調節元件、本發明的分離多核普酸的核酸構建體可以用於生產藥物，所述藥物用於治療與內皮細胞中過度或不足的血管生成有關的多種病症、疾病和狀況，例如肺瘤、轉移疾病和局部缺血性疾病。按照所述優選實施方案的其它特徵，所述藥物與選擇的血管生成調節劑聯合應用，該調節劑能以協同方式進一步增強順式調節元件或內皮特異性啟動子的活性，和/或與選擇的至少一種化合物聯合應用，該化合物能增加腺病毒的拷貝數和/或增強血管生成調節物的表達。本發明通過提供含具有新增強子元件的順式調節元件的分離多核苷酸序列及其使用方法，成功解決了目前已知配置的缺點。新增強子元件可用於製備核酸構建體和藥物組合物，它們用於組織特異性地調節轉基因表達以及通過基因療法用於治療多種病症、疾病和狀況。具體地說，本發明的順式調節元件、分離多核苷酸和藥物組合物可連同選定的轉基因一起在內皮細胞中用於特異性地上調和/或下調血管生成，由此治療腫瘤、轉移疾病和局部缺血性疾病。附圖簡述本文僅作為實例參考附圖描述本發明。現在具體地參考附圖的細節，要著重強調的是，所顯示的詳細資料僅僅作為實例以及用於說明性地論述本發明的優選實施方案，並且提供這些詳細資料是為了提供被認為對本發明的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述。在這方面，並未試圖以比基本上理解本發明所必需的更為詳細的方式來顯示本發明的結構細節，連同附圖的說明使本領域技術人員顯而易見如何實際上實施本發明的幾種形式。在附圖中圖la-b是由TNFR1胞外區和Fas的跨膜區和胞內區構建並克隆到pcDNA3質粒(a)中或腺病毒載體(b)中的Fas嵌合體基因的示意圖。圖2a-b說明促凋亡基因-Fas嵌合體和TNFRl的凋亡活性。圖2a—說明用pcDNA-3-TNFRl(下圖)或者對照空載體(上圖)和編碼GFP的表達質粒轉染的牛主動脈內皮細胞(BAEC)。圖2b—說明用pcDNA-3-Fas-c(下圖)或者對照空載體(上圖)和編碼GFP的表達質粒轉染的293細胞。利用螢光顯微鏡術顯現轉染細胞，且從形態學上確定凋亡活性。圖3a-f是用促凋亡基因轉染的BAEC細胞的電子顯微鏡術圖像。轉染後24小時，將BAEC細胞在2.5。/。戊二醛中固定並進行加工。顯示的是處於凋亡過程連續階段的細胞。圖5a表示AdPPE-Fas-c的PCR分析。泳道1-2—用包含PPE-1啟動子和Fas-c基因的引物獲得的PCR產物。泳道3-4—用Fas-c引物獲得的PCR產物。泳道5-6—在無模板DNA的情況下獲得的PCR產物。圖5b是AdPPE-Fas-c轉染的BAEC細胞的蛋白質印跡分析。蛋白樣品經SDS-PAGE分離，轉移到硝酸纖維素膜上，且用針對TNFR1胞外部分的多克隆抗體探測。泳道l-2—pcDNA3-Fas-cBAEC轉染細胞(陽性對照)。泳道3-4—用指示MOI的AdPPE-Fas-c病毒轉染的BAEC細胞。泳道5—非轉染細胞。泳道6-7—用指示MOI的AdPPE-Luc轉染的BAEC細月包。圖6a-d是說明Fas-嵌合體超表達對內皮細胞凋亡的作用的顯微照片。用下述物質轉染BAEC細胞Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體(圖6a);Ad-PPE-l-3x-螢光素酶(圖6b);Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體和Ad-PPEl-3x-GFP(圖6c);Ad-PPE-l-3x-安光素酶和Ad-PPE-l曙3x畫GFP,各為MOIIOOO(圖6d)。顯微照片是在感染後72小時拍攝的，xl0放大。圖7是說明Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體對內皮細胞的凋亡特異性作用的直方圖。在用Ad-PPE-l-!3x-Fas-嵌合體或對照(螢光素酶)病毒感染後72小時通過結晶紫染色，定量內皮細胞(BAEC、HUVEC)和非內皮細胞(正常皮膚成纖維細胞-NSF)的生存力。圖8顯示施用TNFot對Fas-嵌合體介導的凋亡的劑量反應作用。用Ad-PPE-l-3x-Fas-c感染BAEC。感染後48小時，向生長培養基中(以指示的劑量)添加TNF。24小時後通過結晶紫測定確定生存力。圖9a-e是說明由TNFot配體和Fas-c受體的協同作用介導的內皮細胞特異性凋亡的顯微照片。所指示的細胞在存在或不存在TNFa(10ng/ml)的情況於Ad-PPE-l-3x-Fas-c感染後48小時下溫育；結晶紫染色在感染後72小時進行。圖10a是說明Ad-CMV-Fas-c對內皮細胞的TNFa依賴性凋亡作用的劑量反應曲線。用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的BAEC細胞的生存力在與TNFa溫育後確定。圖10b-d表示TNFa配體和Ad-CMV-Fas-嵌合體對非內皮細胞NSF的凋亡作用。圖10b—經對照病毒感染的NSF。圖10c—經Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的NSF。圖10d—經Ad-CMV-Fas-嵌合體感染並與TNF(10ng/ml)溫育的NSF。圖lla-c說明Ad-PPE-l-3x-Fas-c的體內抗胂瘤作用。當腫癌可觸知時，用Ad-PPE-l-3x-Fas-c、Ad-CMV-Fas-嵌合體、對照病毒或鹽水靜脈內注射接種有B16黑素瘤細胞的小鼠。圖lla—在治療時間段期間測量的腫瘤面積。圖llb—治療時間段結束時的腫瘤重量。圖llc一圖示Ad-PPE-l-3x-Fas-c治療小鼠和對照小鼠中的腫瘤狀態。圖12是直方圖，說明使用B2B細胞系(表達內皮素的支氣管細胞系)作為對照時本發明的增強子元件對牛內皮細胞系和人內皮細胞系中的螢光素酶表達的作用。圖13是直方圖，說明腺病毒載體中的本發明啟動子對各種細胞系中的螢光素酶表達的內皮特異性。圖14A-B是顯微照片，表明了在BAEC細胞系中由本發明的Ad5PPE-l-3X(14A)和Ad5CMV(14B)對照構建體控制的GFP表達。圖15是在內皮細月包和非內皮細月包中由pACPPE-l-3Xp55、pACPPE-l-3X螢光素酶和pCCMVp55誘導的凋亡百分比的直方圖。圖16是直方圖，說明將本發明的增強子元件導入啟動子構建體中對低氧應答的作用。圖17是直方圖，說明將本發明的增強子元件導入腺病毒載體構建體的啟動子中對低氧應答的作用。圖18是直方圖，說明將本發明的增強子元件導入啟動子中對表達內皮素的牛和人內皮細胞系中的表達水平的作用。圖19是直方圖，說明在注射含有內皮啟動子(PPE-1)或對照(CMV)啟動子的腺病毒構建體後在各種器官中觀察到的報告基因的表達水平。圖20A-B是兩張顯微照片，說明Ad5CMVGFP構建體(圖20A)和Ad5PPE-l-GFP構建體(圖20B)在注射所述構建體的小鼠肝組織中的細胞表達。圖21是直方圖，說明將本發明的增強子元件導入啟動子中對內皮細胞系和非內皮細胞系中的表達水平的作用。圖22是直方圖，說明將本發明的增強子元件導入啟動子中對內皮細胞系和非內皮細胞系中的表達水平的作用。圖23A-C是顯微照片，分別說明Ad5PPE-l-3XGFP轉導細胞、Ad5PPE-lGFP轉導細胞和Ad5CMVGFP轉導細胞中的GFP表達。圖24A-B說明了分別用moi-l的Ad5PPE-l-3XGFP和Ad5CMVGFP轉導的SMC中的GFP表達。圖25A-B顯示在HeLa細胞中進行的與圖24A-B的實驗相似的實驗的結果。圖26A-B顯示在HepG2細胞中進行的與圖24A-B的實-瞼相似的實驗的結果。圖27A-B顯示在NSF細胞中進行的與圖24A-B的實驗相似的實驗的結果。圖28A-B是顯樣吏照片，說明在分別注射Ad5PPE-lGFP構建體和Ad5PPE-l-3XGFP構建體的小鼠血管內襯的內皮細胞中的GFP表達。圖29A-C是顯微照片，說明得自經注射的小鼠腎組織的結果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖29A);注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖29B;在血管壁中可見略高的GFP表達；箭標所指)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖29C)。圖30A-C說明在脾組織切片上進行的、與圖29A-C中描繪的實驗相似的實馬全。圖31A-D說明注射鹽水的對照小鼠(圖31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖31B)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖31C)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖31D)的轉移肺中的GFP表達。抗Cd31免疫染色(圖31C'-31D')證實在每種轉移組織中GFP表達和CD31表達共定位。圖32是直方圖，說明用含有鼠PPE-1啟動子的質粒轉染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)在轉染細胞於低氧條件下溫育時明顯更高。圖33是與圖32相同的直方圖，不同的只是4吏用Ad5PPE-lLuc和Ad5CMVLuc。圖34是與圖33相同的直方圖，說明在不同細胞系中的低氧效應。圖35是直方圖，說明本發明的3X序列對BAEC細胞中PPE-1低氧應答的作用。細胞用Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3Xluc轉導。圖36是直方圖，顯示在股動脈結紮後PPE-l-Luc轉基因小鼠各種組織中的螢光素酶表達水平。圖37A-B是結合本發明使用的構建體的質粒圖譜。圖38A-F說明Ad5PPE-l-3XVEGF和Ad5CMVVEGF對小鼠局部缺血肢體的血液灌注和血管生成的作用。圖38A-D是結紮後21天捕獲的各種治療組小鼠局部缺血肢體的代表性超聲(US)血管造影灌注圖像。黃色信號代表強灌注。該圖像的右側代表肢體遠端。圖38A—Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠；圖38B—Ad5CMVVEGF治療小鼠；圖38C—對照，鹽水治療小鼠；圖38D—對照，正常肢體。圖38E-F是直方圖，說明各種治療組US圖像的平均信號強度(圖38E);根據各種治療組中CD31+細胞數目/mm2測量的平均毛細血管密度(圖38F)。圖39是直方圖，說明在用Ad5PPE-lLuc(空心條)和Ad5CMVLuc(黑色條)轉導的增殖和靜息牛主動脈內皮細胞(BAEC)中的螢光素酶活性。圖40是直方圖，說明用Ad5PPE-lLuc轉導的BAEC在正常增殖期間、靜息狀態和加入VEGF後的快速增殖期間的螢光素酶活性。圖41A-B是直方圖，說明在正常注射Ad5PPE-lLuc和Ad5CMVLuc的C57BL/6小鼠主動脈(圖41A)和肝(圖41B)中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。注射後1天0=13)、5天(11=34)、14天(11=32)、30天(n=20)和90天(n-ll)測定活性。圖42A-B是直方圖，說明在正常注射的BALB/C小鼠中注射Ad5PPE-lLuc(空心條)或Ad5CMVLuc(黑色條)後5天(圖42A)和14天(圖42B)(每個時間點均為n=10)檢測的相對營光素酶活性(光單位/iug蛋白)。活性以每隻動物全身螢光素酶表達的百分比表示。圖43是描繪由ApoE缺陷型小鼠解剖的主動脈通過蘇丹(Sudan)-IV著色的現有技術圖像。胸主動脈含有較少的著紅色的動脈粥樣硬化病變，而腹區包含許多著紅色的動脈粥樣硬化病變。(摘自ImagingofAorticatheroscleroticlesionsby125I-HDLand125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology2001;69:225-29)。圖44是直方圖，說明給ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-1Luc(空心條；n=12)或Ad5CMVLuc(黑色條；n=12)後5天檢測的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。從腹主動脈觀測的螢光素酶活性含高病變水平，而從胸區觀測的縈光素酶活性(低病變水平)。圖45是直方圖，說明給誘發傷口癒合的C57BL/6小鼠全身注射AMPPE-lLuc(黑色條)或AMCMVLuc(空心條)後5天的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖46是直方圖，說明誘發Lewis肺癌的小鼠的正常肺、轉移肺和原發性腫瘤中的螢光素酶活性。通過給原發性腫瘤模型的背部和轉移模型的爪墊注射D122-96細胞誘發Lewis肺癌。全身注射Ad5PPE-lLuc(n=9;空心條)或Ad5CMVLuc(n=12;黑色條)後5天測量螢光素酶活性。活性以光單位/嗎蛋白表示。圖47A-D是顯微照片，說明在腫瘤內注射Ad5PPE-lGFP後在帶有LLC的小鼠肺和胂瘤中的GFP表達和組織形態學。將組織在OCT中冷凍，然後用恆冷切片機切成IOiam的切片。所有照片都在放大25倍的情況下拍攝。圖47A—肺轉移的血管生成性血管中的GFP;圖47B—圖47A中所拍攝切片的CD31抗體免疫染色；圖47C—原發性胂瘤血管中的GFP表達；圖47D—說明血管的C切片的相差。圖48是直方圖，說明注射Ad5CMVLuc、Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3X-Luc的"i秀髮的Lewis肺癌小鼠的正常肺和轉移肺中的安光素酶表達。通過給轉移才莫型的爪墊注射D122-96細胞誘發Lewis肺癌。全身注射Ad5CMVLuc(n=7;黑色條)、Ad5PPE-lLuc(n=6;灰色條)或Ad5PPE-l-3XLuc(n=13;褐色條)後5天測量螢光素酶活性。活性以光單位/lug蛋白表示。圖49是直方圖，說明注射Ad5CMV、Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l(3X)的誘發的Lewis肺癌小鼠的正常肺和肺轉移中以肝活性的百分比表示的螢光素酶活性(其中肝中的活性為100%)。圖50A-B是顯微照片，說明注射Ad5PPE-l-3X-GFP的LLC肺轉移小鼠中GFP表達(圖50A)和CD31免疫染色(圖50B)共定位。圖51是直方圖，說明股結紮後2天、5天、10天和18天和對照(未結紮動物一第0天；每組n:8)的PPE-l螢光素酶轉基因小鼠肌肉(局部缺血和正常)中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖52是直方圖，說明股結紮後5天(11=6)、10天0=6)和18天(n=8)以及對照(未結紮動物一第0天)的PPE-1螢光素酶轉基因小鼠的肝、肺和肌肉主動脈(局部缺血和正常)中的安光素酶活性(光單位/Vg蛋白)。圖53是直方圖，說明在原發性腫瘤中注射Ad5CMVLuc(黑色條)或Ad5PPE-lLuc(空心條)的LLC小鼠肝、肺和原發性肺瘤中檢測的營光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖54A-H是原位雜交圖像，說明各種轉基因的組織特異性表達或組成型表達的組織分布。圖54A-C說明與以下的代表性局部缺血肌肉上的VEGF特異性反義探針的原位雜交A，Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠；B,Ad5CMVVEGF治療小鼠；C,鹽水治療小鼠；D,Ad5CMVVEGF治療小鼠的肝切片。箭標表示陽性染色細胞。圖54E-G說明與來自以下的代表性局部缺血肌肉的PDGF-B特異性反義探針的原位雜交E,Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠:F,Ad5CMVPDGF-B治療小鼠:G,鹽水治療小鼠；H,Ad5CMVPDGF-B治療小鼠的肝切片。圖55A-B是直方圖，說明Ad5PPE-l-3XVEGF或Ad5CMVVEGF對小鼠局部缺血肢體中的血液灌注和血管生成的長期作用。A,股動脈結紮後50天各種治療組US圖像中的平均信號強度。B,股動脈結紮後70天根據各種治療組中CD31+細胞數目/mm2測量的平均毛細血管密度。圖56A-D是直方圖，說明Ad5PPE-l-3XPDGF-B對小鼠局部缺血肢體新血管形成的早期作用和長期作用。圖56A-B—通過US成像測量的平均灌注強度(56A,股動脈結紮後30天；56B，股動脈結紮後80天)。圖56C-D—根據各種治療組中CD31+細胞數目/mm2測量的平均毛細血管密度(56C，股動脈結紮後35天；56D,股動脈結紮後90天)。圖57A-G說明單獨或聯合使用處於內皮特異性啟動子或組成型啟動子調節之下的PDGF-B和VEGF的血管生成療法對小鼠局部缺血肢體的新血管形成和血流的長期作用。A,股動脈結紮後80天各種治療組US圖像中的平均信號強度。B，股動脈結紮後90天根據各種治療組CD31+細胞數目/mm2測量的平均毛細血管密度。圖57C-G是股動脈結紮後90天募集到局部缺血肢體肌肉成熟血管內的平滑肌細胞。平滑肌細胞用抗a-SM肌動蛋白抗體進行免疫染色(著紅色，X20)。C，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠D,聯合療法治療的小鼠；E,Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠;F，對照，Ad5PPE-l-3XGFP治療小鼠;G,正常對側肢體(注意到僅大血管被染色)。圖58說明動脈結紮後50天單獨的或與促血管生成因子VEGF聯用的PDGF-B對小鼠局部缺血肢體血液灌注的作用。圖59是基因定向酶前藥治療(gene-directedenzymeprodrugtherapy)(GDEPT)基本原理的示意圖。圖60A-B是代表質粒pEL8(3x)-TK構建的示意圖。圖60A是代表質粒pEL8(3x)-TK構建的示意圖。圖60B是質粒pACPPE-l(3x)-TK的圖語。圖61是通過UV螢光顯現的AdPPE-l(3x)-TK載體PCR產物的瓊脂糖凝膠分離。使用兩種引物正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(前內皮素原啟動子序列中的455-474bp)(SEQIDNO:9)和反向引物5'-taaggcatgcccattgttat畫3'(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQIDNO:10)。其它載體的特異性引物未產生PCR產物。觀察到lkb條帶，證實在AdPPE-l(3x)-TK病毒中存在PPE-l(3x)啟動子和HSV-TK基因。泳道l:100bp大小的大小標記梯。泳道2:pACPPE-l(3x)-TK質粒。泳道3:AdPPE-l(3x)-TK病毒。泳道4:無DNA。圖62A-C顯示了載體AdPPE-l(3x)-TK(圖62a)、AdPPE-l(3x)-Luc(圖62b)和AdCMV-TK(圖62c)的線性示意圖。圖63是一系列顯微照片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的優良內皮細胞細胞毒性。用O.l、1、10、100和1000感染複數(m.o丄)的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉導牛主動脈內皮細胞(BAEC)。在轉導後4小時加入GCV(lpg/ml)。對照是用無GCV的載體或無載體的GCV轉導的細胞。實驗在96孔板中進行兩次，每組12個孑L。兩個對照都不誘導細胞死亡(未列出數據)。以顯著低於AdCMV-TK的m.o丄在AdPPE-l(3x)+GCV處理細胞中明顯觀察到細胞毒性特有的形態學變化(細胞擴大、延伸和膨脹)和細胞毒性(匯合喪失)。用AdPPE-l(3x)-Luc轉導的細胞保持健康(小尺寸、圓形並匯合)。圖64圖示了處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的內皮細胞細胞毒性。BAEC在96孔板中製備，並如圖13轉導，接著在轉導後4小時加入1fig/mlGCV。加入載體後10天，使用結晶紫染色測定細胞生存力。觀察到AdPPE-l(3x)+GCV在高m.o丄時的優良細胞毒性。圖65是一系列顯微照片，說明在PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的內皮細胞細胞毒性的優良協同作用。如上文所述用感染複數(m.o丄)為10的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉導牛主動脈內皮細胞(BAEC),並使其接觸在轉導後4小時加入的濃度漸增的GCV(如所示的0.001-10|ug/ml)。對照為用無GCV的載體或無載體的GCV轉導的細月包。實-驗在96孔板中進4亍兩次，每組12個孔。兩個對照都不誘導細胞死亡(未列出數據)。在顯著低於接觸AdCMV-TK的細胞的GCV濃度，於AdPPE-l(3x)+GCV處理細胞中明顯觀察到細胞毒性特有的形態學變化(細胞擴大、延伸和膨脹)和細胞毒性(匯合喪失)。圖66圖示了在PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的內皮細胞細胞毒性的協同作用。BAEC在96孔板中製備，並如圖65轉導，接著在轉導後4小時加入漸增濃度(0.0001-10lug/ml)的GCV。加入載體後IO天，使用結晶紫染色測定細胞生存力。與AdCMV-TK的強組成型TK表達相比，觀察到AdPPE-l(3x)+GCV在高於0.01pg/ml的GCV濃度時的優良細胞毒性。圖67是一系列顯微照片，說明處於PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的特異性協同內皮細胞毒性。內皮細胞[牛主動脈內皮細胞(BAEC)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)]和非內皮細胞[人肝癌細胞(HepG-2)、人正常皮膚成纖維細胞(NSF)]用m.o丄為10的AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK轉導，接著在轉導後4小時施用1pg/mlGCV。實驗在96孔板中進行兩次，每組12個孔。轉導後4天用顯微鏡檢測細胞毒性和細胞形態學變化。觀察到BAEC和HUVEC培養物中AdPPE-l(3x)-TK+GCV的優良細胞毒性作用[細胞毒性特有的形態學變化(細胞擴大、延伸和膨脹)和細胞毒性(匯合喪失)],及這種作用在HepG-2和NSF培養物中不存在(細胞保持小尺寸、圓形和匯合)。AdPPE-l(3x)-Luc+GCV對所有細胞類型都無毒性。圖68是直方圖，代表處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的特異性協同內皮細胞細胞毒性。內皮細胞(BAEC和HUVEC)和非內皮細胞(HepG-2和NSF)在96孔板中製備，並如圖67轉導，接著在轉導後4小時加入濃度漸增(liug/ml)的GCV。加入載體後10天，使用結晶紫染色測定細胞生存力。與AdCMV-TK+GCV的非特異性細胞毒性相比，觀察到AdPPE-l(3x)+GCV的優良內皮特異性細胞毒性。圖69是一系列直方圖，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用在極端感染複數時的內皮選擇性細胞毒性。如在圖66中一樣，以較高m.o丄100的AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE畫l(3x)畫Luc或AdCMV-TK轉導非內皮細胞(NSF),接著在轉導後4小時施用1jug/mlGCV。實驗在96孔板中進行兩次，每組12個孔。轉導後4天用顯微鏡斥企測細胞毒性和細胞形態學變化。與AdCMV-TK+GCV的非特異性細胞毒性相比，觀察到AdPPE-l(3x)-TK+GCV對NSF細胞形態學沒有作用。圖70是一系列照片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對轉移生長的協同抑制。在14周齡雄性C57BL/6小鼠(n=77)中通過將LLC肺瘤細胞接種入左爪墊誘發Lewis肺癌(LLC)肺轉移，該爪墊在原發性腫瘤一達到7mm大小時就截除。5天後，將1011PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]注射入尾靜脈，接著注射100mg/kgGCV達14天。在載體注射後第24天時處死小鼠，取出肺進行一全查和分析。對照小鼠接受鹽水和GCV。與AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-1和無腺病毒的GCV治療的小鼠肺相比，在AdPPE-l(3x)+GCV治療的小鼠肺中觀察到程度顯著降低的轉移擴散。圖71是直方圖，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對轉移生長的協同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中誘發肺轉移，且用1011PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)曙TK+GCV;AdCMV曙TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治療小鼠。在載體注射後第24天時處死小鼠，且取出肺進行肺轉移評價。對照小鼠接受鹽水和GCV。與無GCV(超過85%)和AdCMV-TK+GCV以及鹽水+GCV對照(超過75%)中的轉移塊相比，在AdPPE-l(3x)+GCV治療小鼠中觀察到對轉移塊的顯著抑制。圖72a-72c是肺轉移的代表性組織病理學切片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對轉移病理的協同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中誘發肺轉移，且用10"PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV國TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治療小鼠。在載體注射後第24天時處死小鼠，且製作肺轉移組織(圖72a和72b)或肺組織(圖72c)的切片，並用蘇木精和伊紅染色。在施用AdPPE-l(3x)+GCV的肺轉移中觀察到大範圍的中心壞死和眾多單核浸潤物簇(圖72a和72b)。圖73a-73b是肺轉移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發性LLC肺轉移的代表性組織病理學切片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對腫瘤凋亡的協同增強作用。對如圖71a-71b所述誘發和製備的LLC肺轉移的切片進行固定並包埋在石蠟中，通過4吏用Klenow-FragEl(Oncogene,Cambridge,MA)的脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記(TUNEL)測定(圖73a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(73b)分析凋亡指示物。在靜脈內AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移中觀察到凋亡增強。圖74a和74b是用肺轉移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發性LLC肺轉移的代表性組織病理學切片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對腫瘤凋亡的內皮特異性協同增強作用。如圖73a-73b所述對誘發和製備的LLC肺轉移的切片進行固定並包埋在石蠟中，且通過使用Klenow-FragEl(Oncogene,Cambridge,MA)的脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記(TUNEL)測定(圖74a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(74b)分析凋亡指示物。黑色箭標指示紅細胞，紅色箭標指示凋亡的內皮細胞，而白色箭標指示凋亡腫瘤細胞。在靜脈內AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移的血管(內皮)區中觀察到凋亡增強。圖75a-75d是鼠肺癌組織的代表性免疫組織病理學切片，說明處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對血管生成的內皮特異性協同抑制作用。如圖73a-73b所述對誘發和製備的LLC肺轉移(圖75a)、肝(圖75c)和正常肺組織(圖75b)的切片進行固定並包埋在石蠟中，且通過抗CD-31免疫螢光分析血管生成指示物。在AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移中觀察到短的、模糊的血管，沒有連續性或分支。圖75d是直方圖，顯示了肺轉移血管形成(血管生成)的基於計算機的血管密度評價(ImagePro-Plus,MediaCyberneticksIncorporated)。左條AdPPE-l(3x)TK+GCV;右條無GCV的AdPPE-l(3x)TK。圖76是鼠肝組織的代表性組織病理學切片，說明在處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用中沒有肝臟毒性。如圖73a-73b所述誘發和製備的帶有LLC肺轉移的小鼠肝切片進行固定並包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。與用組成型表達的AdCMV-TK+GCV(右圖)治療小鼠肝中的顯著細胞毒性相比，在AdPPE-l-TK+GCVpx)(左圖)治療小鼠肝中沒有觀察到細胞毒性指示物。圖77描述了RT-PCR分析，說明了處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達和更昔洛韋(GCV)施用的器官特異性表達。如圖73a-73b所述，在9隻15周齡的性肺瘤去除後14天靜脈內遞送腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK]和鹽水對照。在注射載體後6天處死小鼠，且收穫器官。如下文所述提取不同器官的RNA,且用PPE-l(3x)啟動子引物和HSV-TK基因引物通過RT-PCRPCR擴增PPE-l(3x)和HSV-TK轉錄物。觀察到處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的內皮特異性表達(中部，底部圖)。圖78a和78b圖示了Balb/c鼠結腸癌肺瘤才莫型中的亞治療和無毒輻射範圍。用CT-26結腸癌細胞接種入20隻8周齡Balb/c雄性小鼠的左股，且其在肺瘤直徑已達到4-6mm時在全身麻醉下接受0、5、10或15Gy的局部輻射。對於肺瘤體積(76a),按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且P是長軸)計算腫瘤軸。5Gy劑量僅誘導部分的、非統計學顯著的腫瘤發展延遲(圖78a),且沒有顯著的體重減輕(圖78b)。圖79a-79g說明聯合亞治療放療與處於PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK表達和更昔洛韋(GCV)施用在鼠結腸癌中協同抑制腫瘤生長。用CT-26結腸癌胂瘤細胞接種100隻8周齡的雄性Balb/C小鼠。胂瘤軸一達到4-6mm,就將1011PFU的病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]靜脈內注射入尾靜脈，接著按指示每日腹膜內注射GCV(100mg/kg體重)達14天。載體施用後3天，用局部5Gy劑量輻射小鼠。按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且(3是長軸)評價腫瘤體積。圖79a顯示了載體注射後14天時的平均腫瘤體積士S.E.。圖79b顯示了放療治療組中隨時間變化的平均胂瘤體積進展。圖79c顯示了AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠中隨時間變化的平均胂瘤體積進展。圖79d顯示了AdCMV-TK十GCV治療小鼠中隨時間變化的平均胂瘤體積進展。圖79e顯示了對照鹽水+GCV治療小鼠中隨時間變化的平均腫瘤體積進展。圖79f顯示了無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中隨時間變化的平均肺瘤體積進展。圖79g是處死當天Balb/C小鼠中CT-26原發性肺瘤總病理學的代表性示例。與非耙向載體AdCMV-TK(p-0.04)(圖79c-79f)相比,觀察到放療僅顯著加強血管生成性內皮細胞轉錄粑向的載體AdPPE-l(3x)-TK。在沒有放療的情況下，採用所有病毒載體的治療方案都是無效的。圖80a-80b是原發性CT-26胂瘤的代表性組織病理學切片，表明亞治療放療與處於PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK表達和更昔洛韋(GCV)施用聯合在鼠結腸癌中協同誘導腫瘤壞死。對如圖79a-79g所述誘發和製備的CT-26結腸癌胂瘤切片進行固定並包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。觀察聯合的AdPPE-l(3x)+GCV+低劑量放療情況下的壞死區域(圖80a)和肉芽組織區域(圖80b)。圖81a-81b是用TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發原發性結腸癌腫瘤的代表性組織病理學切片，說明放療與處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用聯合協同增強內皮細胞和肺瘤的凋亡。對如圖77a-77g所述誘發和製備的CT-26原發性結腸癌肺瘤切片進行固定並包埋在石蠟中，且通過使用Klenow-FragEl(OncogeneCambridge,MA)的脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記(TUNEL)測定(圖81a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(81b)測定凋亡指示物。在用聯合的放療和靜脈內AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的腫瘤中觀察到大範圍的凋亡(圖81a)和胱天蛋白酶-3陽性內皮細胞(81b)。圖82是用抗胱天蛋白酶-3染色的誘發原發性結腸癌腫瘤的代表性組織病理學切片，表明放療與處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用聯合協同增強內皮細胞和肺瘤的凋亡。對如圖79a-79g所述誘發和製備的CT-26原發性結腸癌腫瘤切片進行固定並包埋在石蠟中，且通過抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學測定凋亡指示物。黑色箭標指示紅細胞，紅色箭標指示凋亡內皮細胞，且白色箭標指示凋亡肺瘤細胞。觀察到GCV依賴性凋亡作用。圖83a和83b是用抗CD-31染色的肝組織和誘發的原發性結腸癌腫瘤的代表性組織病理學切片，說明放療與處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用聯合協同增強對肺瘤血管形成的抑制。對肝組織(83b)和如圖79a-79g所述誘發和製備的CT-26原發性結腸癌腫瘤(83a)切片進行固定並包埋在石蠟中，且與內皮特異性抗CD-31反應，用於免疫組織病理分析。黑色箭標指示紅細胞，紅色箭標指示凋亡內皮細胞，且白色箭標指示凋亡肺瘤細胞。與肝細胞中的正常血管形成(83b)相比，觀察到放療和靜脈內AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合治療小鼠胂瘤中的廣泛血管破壞(83a)。圖84是小鼠肝組織的代表性組織病理學切片，表明放療與處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達和更昔洛韋(GCV)施用的組織特異性細胞毒性。對接觸單獨及聯合的載體(AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK)和GCV的小鼠肝切片進行固定，並包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。觀察到AdCMV-TK和更昔洛韋(左圖)的典型輕微肝臟毒性，在AdPPE-1(3x)-TK治療的肝中(右圖)沒有血管異常。圖85a和85b圖示了C57B1/6肺癌轉移衝莫型中的亞治療和無毒輻射範圍。用Lewis肺癌(LLC)細胞接種入35隻8周齡C57B1/6雄性小鼠的左爪墊，並在去除原發性腫瘤後8天在全身麻醉下以0、5、10或15Gy接受輻射到胸壁內。在去除腫瘤後28天時處死小鼠。體重減輕指示轉移性疾病。5Gy劑量不是治療性的(圖85a),也不是有毒的(圖85b)。圖86a-86d說明了亞治療放療與處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達和更昔洛韋(GCV)施用聯合在鼠肺癌中協同抑制轉移性疾病。將LLC細胞接種入180隻8周齡雄性Balb/C小鼠的左爪墊中。一發展原發性腫瘤就在全身麻醉下截除該爪。截除後5天，將101QPFU載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾靜脈，接著每日腹膜內注射GCV(100mg/kg)達14天。載體注射後3天，在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單次5Gy劑量放療。圖86a顯示了在55天內輻射過的、無載體治療的小鼠的存活。圖86b顯示了AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的存活。圖86c顯示了AdCMV-TK治療小鼠的存活。圖86d顯示了鹽水治療的對照小鼠的存活。與非耙向載體AdCMV-TK(圖86b-86d)相比，觀察到放療僅顯著增強血管生成內皮細胞轉錄耙向的載體AdPPE-l(3x)-TK。在沒有放療的情況下使用所有病毒載體的治療方案都是無效的。圖87a-87c是一系列直方圖，顯示了在CMV啟動子控制之下的Fas-c的內皮細胞細胞毒性。牛主動脈內皮細胞(BAEC)在用100(左)、1000(右)和10000(左下)moi的CMV-FAS(黑色)或CMV-LUC(灰色，陰性對照)轉導後72小時和在以不同濃度加入人TNF-a配體後24小時用結晶紫染色。觀察到在高moi和TNF-a濃度時BAE細胞的生存力下降。圖88是噬斑發展圖，表明相比於CMV-LUC(紅色正方形)，用CMV-FAS(藍色菱形)增強了293細胞中病毒複製的擴散。CMV-FAS和CMV-LUC的CsCl帶狀原液的滴度如下文所述通過PFU測定來測定。數據按照對數比例以每2-3天噬斑測定觀察到的噬斑數作圖。圖89a和89b是一系列293細胞培養物的照片，說明與CMV螢光素酶相比，採用CMV-FAS-c的病毒感染的細胞-細胞擴散(噬斑形成)速率較高。轉染後4天，拍攝相同稀釋度的CMV-FAS(左圖)和CMV-LUC(右圖)的噬斑照片。CMV-FAS的噬斑明顯大於CMV-LUC的噬斑，從而表明可能由凋亡誘導的細胞-細胞擴散速率較高。圖90是直方圖，說明在PPE-l(3x)啟動子控制之下的Fas-c和阿黴素施用的特異性協同內皮細胞毒性。BAE細胞在載體(PPE-l(3x)-FAS)轉導(103moi)後48小時接觸100nM阿黴素。Dox+PPE-fas=阿黴素+PPE-l(3x)-Fas-c(橙色)；Dox=單獨的阿黴素(綠色)；PPE-FAS=PPE-l(:3x)-FAS(紅色)；未處理=黑色。細胞在載體轉導後96小時用結晶紫染色，且顯微鏡評價細胞生存力。觀察到AdPPE-l(3x)-Fas-c和阿黴素之間有內皮細胞毒性的顯著協同作用。圖91a-91b圖示說明了處於內皮素(PPE-13X)控制之下的VEGF對工程化組織構建體中的血管生成的優良誘導作用。組織工程化構建體(未公開的程序)在培養基有或沒有補加VEGF(50ng/ml)的情況下生長。用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒或對照Ad5PPEC-l-3xGFP腺病毒(對照病毒)感染平行構建體(達4小時)。在培養2周後固定構建體，包埋、製作切片並染色。血管形成表示為血管數/mm2和切片中血管形成的面積百分比。圖91a表明，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細胞對在工程化構建體中形成的血管樣結構的數目和大小具有誘導作用。與接觸培養基中的VEGF(VEGF培養基)的構建體相比，觀察到Ad5PPEC-l-3xVEGF轉導的組織構建體(VEGF病毒)中血管形成的兩個參數急劇增加(4-5X)。圖91b是LUC發光強度的直方圖，說明與Ad5PPEC-l-3xGFP對照相比，與Ad5PPEC-l-3xVEGF感染的細胞一起生長的植入組織構建體的存活和血管形成較好。圖92是野生型鼠PPE-1啟動子DNA序列。所述啟動子包含內源內皮特異性正轉錄元件(黑色斜體)、NF-1反應元件(粉色斜體)、GATA-2元件(紅色斜體)、HIF-1反應元件(藍色斜體)、AP-1位點(綠色斜體)、CAAT信號(橙色斜體)和TATA框(紫色斜體)。圖93是修飾型鼠前內皮素原-1啟動子的3x片段序列。所述片段包含2個完整內皮細胞特異性正轉錄元件(紅色)和兩個作為反向的半個原始序列定位的部分(藍色)SEQIDNO:15(轉錄元件SEQIDNO:6的3'部分的核苷酸)和SEQIDNO:16(轉錄元件SEQIDNO:6的5'部分的核苷酸)。圖94是直方圖，說明了在轉基因小鼠中在PPE-l(3x)啟動子控制之下的LUC基因表達的組織特異性的、波生坦誘導的增強。圖95a和95b是直方圖，說明根據ELISA測量的，不存在針對PPE-l(3x)啟動子控制下表達的轉基因的宿主免疫應答。與在PPE-l(3x)Fas-c治療小鼠中引起的最小抗TNF-R1應答(圖95b)相比，觀察到非特異性的抗腺病毒載體(adenovector)應答(圖95a)。圖96是直方圖，說明了內皮細胞中在PPE-1啟動子控制下的LUC基因表達的ET-B特異性的增強。如上文所述，用PPE-l-螢光素酶構建體(pEL-8)瞬時地轉染牛主動脈內皮細胞。用不同濃度的內皮素拮抗劑處理後l小時，計算相對螢光素酶活性。將相對螢光素酶活性計算為光單位與p-半乳糖苷酶單位的比，(3-半乳糖苦酶活性源自組成型活性的lacZ構建體的共轉染。相對於未處理的細胞表達值(濃度OpM-100%)。值代表著一式三份的平均值士標準差。*相對於未處理的細胞，P<0.05(斯氏a企-瞼)。注意到BQ788對LUC表達的劑量依賴性的、ET-b特異性的增強(灰色條)，和ET-U特異性的抑制劑BQ123的增強的缺乏(黑色條)。圖97A和97B是直方圖，說明了雙重ET-U和ET-1B抑制劑波生坦轉基因小鼠前內皮素原合成和分泌的增強。用波生坦(100mg/kg)處理表達在前內皮素原-l(PPE-l)啟動子控制下的LUC基因的轉基因小鼠30天。圖97A顯示了從轉基因動物肺提取的總RNA的直方圖。圖97B顯示了前內皮素原-1mRNA水平的直方圖(通過半定量RT-PCR測量)。將這些值標準化為P-肌動蛋白，且然後以任意單位圖形顯示。圖97B顯示了對照(空心條)或波生坦-處理的d、鼠(灰色陰影條)中的免疫反應性的內皮素-1(ET-1)水平。將結果表達為與對照未處理的小鼠相比，5隻小鼠的平均值±標準差(斯氏t檢驗)。圖98是直方圖，說明了皮質類固醇對腺病毒載體轉化的內皮細胞中重組蛋白表達的增強。將BAEC暴露於3地塞米松(灰色條)或無類固醇(黑色條)48小時，然後以10-104的MOI，用含有在組成型CMV啟動子控制下的LUC基因的腺病毒構建體轉染。將重組基因表達表示為。/o螢光素酶/pg細胞總蛋白。注意到在所有MOI,皮質類固醇對表達的一致增強，在1000的MOI最高達300%。圖99是焚光顯微照片，說明了皮質類固醇對內皮細胞中在PPE-1啟動子控制下的重組蛋白的表達的增強。在用AdPPE-GFP感染(在100的MOI,48小時)之前48小時，將BAEC暴露於地塞米松(3pM)。顯微照片是2個代表性孔的照片，各自是對照(上面)和地塞米松-處理的(下面)BAEC。注意到在地塞米松處理的細胞中顯著更強的綠色螢光信號。優選實施方案的描述本發明是表現出內皮細胞特異性啟動子活性的多核苷酸序列及其使用方法。更具體地說，本發明涉及一種在內皮細胞中表現出增加的活性和特異性的修飾型前內皮素原-l(PPE-1)啟動子和核酸構建體，所述核酸構建體可用於在特定細胞亞群中活化凋亡，由此使得能夠治療特徵在於異常新血管形成或細胞生長的疾病。本發明還涉及PPE啟動子的修飾，所述修飾響應於包括低氧和血管生成在內的生理條件而增強其表達，並涉及新血管生成內皮特異性聯合療法。在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，要理解的是，本發明在其應用方面不限於在以下描述中敘述的或實施例例舉的細節。本發明能夠具有其它實施方案或以各種方式實施或進行。同樣，要理解的是，本文所用的短語和術語4又用於il明目的，且不應^皮iL為是限制性的。失衡的血管生成為各種病理狀況的典型特徵，且通常支持病理狀態的進展。例如，在實體瘤中，血管內皮細胞的分裂進度是正常組織中的那些細胞的約35倍(Denekamp和Hobson,1982Br.J.Cancer46:711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長和轉移所必需的(Folkman,1986CancerRes.46:467-73)。血管內皮細胞增殖在慢性炎性疾病例如類風溼性關節炎、牛皮癬和滑膜炎中也是重要的，其中這些細胞響應於在炎症部位中釋放的生長因子而增殖(Brown和Weiss,1988,Ann.Rheum.Dis.47:881-5)。另一方面，在局部缺血狀況如心臟缺血、外周血管疾病、傷口癒合、灼傷瘢痕形成和同類疾病中，血管生成的誘導具有治癒作用(Thompson等，PNAS86:7928-7932,1998),且因此是有益的。因此，調節或修飾血管生成過程在限制該過程對基礎性疾病狀態的病理進展的影響以及為研究這種疾病的病因學提供有價值方法方面可具有重要的治療作用。最近，在開發無論是設計成抑制性的還是刺激性的內皮調節劑方面都已取得顯著進展(關於綜述參見Mariam等GenMedGen2003,5:22)。然而，對於促血管生成應用和持久功能性血管的大量形成，需要重複或長期遞送上述蛋白因子，從而限制了它們在臨床情形中的應用。此外，除與血管生成調節因子生產相關的高成本之外，這些因子的有效遞送也需要使用待植入冠狀動脈內的導管，這進一步增加了治療的費用和難度。迄今為止，有前景的臨床實驗已表明，如同Avastin⑥或Bay-43906的抗血管生成治療可通過限制腫瘤周圍的新血管生長而減弱轉移進展。但是，在其中需要顯著的抗血管生成作用來破壞大部分或全部現有血管生成性血管並誘導肺瘤壞死的癌症病理學中，抑制新血管生成和/或部分破壞它們可能並不足夠。此外，儘管在臨床前模型中有前景，但迄今為止在臨床試驗中測試的所有抗血管生成劑的全身施用都顯示出有限的成功率和相當大的毒性，包括血小板減少症、白細胞減少症和咯血。因此，治療劑的內皮特異性靶向對促血管生成治療和抗血管生成治療是必需的。本領域業已描述了內皮特異性啟動子，實例包括flk-l、Flt-lTie-2VW因子和內皮素-1(參見Gu等的美國專利第6,200,751號；Williams等的美國專利第5,916,763號和Harats等的美國專利第5,747,340號，這些專利全部都在此引入作為參考)。本領域還已經描述了在內皮特異性啟動子控制下表達的治療基因的內皮細胞靶向。例如，Jagger等使用KDR或E-選4奪蛋白啟動子在內皮細胞中特異性表達TNFa[JaggarRT.等，HumGeneTher(1997)8(18):2239-47],而Ozaki等使用von-Willebrand因子(vWF)啟動子向HUVEC遞送單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-tk)[HumGeneTher(1996)7(13》1483-90]。儘管這些啟動子,皮認為是內皮細胞特異性的，但研究已表明，這些啟動子中有許多在將表達導向內皮細胞方面是無效的，沒有所需的嚴格特異性，僅表現出微弱活性，且未允許高水平表達。一種構建更有效和特異性的治療用內皮啟動子的方法一直以來都是鑑別和包含組織特異性增強子元件。例如，Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)先前已描述了內皮細胞特異性的增強子元件，他們證實，3個拷貝的PPE-l增強子元件(含有元件ETE-C、ETE-D和ETE-E)在體外賦予啟動子序列內皮細胞特異性。但是，未能證實增強子元件的體內應用。如下文的實施例部分清晰闡述的，本發明已證實了適用於體內治療用途的增強子元件。通過生成獨特的、修飾型三次重複的(3x)增強子元件(SEQIDNO:7)並在體外和體內評價其指導內皮特異性基因表達的活性，本發明的發明人進一步構建了高度活性的增強子元件，其包含新的、重排方向的3x增強子元件序列的部分。此修飾型增強子元件表現出對參與血管生成的增殖性內皮細胞的增強特異性，而在正常內皮細胞中的體內活性可忽略。因此，本發明的發明人首次鑑別了在重構時賦予鄰近的啟動子序列優良活性的增強子元件的部分。因此，按照本發明的一個方面，提供含順式調節元件的分離多核苷酸，所述順式調節元件能夠在真核細胞中指導在轉錄上與其連接的多核苷酸序列的轉錄。所述分離多核苷酸包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列。在一個優選實施方案中，在所述順式調節元件中，所述至少部分SEQIDNO:15所示序列位於所述至少部分SEQIDNO:16所示序列的上遊。在另一個優選實施方案中，在所述順式調節元件中，至少部分SEQIDNO:16所示序列位於所述至少部分SEQIDN0:15所示序列的上遊。SEQIDNO:15是代表鼠內皮特異性增強子元件(SEQIDNO:6)的核苷酸坐標27-44的多核苷酸序列，在3'末端連接一個額外的鳥苷酸，且SEQIDNO:16是代表鼠內皮特異性增強子元件(SEQIDNO:6)的核苷酸坐標1-19的多核苦酸序列。對本說明書和所附權利要求書來說，術語"增強子"指優選但非排它性地以組織特異性方式增加啟動子轉錄活性的任意多核苷酸序列。本文使用的術語"組織特異性增強子"指以組織依賴性或背景序列依賴性(context-dependent)方式增加啟動子轉錄活性的增強子。應當i人識到，這樣的"組織特異性啟動子"在不相容的組織或環境中降低、抑制或甚至沉默啟動子的轉錄活性。按照本發明的一些實施方案，分離多核苷酸包含鄰接拷貝的至少部分SEQIDNo:15和16。這樣的序列優選以頭-尾方向定位，^旦可構建本領域眾所周知的其它方向，例如反向方向(尾-尾或頭-頭)、互補方向(用"t"取代"a"、用"a"取代"t"、用"c，，取代"g，，以及用"g，，取代"c")、反向互補方向等。所述至少部分SEQIDNO:15所示序列可直接共價連接至所述至少部分SEQIDNO:16所示序列，或在優選實施方案中，兩個序列可通過接頭多核苷酸序列連接。本文使用的術語"接頭多核苷酸"指在兩個或更多個側翼多核苷酸(例如SEQIDNo:15和16)之間連^l妾的多核苷酸序列。一種這樣的優選接頭序列例如為三核苷酸序列"cca",其是如SEQIDNO:7的55-57位中的核苷酸所示的接頭序列。其它合適的接頭序列可包括天然或人工的完整附加增強子元件，例如多拷貝的SEQIDN0.15、SEQIDNO:16、PPE-l的lx增強子元件、附加的完整啟動子、低氧反應元件(例如SEQIDNO:5)等。本文使用的術語"部分SEQIDNO:15所示序列......"或"部分SEQIDNO:16所示序列......"定義為代表指明序列的5'末端、3'末端或其間任意序列的至少8個鄰接核苦酸的序列。因此，例如，代表SEQIDNO:15的核苷酸坐標1-8、1-9、1-10、1-11......累加l個核苷酸直至核苷酸坐標1-17的序列皆構成了本發明的部分SEQIDNO:15,代表SEQIDNO:15的核普酸坐標2-9、2-10、2-11......至2-17的全部序列也如是,代表SEQIDNO:15的核普酸坐標3-10、3-11、3-12......至3-17的全部序列也如是，直至包含代表SEQIDNO:15的核苷酸坐標10-17的序列。同樣，代表SEQIDNO:16的核苷酸坐標l-8、1-9、1-10、1-11......累加1個核苷酸直至核苷酸坐標1-19的序列皆構成了本發明的部分SEQIDNO:16,代表核苷酸坐標2-9、2-10......的序列也如是，如上文所述。在將本發明付諸實施時，揭示出修飾型增強子PPE-l(3x)包括連接至SEQIDNO:16所示序列的SEQIDNO:15所示序列，緊在其上遊和下遊側接鼠內皮特異性增強子元件拷貝(lx)(參見SEQIDNO:7)。因此，在一個優選實施方案中，本發明的順式調節元件還包含至少一個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。在更優選實施方案中，所述順式調節元件包含至少兩個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。在最優選實施方案中，本發明的順式調節元件如SEQIDNO:7所示。優選分離多核苷酸還包含內皮細胞特異性啟動子序列元件。對本說明書和所附權利要求書來說，術語"啟動子"指能夠介導下遊目標序列的RNA轉錄的任意多核苷酸序列。內皮特異性啟動子元件可包括例如至少一個拷貝的PPE-l啟動子。本發明的核酸構建體可使用的適宜啟動子/增強子的實例包括內皮特異性啟動子前內皮素原-l,PPE-l啟動子(HaratsD,JClinInvest.1995Mar;95(3):1335-44),PPE-l-3x啟動子[PCT/IL01/01059;Varda-BloomN,GeneTher2001Jun;8(11):819-27]，TIE-1(S79347,S79346)和TIE-2(U53603)啟動子[SatoTN,ProcNatlAcadSciUSA1993Oct15;90(20):9355-8],內皮糖蛋白啟動子[Y11653;RiusC,Blood1998Dec15;92(12):4677-90],vonWillebrand因子[AF152417;CollinsCJProcNatlAcadSciUSA1987Jul;84(13):4393-7]，KDR/flk-l啟動子[X89777、X89776;RonickeV,CircRes1996Aug;79(2):277-85],FLT-1啟動子[D64016AJ224863;MorishitaK,:JBiolChem1995Nov17;270(46):27948-53],Egr-1啟動子[AJ245926;SukhatmeVP,OncogeneRes1987Sep-Oct;1(4):343-55],E-選擇蛋白啟動子[Y12462;CollinsTJBiolChem1991Feb5;266(4):2466-73];內皮粘附分子啟動子ICAM-1[X84737;HorleyKJEMBOJ1989Oct;8(10):2889-96],VCAM-l[M92431;IademarcoMF,JBiolChem1992Aug15;267(23》16323-9],PECAM-1[AJ313330X96849;CD31,NewmanPJ,Science1990Mar9;247(4947):1219-22],血管平滑肌特異性元件CArG框X53154和主動脈羧肽酶樣蛋白(」C丄屍)啟動子[AF332596;LayneMD,CircRes.2002;90:728-736]和主動脈優先表達基因-1[Yen-HsuChenJ.Biol.Chem.,276巻，第50期，47658-47663,2001年12月14日]。其它合適的內皮特異性啟動子在本領域眾所周知，例如EPCR啟動子(Gu等的美國專利第6,200,751號)和VEGF啟動子(Williams等的美國專利第5，916,763號)。本文使用的術語"血管生成調節劑"定義為能抑制或增強組織中的血管生成的分子或化合物。這樣的血管生成調節劑可以是抗血管生成因子，例如血管生成的重要耙的拮抗劑，例如，內皮素受體，或血管生成因子，從而造成內皮特異性啟動子活性的上調或下調。要認識到的是，其它非內皮啟動子也可摻入到上述分離多核苷酸中，以在多種組織中指導所需核酸序列表達。適用於本發明構建體的啟動子在本領域眾所周知。這些啟動子包括但不限於病毒啟動子(例如逆轉錄病毒ITR、LTR、立即早期病毒啟動子(IEp)(例如皰滲病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICP0-IEp)和巨細胞病毒(CMV)IEp)以及其它病毒啟動子(例如晚期病毒啟動子、潛伏期活性啟動子(LAP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和鼠白血病病毒(MLV)啟動子))。其它合適的啟動子是真核啟動子，其包括增強子序列(例如兔P-珠蛋白調節元件)、組成型活性啟動子(例如(3肌動蛋白啟動子等)、信號和/或組織特異性啟動子(例如誘導型和/或阻遏型啟動子，例如TNF或RU486反應性啟動子、金屬硫蛋白啟動子、PSA啟動子等)和肺瘤特異性啟動子，例如端粒酶、絲束蛋白(plastm)和己糖激酶啟動子。優選地，分離的多核苷酸還包含j氐氧反應元件，例如至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示序列。本發明的分離核酸序列可用於在真核組織中調節基因表達，且具體地說是在增殖性內皮細胞(例如涉及血管生成的內皮細胞)中調節基因表達，或者可用於在靜息內皮細胞中沉默(抑制)基因表達。因此，在一些情況下，可提供本發明的分離多核苷酸序列，作為核酸構建體的部分，所述核酸構建體還包含處於本發明的分離多核苷酸調節控制之下的核酸序列。本發明的核酸構建體還可包含另外的多核苷酸序列，例如編碼選擇標記或報告多肽的序列、編碼細菌中的複製起點的序列、允許由單個mRNA翻譯幾種蛋白的序列(IRES)、用於啟動子-嵌合多肽編碼區的基因組整合的序列和/或一般包含在哺乳動物表達載體中的序列，所述哺乳動物表達載體例如為可得自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+A)、pSecTag2、pD邵lay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1;可得自Promega的pCI;可得自Stratagene的pBK-RSV和pBK-CMV;可得自Clontech的pTRES,以及它們的書亍生物。這樣的核酸構建體優選構建用於哺乳動物細胞表達，且可為病毒來源的。適用於哺乳動物表達的核酸構建體的眾多實例是本領域已知的；以下的實施例部分提供了幾個此種構建體的其它細節。對本說明書和所附權利要求書來說，術語"處於......調節控制之下的核酸序列"指具有被RNA聚合酶轉錄的能力的任意多核苷酸序列，其轉錄可由順式調節元件指導，例如本發明的順式調節元件。該定義包括可翻譯為多肽的編碼序列以及反義RNA、結合DNA的RNA、核酶和並非註定會經歷翻譯的其它分子部分的序列。本發明構建體可使用的核酸序列的實例為例如血管生成的正和負調節物，例如VEGF、FGF-1、FGF-2、PDGF、促血管生成素-1和促血管生成素-2、TGF-P、IL-8(關於血管生成調節物的廣泛清單，參見上文表l);細胞毒性藥物；報告基因等。在優選實施方案中，所述核酸序列選自血管生成調節物VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。適於本發明的順式調節元件控制的其它可轉錄核酸序列提供於下文和以下的實施例部分。下文提出的實施例表明，在全身體內施用後，本發明的新順式調節元件可以在局部缺血和/或血管生成(增殖)性內皮組織中優先的方式將報告基因(GFP和LUC)表達可靠地引導至內皮組織。更有意義的是，所述實施例還表明，本發明的分離多核苷酸可用於在腫瘤、轉移、局部缺血組織和/或血管生成組織中優先表達治療基因，從而提供有關本發明的順式調節元件及其衍生物在治療應用中的重要性的直接證據。在一個實施方案中，本發明的核酸構建體用於上調組織中的血管生成，及治療或預防與局部缺血相關的疾病或狀況。這些應由增強的血管生成獲益的疾病和狀況在本領域眾所周知，例如傷口癒合、缺血性中風、缺血性心臟病和胃腸損害。本文使用的術語"下調血管生成"指減緩或阻止導致新血管生成的血管生成過程。術語"上調血管生成，，指增強休眠的或起最低作用的內皮細胞血管生成活化劑的表達。因此，本發明可用於基因治療。本文使用的基因治療指將目標遺傳材料(例如DNA或RNA)轉移至宿主中，以治療或預防遺傳性或獲得性疾病或狀況或表型。目標遺傳材料編碼期望其在體內生產的產物(例如蛋白、多肽、肽、功能性RNA、反義序列)。例如，目標遺傳材料可編碼有治療價值的激素、受體、酶、多肽或肽。關於綜述，一般參見教科書"GeneTherapy"(AdvancedinPharmacology40,AcademicPress,1997)。已發展出基因治療的兩種基本方法(1)先體外後體內和(2)體內基因治療。在先體外後體內基因治療中，從患者取出細胞，在培養的同時體外處理。一般來說，經合適的基因遞送載體/方法(轉染、轉導、同源重組等)和符合需要的表達系統將功能替代基因導入細胞中，然後在培養物中擴增修飾型細胞，並將其返回宿主/患者中。業已表明，這些經遺傳再植的細胞原位表達轉染的遺傳材料。在體內基因治療中，不從受試者取出靶細胞，而是將待轉移的遺傳材料原位(即處於接受者內)導入到接受者生物細胞中。在替代實施方案中，如果宿主基因是缺陷型的，則所述基因原位被修復(Culver,1998.(摘要)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,1998年2月，Coronado,CA)。業已表明，這些基因改造細胞原位表達轉染的遺傳材料。基因表達載體能夠將異源核酸遞送/轉移入宿主細胞中。表達載體可包含以本領域已知的細胞選擇性方式控制核酸的耙向、表達和轉錄的元件。應當指出的是，經常可用表達載體的5'UTR和/或3'UTR替換所述基因的5'UTR和/或3'UTR。因此，本文使用的表達載體根據需要可不包含待轉移的實際基因的5'UTR和/或3'UTR,而僅包含特定的胺基酸編碼區。表達載體可包含控制異源材料轉錄的啟動子，且可為組成型或可誘導啟動子以允許選擇性轉錄。任選地，可包括獲得必需的轉錄水平可能需要的增強子。增強子一般為這樣的任意非翻譯DNA序列，其與編碼序列鄰接(以順式方式)而起作用，以改變啟動子控制的基礎轉錄水平。表達載體還可包括如下文所述的選擇基因。可通過本領域的多種已知方法中的任一種將載體導入細胞或組織中。這樣的方法一4殳可見於Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork1989,1992);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland1989);Chang等，SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,MI1995);Vega等，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMI(995),Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMA1988);和Gilboa等(Biotechniques4(6):504-512:1986)中的描述，且包括例如穩定或瞬時轉染、脂轉染、電穿孔和用重組病毒載體感染。另外，參見關於涉及中樞神經系統的載體的美國專利4,866,042,還參見關於正-負選擇方法的美國專利5,464,764和5,487,992。通過感染導入核酸提供了幾種超越其它列出方法的優勢。由於其感染特性可獲得較高效率。而且，病毒是非常特化的，且通常在特定細胞類型中感染和繁殖。因此，其天然特異性可用於將載體耙向體內或組織中或混合細胞培養物中的特定細胞類型。還可用特異性受體或配體修飾病毒載體，以通過受體介導的事件改變耙向特異性。導入並表達重組序列的DNA病毒載體的具體實例是腺病毒衍生載體Adenop53TK。該載體表達用於正或負選擇的皰滲病毒胸苷激酶(TK)基因和所需重組序列的表達盒。該載體可用於感染具有腺病毒受體的細胞，包括大部分上皮起源的癌症以及其它癌症。該載體以及表現出相似所需功能的其它載體可用於處理混合的細胞群，且其可包括例如體外或先體外後體內細胞培養物、組織或人受試者。還可包括限制特定細胞類型表達的特徵。這樣的特徵包括例如對所需細胞類型特異性的啟動子和調節元件。另外，重組病毒載體可用於所需核酸的體內表達，因為它們提供了諸如側向感染(lateralinfection)和靶向特異性的優勢。側向感染是例如逆轉錄病毒生活周期中固有的，是單個感染細胞產生許多子代病毒體、而這些病毒體出芽並感染鄰近細胞的過程。結果是大面積被快速感染，其中大部分開始時未被原始病毒顆粒感染。這與垂直型感染相對照，在垂直型感染中，感染因子僅通過子代傳播。還可產生不能側向傳播的病毒載體。如果所需目的是將特定基因導入僅局部化的大量靶細胞中，則該特徵可能有用。如上所述，病毒是高度特化的感染因子，其在許多情況下已進化得能避開宿主防禦機制。通常，病毒在特定細胞類型中感染和繁殖。病毒載體的耙向特異性利用其天然特異性，以特異性地耙向預定的細胞類型，且由此將重組基因導入被感染細胞中。本發明方法使用的載體取決於被靶向的所需細胞類型，且將是本領域技術人員已知的。例如，如果要治療乳腺癌，則應使用對此種上皮細胞特異性的載體。同樣，如果要治療造血系統的疾病或病理狀況，則應使用對血細胞及其前體特異性的病毒載體，優選對特定類型的造血細胞特異性的病毒載體。可構建逆轉錄病毒，以起感染性顆粒的作用，或僅進4亍單次初始感染輪次。在前一種情況下，修飾病毒基因組，從而使得其保持合成新病毒蛋白和RNA的全部必需基因、調節序列和包裝信號。一旦合成了這些分子，宿主細胞就將RNA包裝成新病毒顆粒，新病毒顆粒能夠進行更多輪的感染。還對載體基因組進行工程改造，以編碼和表達所需重組基因。對非感染性病毒載體來說，通常使載體基因組突變，以破壞將RNA被嚢化到病毒顆粒中所需要的病毒包裝信號。如果沒有此信號，形成的任何顆粒都將不含基因組，且因此不能進行至隨後輪次的感染。載體的具體類型取決於預期用途。實際的載體也是已知的，且在本領域容易獲得，或者可由本領域技術人員使用眾所周知的方法構建。重組載體可以幾種方式施用。例如，如果^吏用病毒載體，則所述程序可利用其革巴向特異性，並因此不必在患病部位局部施用。但是，局部施用可提供更快速和更有效的治療，施用還可通過例如靜脈內或皮下注射入患者中實施。將病毒載體注射入脊髓液也可用作施用模式，尤其是對神經變性疾病而言。在注射後，病毒載體將循環，直至它們識別具有適宜的感染靶向特異性的宿主細胞。在現有技術中基因治療規程遇到的最常見問題是效力差和宿主對載體的免疫應答。效力差可能起因於所遞送的材料不能進入細胞中、不能整合入基因組中或不能以合適水平表達。另外，隨著時間推移應答經常較差。這意味著可能有利的再施用經常由於上述免疫應答而成問題。這樣的治療應用包括靶組織中的血管生成的增強和抑制。根據針對本發明順式調節元件指導的核酸序列優先表達的細胞反應，可產生導致血管生成增強的內皮細胞增殖，或導致血管生成下降和局部缺血的內皮細胞增殖抑制。因此，在本發明的核酸構建體中包含其表達有細胞毒性的核酸序列，提供了在例如腫瘤的血管生成血管中將細胞死亡靶向快速增殖內皮細胞的方法。因為這樣的載體可全身施用，所以其可用於在發展中的轉移病灶中有效誘導細胞死亡，優於任何目前可獲得的鑑別和定位這種轉移擴散病灶的能力。這些可與本發明的構建體一起用於癌症基因治療的治療性核酸序列經常分類為目標在於恢復突變基因活性和控制的矯正性基因治療、目標在于敏化抗癌細胞之免疫系統的免疫調節性基因治療以及目標在於通過前藥或毒性劑(自殺基因治療)、促凋亡基因、抗血管生成基因或增強化療或放療來殺傷癌細胞的細胞減少性基因治療。適於與本發明的順式調節元件一起用於矯正性基因治療的核酸序列包括但不限於p53基因(GenBank登記號BC018819),其表達在癌細胞中受到抑制的抗瘤性DNA穩定基因；Cip/Kip(p21,GenBank登記號NM000389;和p27,GenBank登記號NM004064)和Ink4(pl4,GenBank登記號NM058197),細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。適於與本發明的順式調節元件一起用於抑制癌基因功能的核酸序列包括但不限於幹擾癌基因(例如ras、myc、erbB2和bcl-2)轉錄和翻譯的反義寡核普酸以及幹擾其翻譯的催化性核酶。抗癌基因反義多核苷酸和核酶多核苷酸的合成和使用方法在本領域眾所周知，且詳述於例如Roth等的美國專利第6,627,189號、Bennet等的美國專利第6,265,216號和Calabretta等的美國專利第5,734,039號，所有這些專利都完整地在此引入作為參考。製備和使用催化性抗癌基因核酶的方法描述於例如Leopold等的美國專利第5,635,385號，該專利完整地在此引入作為參考。在本發明的再一個實施方案中，在本發明的順式調節元件控制下表達的核酸序列涉及免疫調諧基因表達，設計用於防止肺瘤細胞和轉移細胞逃避免疫監視。編碼適於與本發明的順式調節元件一起使用的免疫調諧因子的核酸序列是細胞因子基因，用於增強細胞毒性T細胞識別腫瘤抗原和外源外來免疫原的胞內分子基因(以誘導非特異性局部免疫反應)。合適的免疫刺激因子包括但不限於人IL-2、幹擾素如人a、P或y幹擾素、人T細胞粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、人肺瘤壞死因子(TNF)和淋巴毒素(TNF-b)。人IL-2基因已克隆並測序，且可作為例如pBC12/HIV/IL-2(可得自美國典型培養物保藏中心("ATCC"),保藏號67618)的0.68kBBamHI-HinDIII片段獲得。此外，人(3幹擾素、人GM-CSF、人TNF和人淋巴毒素的序列是已知的並可獲得的。具體地說，人y幹擾素的序列是已知的(Fiers等，(1982)Philos.Trans.R.Soc.Lond.,BBiol.Sci.299:29-38),且已登錄於GenBank,登記號M25460。人GM-CSF的序列是已知的(Wong等(1985)Science228:810-815),且已登錄於GenBank,登記號M10663。人TNF序列業已描述(Wang等，(1985)Science228:149-154)，且登錄於GenBank,登記號M10988。人淋巴毒素(TNF-b)的序列也已公開(Iris等，(1993)NatureGenet3:137-145),且登錄於GenBank,登記號Z15026。在又一個實施方案中，在本發明的順式調節元件控制下表達的核酸序列涉及細胞減少性基因治療或通過直接或間接基因遞送殺傷耙細胞。在一個優選實施方案中，核酸序列是細胞毒性基因，例如但不限於自殺基因，如p53和egr-l-TNF-a,用於藥物易感性治療的細胞毒性前藥/酶，例如更昔洛韋/胸苷激酶和5-氟胞嘧啶/胞嘧咬脫氨酶，以及抗轉移基因，如5E1A。具體細胞毒性構建體的實例詳述於以下的實施例部分。在另一個實施方案中，在本發明的順式調節元件控制下表達的核酸序列可涉及遺傳放射性同位素治療將放射性標記的兒茶酚胺1131-間碘千基胍攝取入表達去曱腎上腺素受體(NAT)的細胞中，是已確立的用於嗜鉻細胞瘤、成神經細胞瘤、類癌瘤和甲狀腺髓樣癌的治療形式。或者，鈉硤同向轉運蛋白(symporter)(NIS)介導碘攝取入正常和惡性甲狀腺細胞中。業已報導，NIS基因作為轉基因在體外和體內模型中抑制前列腺癌。可使用相反的方法使組織再血管形成，例如在動脈粥樣硬化患者中或在由於疾病或損傷(例如糖尿病)而罹患顯著的外周循環損傷的患者中。在此情況下，可使用AdPPE-l-3X-GF型構建體，其中GF是生長因子(例如細胞因子)或其修飾物(例如AdPPE-l-SEQIDNO:7_GF)。用於本文上下文的合適生長因子包括但不限於VEGF(GenBank登記號M95200)和大鼠PDGF-BB(GenBank登記號；與mus-AF162784具有99%同一性)和EGR-1(GenBank登記號M22326)、FGF(包括但不限於GenBank登記號XM003306)及其組合。要認識到的是，優選按照本發明的該方面使用超過一種血管生成因子，以避免已表明與單獨施用VEGF相關的血管不成熟和血管退化的問題(關於進一步的細節，參見實施例部分的實施例27和31)。聯合治療可模擬內皮通道出芽的第一階段，且隨後募集平滑肌細胞以穩定新生血管[RichardsonDM等，(2001)Nat.Biotechnol.19:1029-1034]。本發明該方面的聯合治療可通過將目標多核苷酸克隆在相同核酸構建體上實施，所述目標多核苷酸的每一個都處於本發明的分離核酸調節之下。備選地或優選地，目標多核普酸的每一個都可分別克隆入本發明的核酸構建體中，由此使得能夠對誘導的血管生成過程更緊密地調節。低氧反應元件(例如SEQIDNO:5)摻入到本發明的啟動子序列中也可用於本發明，以進一步增強對局部缺血組織的表達選擇性，由此導致選定組織的新血管形成。隨著血液供應改善，局部缺血減輕，j氏氧反應元件不再被誘導，GF水平下降，且新血管形成過程被停止。應當認識到，4吏用本發明的核酸構建體對內皮組織進行基因治療，提供了用不能靶向血管生成內皮細胞的其它方法不可達到的時序協調。如以下的實施例部分所闡述的，含本發明的新增強子元件[例如PPE-l(3x)]的順式調節元件特異性地引導在經歷血管增殖的組織中的重組基因表達增加，同時防止重組基因在其它非血管生成組織中表達(參見實施例12、14、16、19、20、23、27、29、34和35)。在本發明的順式調節元件和構建體轉錄控制下的治療基因表達與基因產物所針對的細胞過程(血管生成性生長過程)的活化相一致，從而允許更高的效力和治療所需的有效劑量顯著下降。因此，預期含本發明的順式調節元件的構建體在基因治療背景中的使用可將向肺瘤的遞送最大化，同時使對周圍正常組織的毒性作用最小化。有意義的是，如在以下實施例部分中闡述的，即便在周圍組織含內皮組分的情況下也是如此。這是因為即便在PPE-1啟動子背景下，本發明的順式調節元件也極大地提高了快速增殖的內皮組織中的表達水平，如實施例16所^正實的。PPE-1啟動子的用途，但預期本發明的增強子元件在與其它真核啟動子序列一起使用時也將發揮其細胞特異性作用。這樣的預期基於現有技術的觀察結果，該結果表明，增強子元件經常是可移動的，即它們可由一個啟動子序列轉移至另一個不相關的啟動子序列並仍保持活性。例如，參見D.Jones等.(Dev.Biol.(1995)171(1》60-72);N.S.Yew等，(Mol.Ther.(2001)4:75畫820)和L.Wu.等，(GeneTher.(2001)8;1416-26)。實際上，Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)的早期工作強有力地表明，與本發明的那些增強子元件(例如含SEQIDNo.15和16或SEQIDNO:6的增強子)相關的增強子元件，可與組成型啟動子如SV-40啟動子一起使用。同樣，對於經修飾含本發明增強子序列的真核啟動子，包含其的構建體、使用其的方法和包含其的分離多核苷酸，完全屬於要求保護的本發明的範圍。因此，假定本發明增強子元件的最小配置是含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列的分離多核苷酸。預期該增強子與各種各樣的啟動子一起起作用，所述啟動子包括但不限於內皮特異性啟動子(例如PPE-1;SEQIDNO.:l)和組成型啟動子，例如病毒啟動子，如來源於CMV和SV40的啟動子。此增強子應當能夠向各種各樣的啟動子賦予內皮特異性。所述增強子元件可被增大，例如通過加入一個或多個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。這些額外的序列可鄰接或非鄰接地加入到SEQIDNO:8序列中。本發明還包括在內皮細胞中表達目標核酸序列的方法，該方法使用依賴於增強子元件和啟動子的構建體，所述增強子元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，以將目標序列高水平表達特異性地導向內皮細胞。本文所用的"對從受試者身體取出的細胞先體外後體內施用並隨後將所述細胞再導入所述受試者身體內，，具體包括幹細胞的應用，如在(Lyden等(2001)NatureMedicine7:1194-1201)中所描述的。儘管在下文給出的實施例中描述的實驗中使用腺病毒，但是本領域普通技術人員可容易地使本發明的構建體適合於其它病毒遞送系統。含有內皮細胞特異性啟動子的病毒載體也可以與其它方法聯合使用，以增強所述病毒載體的耙向。這樣的方法包括短肽配體和/或雙特異性或雙功能性分子或雙抗體(Nettelbeck等，MolecularTherapy3:882;2001)。要指出的是，在基因治療背景下針對組織中表達的治療性轉基因的宿主免疫應答，在開發和設計有效的基因治療規程方面是重要考慮因素。針對重組轉基因產物的不利免疫應答既可幹擾藥物遞送的效力，又可導致炎症、細胞毒性和疾病。因此，所表達的重組治療性分子的抗原性潛力在基因治療中極為重要。在將本發明付諸實施時，出乎意料地揭示出作為Ad5PPE-l(3x)核酸構建體的部分表達的人多肽(TNF-R1)(實施例41,圖95b)在小鼠中沒有抗原性，且在宿主中不誘導顯著的免疫應答，儘管明顯存在針對施用處於CMV啟動子控制下的Fas-c嵌合基因的抗TNF-R1應答(圖95)。因此，本發明的分離多肽可用於降低或消除針對一種或多種內源表達的重組轉基因產物的宿主免疫應答，這可通過在細胞中表達處於本發明的順式調節元件轉錄控制下的重組轉基因(或基因)來實現。優選地，所述順式調節元件是PPE-1(3x)啟動子。在將本發明付諸實施時，令人驚奇地揭示出血管生成內皮特異性啟動子PPE-l(3x)響應於抗血管生成治療的額外增強。圖94表明，響應於施用雙重內皮素受體(ETA和ETB)拮抗劑波生坦，在攜帶核酸構建體的轉基因小鼠的高度血管形成器官(主動脈、心臟、肺、氣管和腦)中的螢光素酶表達優先增強，其中所述核酸構建體含處於PPE-l(3x)控制下的的治療性重i基因的轉基因表達組合的這種協同作用提供了先前未公開的藥物靶向和降低的抗血管生成治療劑量需求的可能性。儘管不希望受限於單一假設，但認為針對抗血管生成治療的內源組織反應，在經自分泌環活化內皮素啟動子誘導物時，實際上增強了本發明核酸構建體的內皮素啟動子元件。因此，在一個實施方案中，包含本發明的順式調節元件的構建體與附加的抗血管生成治療聯合施用，其中選定的抗血管生成治療能夠誘導內皮特異性啟動子活性的內源增強子。抗血管生成治療在本領域眾所周知，包括但不限於內皮素受體拮抗劑如波生坦、VEGF受體拮抗劑、制管張素和內皮抑制素以及抗血管生成抗體，例如貝伐單抗(Bevacizumab)和Novast。動子活性的其它順式調節元件的構建體的施用，和能誘導內皮特異性啟動子活性的這些附加療法的組合，可以用於增加包含促血管生成序列的構建體的表達，從而增強血管生成活性，例如，在局部缺血狀況的治療中。在將本發明進一步付諸實施時，表明與B-形式特異性內皮素受體拮抗劑(BQ788)溫育牛主動脈內皮細月包(BAEC)i秀導內皮特異性啟動子[PPE-1(3X)]活性的增強，而暴露於A-形式內皮素受體激動劑(BQ123)對內皮素啟動子活性沒有作用(圖96)。使用表達在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶基因的轉基因小鼠的進一步實施已經表明，BQ-788對B-形式內皮素受體的阻斷導致增加的內皮素轉錄和循環血漿內皮素的增加(圖97A和97B)。因而，在一個實施方案中，與附加療法相組合地施用包含本發明的順式調節元件的構建體，其中所述附加療法是B-形式內皮素受體的阻斷。這樣的阻斷可以通過非選擇性的內皮素受體拮抗劑，例如、但不限于波生坦；A-186086;Ro畫61畫6612;SB-209,670;SB-217,243;PD142,893;和PD145，065,或通過選4奪性的B亞型內皮素受體拮抗劑，例如、開於AntineoplasticAgents(PaulCalabresi和BruceA.Chabner)笫52章和其中的引言、Goodman和Gilman的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",第8版,1990,McGraw-Hill,Inc.(HealthProfessionsDivision)的1202-1263中的那些抗瘤劑。應當認識到，儘管優選靶向接觸配體或細胞毒性前藥的細胞，但本發明還設想本發明的核酸構建體在不接觸配體或細胞毒性前藥或者天然不受其影響的細胞中表達。在此情況下，本發明的方法包括將此配體或前藥施用於轉化細胞的步驟。這樣的施用可通過使用任一種上述施用方法實現。優選地，所述配體或前藥使用例如抗體綴合的耙向以細月包耙向的方式施用，從而使得細胞毒性的活化是高度特異性的。細胞毒性或凋亡活化的這種方法詳述於以下的實施例部分。因此，本發明提供核酸構建體、含此種構建體的藥物組合物和使用此種構建體在以過度或異常血管生成為特徵的組織區中下調血管生成的方法。由於本發明使得能夠在特定細胞亞群中靶定表達，所以本發明還可進行修改並用於治療各種腫瘤。因此，按照本發明的另一方面，提供治療胂瘤的方法。本發明該方面的方法通過在腫瘤細胞中表達上述嵌合多肽或自殺基因來實施。因此，根據本發明的這一方面，所述多肽嵌合體或自殺基因的表達由腫瘤特異性元件指導，所述腫瘤特異性元件例如但不限於胃泌素釋放肽(GRP)啟動子[AF293321S3;MorimotoEAnticancerRes2001年1月畫2月；21(1A):329-31]、hTERT啟動子[AH007699;GuJ,GeneTher2002年l月；9(1):30-7]、己糖激酶II型啟動子[AF148512;KatabiMM,HumGeneTher.1999年1月20日；10(2):155-64]或L絲束蛋白啟動子[L05490,AH002870,MMU82611;PengXY,CancerRes.2001年6月1日；61(11):4405-13]。多肽嵌合體(例如Fas-c)或自殺基因在腫瘤細胞中的表達激活這些細胞中的細胞毒性和/或凋亡，並從而導致細胞死亡，這進而引起腫瘤生長減緩或停滯，並有可能引起腫瘤收縮。在檢查以下的非限制性實施例後，本發明的其它目的、優點和新特徵對於本領域普通技術人員而言是顯而易見的。另外，上文敘述的和下文權利要求書部分所要求保護的本發明各種實施方案和方面的每一個都在以下實施例中得到實驗支持。,滋奔現在參考以下實施例，連同以上的描述一起，以非限制性方式闡述本發明。分子技術、生物化學技術、、微生物學技術和重組DNA:術r這些技術在文獻中有詳盡解釋。參見例如"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Samb謹k等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"I-III巻,Ausubel,R.M.編輯,(1994);Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA，，，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",1-4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美國專利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192，659和5,272,057號中敘述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，I畫III巻Cellis,J.E.編著(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"I-III巻ColiganJ.E.編輯，(1994);Stites等(編輯)，"BasicandClinicalImmunology，，(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯)，"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);可用的免疫測定在專利和科學文獻中有全面描述，參見例如美國專利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4，034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521號；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.編專耳，(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯,(1985);"TranscriptionandTranslation，，Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯，(1984);"AnimalCellCulture"Freshney,R丄.編輯，(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes，，IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning，，Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"l-317巻，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996》所有這些文獻均如同在本文完整敘述一樣引入到本文中。其它通用參考文獻貫穿於本文件提供。其中的程序一般認為是本領域眾所周知的，且僅為方便讀者而提供。其中所包含的所有信息都在此引入作為參考。具體地說，結合下文提及的實施例進行的實-瞼使用以下方法和材料使Lewis肺癌細胞-(D122-96)、人胚腎細胞(293)和HeLa細胞在補加了10。/。胎牛血清(FCS)、50U/ml青黴素、50g/ml鏈黴素和2mM穀氨醯胺的4.5gr/1DMEM(Biologicalindustries,Belt畫Haemek,以色列)中生長。使牛主動脈內皮細胞-BAEC、正常皮膚成纖維細胞-NSF、HepG2和人臍內皮細胞-HUVEC-304(ATCC,USA)在補加了5%FCS、50U/ml青黴素、50g/ml鏈黴素和2mM穀氨醯胺的1.0gr/1DMEM(Biologicalindustries,Beit-Haemek,以色列)中生長。給BAEC細胞補加完全成纖維細胞生長因子(Sigma,St.Louis.MO.)。使RINrl046-38(RIN-38)在補加了5%FCS(BiologicalIndustries,Beit-Haemek,以色列)、50U青黴素/ml、50g鏈黴素/ml和2mM穀氨醯胺的199Earle氏鹽(5.5mM葡萄糖)培養基中生長。本文所用的"HepG2，，指ATCC-HB-8065。本文所用的"HeLa"指ATCC-CCL-2。本文所用的"人支氣管上皮細胞"和"B2B"指ATCC-CRL-9609。本文所用的"HUVEC"和"人臍靜脈內皮細胞"指ATCC-CRL-1730。本文所用的"CHO"和"中國倉鼠卵巢"指ATCC-61。轉染或轉導後26小時，將細胞在分離的室中溫育，用以N2平衡的含有0.5%02、5%C02的氣流洗滌30分鐘。將該分離的室置於5%C02、37。C溼潤培養箱中。匆/《f^^歡^資i為了定量測定PPE-1啟動子的體外和體內活性，使用螢光素酶基因表達系統試劑盒(PromegaCorp.,Madison,WI)。轉染或轉導後48小時，洗滌細胞，加入2001裂解緩衝液達15分鐘。收集細胞裂解液，於4。C離心15分鐘(14,000rpm)。隨後，加入101上清液至501螢光素酶測定緩衝液中。用發光計測量20秒時間段內的所述活性。為了測定實體組織中的螢光素酶活性，切取20mg樣品，且在1ml勻漿溶液中勻漿，並於4°C離心15分鐘(14,000rpm),如上所述測定10ml上清液中的螢光素酶活性。結果以螢光素酶光單位/lg蛋白表示。蛋白質採用Bradford測定測量，以牛血清清蛋白(BSA)為標準。謬^^^t力GF屍承#為了測試GFP的體外表達，細胞用PBS洗滌兩次，並用新鮮製備的4。/。低聚甲醛的PBS溶液固定30分鐘。固定後，通過螢光顯微鏡術進行檢查。為了測試所遞送基因的體內細胞分布，將組織在新鮮製備的溶於0.1M磷酸鹽緩衝液的4%低聚甲醛中於4。C固定6小時，在30%蔗糖中於4°C浸泡過夜，然後在OCT化合物(Sakura,USA)中冷凍。用恆冷切片機將組織塊切成10m厚的切片，然後直接在螢光顯微鏡(FITC濾光片)乂#豸勿/《和靜,感勿應為了比4支增殖和靜息BAEC中的PPE-1啟動子活性，將細胞分成兩組1.增殖細胞一在10。/oFCS培養基中生長和感染。2.靜息細胞一轉導前72小時內開始在無血清培養基中生長和感染。使所有細胞皆在5%C02、37。C溼潤培養箱中生長。f邀《劍^潛曹麇;^善^斬務構建幾個重組複製缺陷型腺病毒(5型)。包含鼠前內皮素原-1(PPE-1)啟動子(SEQIDNO:l)的表達盒位於螢光素酶基因(來源於pGL2-basic,GenBank登記號X65323)上遊，且將SV40聚腺苷酸化位點(來源於pGL2-basic,GenBank登記號X65323)連接到pPAC.plpA(無啟動子構建體)的BamHI限制位點。將GFP基因(來源於pEGFP,GenBank登記號AAB02572)於Notl限制位點與PPE-1啟動子連接。按照Becker,T.C.等(MethodsCellbiol.43;RothM.(編著)NewYork.AcademicPress,1994,161-189頁)所述，通過將pPACPPE-lLuc或Ad5PPE-lGFP與腺病毒質粒pJM17共轉染，製備^皮稱為Ad5PPE-lLuc或Ad5PPE-lGFP的複製缺陷型重組腺病毒，然後收穫重組病毒體。製備大規模生產用病毒。將濃度為109-1012噬斑形成單位/ml(pfu/ml)的病毒原液於4。C貯存。按照對PPE-1病毒載體的描述製備供大規^t製備用的含有巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子(GenBank登記號U47119)的病毒Ad5CMV畫Luc和Ad5CMV-GFP(Quantumbiotechnologies,Carlsbad,加拿大)，並將其用作非組織特異性對照。屍屍E啟動子^發謬通過將Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)發現的正轉錄元件的三個拷貝插入到位於43個鹼基對內源正元件(-364至-320bp)下遊(-286bp)的Nhel限制酶位點，開發修飾型鼠PPE-1啟動子。本文稱為"3X"的增強子片段是鼠PPE-1啟動子中存在的內源序列元件(SEQIDNO:1的核普酸坐標407-452)的三重拷貝。先前已經表明，血管內皮細胞中PPE-1啟動子活性的誘導依賴於該元件的存在(Bu等，J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)。通過用長度為96個鹼基對的兩條互補單鏈DNA鏈(BioTechnologyindustries;NesTziona,以色列)(SEQIDNO:2和3)合成3X片段。使所述兩個單鏈DNA片段退火，且用克列諾(Klenow)片段(NEB)填補；所得的雙鏈DNA長145個鹼基對，並包含Nhe-l限制位點(SEQIDNO:4)。用T4連接酶，將所述3X片段連接到內源Nhe-l位點下遊的鼠PPE-1啟動子中。讓所得的構建體在DH5感受態細胞中繁殖，且用大量製備Qiagene試劑盒生產大規沖莫質粒製劑。絲#在野^，屍屍￡-/y^^子含有1.4kb鼠前內皮素原-1(PPE-1)啟動子、具有SV40聚腺苷酸化信號(GenBank登記號X65323)位點的螢光素酶基因和鼠ET-1基因的第一內含子的PPE-l-螢光素酶盒(5249bp)來源於Harats等(J.Clin.Inv.(1995)95:1335-1344)使用的pEL8質粒(8848bp)。用BamHI限制酶從pEL8質粒中提取PPE-l-螢光素酶盒，然後用提取試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)從1%瓊脂糖凝膠中提取DNA片段。尤啟動子p屍」G>//^4|在含有腺病毒5型序列的無啟動子pPAC.plpA質粒(7594bp)來源於pPACCMV.pLpA(8800bp)。用Notl限制酶除去CMV啟動子、多克隆位點和SV40聚腺普酸化位點(1206bp),從1%瓊脂糖凝膠中提取片段化DNA。該線性質粒(7594bp)通過克列諾片段填補，且用快速DNA連接試劑盒將BamHI接頭與兩個粘性末端連接。該線性質粒用T4DNA連接酶再連接，並轉化到DH5a感受態細胞中，以擴增具有BamHI限制位點的pPAC.plpA。製備供大規模製備用的質粒，並用大量製備DNA純化試劑盒純化。盧C屍屍E-/f^,凝婁在通過用T4DNA連接酶，將PPE-l-螢光素酶盒插入到pPAC.plpA質粒的BamHI限制位點中，構建pPACPPE-l安光素酶質粒。隨後用該質粒轉化DH5a感受態細胞。製備大規模製備用質粒(12843bp),並用大量製備DNA純化試劑盒純化。盧C屍屍E腿/GF屍者在通過用T4DNA連接酶，將位於PPE-1啟動子下遊的GFP基因(來源於pEGFP,GenBank登記號AAB02572)亞克隆到Notl限制位點中，構建pPACPPE-1GFP質粒。隨後用該質粒轉化DH5a感受態細胞。製備大規模製備用質粒(11,801bp),並用大量製備DNA純化試劑盒純化。/^C屍屍五-"Z#乂,雄|在和;^403屍五-/3;^(^^,在通過將經BamHI限制酶消化由含有Luc或GFP的pEL8-3X(圖26B)獲得的PPE-l-3XLuc盒或PPE-1-3XGFP盒插入到pPAC.plpA質粒的BamHI限制位點中，構建pPACPPE-l-3X螢光素酶和pPACPPE-l-3XGFP。pEL8-3X含有位於BamHI和Notl之間的修飾型鼠PPE-1啟動子(1.55kb)(紅色)，所述啟動子含有位於兩個NheI位點之間的三重內皮特異性增強子3X(如SEQIDNO:7所示)。所述啟動子、螢光素酶基因或GFP基因、SV40聚腺苷酸化位點和內皮素-1基因的第一內含子，它們一起被稱為PPE-1修飾性啟動子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶對其進行消化和提取。製備供大規模製備用的質粒(12843bp)，並通過大量製備DNA純化試劑盒純化。SV40-螢光素酶才艮道質粒(PromegaGmbh,Manheim,德國)用作BAEC實-瞼中的非選^奪性啟動子對照。Z)A^脊^-轉導前24小時，將細胞接種到24孔或96孔亞中。對樣品孔內的分匯合(subconfluent)細胞進行計數。然後，吸出各孔中的生長培養基，且將指定病毒載體以指定的感染複數(MOI)在感染培養基(DMEM或RPMI1640,2%FBS)中稀釋並加入到單層中。將細胞在室溫下溫育4小時。然後，加入完全培養基，且將該細胞在37°C、5%(:02下溫育72小時。動參所有動物程序都得到ShebaMedicalCenter,Tel-Hashomer的"AnimalCareandUseCommittee，，批准。使用以下的不同小鼠品系(i)3月齡雄性野生型C57BL/6小鼠(Harlanfarms,Jerusalem,以色列)。(ii)3月齡雄性BALB/C小鼠(Harlanfarms,Jerusalem,以色列)。(111)6月齡雄性和雌性ApoE基因缺陷型、C57BL/6xSJ129小鼠的小鼠雜種(PlumpAS.等，Cell(1991)71:343-353)。(iv)3月齡雄性和雌性小鼠，該小鼠超表達處於鼠PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶基因(5.9Kb),由Harats等產生(J.Clin.Inv.(1995)95:1335-1344)。所有小鼠都在脂質和動脈粥樣硬化研究所(LipidsandAtherosclerosisResearchInstitute)生長。j￡,v、it哞w逸歡差^4這為了測定效率和組織特異性，如上文所述，將101Qpfu/ml的Ad5PPElLuc或Ad5CMVLuc(作為非組織特異性對照)懸浮於100l生理鹽水中，然後注射到小鼠尾靜脈內。注射後1天、5天、14天、30天和90天測定螢光素酶活性。為了定位所表達報告基因的細胞分布，將Ad5PPE-lGFP或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml，在100|ul生理鹽水中)注射到3月齡正常雄性C57BL/6小鼠尾靜脈內。注射後5天檢測GFP表達。所有小鼠看來都健康，並且在肝或其它組織中未見毒性或炎症。邀織哞的GF屍活#為了測試所遞送基因的體內細胞分布，將取自注射小鼠的組織樣品在新鮮製備的溶於0.1M磷酸鹽緩沖液的4%低聚甲醛中於4。C固定6小時，在30%蔗糖中於4。C浸泡過夜，然後在OCT化合物(Sakura,California,USA)中冷凍。將組織塊切成10m厚的切片，且直接在螢光顯微鏡(FITC濾光片)下觀察。用胰蛋白酶/EDTA收穫Lewis肺癌糹田月包(LLC),用PBS洗滌3次，且用0.1。/o錐蟲藍(Biologicalindustries,Beit隱Haemek,以色列)計數，以評價其生存力。為了測試小鼠腫瘤血管生成中的PPE-1啟動子活性的活性水平，使用兩種不同的腫瘤膜型。在原發性肺瘤膜型中，將細胞(lxl(^細胞/ml，在100l生理鹽水中)皮下注射入小鼠背部(n=17)。注射後21天，將Ad5PPE-1、Ad5PPE-1GFP、Ad5CMV或Ad5CMVGFP(101Qpfu/ml)注射到腫瘤組織(IT)中或進行靜脈內注射，且如上所述才企測其活性。在轉移性腫瘤^t型中，給小鼠爪墊(n=12)注射細胞(5x105糹田月包/ml，在501生理鹽水中)。當肺瘤組織的直徑達到0.7mm大小時，在麻醉和無菌條件下切除爪墊(帶有原發性腫瘤)。外科手術後14天，給小鼠尾靜脈內注射病毒(Ad5PPE-l、Ad5PPE-lGFP、Ad5CMVLuc或Ad5CMVGFP)。在這兩種胂瘤實驗模型中，注射病毒後5天處死小鼠，切下其組織，且測試螢光素酶活性或GFP活性。^口奮合微通過皮下注射戊巴比妥鈉(6mg/kg)麻醉3月齡雄性C57BL/6小鼠。剃下其背上的毛，且作5cm直切口。立即用4/0無菌絲線將切口縫合。通過H&E和抗von陽Willibrand抗體免疫組織化學染色,每兩天檢查癒合傷口中的血管生成過程。作切口後io天，尾靜脈全身注射101Qpfu/ml的Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc。注射後5天，處死小鼠，且如上所述測定切口部位皮膚和作為對照的正常對側部位中的螢光素酶活性。逾歡夢#》普-為了評價肺瘤和轉移組織中血管生成的程度，將組織切成5pm厚的切片，且用蘇木精和伊紅(H&E)染色。用抗CD31(大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體，Pharminogen,NJ,USA)抗體分析胂瘤模型中的新血管形成。^f口屍Z)G/^8脊羞^《這-重組複製在夬陷型A泉病毒血;青型5長口Varda-Bloom,N.等[Tissue-specificgenetherapydirectedtotumorangiogenesis.(2001)G置77zw8,819陽27]所述構建。筒而言之，對pACCMV.pLpA質粒進行修飾，以包含處於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子調節之下的鼠VEGF165(GenBank登記號M95200)或大鼠PDGF-B(GenBank登記號AF162784)的cDNA。用相同的cDNA序列構建pACPPE-l-3X質粒，其中CMV啟動子一t修飾型鼠前內皮素原-l(PPE-1-3X)啟動子取代。每種質粒與pJM17質粒共轉染到HEK293細胞中，以產生各種重組腺病毒。讓病毒在HEK293細胞中繁殖並降至101QPFU/ml的濃度。對照載體用類似地產生。V、薦^麼^^4ii&模f我差^治^-至少12周齡的雄性和雌性C57B16小鼠(HarlanLaboratoriesLtd.,以色列)4姿照AnimalCareandUseCommitteeofShebaMedicalCenter的指南進行維持。才艮據先前介紹的規程[Couffinhal,T.等,Mousemodelofangiogenesis.爿m/屍^oZ152,1667-79.(1998)],誘導後肢局部缺血。簡而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg,IP)麻醉動物。剃掉肢體軟毛後，對鄰近隱動脈和腦動脈分叉處的右股動脈進行結紮。結紮後5天，靜脈內施用1(^PFU的各種腺病毒載體。-採用Synergy超聲波系統(GeneralElectric,USA),於7.5MHz以血管造影方式，在結紮後以7天的間隔，進行超聲波成像。在成像時讓動物甦醒並受約束。讓動物在常規條件下適應最高達90天。^瘦逸織必夢-將處死的局部缺血小鼠的兩個後肢骨胳肌和肝組織在OCT化合物中冷凍，並進行冷凍切片。內皮細胞用大鼠單克隆抗CD31抗體(PharMingen,SanDiego,CA)進行免疫染色。平滑肌細胞用小鼠多克隆抗-a-SMactin抗體(SIGMA，St.Louis,MO)進行免疫染色。背景用蘇木精染色。-由局部缺血動物的兩個後肢製備5pm骨胳肌切片。用有義或反義DIG-標記探針對VEGF165或PDGF-B進行原位雜交，然後用抗DIG畫AP綴合物(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,德國)斥企測洋地黃毒苦(DIG)。背景用曱基綠染色。塔謬*工-運用Image-ProPlus軟體工具(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)處理超聲波圖像。計算出每幅圖像說明最強灌注的著色像素數。血管生成的調節劑-給轉基因小鼠飼餵正常食物飲食或補加了波生坦(ActelionLtd.,Allschwil,瑞士)，雙重ET-1A/B受體拮抗劑的々大食。假定一隻動物每天消耗4g食物，給每隻小鼠施用100mg波生坦/kg體重，持續30天。處死動物，並4企測螢光素酶活性，肺ET-lmRNA水平和irET-l血清水平。統^夢為、if運用t-檢驗ANOVA或Mann-Whitney秩檢驗，對各組間統計學顯著性差異進行分析。數據以平均值+SE表示。力發勿/^U4五C)和"3勿應^炎源亡差^;矛####源定在癌症治療中，抗血管生成治療靶向滋養生長中的腫瘤的發展中脈管系統[FolkmanJ.NEnglJMed(1995)333(26):1757-63]。隨著凋亡或程序性細胞死亡研究的進展，已鑑定出了眾多編碼選擇性和有效的細胞死亡調節劑的基因[Strasser等，AnnuRevBiochem(2000)69:217-45]。本研究篩選了幾種促凋亡基因，以鑑別最適於抗血管生成治療的試劑。經PCR擴增幾種促凋亡基因，包括MORT1(FADD-Fas相關死亡結構域蛋白，GenBank登記號NM—003824)、RIP(受體-相互作用-蛋白，GenBank登記號U25995)、CASH(c-FLIP,GenBank登記號AF0]0127)、MACH(胱天蛋白酶8GenBank登記號X98172)、CPP32(胱天蛋白酶3,GenBank登記號U13737)、胱天蛋白酶9(U60521)和先前描述的兩個"死亡受體"的融合體Fas-嵌合體(Fas-c),其是由TNFR1的胞外區和Fas的跨膜區和胞內區域構建的[BoldinMP等，JBiolChem(1995)270(14):7795-8,參見圖la],並利用眾所周知的現有克隆技術克隆入pcDNA3(Invitrogen,Inc.)哺乳動物表達載體中。這些促凋亡基因構建體隨pGFP—起在BAEC(牛主動脈內皮細胞)和用作非內皮對照細胞的293細胞中共表達。轉染後24小時，利用螢光顯微鏡術分析細胞。用螢光顯微鏡術根據典型形態學(即小而圓的形狀)鑑別凋亡細胞(圖2a-b)。用電子顯微鏡術實施凋亡表型的進一步評價(圖3a-f)。凋亡作用的定量表明，M0RT1、TNFR1和Fas-嵌合體在BAEC和293細胞中誘導最高的凋亡活性(圖4a-b)。在這方面，胱天蛋白酶3和9效力較低，這可能是因為它們為無活性酶原形式。根據這些結果，選擇Fas-嵌合體(Fas-c)基因來產生用於抗血管生成治療的腺病毒載體。於修謬f屍屍五-/^^^f7V^-/pjc"^^7"#/^v-^^##,將編碼全長Fas-嵌合體的cDNA亞克隆到包含修飾型前內皮素原1啟動子的質粒pPACPPEl-3x中(參見圖lb)。通過將該質粒與pJM17質粒共轉染到人胚腎293細胞中製備重組腺病毒。通過PCR擴增驗證成功的病毒克隆(圖5a)。為了測定Fas-c在粑細胞中的表達，用指示滴度的Ad-PPE-l(3x)-Fas-c轉導內皮BAEC細胞。轉導後72小時裂解細胞，並用非還原性SDS-PAGE凝膠分離細胞蛋白。用抗TNFR1抗體(Sc-7895，Santa-CruzBiotech)進行蛋白質印跡分析。如圖5b所試實的，於45kD處遷移的主條帶非常明顯，且其表達是劑量依賴性的，提示所述嵌合蛋白正確摺疊和表達。相反，在非轉導內皮細胞或用對照空病毒載體轉導的細胞中沒有明顯的對應條帶。因此，這些結果證實，腺病毒介導的Fas-c基因轉移導致靶細胞中的轉基因表達。爿^屍/^-7f3;c」-F^-c襲迷謬^力發細^源亡測定Ad-PPE-l(3x)-Fas嵌合體誘導內皮細胞凋亡的能力。如圖6a-b所示，前內皮素原指導的、腺病毒介導的內皮細胞轉導導致明顯且大量細胞死亡；用Ad-PPE-l(3x)-Fas-c(103MOI)感染的HUVEC和BAEC有經受凋亡的粘附細胞的形態特徵，包括膜起泡、變圓和皺縮以及脫離培養皿。相反，用對照病毒以相同MOI感染的細胞維持正常外觀和生長速率。用100MOI轉導的細胞僅表現出最低程度的細胞死亡(數據未顯示)。通過在表達受PPE-1啟動子控制的報告基因GFP的細胞中表達此病毒，對Ad-PPE-l(3x)-Fas-c的細胞毒性特性實施進一步評價。如從圖6c-d中明顯可見，大部分轉導細胞在轉導後72小時獲得典型凋亡外觀，而用對照病毒和Ad-PPE-GFP共轉導的細胞看起來正常。利用結晶紫染色來定量Fas-c的細胞毒性作用。如圖7所示，用Ad-PPE-Fas-c感染BAEC和HUVEC分別導致57%和65%的死亡率，而對照病毒不影響細胞生存力。通過用此載體感染NSF(正常皮膚成纖維細胞)證實促凋亡載體Ad-PPE-Fas-的內皮細胞特異性。這些表達低水平PPE-1的細胞[Varda畫Bloom,N.等,GeneTher8,819-27.(2001)]不受Ad-PPE-Fas-c感染影響。相反，重組載體Ad-CMV-Fas-c在這些細胞中誘導凋亡。#^7^^7yW-P/^-/px」-/^w-cr€77^/^潔#以這#"#才4'乂#義傻遊亡/，研究了TNFot增大表達Fas-c的細胞中的凋亡作用的能力。將人TNFa添加到用Ad-PPE-Fas-c(MOI100)病毒感染後48小時的內皮細胞培養物中。24小時後測定細月包生存力。如圖8所示，TNFoc(10ng/ml)誘導Ad-PPE-l(3x)-Fas-c感染的細胞生存力下降73%,而單獨的TNFa或對照病毒(Ad-Luc)感染的細胞中沒有實現顯著死亡率。為證實TNFa的作用，處理細胞特異性。用Ad-PPE-Fas-c或對照病毒感染NSF(正常皮膚成纖維細胞)、DA3(小鼠乳腺癌)、D122(Lewis肺癌)和B16黑素瘤細胞。48小時後，向培養物中補力。TNFoc,且用結晶紫染色後評定細胞形態學。如圖9a-e所示，用Ad-PPE-Fas-c感染的非內皮細胞表現出正常外觀，且不受TNF影響。另一方面，腺病毒介導的Fas-c感染BAEC在添加TNF時導致細胞生存力明顯下降。圖10a顯示了由CMV啟動子驅動的Fas-c的非選擇性凋亡活性，說明Ad-CMV-Fas-c對內皮細胞的TNF依賴性凋亡作用。與TNF溫育後測定用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的BAEC細胞的生存力。值得注意的是，非內皮特異性載體Ad-CMV-Fas-c引起內皮細胞和非內皮細胞兩者的TNFa依賴性凋亡(圖lOb-d)。y^-屍屍E7f3"-F^-c,"^小^^^SM,要#4#:力蘭關,/夢用B16黑素瘤小鼠模型來檢驗由PPEl-3x啟動子表達的Fas-c的抗腫瘤作用。將B16黑素瘤細胞(8xl0"皮下注射到40隻C57bl/6小鼠脅腹區。當腫瘤可觸知(約5x5毫米)時，將小鼠隨機分成如下4組(i)對照一鹽水注射；(ii)對照病毒(包含受PPE啟動子控制的營光素酶的腺病毒)；(iii)包含受前內皮素原(PPE)啟動子控制的Fas-TNF受體嵌合基因的Ad-PPE1-3x-Fas-c-病毒；和(iv)包含受非內皮特異性CMV啟動子控制的Fas-TNF受體嵌合基因的Ad-CMV-Fas-c-病毒。用手持測徑器測量腫瘤大小(長和寬)。如圖lla所示，與對照小鼠相比，用Ad-PPEl-3x-Fas-c或Ad-CMV-Fas-c處理的小鼠肺瘤尺寸較小。在治療期結束時，Ad-PPEl-3x-Fas-c處理小鼠中的肺瘤重量也4支4氐(圖llb)。用Ad-PPEl-3x-Fas-c注射的小鼠顯示其肺瘤明顯壞死(圖llc)。脊移^^^,賴.'丄eM^都「4模婁,在轉移性Lewis肺癌模型中進一步檢驗PPE-l(3x)-Fas-c嵌合體的表達特異性和抑制腫瘤生長的功效。如下文詳述在雄性C57BL/6J中誘發肺LLC轉移，且以9天的間隔給小鼠注射兩次病毒載體AdPPe-l(3x)LUC、AdPPE-l(3x)-Fas-c和AdCMV-Fas-c(Greenberger等，JClmInvest2004;113:1017-1024)。在病毒施用後6天由小鼠收穫器官，且通過PCR測定Fas-c表達。PPE-l(3x)啟動子對Fas-c的轉錄控制導致表達受限於具有腫瘤的肺(結果未顯示)，與CMV-Fas-c-處理小鼠中的Fas-c表達的廣泛分布完全相反(未顯示數據,參見Greenberger等，JClmInvest2004;113:1017-1024)。此外，處理組和對照組的肺的總體病理學糹企查揭示，向具有轉移的小鼠施用AdPPE-l(3x)-Fas-c抑制腫瘤生長，且降低肺表面上生長肺瘤的大小，而對照動物肺幾乎被腫瘤組織完全取代(未顯示數據，參見Greenberger等，JClinInvest2004;113:1017-1024)。另外，處理小鼠和對照小鼠肺切片的組織病理學以及TUNEL和內皮特異性CD31染色揭示，向具有轉移的小鼠施用AdPPE-l(3x)-Fas-c在肺瘤組織中引起與對胂瘤血管內皮的廣泛損傷相關的大範圍凋亡和壞死。相反，對照處理小鼠的血管未受影響(未顯示數據，參見Greenberger等，JClinInvest2004;113:1017-1024)。31屍/^-/^在謬,/v^/i^為、^f為了分析PPE-l-3X的活性，對PPE-l-3X啟動子質粒和未經修飾的PPE-l啟動子質粒的報告基因表達進行比較。將含有PPE-1-3X片段或未經修飾的PPE-1片段以及報告基因螢光素酶的報告基因質粒轉染到內皮細胞系和非內皮細胞系以及表達PPE-l啟動子的支氣管上皮細胞系(B2B)中(參見上文的材料和方法)。選擇B2B細胞系是為了提供相對於PPE-1啟動子而言所述3X元件降低非內皮細胞系中表達的能力的指示。採用脂質轉染胺(PromegaCorp.,Madison,WI)完成轉染。每種情況下，按照公認的分子生物學實踐，用p-gal-neo質粒作為轉染效率的指示劑。轉染後48小時，用裂解緩衝液(PromegaCorp.,Madison,WI)收穫細胞，且用發光計(TD-20e—TurnerDesigns,Sunnyvale,California)分析螢光素酶活性。在平行實驗中，分析？gal活性，以將不同的轉化效率標準化。結果總結於圖12和表2中。處於PPE-3X控制之下的螢光素酶活性為處於未經修飾的PPE-l控制之下的螢光素酶活性的15-20倍。在非內皮細胞系中，用PPE-l和PPE-1-3X兩者片企測最4氐表達。這證明PPE-3X是用於在體內將基因特異性地遞送到內皮細胞中的有前景候選物。,2—1#p/V^-/-3ir資^#雜淘建#脊襲#勿應^^資itableseeoriginaldocumentpage88JW屍屍五-〃,^#躇^傳#活^和掙7^#也將PPE-1/螢光素酶、PPE-l-3X/螢光素酶、PPE-1/GFP和PPE-1-3X/GFP連接到Ad5質粒中，以產生Ad5PPE-l/Luc和Ad5PPE-l-3X/luc、Ad5PPE-l/GFP和Ad5PPE-l-3X/GFP(Varda-Bloom等,(2001)Genetherapy8:819-827)。如下文詳述，分別測定這些構建體。為了測試Ad5PPE-l/luc的活性，對B2B(人支氣管上皮)、BAEC(牛主動脈內皮細胞)和HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)進行轉染。這三個細胞系都表達內皮素基因，且選擇這些細胞系以指示被測構建體在內皮細胞中的表達水平。用不表達內皮素的RIN(大鼠胰島素瘤)細胞系作為陰性對照，且用相同構建體進行轉染。用Ad5CMVLuc(處於CMV啟動子控制之下的螢光素酶)作為所有細胞系中的非內皮特異性對照。圖13清楚說明，用PPE-1啟動子比用CMV啟動子在內皮BAEC和HUVEC細胞系中達到的螢光素酶表達要高。在非內皮來源的RIN細胞中，CMV啟動子比PPE-1啟動子產生的螢光素酶活性要高。這些結果證實了未經修飾的PPE-1啟動子的內皮特異性。爿必屍屍E-3ZLwc^M必屍屍E-3IGF屍用Ad5PPE-3X/螢光素酶和Ad5PPE-3X/GFP構建體轉染上文實施例7中所述的細胞系，以確定3X元件對特異性和表達水平的影響。如同在實施例7中一樣，用Ad5CMVLuc作為非內皮特異性對照。與CMV啟動子相比，在BAEC細胞系和HUVEC細胞系中檢測出處於PPE-3X啟動子控制之下的較高螢光素酶表達。圖14A是顯微照片，說明在BAEC細胞系中處於Ad5PPE-l-3X控制之下的GFP表達。圖14B是顯微照片，說明BAEC系中Ad5CMV的GFP表達。如這些圖所清楚顯示的，PPE-1-3X啟動子在內皮細胞中更有活性。這些結果清楚表明，所述3X元件不降低PPE-1啟動子的內皮特異性。下文實施例11中給出了PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子在細胞培養物中的相對活性。,^辨;55i^炎源亡法'/iW傳々",;C將P55(TNFR1,GenBank登記號M75866)亞克隆到PACPPE3X(含有PPE-1-3X啟動子)和PACCMV中後，如上文所述將這些質粒和GFP(pEGFP-Cl載體；CLONTECH，PaloAlto,CA)進行共轉染。簡而言之，通過T4DNA連接酶將所述基因亞克隆到PPE-1啟動子(而不是螢光素酶基因)下遊的Notl限制位點中，然後將其轉化到DH5a感受態細胞中。轉染後24小時，目測可辨別小而圓的凋亡細胞和正常細胞。用促凋亡質粒轉染的細胞的電子顯微鏡術顯示出典型凋亡外觀，從而證實所述目測評1介。在PPE-1-3X啟動子控制之下，p55僅在內皮細胞中誘導凋亡(圖15),而CMV啟動子沒有顯示任何細胞特異性活性。處於PPE-1-3X控制之下的螢光素酶在任何被測細胞系中都沒有誘導調亡。這些結果表明，通過應用PPE-1-3X啟動子，在內皮細胞中特異性地誘導凋亡是可行的。錄真A^^伴f7/Z^;T增強/庶真敏4V4力發-取敏f^/S差^^i^低氧是血管緊張性和結構的重要調節劑。還已表明，它是血管生成的有效刺激物(在缺血性心臟病和癌症中(Semenza,G丄.等，(2000)AdvExpMedBiol.;475:123-30;Williams,K.J.(2001)BreastCancerRes.2001:3;328-31和Shimo,T.(2001)CancerLett.174;57-64))。此外，據報導低氧調節許多基因包括促紅細胞生成素、VEGF、糖酵解酶和ET-1的表達。這些基因受共同的氧傳感途徑(oxygen-sensingpathway),稱為低氧誘導型因子-1(HIF-1)的誘導型轉錄複合體控制。所述HIF-1複合體通過結合靶基因的順式作用低氧反應元件(HRE)來介導對低氧的轉錄反應。HRE是位於對低氧應答的少數基因啟動子中的保守序列，所述基因包括VEGF、氧化氮合酶-2、促紅細胞生成素和包括內皮素-l-ET-1在內的其它基因。ET-1啟動子在轉錄起始位點上遊-118bp位含有反向低氧反應元件，該元件含有7個鹼基對，且位於GATA-2和-50鹼基對的API位點5'GCACGTT3'之間。(SEQIDNO:5)。前內皮素原-1(PPE-l)啟動子含有具有增加其在胂瘤或局部缺血組織的低氧微環境中表達之潛力的低氧反應元件(HRE),從而使其具有"腫瘤組織特異性"和/或"局部缺血組織特異性"。為了評價該HRE的實際功能，結合荄光素酶或GFP報告基因以及用腺病毒載體遞送對PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子進4亍測定。比較在BAEC細胞中在常氧和低氧條件(0.5%02達16小時)下處於PPE-1啟動子或PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性。處於PPE-1啟動子控制之下的安光素酶活性當暴露於低氧時提高至5倍(圖16和圖17)。此外，處於PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性在低氧條件下提高至2.5倍。概括地講，將3X元件導入PPE1啟動子中仍能夠增加下遊基因對低氧應答的表達水平，即使在用PPE-1-3X基因時常氧的表達水平比用未經修飾的PPE-1啟動子所觀察的表達水平高。乂力^7乂敘應屑f屍屍五-/-3J^和屍屍EW^^子談##遽一#伊估圖18總結了得自用pPPE-l/螢光素酶和pPPE-l-3X/螢光素酶的B2B、HUVEC和BAEC轉染實驗的結果。分別在B2B、HUVEC和BAEC中觀察到處於PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶表達高於處於PPE-1啟動子控制之下的安光素酶表達(是後者的30倍、8.5倍和1.5倍)。這些結果證實了上文給出的結果，並可用於確立PPE-1-3X非常適合將高水平表達特異性地導向內皮細胞。在將來的體內遞送背景中，用PPE-1-3X構建體實現的較高表達水平轉化為施用更少量的DNA。這進而會用來甚至進一步增加特異性。爿必屍屍￡-/Lwc^沐力^放羊、為了證實在實施例7-10中所觀察的表達的內皮特異性不是細胞培養物的人為產物，如上文在"正常小鼠中的組織基因表達，，中所述，將Ad5PPE-l/螢光素酶構建體注射到C57BL/6小鼠中。如同在所述體外研究中一樣，用Ad5CMV/螢光素酶作為陰性對照。注射腺病毒載體後，測定血管形成組織和非血管形成組織中的螢光素酶的特異性活性和穩定性。結果總結於圖19(相對於肝中表達的螢光素酶表達)和表3(螢光素酶表達以身體總表達的百分比表示)。正如所料，在Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠中，在肝中發現大部分螢光素酶活性(〉總身體表達的80%)。由PPE-1啟動子控制的螢光素酶活性在肝中較低(總身體表達的37-54%)。與Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠相比(最高達總身體表達的1.8%;表2),PPE-1驅動的表達在主動脈中高得多(在注射後5天和14天分別為總身體表達的23-33%)。這些結果證實了在細胞培養物中觀察到的內皮特異性。應記得的是，肝是高度血管形成器官。因此，如下文詳述對器官內的細胞表達進行檢查。《3—S#差於屍屍E-/和CMK^種建傳y^5乂和"乂器^^W:f尉麟顛tableseeoriginaldocumentpage92圖41A和圖41B圖示了110隻注射小鼠的主動脈(A)和肝(B)中的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。注射後1天0=13)、5天(11=34)、14天0=32)、30天(11=20)和90天(11=ll)測量螢光素酶活性。主動脈中的結果代表主要在內皮細胞中的啟動子(PPE-1或CMV)活性，而肝中的結果代表其主要在肝細胞中的活性。5J丄B/CV、itf爿必屍屍5W^謬力放羊，#一###口潛定^#都定在12周齡BALB/C小鼠(每組n=IO)中重複實施例12的實驗，以證明所觀察的結果不是特定動物品系的人為產物。因為用腺病毒載體得到的絕對結果在BALB/C小鼠中比在C57BL/6小鼠中低，所以螢光素酶表達以所有組織中總螢光素酶活性的百分比表示。在注射Ad5PPE-l的小鼠脾(90.9。/。)和注射Ad5CMV的小鼠肝(86.20/0)中觀察到注射後5天的最高相對螢光素酶表達。還觀察到注射後14天注射Ad5PPE-l的小鼠主動脈中的相對螢光素酶活性(32.9%)與注射後5天的其活性(1.75%)相比顯著增力口(圖42A和圖42B;Ad5PPE-lLuc—空心條Ad5CMVLuc—黑色條)。這些結果證實，無論用何種小鼠品系，PPE-1啟動子的組織特異性都足以強烈地有效消除肝細胞表達，儘管肝細胞優先攝入注射的DNA。爿^/5屍屍￡-/摩遽這差^^^力-欲應定在為了確定PPE-1表達的基因在體內的細胞表達部位，使用通過腺病毒載體Ad5PPE-l-GFP遞送的綠色螢光蛋白(GFP)。用Ad5CMVGFP(Quantum,加拿大)作為非內皮細胞特異性陰性對照。靜脈內注射後5天處死小鼠，並通過螢光顯微鏡術分析其組織。在注射Ad5CMVGFP載體的小鼠中，在肝細胞中檢測到大部分表達，而在肝內皮細胞中沒有檢測到表達(圖20A)。與之形成鮮明對比的是，注射Ad5PPE-l-GFP的小鼠(圖20B)顯示在肝細胞中沒有表達，但在肝血管內皮細胞中有顯著表達。在其它組織中也獲得相似的結果，在那裡於內皮中檢測到幾乎所有PPE-1驅動的表達，而CMV驅動的表達是非內皮性的。這些結果表明，內皮特異性甚至在含有內皮細胞和非內皮細胞的器官中也可保持。這一發現對預防生長中肺瘤的血管生成具有重大意義。^必屍屍五-/-37丄^^y4必屍屍EW-3ZGF屍^##放羊^力發#"###都定為了測定Ad5PPE-l和Ad5PPE-l-3X在細胞中驅動報告基因螢光素酶和綠色螢光蛋白(GFP)表達的相對功效，用上文所述細胞系體外測試內皮細胞中的特異性活性。用Ad5CMVLuc和Ad5CMVGFP作為非組織特異性對照。Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-lGFP用來確定因加入3X序列所引起的表達水平的相對變化。在圖21和圖22中總結的結果表明，在EC系(牛主動脈內皮細胞-BAEC)中處於PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性是在非內皮細胞一大鼠胰島素瘤-RIN、HeLA、HePG2和正常皮膚成纖維細胞(NSF)中的活性的5-l(H咅(圖21和圖22)。圖21顯示在Ad5PPE-lLuc、Ad5PPE-l-3XLuc和Ad5CMVLuc轉導的B2B細胞、BAEC細胞和RIN細胞中以光單位/pg蛋白表示的安光素酶活性。在Ad5CMVLuc轉導的RIN細胞中觀察到最高的螢光素酶表達，然而，該構建體在BAEC細胞和B2B細胞中表達差。在Ad5PPE-l-3Xluc轉導的BAEC細胞中觀察到次最高水平的螢光素酶表達。Ad5PPE-lLuc在BAEC細胞中以較低水平表達。在B2B細胞系中，Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3Xluc以幾乎相同的水平表達。總的來講，在相同感染條件下(moi=10),在內皮細胞系中處於PPE-1-3X啟動子控制之下的縈光素酶活性是處於PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶活性的23倍，且是處於CMV啟動子控制之下的螢光素酶活性的23-47倍，而處於CMV啟動子控制之下的非內皮RIN細胞中的螢光素酶表達高達3000倍(圖21)。為了確立PPE-1和PPE-1-3X在其它非內皮細胞語系中是無活性的，轉導了HeLA、HepG2、NSF細胞系。用BAEC作為內皮對照。圖22顯示了在用Ad5PPE-lLuc、Ad5PPE-l-3XLuc和Ad5CMVLuc轉導的HeLA細月包、HepG2糹田胞、NSF細胞和BAEC細胞中以光單位/pg蛋白表示的螢光素酶活性。用Ad5CMVLuc轉導在HeLA細胞、HepG2細胞和NSF細胞中引起高水平的螢光素酶表達。這些細胞系不能表達處於PPE-1控制之下的螢光素酶，在PPE-1-3X啟動子控制之下以低水平表達螢光素酶。正如所料，用Ad5PPE-lLuc或Ad5PPE-l-3XLuc轉導的BAEC細胞表現出高螢光素酶表達。綜合考慮，這些結果表明，將所述3X序列導入PPE-1啟動子中引起內皮細胞系中較高水平的表達，同時防止非內皮細胞中不想要的表達。加入3X序列至PPE-1啟動子中還增加EC系(牛主動月永內皮細月包-BAEC)中綠色焚光蛋白表達的水平，如描繪了以moi=l轉導的BAEC中的GFP表達的圖23A-C所示。在該實驗中，用CMV啟動子沒有觀察到GFP的表達。在圖23中，圖A表示Ad5PPE-l-3XGFP轉導的細胞，圖B表示Ad5PPE-lGFP轉導的細胞，而圖C表示Ad5CMVGFP。再次，將3X序列導入PPE-1啟動子中顯著增加報告基因的表達。這一結果表明，所述3X序列作為內皮特異性增強子起作用的能力並不隨待轉錄的下遊基因而變。此外，相比於在CMV啟動子下的高表達，Ad5PPE-l-3X-GFP和Ad5PPE-lGFP轉導導致在非內皮細胞SMC、HeLa、HePG2和正常皮膚成纖維細胞(NSF)中無GFP表達，如圖24-27中總結的。圖24顯示了以moi=1的Ad5PPE-l-3XGFP(圖A)或Ad5CMVGFP(圖B)轉導的SMC中的GFP表達。儘管Ad5CMVGFP轉導導致高水平GFP表達，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉導不引起GFP表達。圖25顯示了在HeLa細胞中進行的相似實驗的結果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l-3XGFP轉導的細胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉導的細胞。再次，儘管Ad5CMVGFP轉導導致高水平GFP表達，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉導不引起GFP表達。圖26顯示在HepG2細胞中進行的相似實驗的結果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l(3X)GFP轉導的細胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉導的細胞。再次，儘管Ad5CMVGFP轉導導致高水平GFP表達，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉導不引起GFP表達。圖27顯示了在NSF細胞中進行的相似實驗的結果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l-3XGFP轉導的細胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉導的細胞。再次，儘管Ad5CMVGFP轉導導致高水平GFP表達，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉導引起極低的GFP表達。這些結果綜合起來表明，高水平的內皮特異性和高水平的內皮表達通過使用含SEQIDNO.:7的3X序列的修飾型PPE-1啟動子而獲得。遽這#孩普差^力*應定在為了測定處於PPE-1-3X啟動子控制之下表達的報告基因的體內細胞定位才莫式，如上文所述將Ad5PPE-l-3XGFP和Ad5PPE-lGFP注射到小鼠內。靜脈內注射後5天，處死小鼠並通過螢光顯微鏡術分析其組織。注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠與注射Ad5PPE-lGFP的小鼠相比，在肝血管、腎血管和脾血管的內皮細胞中觀察到顯著更高的GFP活性。圖28A-B顯示了代表性結果。圖28A顯示了注射Ad5PPE-lGFP的小鼠血管內襯內皮細胞中的低水平GFP表達。圖28B顯示了由於加入3X序列至構建體中產生的水平高得多的GFP表達。儘管在血管內襯中高表達，但是在肝細胞、腎小球、上皮細胞和脾細胞中沒有檢測到表達(圖18和圖19)。圖29顯示了得自注射小鼠腎組織的代表性結果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖29A)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖29b)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖29C)在腎細胞中都表現出低GFP活性。在圖29B中，在血管壁中可見略高的GFP表達(箭標所指)。圖30顯示了注射小鼠脾組織的代表性結果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖30A)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖30B)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖30C)在脾細胞中都表現出低水平的GFP活性。在注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠血管可見較高的GFP活性(箭標所指)。這些結果證實，PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子在體內均為內皮細胞特異性的。它們進一步提示，這兩種啟動子的活性限於非增殖性內皮組織(即健康器官的血管。因此，在腫瘤血管生成模型中進行測定。方/Vf新j&會形^^爿必屍屍￡-7^々建#的謬力溯/定為了確定AD5PPE將報告基因的表達特異性地導向腫瘤中血管生成性血管的能力，使用鼠LLC模型(上文在材料和方法中描述的)。在一個實驗中，全身注射Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc(各1010pfu/ml)後5天測試肺瘤新血管形成中的螢光素酶表達。在該實驗中，給原發性腫瘤模型和轉移腫瘤模型全身注射Ad5CMVLuc導致在原發性肺瘤或轉移肺中均產生最低表達。該表達水平與在首次用於實驗的正常肺中由CMV指導的螢光素酶的最低表達相似(圖35;黑色條；n=12)。與之鮮明對比的是，在PPE-1啟動子控制下(圖35;空心條；n=9),高血管生成性肺轉移與螢光素酶活性相關，所述螢光素酶活性為在血管形成程度低的原發性腫瘤和首次用於實驗的肺中的螢光素酶活性的約200倍。在諸如肝、腎、心臟和胰的非轉移瘤組織中的螢光素酶表達最低。主動脈中的表達水平大約是轉移肺中所述水平的30%。在LLC才莫型的另一個實-瞼中，用Ad5PPE-lGFP構建體和Ad5CMVGFP構建體將報告基因表達定位於原發性腫瘤和轉移肺中。注射Ad5PPE-lGFP的小鼠在原發性胂瘤血管中顯示高水平的GFP特異性表達(圖47C),儘管在腫瘤細胞自身中沒有檢測到表達。此觀察結果與實施例20中提供的LLC細胞培養物模型的結果相一致。在肺轉移中，在轉移病灶的大動脈和小血管生成性血管兩者中均檢測到高水平的GFP表達(圖47A)。在正常肺組織中沒有檢測到表達。內皮細胞定位為GFP表達(圖47A)和CD31抗體免疫染色(圖47B)的共定位所證實。與之形成鮮明對比的是，在注射Ad5CMVGFP的小鼠中，在原發性胂瘤和肺轉移兩者中均沒有檢測到GFP活性。圖47C說明瘤內注射Ad5PPE-lGFP後在原發性肺瘤血管中的GFP表達。圖47D是與說明肺瘤及其血管的圖C一樣歸檔的相差圖像。這些結果表明，儘管PPE-1不驅動腫瘤細胞自身中的高水平表達，但所述啟動子的確驅動肺瘤內血管內皮中、尤其是在快速增殖的血管生成性血管中的高水平表達。給原發性皮下腫瘤沖莫型瘤內注射Ad5CMV,導致在肺瘤組織中的高螢光素酶表達，及在肝中導致中等水平表達(胂瘤表達量的10%;圖53)。在轉移肺中沒有檢測到表達。另一方面，當瘤內注射時，處於PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶表達在原發性胂瘤和轉移肺中產生相似的螢光素酶表達水平，而在肝中沒有檢測到表達。;#*/《乂##參,秀遂#爿必屍屍E-/W,i/定為了測定Ad5PPE-l和Ad5CMV在癌性細胞中驅動螢光素酶表達的效率，使用D122-96Lewis肺癌細胞系。以不同的感染複數(moi)進行體外轉導。結果表明，兩種腺病毒載體均能夠將螢光素酶基因轉導給這些細胞(表4)。然而，由PPE-1啟動子指導的螢光素酶活性在LLC細胞中比在內皮細胞中檢測到的所述活性低得多，分別為50光單位/g蛋白對1000-2500光單位/g蛋白。44一^爿6/5屍屍五畫/Lwc和爿6/5CvWXwcy^膚勿/g屑tableseeoriginaldocumentpage98為了確定3X序列對血管生成性血管中PPE-1啟動子的作用，使用Lewis肺癌(LLC)轉移^f莫型(上文材料和方法中所描述的)。如材料和方法所述的，靜脈內注射1010感染單位的Ad5PPE-lGFP、Ad5PPE-l-3XGFP或Ad5CMVGFP後5天，處死小鼠並分析其組織。圖31A-D總結了注射鹽水的對照小鼠(圖31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖31B)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖31C)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖31D)的轉移肺中的GFP表達。抗CD31免疫染色(圖31C'-20D')證實每種轉移組織中GFP表達的位置。結果表明，儘管在對照一注射鹽水的小鼠中沒有檢測到GFP表達(圖31A),在注射CMV的小鼠上皮支氣管周圍有微弱表達，但在這些小鼠轉移肺血管生成性血管中沒有表達(圖31B)。在注射Ad5PPE-lGFP的小鼠轉移肺中觀察到低GFP表達(圖31C和31C'),而在注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠新血管中觀察到高且特異性的表達(圖31D和31D')。這些結果解釋了實施例15的體內結果和實施例7、8和11的體外結果之間明顯不一致之處。PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子兩者都是內皮特異性的。然而，所述3X序列大大增加了快速增殖的內皮組織(諸如生長腫瘤中的新形成血管)中的表達水平。3JT元斧乂^產;^i^^成Vij^15^7屍屍E-7啟動子^斧^Z為了研究本發明的3X元件對腫瘤血管生成性血管中PPE-1啟動子功效和特異性活性的作用，使用LLC轉移模型。如上文所述，靜脈內注射101Qpfu/ml的Ad5PPE國lLuc、Ad5PPE國l畫3XLuc、Ad5CMVLuc、Ad5PPE-lGFP、Ad5PPE-l-3X-GFP或Ad5CMVGFP後5天，處死小鼠並分析其組織的螢光素酶表達或GFP表達。圖48是直方圖，比較全身注射Ad5PPE-l-3Xluc、Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc後在正常肺和轉移肺中的螢光素酶表達。各實-瞼組為Ad5CMVLuc(n=7;黑色條)、Ad5PPE-lLuc(n=6;灰色條)和Ad5PPE-l-3XLuc(n=13;褐色條)。活性以光單位/iug蛋白表示。處於PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶表達在轉移肺中是其在正常肺中的活性的35倍，且是由無所述3X元件的PPE-1啟動子驅動的表達的3.5倍(p〈0.001)。在注射Ad5PPE-l-3XLuc的小鼠的其它組織中檢測到非常低的螢光素酶活性。計算每隻經注射的動物肺中螢光素酶表達佔肝中表達的百分比揭示出，與正常肺中的所述活性相比，轉移肺中的所述活性增加至IO倍(圖49)。為了將報告基因表達定位至特定細胞類型，使用GFP構建體。圖50A-B顯示了注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠轉移肺中的GFP表達(圖50A)。通過CD31抗體免疫染色(圖50B)證實GFP表達定位於新血管中。在對照一注射鹽水的小鼠中沒有檢測到GFP表達。注射CMV的小鼠上皮支氣管周圍有低水平表達，但在轉移肺的血管生成性血管中沒有表達。概括地講，這些結果表明，表達水平大大增加是由於將3X元件導入Ad5PPE-l構建體中所致，並且這種增加的表達對腫瘤血管生成性血管是特異性的。可能是，所觀察的作用可能與上文所述的低氧應答結合，以進一步增強目標序列的表達水平。屍屍五-/瓶真^吝#遽一#4在為了進一步表徵低氧對鼠PPE-1啟動子活性的作用，用DNA質粒(pEL8;圖37A)轉染牛主動脈內皮細胞(BAEC)。pEL8質粒含有鼠PPE-1啟動子(1.4kb)(紅色)、螢光素酶基因(1842bp)、SV40聚腺苷酸化(polyA)位點和內皮素-1基因的第一內含子，它們合稱為PPE-1啟動子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶對其進行消化和提取。轉染後，讓細胞經歷低氧條件。經歷18小時低氧(0.5%02)的轉染的BAEC中的縈光素酶表達高達常氧環境下生長的細胞中的螢光素酶表達的8倍(圖32)。圖32顯示，用含有鼠PPE-1啟動子的質粒轉染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)當轉染的細胞在低氧環境下溫育時明顯更高。同樣的轉染效率通過與P-半乳糖普酶報告載體共轉染和LacZ活性測定得以證實。為了確定由腺病毒載體遞送的鼠PPE-1啟動子是否也受到低氧的上調，用Ad5PPE-lLuc轉導BAEC。在該實驗中用Ad5CMVLuc作為非特異性對照。結果總結於圖33中。用Ad5PPE-lLuc轉導的BAEC中的低氧螢光素酶活性。與之明顯相反，在Ad5CMV轉導的細胞中沒有檢測到常氧和低氧之間的顯著性差異(圖33)。為了了解PPE-1啟動子活性的增強是否是內皮細胞特異性的，用Ad5PPE-l(moi=IO)轉導不同的細胞系(BAEC、B2B、CHO、RIN和心肌細胞)，且讓其經歷低氧(0.5%02)或常氧環境。結果總結於圖34中。螢光素酶表達在低氧環境下培養的B2B細胞中略微增力口，而在低氧環境中培養的BAEC細胞中顯著增加。與常氧相比，低氧環境降低其它細胞系中的縈光素酶表達。這些結果證實，PPE-1啟動子的低氧誘導主要在內皮細胞語系中發生。為了確定3X序列對PPE-14氐氧應答的作用，用Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l(3X)Luc轉導BAEC。轉導後，如上文詳述，將BAEC細胞或者在低氧環境中或者在常氧環境中溫育。結果總結於圖35中。使用Ad5PPE-lLuc構建體的螢光素酶表達在對低氧應答時顯著增加(7倍)(低氧條件下為2578,而常氧條件下為322.1)。相比之下，Ad5PPE-l(3X)Luc構建體在對低氧應答時僅表現出增加至1.5倍(從常氧條件下的2874.5增加至低氧條件下的4315)。這些結果表明，當在PPE-1啟動子中加入3X序列時所觀察的高常氧表達水平在一定程度上起掩蔽低氧應答的作用。^脊差^V、薦模fX,效IL^吝^姅;t為了檢查經歷區域低氧/局部缺血的組織中的鼠PPE-1啟動子活性，使用如上文在材料和方法中描述的mPPE-l-Luc轉基因小鼠。如先前(CouffinhalT.等，(1998)Am.J.Pathol.152;1667-1679)所述，誘發小鼠發生區域性後肢局部缺血。簡而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg,IP)麻醉動物。通過對鄰近隱動脈和腯動脈分叉處約2mm的右股動脈結紮，誘發後肢單側局部缺血。為了證實灌注功能變化的誘導，通過配備7.5MHz轉換器和血管造影軟體的Synergy超聲波系統(GE),在第4天和第14天進行超聲波成像。將動物在常規條件下圈養最高達18天。結紮後2天、5天、10天和18天，測定局部缺血肌肉、正常未結紮肌肉、肝、肺和主動脈中的螢光素酶表達。在圖36中總結的結果顯示，儘管在結紮後數天期間，在肝、肺和主動脈中沒有檢測到顯著性差異，但是在股動脈結紮後螢光素酶基因表達在正常未結紮肌肉和局部缺血肌肉兩者中均增加。儘管在結紮後5天在局部缺血肌肉中檢測到峰值螢光素酶表達，但在股動脈結紮後10天在未結紮肌肉中也檢測到峰值螢光素酶表達。這表明PPE-1啟動子的低氧應答在體內系統中是有功能的。非局部缺血肌肉中的螢光素酶表達在所測試的天數期間與其在對照未經手術組織中的表達(天數=O)相比並沒有變化。相比之下，第5天在局部缺血肌肉中的螢光素酶表達明顯高於其它時間點。笫5天，PPE-1驅動的螢光素酶表達在對照未經手術小鼠中，及與第10天和第18天局部缺血肌肉相比為2.5倍高(圖51)。在經歷區域局部缺血的轉基因小鼠的其它非局部缺血組織包括肝、肺和主動脈中的縈光素酶表達揭示出，在誘發局部缺血後18天內，在這些組織中的螢光素酶表達沒有顯著變化(圖52)。此外，這些結果證實，螢光素酶表達在含有高百分比內皮組織的組織(肺和主動脈)中比在含有^氐百分比內皮組織的組織(肝和非局部缺血肌肉)中高。細應增遂^乎義/力發勿應^爿J5屍屍5-7Z^c為了確定細胞增殖水平對Ad5PPE-lLuc的效率和特異性活性的作用，體外測試內皮細胞血管生成性^t型(BAEC)。通過血清除盡誘導經轉導的BAEC靜息，或者讓其在10%FCS中生長而正常增殖。簡而言之，將細胞轉導48小時，作為靜息細胞一血清除盡後72小時，或者作為增殖細胞一在正常培養基(10%FCS)中。螢光素酶活性以光單位/g蛋白表示，以對細胞量差異標準化。所給出的結果是得自4個代表性獨立實驗的一式三份試驗的平均值。處於PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶表達(空心條；圖28)在正常增殖的BAEC中是在靜息細胞中的4倍，且在正常增殖的BAEC中是處於CMV啟動子控制之下的螢光素酶表達的25倍(黑色條；圖28)。此外，在增殖細胞中，處於PPE-1啟動子控制之下的活性是處於CMV啟動子控制之下的活性的10倍。為了體外才莫擬血管生成性狀況，測試通過加入40ng/ml血管內皮生長因子(VEGF)誘導快速增殖的BAEC中的Ad5PPE-lLuc活性。如上文所述，比較在這些條件下正常增殖細胞和靜息細胞中的活性。用VEGF誘導細胞增殖的BAEC中的螢光素酶表達是在正常增殖細胞中的44倍，且是在靜息細胞中的83倍(圖40)。總的來講，這些實驗表明，處於PPE-1啟動子轉錄控制之下的目標序列的活性水平隨細胞增殖水平而變動，快速增殖引起較高水平的表達。乂,滲發'^^:遊/f硬必^V、it^^屍屍E-/W^W定為了測試動脈粥樣硬化血管中Ad5PPE-l載體的效率和特異性，給6月齡ApoE缺陷型小鼠(Plump，A.S.等Cell;1991;71:343-353)全身注射101Qpfu/ml病毒載體。隨著ApoE缺陷型小鼠衰老，在沒有脂質獲取膳食(lipidreachdiet)誘導的情況下，它們發展高膽固醇值和廣泛的致動脈粥樣化斑。圖43是從ApoE缺陷型小鼠解剖的Sudan-IV著色的主動脈照片。注意到胸主動脈含有的紅色染色的動脈粥樣硬化病變較少，而腹區高度動脈粥樣硬4匕(圖43,摘自ImagingofAorticatheroscleroticlesionsby125I-HDLand125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology畫Pathobiol2001;69:225-9)。圖44總結了給ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-lLuc(空心條；n=12)和Ad5CMVLuc(黑色條；n=12)後5天所觀察到的螢光素酶表達。結果以含有較少動脈粥樣硬化病變的胸主動脈和富含動脈粥樣硬化病變的腹主動脈中的絕對螢光素酶表達來表示。與處於對照CMV啟動子之下的表達相比，受PPE-1啟動子控制的螢光素酶表達在高度動脈粥樣硬化的腹部中為其6倍，而在輕微動脈粥樣硬化的胸主動脈中為其1.6倍。在注射Ad5PPE-lLuc的小鼠的兩個主動脈區之間沒有觀察到顯著性差異，而與含有病變的腹主動脈中的低表達相比，在Ad5CMVLuc注射組的胸主動脈中觀察到較高的螢光素酶表達。這些結果表明，儘管組成型啟動子(CMV)在動脈粥樣硬化最嚴重的區域往往不起作用，^旦PPE-1啟動子相對而言不受疾病進程影響。口奮合^^fy^^fW溯/定為了測試Ad5PPE-l構建體在將螢光素酶表達導向癒合傷口血管方面的效率和特異性活性，使用如上文在材料和方法中描述的鼠傷口癒合。如同在其它實驗中一樣，用Ad5CMVLuc作為非組織特異性對照。處於PPE-1啟動子(圖45;空心條)控制之下的螢光素酶活性在正常區域(6.8士3.2)和癒合傷口區域(5士1.6)中均比處於CMV控制(圖45;黑色條)之下所觀察到的活性高。因為CMV啟動子和PPE-1啟動子在癒合傷口中均表現出降低的表達水平，所以這些結果難以解釋。儘管這是意想不到的觀察結果，但顯然PPE-1啟動子在正常組織和癒合組織中都比CMV啟動子驅動的表達水平高。壞死性瘢痕組織的存在可能是在癒合傷口中用兩種啟動子所觀察到的表達水平降低的原因。^口屍ZX7i^S乂,—局舉^j&y^力j&f這些新生血管容易破裂、有退化和滲漏傾向並且灌注差。為了克服這些局限，需要定位、定時和劑量可控地遞送各種能夠募集內皮細胞以及內皮周細胞(即小血管中的周細胞或較大血管中的平滑肌細胞)的血管生成因子。修飾型前內皮素原-1啟動子PPE-1-3X用於在局部缺血肢體肌肉的內皮中表達VEGF或PDGF-B,即將平滑肌細胞募集到分泌起源的內皮分泌的因子，從而阻止新形成的血管的高滲透性。為了測定VEGF和PDGF-B在局部缺血組織中的表達，進行原位雜交。如圖54A-C所示，儘管在來自Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的局部缺血肌肉切片中可檢測到VEGFmRNA的顯著表達，但在Ad5CMVVEGF或鹽水治療小鼠的肌肉切片中基本上沒有觀測到信號。類似地，在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠的局部缺血肢體肌肉中檢測到PDGF-BmRNA的存在，但在Ad5CMVPDGF-B或鹽水治療小鼠中卻沒有檢測到(圖54E-G)。有趣的是，圖12A和圖12E中的信號模式類似血管結構。值得注意的是，各種治療組的代表性肝切片證明VEGF或PDGF-B在Ad5CMV治療的動物中大量表達(圖54D和54H),而在Ad5PPE-l-3X載體治療小鼠的肝中沒有檢測到表達(數據未顯示)。總而言之，該測定表明，Ad5PPE-l-3X載體介導血管生成因子在耙器官中的可測量表達，而組成型Ad5CMV載體幾乎只在肝組織中表達其轉基因。屍屍￡介爭的將Ad5PPE-l-3XVEGF的治療作用與先前寺艮道的Ad5CMVVEGF的治療作用進行比較。股動脈結紮後5天，將109PFU的任一治療載體以及報告載體Ad5CMV螢光素酶和等體積的鹽水(作為對照)全身施用於小鼠。以血管造影模式獲得兩個肢體的內側面(medialaspect)的超聲波(US)圖像。如圖38A-D所示，在結紮後21天，對照動物中的灌注信號減少並截短；然而，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠和Ad5CMVVEGF治療小鼠的US圖像中均觀察到持續增強的信號。在兩個VEGF治療組中，第21天的平均灌注強度是對照組平均灌注強度的3倍以上(p〈0.01),並且與所述動物的正常對側肢體記錄的結果相似(圖38E)。股動脈結紮並使用內皮特異性標記抗CD-31後21天進行的免疫組織化學分析顯示，分別與Ad5CMVVEGF組和對照組中的585和485個CD31+細胞/mm2相比，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的局部缺血肌肉切片中的平均值為546個CD31+細胞/mm2(圖38F)。該數據表明，用Ad5PPE-l-3XVEGF短期治療與Ad5CMVVEGF的有效CMV啟動子治療同樣有效。此外，用H&E染色的小鼠肝切片顯示，沒有肝炎或其它慢性病理變化的指徵(數據未顯示)，從而排除了腺病毒對肝細胞的向性效應。考察針對血管生成誘導的促血管生成因子的組織特異性表達和組成型表達的對比。在長達70天的實-驗中，對PPE調節的和CMV調節的VEGF表達對灌注和血管生成的作用進行了測試。具有局部缺血肢體的小鼠如上進行治療(參見實施例28)。US成像揭示出自病毒施用後1-2周開始在兩個治療組中灌注方面的顯著改善，而在對照組中檢測到微小變化(數據未顯示)。股動脈結紮後50天和60天，檢測到Ad5PPE-l-3XVEGF治療的長期作用。與Ad5CMVVEGF或鹽水治療的小鼠相比，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療的小鼠中灌注顯著增加。Ad5CMVVEGF治療動物和對照治療動物之間的灌注差異隨時間間隔的增加而減少。第50天，Ad5PPE-l-3XVEGF治療組的平均灌注強度比Ad5CMVVEGF或鹽水治療小鼠的平均灌注強度高約50%,而與對側正常肢體的平均灌注強度相似(p〈0.01，圖55A)。第70天處死動物後，Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的肌肉切片中的毛細血管密度為747個CD31+細胞/mm2,分別比Ad5CMVVEGF組(474個CD31+細胞/mm2)和對照組(342個CD31+細胞〃mm2)高57%和117%(p<0.01,圖55B)。屍屍^^動f《這增強^J&^J^成PDGF-B是旁分泌內皮分泌的因子，已經表明它通過募集平滑肌細胞而參與血管成熟，且也可能參與血管生成[Edelberg,J.M.等，Ocw/a"ow105，608-13.(2002);Hsu等，■/Ce〃屍/zjwo/165,239-45.(1995);Koyama,N.等，JCe〃屍/7",。/158,1-6.(1994)]。另外，已經表明PDGF-B參與內膜增厚[Sano,H.等，Ocw/a,,ow103,2955-60.(2001);Kaiser,M.等，爿^7〃toW/^ww41,623-33.(1998)]，並參與成纖維細胞增殖[Nesbit,M.等，LW/"veW81,1263-74.(2001);Kim,WJ.等，/"veW(9盧/za/膨/40,1364-72.(1999).]。在體外和體內測試PDGF國B處於內皮特異性調節下誘導血管生成的能力。同Ad5PPE-l-3XVEGF—樣，Ad5PPE-l-3XPDGF-B載體在體外誘導內皮細胞中的血管生成性變化(數據未顯示)。用10MOI的Ad5PPE-l-3XPDGF-B轉導在血纖蛋白包^皮的培養器具中培養的內皮細胞導致形成二維環狀結構和血纖蛋白降解。對於體內作用，在股動脈結紮後5天用109PFU的Ad5PPE-l-3XPDGF-B對小鼠進行全身治療。結紮後30天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠的平均灌注強度比對照組的平均灌注強度高約90%(圖56A)。結紮後80天，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療組的灌注強度比對照組的灌注強度高60%(圖56B)。結紮後35天和90天測量毛細血管密度。在短時間間隔內，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的局部缺血月幾肉切片中的平均毛細血管密度為516個CD31+細胞/mm2,而在鹽水治療組中，平均毛細血管密度為439個CD31+細胞/mm2(圖56C)。結紮後90天，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的平均毛細血管密度略微增加到566個CD31+細胞/mm2，而在對照組中檢測到中等減少(378個CD31+細胞/mm2,圖56D)。結果表明，Ad5PPE-l-3XPDGF-B載體本身是有效的血管生成治療，它不僅在施用後短期內誘導血管生成，而且能夠長時間段地維持治療作用。在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的肝中沒有檢測到慢性變化。力發*應f^^這炎f^成',熟採用兩種治療模式檢驗以下假設在聯合療法中使用VEGF和PDGF-B這兩者可實現血管生成和血管系統成熟的進一步增強，這兩種治療才莫式是(i)單次施用109PFU的Ad5PPE-l-3XVEGF和Ad5PPE-l-3XPDGF-B;(ii)在施用Ad5PPE-l-3XVEGF後5天施用相似劑量的Ad5PPE-l-3XPDGF-B。這兩種才莫式均獲得相同的結果，且因此將其認為是相同的。結紮後90天，與對照Ad5PPE-l-3XGFP治療的小鼠相比，所述聯合療法和Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠均表現出顯著更高的毛細血管密度，但在各種治療組中不存在顯著性差異(圖57B)。然而，聯合療法組中US成像的平均灌注強度比Ad5PPE-l-3XVEGF治療組最高42%(圖57A)。這可用聯合療法組和Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的局部缺血肌肉小血管的成熟來解釋。在用聯合療法或Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的對a-SMactin免疫染色的肌肉切片中，觀察到血管平滑肌細胞的明顯染色(圖57C-D)。在對照和Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠中可以觀察到稀疏染色(圖57E-F)。在正常肢體肌肉中，較大的小動脈和小靜脈周圍存在明顯染色(圖57G)。在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠中，相似的結果早在結^^後35天就可獲得(數據未顯示)。結紮後35天，治療小鼠肝切片中的慢性變化不明顯。這些結果在獨立的實驗中得到進一步證實，該實驗考察單獨的和聯合療法中的PDGF-B對結紮後50天血液灌注的作用。如圖58所示，結紮後50天，聯合療法組的血液灌注強度與正常肢體的十分相似。該作用是PPE-3X依賴性的，因為這兩種生長因子的組成型表達(CMV啟動子)僅導致產生一半的灌注能力。有趣的是，單獨的PDGF-B的PPE-3X依賴性表達可以介導與聯合療法誘導幾乎相同的灌注(即77%)。然而，使用組成型啟動子時這樣的結果並不明顯。這些結果證實，PPE-1-3X啟動子儘管全身施用也能夠足夠強地激活治療基因，而不損害在血管生成性內皮細胞中的優先表達。此外，這些結果還證實PDGF-B為可介導其血管生成作用的促血管生成因子，而無需再加入公認的血管生成生長因子如VEGF。種^^^^在^^屍屍￡-/(0^-7^裁'#HSV-TK/GCV是最廣泛研究和實施的細胞減少性基因藥物聯合。使用含HSV-TK的質粒轉染的細胞或用含HSV-TK的載體轉導的細胞對包括阿昔洛韋、更昔洛韋(GCV)、伐昔洛韋和泛昔洛韋在內的藥物超家族敏感。鳥苦類似物GCV在與TK組合時是活性最強的藥物。HSV-TK陽性細胞產生病毒TK,其將GCV磷酸化成單磷酸GCV(GCV-MP)的有效性高達人TK的3個數量級。GCV-MP隨後由天然胸苷激酶磷酸化成二磷酸GCV，且最終磷酸化成三磷酸GCV(GCV-TP)。首先，製備兩種質粒。一種質粒包含受控於修飾型鼠前內皮素原-1(PPE-13x)啟動子的HSV-TK基因，且製備該質粒以檢驗由PPE-l(3x)啟動子控制的基因的體外功效。製備含由PPE-l(3x)啟動子控制的HSV-TK基因以及腺病毒序列的更大質粒，用於通過同源重組製備病毒載體。通過兩種限制酶由4348bp的質粒pORF-HSVlTK消化出HSV-TK基因(1190bp)。Sail限制位點靠著(against)HSV-TK基因的5'末端定位，且EcoRI位點靠著3'末端定位。將HSV-TK基因連接至3400bp質粒pBluescript-SK的多克隆位點，質粒pBluescript-SK在插入的基因的上遊含Notl限制位點(靠著HSV-TK基因的3'末端)。Sail位點經受克列諾(Klenow)程序，且Notl接頭連接至HSV-TK基因的5'末端。HSV-TK基因(現在由兩個Notl限制位點翼側包圍)連接至上文所述的兩個質粒pEL8(3x)-Luc和pACPPE-l(3x)-GFP的Notl限制位點中1.8600bp質粒稱為pEL8(3x)-Luc,代替1842bp的螢光素酶基因，側接兩個Notl限制位點。pEL8(3x)-TK質粒包含PPE-l(3x)啟動子、HSV-TK基因、SV-40聚腺苦酸化位點和鼠內皮素-1基因的笫一內含子(圖60a)。2.11946bp質粒pACPPE-l(3x)-GFP，代替1242bp的綠色焚光蛋白(GFP)基因，由兩個NotI限制位點翼側包圍(圖60b)。溝建^^"憂控f修謬f^^//SK-7X名欲^厲^#-5裁'#。在第一代(E1基因缺失，E3不完整)腺病毒-5載體的基礎上構建稱為AdPPE-l(3x)-TK的複製缺陷型載體。使用眾所周知的常規克隆技術，通過質粒pACPPE-1(3x)-TK和pJM-17(40.3kb)在人胚腎-293(HEK-293)中的共轉染製備重組載體。pJM-17質粒包含除El基因之外的完整腺病毒-5基因組。HEK-293細胞系替代了El缺失，因為它們含反式E1基因。40種同源重組中有一種誘導載體AdPPE-l(3x)-TK。爿6/屍屍￡-/(0^-7^我##在。對病毒DNA進行PCR分析，以驗證重組腺病毒中TK轉基因和啟動子的存在。使用兩種引物正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(前內皮素原啟動子序列中的455-474bp)(SEQIDNo:9)和反向引物5'-taaggcatgcccattgttat曙3'(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQIDNo:10)。使用在我們的實驗室中產生的其它載體引物，以驗證載體純度。約1kb的條帶證實在AdPPE-l(3x)-TK病毒中存在PPE-l(3x)啟動子和HSV-TK基因(圖61)。但是，構建的腺病毒載體的其它引物沒有一個能提供任何產物。因此，所述載體是純集落。所述病毒在HEK-293細胞中進一步純化，以分離單個病毒克隆。在雙脫氧核苷酸存在下通過循環測序反應對AdPPE-l(3x)-TK的病毒DNA測序，對其進行化學修飾，以在UV光下發螢光。4種引物用於驗證完整轉基因的存在1.正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(在前內皮素原啟動子中的455-474bp)(SEQIDNO:9)，之後是"3x"元件。2.反向引物5'-gcagggctaagaaaaagaaa-3'(在前內皮素原啟動子中的551-570bp)(SEQIDNO:11)。3.正向引物5'-tttctttttcttagccctgc畫3'(在前內皮素原啟動子中的551-570bp)(SEQIDNO:12)。4.反向引物5'-taaggcatgcccattgttat-3'(在HSV-TK基因中的1065-1084bp)(SEQIDNO:10),其處於HSV-TK基因中。使用稱為2(SEQIDNO:1l)和3(SEQIDNO:12)的引物，因為僅由引物1(SEQIDNO:9)和3(SEQIDNO:10)不能獲得產物。結果顯示出與小鼠(Musmusculus)Balb/c前內皮素原-1基因啟動子區gil560542|gblU07982.1|MMU07982[560542](SEQIDNO:l)具有99%同一性，以及顯示出與單純皰滲病毒胸苷激酶基因gil59974lemblV00470.1IHERPES[59974]具有99.4%同一性。AdPPE-l(3X)序列詳述於圖92。3x序列(圖93)包含內皮特異性正轉錄元件的額外一式三份重複。如上文所述，在此145bp序列中，有兩個完整的內皮特異性正轉錄元件和一個被切成兩個反向順序的片段的序列。乂六裙裁'舉。構建兩個腺病毒載體，一個沒有PPE-l(3x)啟動子，且第二個沒有Luc基因，以用作AdPPE-1(3X)載體的對照。載體AdCMV-TK(用作非組織特異性啟動子對照)包含由早期巨細胞病毒(CMV)啟動子控制的HSV-TK基因(圖62c)。載體AdPPE-l(3x)-Luc包含由修飾型鼠前內皮素原-1啟動子控制的荄光素酶(Luc)基因(圖62b)。所述病毒以按比例放大批次培養，並以10、10"顆粒/ml的濃度儲存於-20。C。^者洛，和義於屍屍￡"-/(3々^動子#賴之7"^^屍屍￡-/^^^^子控賴之7^4###說'處力發*應勿應^#通過與對照載體AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc對比，在內皮細胞系中體外評價AdPPE-l(3x)-TK的特異性內皮細胞耙向的細胞毒性。爿^屍屍7-/廣3力-7^##:用感染複數(m.o丄)為O.l、1、10、100和1000的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV隱TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉導牛主動脈內皮細胞(BAEC)。轉導後4小時加入GCV(l)Lig/ml)。對照是用無GCV的載體或無載體的GCV轉導的細胞。兩個對照都未謙導細胞死亡(數據未顯示)。於顯著低於AdCMV-TK的m.o.i.在AdPPE-l(3x)+GCV處理細胞中注意到明顯的細胞毒性的特徵性形態學變化(細胞擴大、延伸和膨脹)和匯合喪失。AdPPE-l(3x)-Luc轉導的細胞保持健康(小尺寸、圓形和匯合，圖63)。通過用結晶紫染色測定評價細胞生存力(圖64),證實與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體在BAE細胞中於低於受強組成型CMV啟動子控制的TK基因的m.o丄表現出較高的細胞毒性。y^屍屍j5Wf3;c;-7X+GCr^/^^^GC7如上文所述，用AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc以感染複數(m.o丄)10轉導牛主動脈內皮細胞(BAEC),並使該細胞接觸轉導後4小時加入的濃度漸增的GCV(0.001-10pg/ml，如所示)。用無GCV的載體轉導的對照細胞或接受無載體的GCV的對照細胞在任何濃度都未顯示出細胞死亡的指徵(數據未顯示)。在比接觸AdCMV-TK(中間系歹'J)的細胞顯著低的GCV濃度，在AdPPE-l(3x)-TX+GCV處理細胞中注意到明顯的細胞毒性的特徵性形態學變化(細胞擴大、延伸和膨脹)和匯合喪失(圖65)。通過用結晶紫染色測定評價細胞生存力(圖66),證實與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體在BAE細胞中且於比受強組成型CMV啟動子控制的TK基因低的GCV濃度表現出較高的細胞毒性。^W屍屍五-7(Ox」-7X+GCK*/《##X,^^^i^€#>f為了評價載體AdPPE-l(3x)-TK對內皮細胞的特異性和功效，用AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK以m.o丄10轉導內皮細胞[牛主動脈內皮細胞(BAEC)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)]和非內皮細胞[人肝癌細胞(HepG-2)、人正常皮膚成纖維細胞(NSF)],接著在轉導後4小時施用1|ug/mlGCV。轉導後4天檢測細胞毒性和細胞形態學變化。AdPPE-l(3x)-TK+GCV在BAEC和HUVEC中特異性地誘導細胞毒性，而AdCMV-TK+GCV僅在HepG-2中誘導細胞毒性。NSF對m.o丄=10的所有載體都有抗性。AdPPE-l(3x)-Luc+GCV對所有細胞類型都無毒(圖67)。通過用結晶紫染色測定評價細胞生存力(圖68),證實與受強組成型CMV啟動子控制的TK基因(AdCMV-TK+GCV)的非特異性細胞毒性相比，與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體表現出協同的內皮細胞特異性細胞毒性。用AdPPE-l(3x)陽TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK以較高的m.o丄100轉導非內皮性NSF細胞，接著在轉導後4小時施用1pg/ml的GCV時，未觀察到AdPPE-l(3x)-TK+GCV對細胞形態學的作用(圖69)。相反，用處於強組成型CMV啟動子控制之下的TK(AdCMV-TK+GCV)處理的細胞顯示出強的非特異性細胞毒性，從而證實了即使在極端的感染複數下，處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用也有內皮選擇性細胞毒性。總之，這些結果首次表明，載體AdPPE-l(3x)-TK能夠特異性誘導內皮細胞包括人內皮細胞的殺傷。而且，載體AdPPE-l(3x)-TK完全受控於前藥GCV,且於相對低的GCV濃度具有相當的活性。最後，儘管腺病毒載體的內皮細胞轉導功效相對低，但內皮細胞殺傷是高效的。屍屍五-7(Ox」啟動子控斜之7"的IX在#力^說'處力發勿應勿應##在癌症胂瘤發生和轉移生長的動物模型中，通過與全身施用GCV和對照載體AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc相比，體內評價AdPPE-1(3x)-TK的特異性內皮細胞耙向的細胞毒性的治療功效。處f屍屍E-7(0^啟《f控賴7"^謬^7^i^和^者洛4rGC"滋^/乂,Z^t^,蕃(2XC」^脊移^^Lewis肺癌是充分表徵的、具有高度轉移潛力的嚴重侵襲性惡性癌症的動物模型。已嘗試了使用細胞因子IL-2(Kwong等，Chest119;112:1332-37)、採用內皮啟動子Tie/Tek和GCV(dePalma等，NatMed2003;9:789-795)以及體外VEGF啟動子和GCV(Koshikowa等，CaneRes2000;60:2936-4l)與HSV-TK進行聯合治療。為了測試全身施用AdPPE-l(3x)和GCV對轉移性疾病的作用，通過用腫瘤細胞接種左足且一發展原發性胂瘤就截足來誘發LLC肺轉移。去除原發性腫瘤後5天靜脈內施用腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]，接著每日腹膜內施用GCV達14天。如下排除小鼠22隻小鼠由於無發展原發性腫瘤而被排除，l只小鼠由於載體注射失敗而被排除，8隻小鼠無任何肺轉移蹤跡而死亡。在排除的小鼠中，18隻小鼠在入選前被排除，6隻由組1(AdPPE-l(3x)-TK+GCV)排除，2隻由組2(AdCMV-TK+GCV)排除，3隻由組3(無GCV的AdPPE-l(3x)-TK)排除，且2隻由組4(鹽水+GCV)排除。在載體注射後第24天處死小鼠。在第24天，對照組(鹽水+GCV和無GCV的AdPPE-l(3x)-TK)中25%的小鼠由於肺轉移擴散而死亡。圖70顯示了治療組和對照組的代表性肺組織，從而表明在AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺中的轉移擴散程度比AdCMV-TK+GCV、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK和無腺病毒的GCV治療的小鼠肺中的轉移擴散程度顯著降低。在處死後，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療的小鼠轉移的平均重量(轉移性疾病程度指標)低至用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的該平均重量的1/3.3(平均值士SE:分別為0.3g士0.04對0.8g士0.2;p<0.05)。用AdCMV-TK+GCV或用鹽水+GCV治療的小鼠轉移的平均重量與其它組別的該平均重量無統計學差異(圖71)。^於屍/^-/(3義」^動子控斬之T的7X殺力襲迷和^者洛，(^GCK」乂,脊移7^^紐織^*應###^,為了確定AdPPE-l(3x)和GCV施用對LLC轉移生長的作用機制，對轉移性肺的肺組織進行蘇木精和伊紅染色(圖72a-72c)。在取自無GCV的AdPPE-l(3x)匿TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺轉移中檢測到輕微的外周壞死(圖72a)。取自AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺組織表現出肺泡和支氣管周圍單核浸潤，而在取自用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺中未檢測到浸潤。與取自用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的轉移相比，取自AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移表現出單核浸潤簇(圖72b、c)。還在取自AdCMV-TK+GCV治療小鼠的標本中檢測到最少的壞死和單核浸潤。結果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV在肺轉移中裔導增加的中心壞死和單核浸潤。為確定負責AdPPE-l(3x)-TK+GCV對LLC肺轉移的抑制作用的細胞死亡特徵，對肺組織進行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以評價凋亡。與無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠相比，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移呈現出眾多的凋亡肺瘤細胞(圖73a和73b)。與AdCMV-TK+GCV治療小鼠的標本相比，取自AdPPE-1(3x)-TK+GCV治療小鼠肺之標本的組織病理學切片顯示出顯著更高程度的DNA損傷(TUNEL，圖73a)和胱天蛋白酶-3(圖73b),從而表明胂瘤細胞凋亡。更有意義的是，轉移肺的組織病理切片的TUNEL和胱天蛋白酶-3染色在靜脈內AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠肺轉移血管(內皮)區中表現出增強的凋亡(圖74),從而表明處於PPE-l(^x)啟動子控制下的TK體內表達和更昔洛韋(GCV)施用對轉移細胞凋亡的協同增強作用。結果提示，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV誘導大規模的肺瘤細胞凋亡。而且，血管生成性內皮細胞凋亡可能是大規模中心轉移壞死和凋亡的才幾制。義、於屍/^-/卩々^《子控賴之7X^這和^者洛，「GCK」滋^7在脊移^疾病^^^"舉力在AI5^^/，^,CD-31是血管生成的特徵性內皮細胞標記。對轉移肺組織進行抗CD-31染色，以確定內皮細胞涉及全身性AdPPE-1(3x)+GCV的抗轉移作用的情況。圖75a-75d揭示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉移中的血管生成性血管短，無連續性或分支，且邊界模糊(圖75a-75c)。在無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺轉移中的血管生成性血管表現為具有豐富分支和明顯邊界的長血管(圖75a)。在AdCMV-TK+GCV治療小鼠的肺轉移中也檢測到最低程度的異常血管系統，儘管遠小於AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的狀況(未顯示)。對肝血管沒有作用說明了對增殖的內皮組織的這種抗血管生成作用的特異性(圖75c)。基於計算機的血管密度測量(ImagePro-Plus,MediaCyberneticsIncorporated)表明，AdPPE-l(3x)-TK+GCV組的肺轉移中的血管密度小至無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療組的1/1.5(分別為40107.7pm2對61622.6^1112)(圖75d)。綜上所述，這些結果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV通過高度選擇性誘導血管生成內皮細胞凋亡而誘發中心轉移壞死和凋亡。y^CMF-ZX^^l丄丄C/f^^移^V、處^謬發^f應^#。因為全身施用腺病毒載體的其中一種主要副作用是肝毒性，所以在具有誘發的LLC腫瘤的C57B1/6小鼠中測定肝形態學。治療肝組織和對照肝組織的蘇木精和伊紅染色切片分析揭示，用處於組成型啟動子AdCMV-TK控制之下的TK十GCV治療的小鼠的肝表現出門(portal)和門管周單核浸潤以及小匯合壞死區域，而AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠和對照組的肝僅表現出最小的單核浸潤和肝細胞核增大(圖76)。結果表明，儘管處於CMV啟動子控制之下的TK組成型表達明顯有肝毒性，但採用血管生成特異性AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療沒有觀察到對肝形態學的不利副作用。^於屍屍￡-/^一啟動子控教之7"^謬/^^這^嚴^薦^V,並^;為評價處於PPE-l(3x)啟動子控制之下的HSV-TK表達的抗轉移作用的器官和組織特異性程度，使用HSV-TK引物和P-肌動蛋白引物對用腺病毒載體治療的具有LLC肺轉移的小鼠不同器官的多種組織進行PCR分析。9隻15周齡的C57BL/6雄性小鼠入選。通過用腫瘤細胞接種左足以及一發展原發性腫瘤就截足來誘發LLC肺轉移。在去除原發性腫瘤後14天靜脈內遞送腺病毒載體(AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK)或鹽水。在注射載體後6天處死小鼠，且如所述由收穫的器官提取RNA。對RNA實施逆轉錄酶PCR,接著使用HSV-TK引物和P肌動蛋白引物進行PCR。在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的肺中檢測到陽性HSV-TK表達，而在肝中沒有檢測到HSV-TK表達。相比之下，在AdCMV-TK治療的小鼠肝中檢測到高度陽性的HSV-TK表達，且在肺中沒有檢測到表達(圖77)。根據(3肌動蛋白校正的基於計算機的光密度測定法(Optiquant,Packard-Instmments)表明，與AdCMV-TK治療小鼠中的肝/肺表達比率5.8相比，AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中的肝/肺表達比率為11.3。這些結果表明，AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠主要在富血管生成器官(即轉移性肺)中表達HSV-TK基因，而處於CMV啟動子控制之下的TK表達(AdCMV-TK治療小鼠)主要在柯薩奇腺病毒受體富集器官如肝中進行(圖")。還在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的睪丸中檢測到強陽性HSV-TK表達。儘管不希望受限於單一假設，但要認識到，在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中的陽性表達可能由性腺中內皮素啟動子的高度表達來解釋。在AdCMV-TK治療小鼠中的陽性表達由相對高的RNA洗脫(RNAelution)來解釋，如由高度陽性的(3-肌動蛋白條帶反映出來的。總之，這些結果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV通過誘導中心轉移壞死和選^f性誘導血管生成性內皮細胞凋亡，可以安全和組織特異性方式有效抑制甚至高度侵襲性的癌症轉移擴散。就導致不希望的副作用減少的所需劑量降低和治療持續時間縮短形式抗癌治療提供了超越個別治療的顯著優勢(關於近期綜述參見Fang等，CurrOpinMolTher2003;5:475-82)。為了測試在多形式治療中AdPPE-l(3x)-TK+GCV施用的功效，評價與單劑放療聯合的全身性AdPPE-l(3x)-TK+GCV施用對Balb/C小鼠中緩慢生長的原發性CT-26結腸癌和C57B1/6小鼠中的轉移性Lewis肺癌的作用。^f^^^fpf用CT-26結腸癌接種入20隻8周齡雄性BALB/C小鼠的左股，以發現亞治療性且無毒的輻射劑量。肺瘤直徑一達到4-6mm,就用局部單劑輻射治療小鼠。檢查4個輻射劑量0Gy(黑色圓)、5Gy(空心圓)、10Gy(黑色三角形)或15Gy(空心三角形)。通過測量大軸和小軸每日評價肺瘤體積[按照式V=7r/6xa2xp(a是短軸，且(3是長軸)計算]。每日通過觀察和稱重監控小鼠保持良好狀態。與未治療的小鼠相比，IO和15Gy劑量抑制腫瘤進程的發展(分別為p=0.039、p=0.029)。但是，5Gy劑量僅誘導部分的、非統計學顯著的腫瘤發展延遲(圖78a)，且在5Gy治療小鼠中，既沒有檢測到顯著的重量減輕(圖78b),也沒有檢測到異常行為。根據這些結果，在聯合治療實驗中使用單劑5Gy放療。義、f屍屍5W卩々^^子控斜之7"^7X舉力衷迷和^者洛-^GC「」滋^7炎合^孝5Qy放^^賴n發'嫂潛應;^v^vf迷^.'用CT-26結腸癌肺瘤細胞接種100隻8周齡雄性Balb/C小鼠。肺瘤軸一達到4-6mm,就向尾靜脈中靜脈內注射1011PFU病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK],接著每天按指示腹膜內注射GCV(100mg/kg體重)達14天。載體施用後3天，用局部5Gy劑量輻射小鼠。按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且p是長軸)評價胂瘤體積。在處死時，給小鼠照相，且收穫肺瘤和肝標本進行組織學分析。與其它治療方案相比，AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放療抑制腫瘤進展。平均腫瘤抑制持續時間約2周，與腺病毒活性持續時間相匹配。AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療治療組的平均腫瘤體積進展小於AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療組(p=0.04)和AdCMV-TK+GCV治療組(p=0.008)。而且，該組(AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療)中的平均腫瘤體積進展小於所有其它組中累積的平均腫瘤體積進展(p=0.0025)、所有非輻射組(AdPPE-l(3x)-TK+GCV、Ad5CMV-TK+GCV、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK和鹽水+GCV;p=0.0005)中的累積平均胂瘤體積進展以及其它輻射組(Ad5CMV-TK+GCV+放療、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK+放療以及鹽水+GCV+放療；p=0.041)中的累積平均肺瘤體積進展(圖79a、b)。與非耙向載體AdCMV-TK相比，放療僅顯著加強血管生成內皮細胞轉錄耙向的載體AdPPE-l(3x)-TK(p-0.04)(圖79c-f)。在沒有放療時採用所有病毒載體的治療方案都無效。總之，這些結果表明了聯合的AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療在體內對CT-26結腸癌胂瘤發展的顯著協同性腫瘤抑制作用。爿6/屍/^-/(0^-7^+〇(:「農合放;^謬爭義說模^9#豕/S;為了確定聯合的AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療的抗肺瘤發生作用的機制，對腫瘤組織進行蘇木精和伊紅染色。肺瘤組織是細胞過多的(hypercellular)、凝縮的並具有高有絲分裂指數。檢測所有組中的兩種要素壞死和壞死區域中的肉芽組織。與取自非輻射小鼠的胂瘤相比，取自用包含輻射的方案治療的小鼠的胂瘤表現出更大的壞死區域和肉芽組織。在這些組中，壞死(圖80a)和肉芽組織(圖80b)主要位於中心。AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合放療治療的小鼠表現出最廣泛的壞死和肉芽組織(圖80a和80b),估計佔標本面積的約55%-80%(圖80)。與其它非輻射組相比，取自用無放療的AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療的小鼠的胂瘤表現出相對更大的壞死區域(數據未顯示)。結果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療誘發大規模中心肺瘤壞死，其部分地被肉芽組織替代。爿^/屍屍￡-/(0^-7^+GCF農合i^f滲,力發勿^^義說^^9f源z^.'為確定負責AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療對結腸癌腫瘤的抑制作用的細胞死亡特徵，對腫瘤組織進行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以顯現凋亡細胞。TUNEL染色在輻射組中顯現出中心壞死區域周圍的凋亡腫瘤細胞。在由AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合放療治療小鼠取出的胂瘤中鬥企測到比任何其它組都更多的凋亡腫瘤細胞(圖30a)。由胂瘤切片的抗胱天蛋白酶-3染色檢測到相同的凋亡細胞模式。而且，被凋亡肺瘤細胞包圍的壞死區域(白色箭標)為蛇形，且就含有增加的血管密度而言是獨特的(圖81b)。凋亡區域中的血管內皮細胞表現出陽性抗胱天蛋白酶-3染色(圖82)。總之，這些結果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合放療在結腸癌腫瘤的壞死區域周圍誘導大規^t的肺瘤細胞凋亡。而且，腫瘤凋亡區域中的血管生成性血管密度增加、壞死和凋亡區域的形狀以及內皮細胞凋亡的存在表明血管周圍壞死在血管生成組織損傷之後發生。炎合#」c^/^-/「3;c,-7Xj才面^l我i^^;成作-CD-31是血管生成的特徵性內皮細胞標記。對腫瘤組織進行抗CD-31免疫染色，以證實聯合治療對內皮細胞的直接作用。由採用含單獨輻射的方案治療的小鼠取出的腫瘤切片的血管生成性血管短，沒有連續性或分支，且邊界模糊。施用無GCV的單獨載體未引起異常(圖83a),而AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合放療顯示出最廣泛的血管異常(圖32a)。肝血管未受影響(圖83b)。結果表明，施用聯合放療的AdPPl(3x)-TK+GCV在血管生成性血管中誘發廣泛的血管破壞。全j'/i滋^/爿c/CA/K-7X+GCF但尤」^/屍/^-/^1」滋^^#,Cr-26潛應疾^Vf^V、虞^滲發^f處善^.'因為全身施用腺病毒載體的其中一種主要副作用是肝毒性，所以對載體治療小鼠、聯合治療小鼠和對照小鼠的肝組織進行蘇木精和伊紅染色。每個治療組中的肝標本都顯示出增大的肝細胞核和K叩fer細胞增生。最顯著的變化在用有或無放療的AdCMV-TK+GCV治療小鼠中表現出來(圖84)。在組間沒有發現肝功能血漿標記(肝酶SGOT、SGPT)或腎功能血漿標記(尿素、肌酸酐)的差異。應當指出的是，肝內皮細胞不受載體AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯合放療的影響(圖84,右圖)。結果表明，在CMV啟動子控制下表達HSV-TK的腺病毒載體相對有肝毒性。綜上所述，這些結果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV對於靜脈內施用是安全的。而且，所述載體〗又在與加入的無毒、局部遞送的放療l關合時有效抑制緩慢生長的原發性肺瘤進展。儘管不希望受限於單一假設，然而看起來經由凋亡而特異性抑制腫瘤血管生成似乎是肺瘤抑制的機制。而且，AdPPE-l(3x)-TK載體的細胞毒性活性依賴於GCV和放療的施用。滋^7^者洛4和義f屍屍醜-/(^義」^《子控教7"的7X炎合^^f:沐力錄^7增強#移^;#症吵W^;^為了評價AdPPE-l(3x)-TK+GCV和單劑放療的抗血管生成活性對癌症中的長期存活的聯合作用，選擇在快速轉移的Lewis肺癌模型中全身施用載體和GCV和放療。f口亞治^Vi^,'用LLC細胞接種入35隻8周齡雄性C57BL/6小鼠的左爪墊。一發展原發性腫瘤就在全身麻醉下截足。截足後8天在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單劑放療。4全查5個輻射劑量0、2、50、10和15Gy。去除原發性腫瘤後3-4周，未輻射小鼠開始體重下降，這是轉移疾病的病徵。由此按照去除原發性肺瘤後第28天的計劃處死小鼠。通過觀察和稱重每日監控小鼠保持良好狀態。用15Gy治療的6隻小鼠中有5隻在輻射後5天內死亡，沒有任何肺轉移的症徵。如下排除小鼠1隻小鼠由於相比於其它組原發性肺瘤發展延遲2周而被排除。3隻小鼠在隨訪期間死亡，且未進行屍體剖檢。在被排除的小鼠中，1隻小鼠在入選前糹皮排除，1隻來自未治療組，1隻來自2Gy組，且1隻來自5Gy組。用10Gy治療的小鼠的平均轉移重量低於其它組的該重量，但僅與5Gy治療組有統計學差異(口=0.001)(圖85a)。如前所述，15Gy輻射治療的小鼠在5天內死亡，無任何轉移蹤跡。10Gy治療小鼠在輻射後10天表現出非顯著性的短暫重量下降(圖85b)。因為單劑5Gy放療既不是治療性的(圖85a)也不是有毒性的(圖85b),所以其用於聯合治療實驗。聯合^亞浴^V^^^和^於屍屍E-7(Oc」^^子控斬7的4^遽/^^者洛，fGCF」滋^7鈔^^伊觀虞單;^^^脊移^疾病,將LLC細胞接種入180隻8周齡雄性Balb/C小鼠左爪墊中。一發展原發性胂瘤就在全身麻醉下截足。截足後5天，將101GPFU載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾靜脈中，接著每日腹膜內注射GCV(100mg/kg)達14天。載體注射後3天，在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單劑5Gy放療。小鼠分為6組1.Ad5PPE-l(3x)曙TK+GCV;2.Ad5CMV-TK+GCV;3.鹽水+GCV;4.Ad5PPE-l(3x)-TK+GCV+放療；5.Ad5CMV-TK+GCV+放療；和6.鹽水+GCV+放療。小鼠排除4隻小鼠在截腿後不久死亡，4隻小鼠由於原發性腫瘤對於入選來說太大而被排除，7隻小鼠由於原發性腫瘤發展晚而被排除，12隻小鼠沒有任何肺轉移蹤跡而死亡，1隻小鼠由於兩側眼排出物而被排除。在排除的小鼠當中，14隻在入選前內排除，2隻由組1排除，2隻由組2排除，2隻由組3排除，4隻由組4排除，3隻由組5排除，且1隻由組6排除。用AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療治療的小鼠的存活顯著長於任何其它治療組中的小鼠(p=0.05)(圖86a)。而且，相比於非靶向載體AdCMV-TK，放療僅顯著增強血管生成性內皮細胞轉錄靶向的載體AdPPE-l(3x)-TK(p=0.04)(圖86b-d)。結果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK載體+GCV+單劑放療的聯合治療協同延長了轉移性疾病中的存活。|義、f屍屍^-/^^^動子控#之7"^Fm和7W/^^合差^^雙重浴^;與，#^錄^7#強##^發*####為了測試化療和HSV/TK以外的"自殺基因"的血管生成性內皮特異性表達聯合的功效，單獨地和與蒽環類糖苷阿黴素(DOX)聯合向BAE細胞施用AdPPE-l(3x)-Fas-c,其具有與Fas-嵌合體(Fas-c,參見上文的詳述)組合的PPE-l(3x)啟動子。根據BAE細胞中細胞存活(％生存力，通過結晶紫染色評價)測量的凋亡在AdPPE-l(3x)-Fas-c+DOX治療小鼠中顯著高於在AdPPE-l(3x)-Fas-c或單獨的DOX治療小鼠中的凋亡(圖91)。這些結果表明，PPE-l(3x)啟動子可用於指導其它治療基因構建體的有效的、內皮特異性的表達，並且PPE-l(3x)依賴性的、凋亡誘導性的Fas-c表達和化療的聯合導致產生高度有效的協同內皮凋亡。務伴復教f靡^^戎殺*/《潛#:牛主動脈內皮細胞(BAEC)和人正常皮膚成纖維細胞-NSF細胞系在含10%熱滅活FCS、100|ug/ml青黴素和100|iig/ml鏈黴素的低葡萄糖DMEM中培養。HeLa(人子宮頸上皮腺癌)、Lewis肺癌細胞(D122-96)和293(人胚腎)細胞系在含10%熱滅活FCS、100pg/ml青黴素、100|ug/ml鏈黴素的高葡萄糖DMEM中培養。人臍內皮細胞-HUVEC(CambrexBioScienceWalkersville,Inc.)在EGM-2Bullet試劑盒(Clonetics,Bio-Whittaker,Inc.,MD,USA)中培養。人肺癌細胞系(A549)在含10%熱滅活FCS、100|ig/ml青黴素和100|ug/ml鏈黴素的MEM中培養。所有細胞都在37。C、5%C02、溼潤氣氛中生長。#在^|#我'#身建.'將螢火蟲螢光素酶cDNA亞克隆入pcDNAIII表達質粒(含CMV啟動子區，Invitrogen)的多克隆位點中，以及亞克隆入含PPEl-3x啟動子和腺病毒-5DNA序列部分的pPACPPE-l.plpA中。通過從pPACPPE-l.plpA質粒中缺失PPE-1啟動子的第一內含子克隆第三種質粒。先前已在我們的實驗室中克隆了這3個質粒，並用於細胞培養物轉染。復#^潛^戎#^謦,將FAS-嵌合體的cDNA亞克隆入pPACPPE-l.plpA和pPACCMV.plpA質粒中。這些質粒與含大部分腺病毒-5基因組的pJM17共轉染，且用磷酸4丐法共轉染入293人胚腎細胞系(ATCC)中。該細胞系設計成包含病毒複製必需^旦不包含在pPAC.plpA或pJM17質粒中的El基因。所述質粒在所述細胞中經歷同源重組，且約2周後形成重組病毒，並開始複製且最終引起細胞裂解。分離病毒集落並增殖，且其確切插入方向通過PCR驗證。複製缺陷型載體先前通過現有技術的常規克隆技術製備。務伴復賴f應病^卩a^4Z)」種建.'使用AdEasy法(Stratagene,LaJollaCA)構建CRAD。如下修飾含腺病毒-5DNA序列部分的質粒PShuttle-MK:由中期因子(Midkine)(mk)啟動子和連續的腺病毒El區替代pShuttle(Stmtagene,LaJolla,CA)中的多克隆位點和右臂。之後，以無內含子的PPEl-3x替代MK啟動子。通過在所述啟動子和E1之間亞克隆IRES序列(得自pIRES-EYFP質粒，BDBiosciences)和FAS-嵌合體cDNA來構建第二種質粒。IRES允許由相同轉錄物翻譯兩種蛋白質。所獲得的兩種穿梭物(shuttle)用Pmel消化線性化，且隨後轉化入大腸桿菌BJ5183ADEASY-1(Stmtagene)中。該種細菌已用pADEASY-l質粒轉化，所述pADEASY-l質粒含除El和E3基因區以外的大部分腺病毒-5序列。質粒在細菌中經歷同源重組(在pShuttle和pADEASY-l之間)，由此生成完整載體基因組。重組體隨後用Pacl消化，並用磷酸《丐法轉染入293人胚腎細胞系(ATCC)中。餘下的程序如對複製缺陷型載體的描述一樣。通過將普通啟動子CMV(巨細胞病毒)亞克隆在E1基因之前構建陽性對照病毒CMV-E1。CMV-E1病毒是遍在性的，且對內皮細胞沒有特異性。按照上述方法構建以下的複製缺陷型載體和CRAD:複製缺陷型載體PPE-l(3x)-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC(LUC-螢火蟲螢光素酶報告基因的縮寫)、PPE-l(3x)-LUC。CRAD:PPE-l(3x)-CRAD、PPE畫l(3x)-Fas-CRAD、CMV-E1。脊^,-發.'BAEC和HeLa細胞在24孔板中培養至60-70%匯合。使用0.4pg/孔表達構建體和作為轉染效率對照的0.04iug/孔pEGFP-Cl載體(CLONTECH,PaloAlto,CA)進行共轉染。Lipofectamine和Lipofectamineplus(Invitrogen,Carlsbad,CA)用於轉染。於37。C溫育3小時後，用生長培養基替換轉染混合物。轉導實,驗載體(PPE-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC、PPE-LUC)用感染生長培養基(含2。/。FCS,而不是正常生長培養基中的10%)稀釋，以達到10、100、1000、10000的感染複數(moi)。感染複數根據每個耙細胞的病毒數計算。靶細胞(BAEC和293)已在轉導前24小時接種。在轉導當天，用含以所需moi混合在0.1或2ml感染培養基中的病毒的溶液分別替換96孔板或60mm板的細胞生長培養基。細胞溫育4小時，接著向轉導細胞中加入新鮮培養基。分別由PFU滴定(參見下文)和ApoPercentage試劑盒(AccurateChemical,Westbury,NY)評價載體複製和凋亡誘導。結晶紫染色也用於評價附著於板表面的細胞量，作為細胞生存力的指示。^/試病#諒產—逸嫂多4卓在溯0tfPFL9:滴定病毒原液並儲存於-80°C。利用感染培養基稀釋的連續稀度(10-2-10-13)的病毒載體感染293細胞的分匯合(80%)培養物2小時。2小時後，用PBS洗滌培養基，且替換為瓊脂覆層。在約2周後有明顯噬斑的最高稀度定為以PFU/ml為單位的濃度(PFU—噬斑形成單位)。潛果敘敏辜^差^^這增獲靡病毒復餘為了檢驗凋亡誘導對病毒複製的影響，在293(人胚腎)細胞系中檢驗CMV-FAS複製。在該細胞系中，所述病毒可通過FAS-c或因其複製引起的細胞裂解誘導凋亡。早期(病毒感染後幾小時)凋亡可能干擾病毒複製，而晚期凋亡(病毒感染後幾天)可能增強病毒傳播。為了測試CMV-FAS誘導凋亡的能力，轉導BAEC,且通過生存力的ELISA-結晶紫測定來評價細胞凋亡(圖89)。較高濃度(IOOOOmoi)的CMV-FAS在沒有活化配體(TNF-a)的情況下誘導凋亡，而在4交低濃度時需要加入所述配體來誘導凋亡。通過293細胞中的嗜斑發展來測定細胞至細胞的CMV-FAS傳播。如按照噬斑發展速率和噬斑大小所觀察到的(圖88和89),和非凋亡誘導載體CMV-LUC相比，採用CMV-FAS載體時噬斑發展以較高速率發生。通過螢光素酶報告基因評價有和沒有內含子時PPEl-3x啟動子誘導RNA轉錄的能力(未顯示)。未觀察到顯著差異。這些結果表明，通過宿主細胞的額外凋亡裂解，可增強腺病毒載體的複製，所述載體例如為上文所述的血管生成性、內皮特異性病毒構建體AdPPE-1(3x),其攜帶誘導凋亡的"殺傷"基因如FAS。J^GF《這^屍屍五-/(Ox」控翔增強工在必逸歡^新i^多4和存活為了研究處於內皮素啟動子控制下的VEGF表達在體外和體內對工程化組織構建體的血管形成的作用，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細胞，並分析構建體，以觀察對血管形成的作用。圖91a表明，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細胞對在工程化構建體中形成的血管樣結構的數目和大小具有誘導作用。構建體在培養基有或沒有補加VEGF(50ng/ml)的情況下培養。用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒或對照GFP腺病毒感染平行構建體(達4小時)。在培養2周後，對構建體進行固定、包埋、切片和染色。在加入VEGF至培養基和用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細胞之間進行對比，發現用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒處理的樣品中的血管數和血管面積百分比增加至4-5倍(圖91a)。在體內研究中，使用3種不同模型分析植入物的體內存活、分化、整合和血管形成。這些模型包括(i)在SCID小鼠背部皮下植入，(ii)植入棵大鼠四頭肌中，和(iii)用構建體替代棵d、鼠前腹肌節。構建體一皮宿主血管滲透。Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒感染的構建體與對照構建體相比顯示出血管結構增加。為評價組織工程化構建體的體內存活和整合，我們使用基於螢光素酶的成像系統。體內成像系統(IVIS)通過檢測由全身施用的螢光素和局部產生的螢光素酶的相互作用產生的光來工作。構建體用編碼螢光素酶的腺伴隨病毒(AAV)載體感染48小時，然後移植。接著將構建體原位置於棵小鼠的前腹肌壁中。在外科手術時將AAV-螢光素酶注射入每隻小鼠左下肢，以用作陽性對照。外科手術後3-4周，小鼠接受螢光素，以評價對組織工程化構建體的灌注。用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染(和之後用AAV-螢光素酶感染)的構建體具有比僅用AAV-螢光素酶感染的對照構建體高的信號(未顯示結果)。總之，這些結果提示，用Ad5PPEC-l-3xVEGF體外感染可改善植入的工程化組織構建體的存活和血管形成。我i^蘭成'治#謬力活/A/f3;cjj動子許多組織對血管生成阻抑的常見應答是響應於由控制血管穩態的自身調節的自分泌反饋迴路產生的複雜信號傳導上調內源性血管生成途徑(參見Hahn等，AmJMed1993,94:13S-19S,和Schramek等，SenimNephrol1995;15:195-204)。為了確定此機制如何能影響處於PPE-l(3x)啟動子控制下的核酸序列的表達，在有和沒有施用有效抗血管生成藥物波生坦的情況下，測量用本發明核酸構建體轉化的轉基因小鼠組織中的體內發光水平，其中所述核酸構建體含處於PPE-l(3x)控制下的螢光素酶(LUC)基因[PPE-l(3x)-LUC]。波生坦(TracleerTM)是雙重內皮素受體(ETA和ETB)拮抗劑，目前臨床上批准用於多種適應症，最重要的是肺動月永高血壓和肺纖維^匕。如上文詳述的，通過本領域眾所周知的克隆方法，產生攜帶本發明的PPE-l(3x)-LUC構建體或Harats等人(JClinInvest1995;95:1335-44)詳述的PPE-1-LUC構建體的轉基因小鼠。用食物飲食或含100mg/kg/天波生坦的食物飲食經口飼餵10周齡PPE-l(3x)-Luc或PPE-1-LUC轉基因小鼠(每組11=5)達30天。如在上文的方法部分中所述，在治療最後一日處死小鼠，並取出器官，取出的小鼠器官用於測量發光強度。圖94顯示了PPE-l(3x)啟動子賦予轉基因小鼠中的重組基因以組織特異性超表達。一般具有較高內皮素活性的器官如心臟和主動脈，以及具有程度低一些的內皮素活性的器官腦、氣管和肺，與肝或腎相比顯示出增加的發光強度。但是，在大部分器官中，波生坦施用使發光強度顯著增強(在心臟組織中最高達40%)(圖94),由此表明內皮素受體拮抗劑，尤其是和一般的血管生成抑制劑一起，可活化本發明的內皮特異性啟動子，並以組織特異性方式誘導處於PPE-l(3x)轉錄控制下的轉基因表達進一步增強。細胞內前內皮素原-1mRNA和循環內皮素-1的水平的測量，表明給表達在PPE-1啟動子控制下的縈光素酶的轉基因小鼠施用內皮素受體拮抗劑(例如波生坦)事實上導致增強的組織內皮素-1轉錄(圖97A)和在血漿中檢測到的增加的免疫反應性的內皮素-l(圖97B)。為了進一步測定在PPE-1啟動子控制下的基因產物的表達增強的特異性，將雙重內皮素拮抗劑波生坦對內皮素受體活性的抑制作用與ET-1A(BQ123,Sigma-Aldnch,St.Louis,Missouri,USA)和ET-1B(BQ788,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)的個別特異性拮抗劑的抑制作用相對比。圖96顯示了用在PPE-1啟動子(上文所述的質粒pEL8-LUC)或對照SV40啟動子控制下的螢光素酶表達質粒轉染、隨後用ET-1受體拮抗劑波生坦、BQ123或BQ788處理1小時的牛主動脈內皮細胞(BAEC)培養物中測量的螢光素酶活性，表達為未處理對照的百分比。用波生坦和BQ788處理測量到在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶活性的顯著增加，但是BQ123(ET-U拮抗劑)不然。波生坦和BQ788處理(在linM)導致螢光素酶活性與未處理對照相比分別有1.6和1.3倍增力口(圖96)。在SV40-螢光素酶轉染的細胞中沒有觀察到顯著增力口(數據未顯示)。總之，這些結果表明，響應於ETB阻斷的增加的前內皮素原-1mRNA水平由增加的PPE-1啟動子活性介導，這暗示著響應於ET-1受體阻斷在PPE-1控制下的基因增強的轉錄。此外，可以體外和體內檢測增加的PPE-1啟動子活性，分別用於短期和長期處理。如本文所顯示的，PPE-1mRNA水平與表達在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶報告基因的轉基因小鼠的螢光素酶活性相關。因而，該模型也可以用於評價包括高血壓、癌症和急性腎衰竭在內的不同病理生理學狀態中的ET-1表達。在屍屍E-/卩jc」^動f控教力《3W脊差^不乂^#W如上文所述，同其它長期治療模式一樣，基因治療經常伴有針對持續接觸所表達的轉基因蛋白產生的內源性宿主免疫反應。轉基因蛋白的免疫刺激可引起治療功效降低、炎症並有時引起嚴重副作用。為了測試針對使用本發明的順式反應調節元件表達的轉基因的宿主免疫應答，在具有LLC微轉移、並用攜帶Fas-TNF-Rl嵌合體(Ad5PPE-l(3x)Fas-c和Ad5CMVFas-c)或LUC報告基因(Ad5PPE-l(3x)Luc)的載體治療的小鼠(每組6隻小鼠)中測定抗腺病毒異己酮和TNF-R1的抗體效價。對照小鼠用鹽水治療。載體以注射之間5天的間隔注射3次。在最後一次載體注射後10天處死小鼠，以使用ELISA測定來測定抗腺病毒和抗人TNF-R1(由所插入的轉基因表達的蛋白)的抗體水平。出乎意料的是，發現抗人TNF-R1的抗體水平低於Ad5-PPE(3x)-Fas-c治療小鼠中的檢測水平，而這些水平在非特異性Ad5-CMV-fas載體治療小鼠中相對較高(圖95b)。抗腺病毒異己酮抗原的抗體效價在注射不同病毒的組別間是相似的(圖95a)。這些結果表明，使用本發明的PPE-l(3x)構建體表達的轉基因被宿主免疫系統良好耐受，與系統發生接近度(phylogeneticproximity)無關。,滋辨W發者類/^攀^理f^力^:勿/《吵脊^^W^^:最近已經表明，皮質類固醇(地塞米松)施用可以預防一些免疫-和凋亡-有關的重組腺病毒感染的內皮損傷(Murata，等人ArteriosclerThrombVascBiol2005;25:1796-803),從而抑制促炎症基因表達和最優化體外和體內重組基因表達效率。為了測試皮質類固醇是否可以增強內皮細胞中病毒介導的轉基因表達，在轉染之前，用地塞米松處理用包含螢光素酶報告分子編碼序列或綠色螢光蛋白(GFP)報告分子編碼序列的腺病毒構建體轉染過的BAEC細胞。圖98表明，在用表達在CMV啟動子控制下的螢光素酶的腺病毒(Ad-CMV-LUC)感染之前用3pM地塞米松處理過的BAEC細胞中按照每pg總蛋白的安光素酶百分比測得的螢光素酶表達增加至超過3倍。最突出的作用是用1000感染複數。圖99解釋了在PPE-1啟動子控制下的有活性的重組綠色焚光蛋白(GFP)在內皮BAEC中的表達，這由皮質類固醇-處理的細胞的增強的綠色指示。因而，皮質類固醇可以增強內皮細胞中病毒介導的轉基因表達，且可以與本發明的方法一起使用。要認識到的是，為清楚起見而在獨立實施方案背景下描述的本發明的某些特徵也可組合在單一實施方案中提供。相反，為簡短起見而在單一實施方案背景下描述的本發明的各種特徵也可獨立地或以任意合適的子組合方式提供。儘管已結合本發明的具體實施方案描述了本發明，但是顯然許多替代方案、修改和變化對於本領域技術人員是顯而易見的。因此，本發明計劃包括屬於所附權利要求書的精神和寬泛範圍內的所有這樣的替代方案、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請都全文引入到本說明書中作為參考，其程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請具體而單獨地被指明引入本文中作為參考。另外，本申請中的任何參考文獻的引用或鑑定不應解釋為承認這樣的參考文獻對於本發明而言是現有技術。權利要求1.一種產品，其包含包裝材料和(a)核酸構建體，它包含(i)內皮細胞特異性啟動子；(ii)SEQIDNO5所述低氧反應元件的至少一個拷貝；和(iii)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應元件的調節控制下；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況。2.—種產品，其包含包裝材料和(a)核酸構建體，它包含(i)內皮特異性啟動子；(ii)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述內皮特異性啟動子和順式調節元件的調節控制下，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況。3.—種產品，其包含包裝材料和(a)設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(ii)第二多核普酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中與過度血管生成有關的疾病或狀況。4.一種產品，其包含包裝材料和(a)設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(n)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中與過度新血管形成有關的疾病或一犬;兄。5.—種產品，其包含包裝材料和(a)設計並構建用於在肺瘤細胞中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(ii)第二多核苷酸區，其編碼在所述肺瘤細胞中指導所述嵌合多肽的表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述肺瘤細胞的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中的腫瘤生長或發育。6.—種產品，其包含包裝材料和(a)設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生血管生成的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區；和(H)第二多核苦酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述促血管生成因子的表達的順式調節元件；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中局部缺血相關的疾病或狀況。7.—種產品，其包含包裝材料和(a)設計並構建用於在血管生成細胞中的細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核普酸區，和(ii)第二多核苷酸區，其編碼能夠在所述血管生成細胞中指導所述自殺基因的表達的順式調節元件；和(b)至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；其中所述包裝材料包括標籤或包裝插頁，它們指示所述核酸構建體和所述血管生成調節劑用於治療受試者中與過度血管生成有關的疾病或狀況。8.權利要求1-7中任一項的產品，其中所述核酸構建體另外包含條件複製型腺病毒。9.權利要求8的產品，另外包含至少一種能增加所迷腺病毒的拷貝數的化合物。10.權利要求9的產品，其中所述化合物是皮質類固醇和/或N-乙醯半胱氨酸。11.權利要求1-7中任一項的產品，其中所述血管生成調節劑是除了波生坦以外的內皮素受體拮抗劑。12.權利要求11的產品，其中所述內皮素受體拮抗劑是雙重A-形式和B-形式內皮素受體拮抗劑。13.權利要求11的產品，其中所述內皮素受體拮抗劑是B-形式特異性內皮素受體拮抗劑。14.權利要求13的產品，其中所述B-形式特異性內皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。15.權利要求2的產品，其中所述核酸序列編碼促血管生成因子，且其中所述疾病或狀況與減少的血管生成有關。16.權利要求2的產品，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關。17.權利要求3-5中任一項的產品，另外包含所述配體結合結構域的配體。18.權利要求3-7中任一項的產品，其中所述順式作用調節元件是動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-1啟動子、TIE-2啟動子、內皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。19.權利要求6的產品，其中所述局部缺血相關的疾病或狀況選自傷口癒合、缺血性中風、缺血性心臟病和胃腸損害。20.權利要求7的產品，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉化成毒性化合物，後者能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。21.權利要求7和20中任一項的產品，另外包含前藥，當所述前藥被所述自殺基因轉變為毒性化合物時，該前藥能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。22.核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)內皮細胞特異性啟動子；(b)SEQIDNO:5所述低氧反應元件的至少一個拷貝；和(c)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應元件的調節控制下；所述藥物用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性。23.核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)內皮特異性啟動子；(b)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述內皮特異性啟動子和順式調節元件的調節控制下，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；所述藥物用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性。24.設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；所述藥物用於治療受試者中與過度血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。25.設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；所述藥物用於治療受試者中與新血管形成有關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。26.設計並構建用於在腫瘤細胞中產生細胞毒性的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核芬酸區，其編碼在所述腫瘤細胞中指導所述嵌合多肽的表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述腫瘤細胞的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；所述藥物用於治療受試者中的腫瘤生長或發育，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。27.設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生血管生成的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述促血管生成因子的表達的順式調節元件；所述藥物用於治療受試者中局部缺血相關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。28.設計並構建用於在血管生成細胞中的細胞毒性的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核普酸區，和(b)第二多核苷酸區，其編碼能夠在所述血管生成細胞中指導所述自殺基因的表達的順式調節元件；所述藥物用於治療受試者中與過度血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。29.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用包含下述的核酸構建體治療(a)內皮細胞特異性啟動子；(b)SEQIDNO:5所迷低氧反應元件的至少一個拷貝；和(c)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應元件的調節控制下，其中選擇的所述血管生成調節劑能以協同方式增強所述內皮特異性啟動子的活性。30.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於治療受試者中血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用包含下述的核酸構建體治療(a)內皮特異性啟動子；(b)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述內皮特異性啟動子和順式調節元件的調節控制下，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；其中選擇的所述至少一種血管生成調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性。31.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體來治療，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；其中選擇的所述至少一種血管生成調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。32.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於治療受試者中與新血管形成有關的疾病或狀況，所述受試者用設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體來治療，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細力包亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；其中選擇的所述至少一種血管生成調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。33.設計並構建用於在肺瘤細胞中產生細胞毒性的核酸構建體用於生產藥物的用途，所述核酸構建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述肺瘤細胞中指導所述嵌合多肽的表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述腫瘤細胞的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；所述藥物用於治療受試者中的腫瘤生長或發育，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調節劑來治療，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。34.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於治療受試者中局部缺血相關的疾病或狀況，所述受試者用設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生血管生成的核酸構建體來治療，所述核酸構建體包含(a)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區；和(b)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述促血管生成因子的表達的順式調節元件；其中選擇的所述至少一種血管生成調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。35.至少一種血管生成調節劑用於生產藥物的用途，所述藥物用於治療受試者中與過度血管生成有關的疾病或狀況，所述受試者用設計並構建用於在血管生成細胞中的細胞毒性的核酸構建體來治療，所述核酸構建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區，和(b)第二多核苷酸區，其編碼能夠在所述血管生成細胞中指導所述自殺基因的表達的順式調節元件；其中選擇的所述至少一種血管生成調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性。36.權利要求22-35中任一項的用途，其中所述核酸構建體另外包含條件複製型腺病毒。37.權利要求36的用途，另外包含至少一種能增加所述腺病毒的拷貝數的化合物。38.權利要求37的用途，其中所述化合物是皮質類固醇和/或N-乙醯半胱氨酸。39.權利要求22-35中任一項的用途，其中所述血管生成調節劑是除了波生坦以外的內皮素受體拮抗劑。40.權利要求39的用途，其中所述內皮素受體拮抗劑是雙重A-形式和B-形式內皮素受體拮抗劑。41.權利要求39的用途，其中所述內皮素受體拮抗劑是B-形式特異性內皮素受體拮抗劑。42.權利要求41的用途，其中所述B-形式特異性內皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。43.^l利要求23和30中任一項的用途，其中所述核酸序列編碼促44.權利要求23和30中任一項的用途，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關。45.權利要求24-26和31-33中任一項的用途，另外包含所述配體結合結構域的配體。46.權利要求24-28和31-35中任一項的用途，其中所述順式調節PPE-1啟動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-]啟動子、TIE-2啟動子、內皮糖蛋白啟動子、vonWillebrand啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。47.權利要求27和34中任一項的用途，其中所述局部缺血相關的疾病或狀況選自傷口癒合、缺血性中風、缺血性心臟病和胃腸損害。48.權利要求28和35中任一項的用途，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉化成毒性化合物，後者能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。49.權利要求28、35和48中任一項的用途，另外包含前藥，當所述前藥被所述自殺基因轉變為毒性化合物時，該前藥能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。50.調節受試者組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在組織中表達核酸構建體，該核酸構建體包含(i)內皮細胞特異性啟動子；(ii)SEQIDNO:5所述低氧反應元件的至少一個拷貝；和(iii)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應元件的調節控制下；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性；從而調節所述受試者的所述組織中的血管生成。51.調節組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在組織中表達核酸構建體，該核酸構建體包含(i)內皮特異性啟動子；(ii)編碼血管生成調節物的核酸序列，所述核酸序列在順式調節元件的調節控制下，所述順式調節元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；和(b)給組織施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述內皮特異性啟動子的活性；從而調節所述組織中的血管生成。52.下調受試者的組織中血管生成的方法，該方法包含(a)給受試者施用設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(ii)第二多核苦酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；和(b)給受試者施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；由此在所述組織中下調血管生成。53.治療與過度的新血管形成有關的疾病或狀況的方法，該方法包含(a)施用治療有效量的設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(ii)第二多核苷酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述嵌合多肽的表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述血管生成細胞亞群的配體結合，而所述配體與所述配體結合結構域的結合活化所述細胞毒性分子的所述效應物結構域；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性，由此在所述組織中下調血管生成，並治療與過度的新血管形成有關的疾病或狀況。54.治療受試者的胂瘤的方法，該方法包含(a)給受試者施用治療有效量的設計並構建用於在腫瘤細胞中產生細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區，所述嵌合多肽包含與細胞毒性分子的效應物結構域融合的配體結合結構域；和(n)第二多核普酸區，其編碼在所述胂瘤細胞中指導所述嵌合多肽的表達的順式調節元件；其中選擇所述配體結合結構域，從而使其能與存在於或提供給所述述細胞毒性分子的效應物結構域，以由此在所述腫瘤細胞中指導細胞毒性；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；從而治療所述受試者的腫瘤。55.治療與局部*夾血相關的疾病或^1犬況的方法，該方法包含(a)給受試者施用治療有效量的設計並構建用於在血管生成細胞亞群中產生血管生成的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼促血管生成因子的第一多核普酸區；和(ii)第二多核苦酸區，其編碼在所述血管生成細胞亞群中指導所述促血管生成因子的表達的順式調節元件；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；從而治療所述受試者中所述局部缺血相關的疾病或狀況，由此上調所述組織中的血管生成，並治療與局部缺血有關的疾病或狀況。56.下調受試者的組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在所述組織中表達設計並構建用於在血管生成細胞中的細胞毒性的核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區，和(ii)第二多核苷酸區，其編碼能夠在所述血管生成細胞中指導所述自殺基因的表達的順式調節元件；和(b)給受試者施用至少一種選擇的血管生成調節劑，該調節劑能以協同方式進一步增強所述順式調節元件的活性；由此下調所述組織中的血管生成。57.權利要求50-56中任一項的方法，其中所述核酸構建體另外包含條件複製型腺病毒。58.權利要求57的方法，另外包含至少一種能增加所述腺病毒的拷貝數的化合物。59.權利要求58的方法，其中所述化合物是皮質類固醇和/或N-乙醯半胱氨酸。60.權利要求50-56中任一項的方法，其中所述血管生成調節劑是除了波生坦以外的內皮素受體拮抗劑。61.權利要求51的方法，其中所述核酸序列編碼促血管生成因子，且其中所述疾病或狀況與減少的血管生成有關。62.權利要求51的方法，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關。63.權利要求52-54中任一項的方法，另外包含施用所述配體結合結構域的配體。64.權利要求56的方法，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉化成毒性化合物，後者能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。65.權利要求56和64中任一項的方法，另外包含前藥，當所述前藥被所述自殺基因轉變為毒性化合物時，該前藥能造成所述血管生成細胞的細胞毒性或凋亡。全文摘要公開了表現出內皮細胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列、新順式調節元件及其使用方法，所述方法使得能夠治療特徵為異常新血管形成或細胞生長的疾病。文檔編號A61K48/00GK101443049SQ200780014285公開日2009年5月27日申請日期2007年2月22日優先權日2006年2月23日發明者D·哈拉茨,E·布賴特巴特,L·班喬,M·佩萊德,S·格林伯格申請人:脈管生物生長有限公司