一種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-31 13:32:46 1

專利名稱：一種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及高分子藥物載體領域，具體地說，是ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料及其製備方法和應用。
背景技術：
目前，國內外關於肝癌的研究主要集中在單配體修飾的聚合物製備載藥(或基因)納米粒子方面。如，以去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)介導的肝靶向納米粒子的研究，顯示具有趨肝性，並且對肝癌也有一定的抑制作用，以甘草次酸受體介導的肝主動靶向也有同樣的效果。然而這種單個配體修飾的納米粒子在進行受體一配體相互作用時易受到許多病理及生理條件的變化而變化，從而導致受體介導作用的部分失效，影響靶向治療的效果。如對於患肝臟疾病的病人，ASGP-R的密度和活性會降低，這是由於血清抑制劑的存在， 而導致肝癌細胞的結合量降低大約95%，因此在病理條件下，單純ASGP-R介導的肝主動靶向將會變得不那麼有效。另外，並不是所有的靶向受體都僅僅在靶細胞上過量表達，這會導致單配體修飾納米粒子與靶向受體結合的不足，Negishi等發現大鼠肝臟中含有最高的甘草次酸受體，而腎臟中也含有少量的甘草次酸受體。因此單個配體修飾的載體材料的低的轉運率、有限的被受體特異性識別的能力等，仍是現階段急需解決的問題。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。本發明的第二個的目的是，提供ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法。本發明的第三個目的是，提供ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法的應用。本發明的第四個目的是，提供ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖/5-氟尿嘧啶載藥納米粒子。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料是選用殼聚糖作為載體，甘草次酸和乳糖酸作為配體，通過N-醯化反應，合成的甘草次酸和乳糖酸共修飾的殼聚糖材料。所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法包括以下步驟
a、首先稱取甘草次酸溶於DMF溶液中，並加入EDOHCl和NHS進行活化，在磁力攪拌的條件下，將活化的甘草次酸溶液加入到殼聚糖溶液中，並在室溫下反應，用丙酮靜置沉澱後，再用こ醇、こ醚洗滌沉澱，室溫真空乾燥即得到甘草次酸殼聚糖材料；
b、將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。所述的步驟a中甘草次酸殼聚糖合成的條件為EDOHCl與GA的摩爾比為O. 6-2. 4:1，EDOHCl 與 NHS 的摩爾比為 O. 4-2. 5:1，GA 與 CTS 的摩爾比為 O. 8-1. 5:1，反應時間為1-3 do所述的步驟b為將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應中72小時後，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析4天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法包括以下步驟
a、首先稱取甘草次酸溶於DMF溶液中，並加入EDOHCl和NHS進行活化，在磁力攪拌的條件下，將活化的甘草次酸溶液加入到殼聚糖溶液中，並在室溫下反應，用丙酮靜置沉澱後，再用こ醇、こ醚洗滌沉澱，室溫真空乾燥即得到甘草次酸殼聚糖材料； b、將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。所述的步驟a中甘草次酸殼聚糖合成的條件為EDOHCl與GA的摩爾比為O. 6-2. 4:1，EDOHCl 與 NHS 的摩爾比為 O. 4-2. 5:1，GA 與 CTS 的摩爾比為 O. 8-1. 5:1，反應時間為1-3 do所述的步驟b為將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應中72小時後，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析4天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料作為載體材料在製備治療肝靶向治療藥物中的應用，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的濃度為O. 005-0. 05 mg/ml O為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖/5-氟尿喃唳載藥納米粒子，所述的載藥納米粒子是由權利要求1-4任一所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，通過離子交聯的方法，製成的載5-氟尿嘧啶的載藥納米粒子。所述的載藥納米粒子的製備方法稱取乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料溶於醋酸溶液中，並用NaOH調節其pH值後，加入5-氟尿嘧啶於上述溶液中溶解，然後逐滴滴加TPP溶液於上述均勻混合的溶液中，室溫低速磁力攪拌進行離子交聯反應，並自發形成納米粒子；將得到的納米粒子懸浮液以10000轉/分離心30分鐘，然後用大量去離子水洗殘留物，分散後再離心洗滌，然後重新分散在去離子水中，冷凍乾燥，保存備用。本發明優點在幹
1、首次合成雙配體(甘草次酸和乳糖酸)共修飾的殼聚糖材料，並製成納米粒子，進行靶向研究，為新型肝癌靶向給藥系統的設計與製備提供理論基礎和科學依據，並豐富了肝靶向給藥系統的內容，為臨床肝癌的靶向治療奠定實驗基礎；
2、本發明的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖製備成納米粒子後，比GA-CTS和CTS具有更強的肝靶向性和肝癌細胞受體介導的主動靶向性，能顯著減少在其他臟器的分布，提高了肝癌靶向的可靠性，可以作為ー種在醫學臨床中對肝癌的靶向治療具有廣闊應用前景的載體材料。


圖I.乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的N-醯化反應機理。圖2. GA-CTS在EDOHC1/NHS交聯劑介導下的反應機理。圖3. GCGA的合成路線及機理。圖4. GA-CTS, CTS和GA的紅外光譜圖。圖5.通過正交實驗設計法合成的九組GA-CTS的紅外光譜圖。圖6. GCGA, GA-CTS和LA的紅外光譜圖。 圖7. GCGA和CTS的核磁共振氫譜圖，其中，★是乳糖酸特徵峰， 是殼聚糖的特徵峰，▲是甘草次酸的特徵峰。圖8.不同濃度下CTS和GCGA材料對L929細胞由MTT得到的OD值。圖9. FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子的掃描電鏡照片。圖10. FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子的粒徑分布。圖11.三種納米粒子與BEL-7402細胞共孵育2 h的流式細胞儀分析結果，a，無納米粒子陰性對照組；b，GCGA納米粒子組；c，GA-CTS納米粒子組；d，CTS納米粒子組，GCGA納米粒子組與GA-CTS有顯著顯著性差異(P〈O. 05)，與CTS組有高度顯著性差異(P〈0.01)。圖12.三種納米粒子與BEL-7402細胞共孵育4 h的雷射共聚焦顯微鏡照片。圖13. GCGA納米粒子分別與BEL-7402和L02細胞共孵育4 h的流式細胞儀分析結果，其中a，BEL-7402中無GCGA納米粒子組；b，BEL-7402細胞中GCGA納米粒子組；c，L02細胞中無GCGA納米粒子組；d，L02細胞中GCGA納米粒子組。BEL-7402和L02細胞之間的流式結果具高度有顯著性差異(P〈0. 01)。圖14. GCGA納米粒子分別與BEL-7402和L02細胞共孵育4 h的雷射共聚焦顯微鏡照片。圖15.螢光標記CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子在大鼠體內分布的螢光圖像。圖16. CTS、GA-CTS和GCGA載5-Fu納米粒子的粒徑分布。圖17. CTS (A)、GA-CTS (B)和GCGA (C)載5-Fu納米粒子的掃描電鏡圖片及其懸浮液靜置4 d後拍攝實物照片。圖18. 5-Fu在PBS緩衝溶液中的最大紫外吸收峰和及其標準曲線。圖19. GCGA載5_Fu納米粒子和純5_Fu的藥物釋放。圖20. GCGA載5-Fu納米粒子可能的結構。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發明中甘草次酸(GA);乳糖酸(LA);殼聚糖(CTS);乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA) ;N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) ;1_(3_ ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)。實施例I乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的合成及結構表徵
本實施例選擇殼聚糖(CTS)作為基體材料，甘草次酸(GA)和乳糖酸(LA)作為肝靶向配體，並通過N-醯化反應的方法分兩步把甘草次酸和乳糖酸分別接枝到殼聚糖上，達到對肝癌細胞的主動靶向的目的。為了優化反應條件，獲得合適的接枝率，本實驗設計了四因素三7K平し9(34)正交試驗，考查EDOHCl與NHS物質的量的比、EDOHCl與GA物質的量的比、GA與CTS物質的量的比以及反應時間對接枝率的影響，用傅立葉紅外測試(IR)和核磁共振氫譜(1H-NMR)驗證此雙配體修飾的殼聚糖材料是否合成成功，並計算其取代度。然後通過採用圖像分析系統測定CTS、甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)表面的水接觸角，為後續納米粒子的製備與分析奠定研究基礎。I.實驗方法
I.I實驗試劑與儀器
主要藥品殼聚糖(CTS)，脫こ醯度91%，粘性78mPa. S，浙江澳興生物科技有限公司；甘草次酸(GA)，含量> 97%，西安富捷藥業有限公司；乳糖酸(LA)，含量97%，美國
Sigma-Aldrich公司；ニ甲基甲醯胺(DMF),分析純，美國Amresco公司；四甲基こニ胺(TEMED)，分析純，加拿大Bio Basic公司；1_ (3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)，含量99. 5%，上海共價化學科技有限公司；N_羥基琥珀醯亞胺(NHS)，含量99. 6%，上海共價化學科技有限公司。主要儀器傅立葉紅外光譜儀，核磁共振儀，冷凍乾燥機，磁力加熱攪拌器，生物醫學冷凍櫃，生化培養箱，數顯恆溫水浴鍋，pH計，真空乾燥箱，理化乾燥箱，分析天平。I. 2材料合成
I.2. I甘草次酸殼聚糖的合成
首先稱取一定質量的甘草次酸溶於DMF溶液中，並加入EDOHCl和NHS進行活化，在磁力攪拌的條件下，將活化的甘草次酸溶液加入到殼聚糖溶液中，並在室溫下反應一定時間後，用丙酮靜置沉澱後，再用こ醇、こ醚洗滌沉澱，室溫真空乾燥即得到甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)材料。
1.2.2正交試驗設計
在材料的合成中考慮到最終產物的需要，在第一步的GA-CTS材料的合成中考察較為合適的氨基取代度，本研究選擇四因素三水平L9(34)正交試驗設計，來優化醯胺化反應的エ藝條件，對EDOHCl與NHS物質的量的比、EDOHCl與GA物質的量的比、GA與CTS物質的量的比以及反應時間對氨基取代度的影響等因素進行了考察。正交試驗設計的試驗因素與水平如表I所不。表I GA-CTS合成中正交試驗設計的因素水平表
Γ因蛋
EDC'H 甘草 EDOHCI'NHS GA:CTS |"反應賺戰#
1Oi: IOAI0.S.J [I
21.2:11:1U I"2
324:123:11.5:1 Γ 3 1.2.3 GCGA材料的合成
GCGA材料是在GA-CTS材料上進ー步接枝上乳糖酸，按照GA-CTS合成的正交設計試驗中的最佳方案進行GCGA的合成。即將LA溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化。同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應72小時後，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析4天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥得到GCGA材料。I. 3材料性能的測試與表徵
1.3.I氨基取代度的測定(DS)
準確稱取100-200 mg已烘乾至恆重的甘草次酸殼聚糖樣品，加入足量的O. I mol/L的HCl溶液，攪拌至完全溶解，再加入30 ml的蒸餾水，然後以O. I mol/L的標準NaOH溶液進行滴定，同時記錄下消耗NaOH的體積和溶液的pH值，然後根據所測試的結果作出pH-VNaQH滴定曲線及其ー級微商曲線，找出其突躍點並計算兩突躍點間消耗的NaOH溶液體積之差， 由下式計算出取代度。
DS = I-ぼ:を戀:。空！·X100%式中，DS :為甘草次酸殼聚糖的取代度；AV (ml):為兩突躍點間消耗的NaOH體積之差；CNaQH (mol/L):為NaOH的濃度；16 :為氨基的相對分子質量；m (g):為樣品的質量；
O.0994 :為理論氨基含量。I. 3. 2傅立葉紅外測試(IR)
將殼聚糖(CTS)、甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)以及乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)等樣品的粉末以KBr壓片，用Nexus型傅立葉變換紅外光譜儀記錄各樣品的紅外光譜圖，測量範圍為 4000-400 CnT1。1.3.3核磁共振氫譜測試(1H-NMR)
為了進一步驗證合成所獲得的終產物的化學結構，採用核磁共振氫譜的方法分別對殼聚糖(CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)進行測試。其測試分析的方法和條件為分別將樣品溶於氘代鹽酸與重水的混合溶液中，以TMS為內標，1H-NMR的頻率設定為600MHz0甘草次酸和乳糖酸在殼聚糖上的取代程度最終通過其1H-NMR的特徵峰的分配進行計算(mol%)。I. 3. 4材料表面潤溼角的測定
殼聚糖(CTS)、甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)以及乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)三種材料的親水性能，採用圖像分析系統對材料表面潤溼角(水接觸角)進行測定。2.結果與討論
2. I乳糖酸化甘草次殼聚糖的反應機理
在乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)的合成過程中，我們採用兩步N-醯化合成方法得至IJ。第一步為甘草次酸修飾殼聚糖(GA-CTS)的合成，第二步為乳糖酸修飾甘草次酸殼聚糖(GCGA)的合成。其中甘草次酸(GA)和乳糖酸(LA)為醯化劑，由於其羰基上電子位移的結果，使碳上帶有部分正電荷，是ー個親電試劑，反應的中心在羰基碳原子上。殼聚糖作為被醯化物，其氨基中N原子的親核能力較羥基的O原子為強，具有未共用電子對，是ー個親核試劑。在N-醯化反應的過程中，以親核試劑殼聚糖為底物，帶正電荷的甘草次酸和乳糖酸中的羰基碳原子向殼聚糖氨基N原子上的未共用電子對作親電進攻，形成過渡態，最後脫去H2O形成醯胺，其反應過程如圖I所示。
羧酸是ー個弱醯化劑，未完全脫こ醯的殼聚糖在進行接枝後空間位阻增大會降低反應活性，為了提高N-醯化反應的活性和效率，反應中加入水溶性的EDOHC1/NHS化學交聯劑，其具有無毒、生物相容性良好、產物易清洗等優點，所以在用於羧基與伯胺的N-醯化反應，已在生物化學領域獲得廣泛的用途，如將半抗原結合於載體蛋白形成免疫抗原、通過與核酸5』位的磷酸基團反應形成氨基反應活性的NHS-酷、在多肽合成中形成醯胺鍵等。在本研究的兩步合成中，通過增加EDOHC1/NHS，可以將羧基轉變為氨基反應活性的NHS酷，這步反應通過將EDOHC1、含羧基分子以及NHS混合即可實現。然後再和含氨基分子進行反應，即可形成醯胺鍵。2. I. I甘草次酸殼聚糖的合成
甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)的合成路線及反應機理如圖2所示，EDC-HCl首先將甘草次酸(GA)上的羧基(-C00H)進行活化，形成不穩定的氨基反應活性的GA-O-醯基脲中間體(圖 2，①)。該中間體可以與殼聚糖的氨基(-NH2)進行反應，通過醯胺健形成這兩個化合物的鍵合物(圖2，③)。然而GA-O-醯基脲在水溶液中並不穩定，只能短暫存在，然後則會很快水解並重新釋放出羧基基團，又形成了 GA (圖2，②)，因此如果在反應中只加入EDOHC1，則反應物之間就不能進行有效地交聯，水解過程將會和醯胺化反應競爭，大大降低反應效率。通過加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，可以保護活化了的羧基使其變得穩定，從而大大提高EDOHCl介導的縮合反應的效率，並將GA-O-醯基脲中間體轉化為氨基反應活性的NHS酷(GA - CO - O - NHS )(圖2，④)。這種氨基反應活性的NHS酷中間體非常穩定，可以與殼聚糖的氨基進行醯化反應，生成穩定的醯胺鍵(GA -CO-NH- CTS)，得到甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)(圖 2， )。2. I. 2乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的合成
乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的合成機理與上述甘草次酸殼聚糖的合成機理類似，均為N-醯化反應，如圖3所示。2. 2甘草次酸修飾殼聚糖的分析 2. 2. I甘草次酸殼聚糖的紅外譜圖
圖4為甘草次酸(GA)、殼聚糖(CS)和甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)的紅外光譜圖。其中，在甘草次酸的紅外譜圖中，1386 CnT1和1367 cnT1處出現了齊墩果烷型五環三萜骨架的A區和B區，此特徵峰為C4連接的偕ニ甲基的C-H面內彎曲振動吸收峰，1664 cnT1為Cll羰基的P- 共軛吸收峰，1706 cm—1出現的特徵峰為C30羧基的吸收峰，在3440 cm—1出現的強吸收峰為C3羥基的伸縮振動吸收峰。殼聚糖的紅外譜圖顯示了醯胺鍵的三個特徵吸收峰，即醯胺I (1655 cnT1)、醯胺
II(1600 cm-1)和醯胺IIK1323 cnT1)，弱的醯胺I吸收峰和很強的醯胺II吸收峰意味著殼聚糖具有高的脫こ醯度。在1155 cnT1 (C-0-C的反對稱伸縮振動吸收峰)、1078 cnT1和1025 cm—1 (C-0伸縮骨架振動))出現了糖類的特徵吸收峰。O-H和N-H的伸縮振動吸收峰出現在3440 cnT1。2877 cnT1為C-H的伸縮振動峰。對比殼聚糖的紅外譜圖，甘草次酸殼聚糖中的醯胺I和醯胺II的峰均發生了紅移(醯胺鍵的吸收峰I、II和III則分別從1655 cm'1600 cm'1323 cnT1移至1654 cm'1560cm'1314 cnT1)，並且醯胺I的峰變的更加鋭利而醯胺II的峰強度卻變弱，另外，甘草次酸羧基的吸收峰(1706 cm—1)也隨之消失，這些光譜的改變是由於甘草次酸的羧酸基團和殼聚糖的氨基反應形成了醯胺鍵。2. 2. 2甘草次酸殼聚糖合成的正交設計實驗
通過正交試驗設計L9(34)的方法，我們合成了甘草次酸殼聚糖，考察了各因素(EDC-HCl GA，EDOHCl NHS，GA CTS和反應時間)對試驗指標(甘草次酸殼聚糖的取代度)的影響。圖5為正交試驗設計的九組實驗產物(GA-CTS)的紅外光譜圖。從圖中可知，九組的實驗產物在1500 1600 cm—1區間都有兩個峰，均為醯胺I和醯胺II。由上節2. 2. I的分析，與殼聚糖的紅外圖譜相比較，接枝甘草次酸後，醯胺鍵的特徵吸收峰均發生了不同程度的改變，說明了甘草次酸已接枝到殼聚糖上。正交試驗設計的結果和極差分析可知，各因素對取代度影響的重要程度的順序為反應時間> EDOHCl NHS > EDOHCl GA > GA CTS ;為了在甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)合成中獲得較高的取代度，由均值分析可知，甘草次酸殼聚糖合成的最佳條件為EDOHCl與GA的摩爾比為1.2 I、EDOHCl與NHS的摩爾比為I : I、GA與CTS的摩爾比為I :
I、反應時間為3 d。2. 3乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的分析
2.3. I紅外光譜分析
圖6為乳糖酸(LA)、甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)的紅外圖譜。與乳糖酸和甘草次酸殼聚糖的紅外譜圖進行對比，在乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的紅外光譜中，乳糖酸中的羰基(C=O)伸縮振動特徵吸收峰(1740 cnT1)消失，取而代之的是新增的1726 cnT1酯鍵特徵吸收峰，3400 cnT1處的O-H伸縮振動吸收峰也大幅度減弱，甘草次酸殼聚糖在1654 cnT1的醯胺I、1560 cnT1的醯胺II和1315 cnT1的醯胺III特徵吸收峰也發生了輕微的紅移，分別移到了 1640 cm_1> 1550 cnT1和1312 cnT1,這些分子間結構的變化說明了乳糖酸成功接枝在甘草次酸殼聚糖中。為了進ー步證實甘草次酸和乳糖酸已成功接枝到殼聚糖鏈上，再通過核磁共振氫譜進行表徵。 2. 3. 2核磁共振氫譜分析
殼聚糖(CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)的核磁共振氫譜(1H-NMR)見圖7。與殼聚糖的譜圖相比較，在乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的譜圖中，出現了ー些新的來自於甘草次酸和乳糖酸的特徵峰。在化學位移I. 410 ppm處出現了強的特徵峰，這是甘草次酸角甲基(-CH3)中的質子所對應的。I. 990 ppm處的化學位移為甘草次酸基團中C9處的質子峰(如圖7中▲所示)，這是由於在甘草次酸中該處是唯一個其鄰近的碳均為季碳的叔碳，故其呈現ー個特徵的單峰信號。3.895 ppm和3. 890 ppm的特徵峰是乳糖酸基團和殼聚糖主鏈相連處開環的吡喃葡萄糖的次甲基(-CH(OH)-)中的質子峰(圖7中★所示)。殼聚糖的原こ醯胺基團中甲基的質子峰出現在1.906 ppm (圖7中·所示)。綜上表明，在殼聚糖鏈的氨基上成功的接枝了甘草次酸和乳糖酸。根據GCGA 1H-NMR圖中甘草次酸和乳糖酸的特徵質子峰的積分面積分別於殼聚糖的特徵質子峰的積分面積的比值可以計算出GCGA中甘草次酸(GA)和乳糖酸(LA)的取代度(Degree of Substitution, DS)。經過計算可得接枝到殼聚糖上的甘草次酸和乳糖酸的取代程度分別為13. 77 mol%和16. 74 mol%。3.結論
通過N-醯化反應方法首次合成了具有兩親性的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)，我們認為是以親核試劑殼聚糖為底物，帶正電荷的甘草次酸和乳糖酸中的羰基碳原子向殼聚糖氨基N原子上的未共用電子對作親電進攻，形成過渡態，最後脫去H2O形成醯胺，並對催化劑EDOHCl與NHS的作用機理進行了探討。採用FT-IR和1H-NMR對GCGA的化學結構進行了分析，分析結果表明甘草次酸和乳糖酸接枝成功，並由1H-NMR中各特徵峰的積分，計算得到甘草次酸和乳糖酸的取代度分別為 13. 77 mol% 和 16. 74 mol%。通過正交試驗的方法研究了各因素在N-醯化反應中對取代度的影響。各因素對取代度影響的重要程度的順序為反應時間> EDOHCl NHS > EDC-HCl GA > GA CTS ；甘草次酸殼聚糖合成的最佳條件為=EDOHCl與GA的摩爾比為I. 2 UEDC-HCl與NHS的摩爾比為I : I、GA與CTS的摩爾比為I : I、反應時間為3 d。接觸角測試的結果顯示殼聚糖本身即為ー種親水性材料，其接觸角顯著大於乳糖酸化甘草次酸殼聚糖，而稍微小於甘草次酸殼聚糖，這些變化歸因於接觸角不僅與材料 表面的親水性有關(甘草次酸為疏水性，乳糖酸為親水性)，還與其表面的粗糙度有關(甘草次酸、乳糖酸的接枝改變了殼聚糖薄膜表面的粗糙程度)，因此接觸角受這些綜合因素的影響。實施例2體外細胞實驗及大鼠體內分布研究
為了考察乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)作為藥物載體的靶向性及其製成納米粒子後被肝癌細胞攝取的情況。本實施例先通過MTT法評價該載體材料對L929細胞的毒性。然後將FITC分別接枝到殼聚糖(CTS)、甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)和GCGA上，合成了 FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA，並由離子交聯的方法製備了 FITC標記的無配體修飾的CTS納米粒子、單配體修飾的GA-CTS納米粒子和雙配體修飾的GCGA納米粒子。用流式細胞分析儀和雷射共聚焦顯微鏡研究BEL-7402人肝癌細胞對FITC標記的CTS、GA_CTS和GCGA納米粒子的攝取情況，並對比了 L02人正常肝細胞對GCGA納米粒子的攝取情況，並研究了三種納米粒子在大鼠體內的分布。I.實驗方法
I.I實驗試劑與儀器
主要藥品殼聚糖(CTS)，脫こ醯度91%，粘性78mPa. S，浙江澳興生物科技有限公司；甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)，自製(實施例I);乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)，自製(實施例I);異硫氰酸螢光素(FITC)，分析純，美國Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養基幹粉培養基，美國Hyclone Labs ;噻唑藍(MTT),分析純，美國Sigma-Aldrich公
司；青鏈黴素雙抗，分析純，美國Sigma-Aldrich公司；突光染料Hoechst 33258,分析純，美國Sigma-Aldrich公司；胎牛血清(FBS)，含量99. 5%，美國Hyclone Labs ;PBS緩衝液，pH=7. 2-7. 6，博士德生物工程有限公司；ニ甲基亞碸(DMS0)，分析純 ，美國AMRESC0公司；多聚磷酸鈉(TPP)，含量彡98%，阿拉丁試劑有限公司；人肝癌細胞，BEL-7 402美國模式培養物集存庫；小鼠成纖維細胞，L929，美國模式培養物集存庫；人正常肝細胞L02，中國科學院細胞文庫菌物保藏中心。本實驗所用主要儀器ニ氧化碳培養箱，全溫振蕩培養箱，場發射掃描電子顯微鏡，動態光散射雷射粒度和ZETA電位分析儀，全波長酶標儀，流式細胞分析儀，雷射共聚焦顯微鏡，蔡司雙光子共聚焦螢光顯微鏡，萊卡冰凍切片機，電子秤，低速冷凍離心機，生物超淨工作檯，生物醫學冷凍櫃，生化培養箱，pH計，冷凍乾燥機，磁力加熱攪拌器，立式高壓蒸汽滅菌鍋，倒置相差顯微鏡，理化乾燥箱，分析天平。I. 2細胞培養
將L-929小鼠成纖維細胞、BEL-7402人肝癌細胞和L02人正常肝細胞培養於含有體積分數為10%的胎牛血清(FBS)和體積分數為1%的青鏈黴素雙抗溶液(其中還有100 U/ml的青黴素G和100 μ g/mL的鏈黴素)的RPMI 1640培養基中，置於37 V，5% CO2和相対溼度為95%的ニ氧化碳培養箱中培養。根據細胞的生長狀態，姆隔一定的時間進行換液、傳代以保證細胞良好生長狀態。I. 3細胞毒性測試(MTT)
1.3.I樣品的處理
本實施例實驗中所用的RPMI 1640培養基為雙倍的，並調節其pH為6. 8，保證材料在此種培養基中較好的溶解性，以及與MTT實驗中單倍培養基相匹配。殼聚糖(CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)分別溶解在O. 5%的醋酸溶液中，再用O. 5%的醋酸溶液依次稀釋成不同的濃度，即O. 01，O. 05，O. I，O. 2，O. 5和I mg/ml，並調節其pH值為6. 8，得到原液。然後將原液用等體積的雙倍的RPMI 1640培養基(pH=6. 8)進行稀釋，即得到用於MTT實驗的一系列不同濃度(O. 005,0. 025,0. 05,0. 1,0. 25和O. 5 mg/ml)的材料溶液。I. 3. 2 MTT 實驗
取對數生長期的L-929小鼠成纖維細胞，用胰酶消化後加培養液稀釋，按每孔8000個的細胞密度接種在96孔培養板中，培養箱中預培養24 h，待細胞貼壁生長後，吸棄培養板中的細胞培養液，分別加入6種不同濃度(O. 005，O. 025，O. 05,0. 1,0. 25和O. 5 mg/ml)的材料溶液，每孔加入量為200 μ I，每個劑量設定6個復孔，孵育20 h後，每孔再加入20 μ I5 mg/ml的MTT溶液(用PBS作為溶劑)，繼續孵育4 h後，吸棄上清液，每孔中加入200 μ I的DMSO溶液，終止培養，將培養板水平振蕩10 min使結晶物充分溶解。由不含材料溶液在RPMI 1640培養基中(pH=6. 8)的細胞作為陰性對照組。用酶標儀測定樣品的吸光度(0D值)，其中波長為550 nm，參考波長為690 nm。I. 4體外細胞攝取實驗
1.4.I螢光標記的CTS、GA-CTS和GCGA的合成
稱取一定量的異硫氰酸螢光素(FITC)溶於無水こ醇中，在磁力攪拌的條件下，加入到殼聚糖的溶液中，避光反應3 h。用NaOH溶液調節反應體系的pH值出現沉澱，反覆離心並洗滌沉澱，直到上清液沒有螢光物質被檢測到為止。再將得到的沉澱溶溶解，置於透析袋中(MWC0,8000 - 14000)，用蒸餾水透析3天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥，即得到FITC標記的殼聚糖材料，FITC標記的GA-CTS和GCGA材料的合成方法同上。I. 4. 2 FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子的製備
稱取一定量的FITC標記的殼聚糖材料，溶於1% (v/v)的醋酸溶液中，得到FITC標記的殼聚糖溶液，用NaOH溶液調節其pH值，在磁力攪拌條件下，將多聚磷酸鈉(TPP)溶液加入上述溶液中，繼續反應一段時間後，離心分離出納米粒子，冷凍乾燥，保存在4 V的冰箱中。FITC標記的GA-CTS和GCGA納米粒子的製備方法同上。I. 4. 3 FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子的表徵
形貌觀察取FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米懸浮液，過濾後滴在錫箔紙上，烘乾後用掃描電子顯微鏡進行形態學觀察；粒徑分布和zeta電位取製備後的FITC標記的CTS,GA-CTS和GCGA納米懸浮液原液，用雷射粒度測試儀測定納米粒子的粒徑大小、粒徑分布和zeta電位。1.4.4納米粒子的處理
將FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子分別分散在O. 01 M的無菌PBS緩衝溶液中，然後用不含血清的細胞培養基稀釋成所需的濃度，並將其與細胞共培養，在孵育階段，用O. 01 M的PBS進行清洗，以除去多餘的游離納米粒子。1.4.5流式細胞儀檢測細胞對納米粒子的攝取
將BEL-7 402細胞和L02細胞以每孔2X IO5個的密度接種於6孔培養板中，孵育24 h，然後分別加入一定量的FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子，繼續培養4 h。避光條件下，除去孵育液，用胰酶消化後，將細胞懸浮在O. 5 ml的新鮮培養基中，即時用流式 細胞儀在激發波長488 nm處檢測螢光強度，每個樣品被檢測細胞數不少於I X IO4個細胞，沒有用納米粒子處理的細胞作為陰性對照,通過PASW Statistics 18. O分析實驗結果,姆個實驗重複三次。1.4.6細胞染色與成像實驗
兩種類型的細胞(BEL-7 402細胞和L02細胞)分別接種在6孔板中(每個孔中均放置一個乾淨的圓形蓋玻片)，孵育24 h。然後加入新鮮的培養基，其中分別含有不同的FITC標記的納米粒子(CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子)，繼續孵育4 h。此後，用4%的多聚甲醛在室溫下固定細胞20 min後，將細胞核用螢光染料Hoechst 33258進行染色，並用O. 01 M的PBS清洗三次，用小鑷子取出蓋玻片，並將其放在ー個玻璃載玻片上，用甘油緩衝溶液封片後，通過雷射共聚焦顯微鏡觀察樣品的螢光圖像，對螢光標記的納米粒子的激發波長為488nm，對螢光染料Hoechst 33258的波長為405 nm，並用NIS元素成像軟體對拍下的圖像進行疊加處理。I. 5體內分布實驗
準備20隻6(T80 g購於華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心的SD大鼠，隨機分為
4組，5隻/組，第一組為陰性對照組僅注射等體積的生理鹽水；第二組為FITC標記的CTS納米粒子組；第三組為FITC標記的GA-CTS納米粒子組；第四組為FITC標記的GCGA納米粒子組。準確稱量SD大鼠體重後，經尾靜脈注射藥物，4 h後處死，迅速取肝、脾、腎、心、肺、腦和骨骼肌組織，快速冰凍切片，切片厚度為10 Um0切片經4%的多聚甲醛固定後，予以Hoechst 33258染色5min，並用PBS漂洗三次，立即在共聚焦顯微鏡下觀察綠色螢光分布情況，並對比各組間的螢光變化。2.結果與討論
2.I MTT實驗結果分析
殼聚糖(CTS)和乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)的細胞毒性測試結果如圖8所示。當雙靶向材料的濃度在O. 005-0. 05 mg/ml範圍內時，細胞相對增值率> 75% (通過公式0D$驗組/OD對Ma計算)，毒性評分均為I級，顯示無細胞毒性。2. 2 FITC標記的納米粒子表徵與分析
2.2. I納米粒子的表徵
FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子由離子交聯的方法製備，研究了其粒徑分布和zeta電位，並通過掃面電鏡觀察其表面形貌。如圖9所示，三種納米粒子呈規則球形，表面有凹凸，分散性好。圖10為三種納米粒子的粒徑分布圖，其中，FITC標記的GCGA納米粒子的平均粒徑為213. 5 nm,小於CTS納米粒子的平均粒徑(248. 3 nm),而大於GA-CTS納米粒子的平均粒徑(180. 4 nm)，造成這種現象的原因可能是因為殼聚糖上接枝的具有疏水性的甘草次酸基團和親水性的乳糖酸基團與溶液中水分子相互作用的結果。FITC標記的CTS,GA-CTS和GCGA納米粒子的粒徑在100-500 nm均有ー個主要的粒徑分布範圍，其zeta電位分別為45. 6 mV、30. 6 mV和33. 4 mV，這說明所製備的納米粒子具有較好的穩定性，並且較容易被細胞攝取。2. 2. 2肝靶向納米粒子的分析
在這項研究中，甘草次酸和乳糖酸均至少具有兩個作用。乳糖酸不但作為ー個親水性基團(甘草次酸作為ー個疏水性基團)，而且還具有肝靶向作用。乳糖酸由於具有親水性，而甘草次酸由於具有疏水性，作為疏水內核會大量存在於GA-CTS納米粒子或GCGA納米粒子的內部，然而這些納米粒子的表面是否仍然存在甘草次酸基團對於本課題研究的具有肝靶向作用的載體具有至關重要的意義。儘管本研究並沒有直接給出GA-CTS納米粒子或GCGA 納米粒子的表面存在甘草次酸基團的依據，但我們由ー些研究可以總結出仍有部分甘草次酸基團分散在GA-CTS納米粒子或GCGA納米粒子的表面，這對於具有單靶向作用的GA-CTS納米粒子和具有雙靶向作用的GCGA納米粒子識別肝細胞表面的甘草次酸受體，達到主動靶向肝臟的目的是十分重要的。Chiu等製備了 N-棕櫚醯化殼聚糖(NPCS)納米粒子，並且證實有部分棕櫚醯基團存在於微球的表面，它能和細胞膜進行相互作用；Park等把葉酸偶聯到甲氧基聚こニ醇/聚己內酯(MPEG/PCL)膠束的疏水部分，也發現具有疏水性的葉酸配體仍然部分暴露在微球的表面；為了研究甘草次酸基團是否存在於甘草次酸修飾海藻酸鈉納米粒子(GA-ALG NPs)的表面，張闖年等先將こニ胺修飾到甘草次酸的羧基上，然後再遇海藻酸鈉偶合，製備了 GA-ALG NPs，然後通過X射線光電子能譜測定了在GA-ALG NPs表面的氮元素(來自こニ胺中的氮元素)的含量為I. 1%，這很好的證實了部分甘草次酸基團仍然存在於GA-ALG NPs的表面。綜上所述，本研究中的GCGA或GA-CTS材料製成納米粒子後表面仍然存在一定量的甘草次酸基團。2. 3納米粒子的體外細胞攝取
雙配體修飾的納米粒子一乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)納米粒子的表面同時存在甘草次酸(GA)與乳糖酸(LA)兩種配體，乳糖酸由於含有半乳糖殘基，其在肝實質細胞膜表面過量表達，而且在分化的肝癌細胞膜表面也有表達，因此可通過受體介導的主動靶向作用，引導GCGA納米粒子富集至肝臟並可靶向至肝癌細胞；甘草次酸對應的受體在癌細胞表面過量表達，顯著高於臨近的非腫瘤細胞，因而也可以經受體介導將納米粒子輸送至肝癌細胞。所以GA與LA均具有肝癌細胞的親和作用，從而使納米粒子在肝癌細胞中的分布顯著提高。為了驗證GCGA納米粒子對肝臟癌細胞的靶向性，本研究即以人正常肝細胞L02和人肝癌細胞BEL-7402為模型，通過流式細胞儀定量的分析BEL-7402人肝癌細胞和L02人正常肝細胞對GCGA納米粒子的內吞作用，螢光強度與細胞內吞的納米粒子的數量成正比，並用共聚焦顯微鏡進行定性觀察。2. 3. I GCGA納米粒子的體外高效肝靶向性
BEL-7402細胞對三種螢光標記的納米粒子的內吞作用用流式細胞分析儀進行定量分析，如圖11所示，BEL-7402細胞與雙配體修飾的GCGA納米粒子孵育後的平均螢光強度為37919，該細胞被單配體修飾的GA-CTS納米粒子處理後的平均螢光強度降到了 27137. 67，而被無配體修飾的CTS納米粒子處理後的平均螢光強度降到了更低值，為17763.33 (無任何納米粒子處理的細胞的平均螢光強度< 200，作為對照組)，被GCGA納米粒子處理的BEL-7402細胞的平均螢光強度是GA-CTS納米粒子的I. 43倍，是CTS納米粒子的2. 00倍。相比較CTS和GA-CTS納米粒子，BEL-7402細胞有更強攝取GCGA納米粒子的能力，GA-CTS納米粒子次之。綜上分析可知，與無配體修飾的CTS納米粒子相比，單配體修飾的GA-CTS納米粒子對肝癌細胞(BEL-7402細胞)有著較強的細胞親和力，而雙配體修飾的GCGA納米粒子有著最強的親和力，可獲得最大的細胞攝取量，這是由於肝癌細胞膜表面具有甘草次酸和半乳糖(乳糖酸含有半乳糖殘基)的受體，有配體修飾的納米粒子主要通過受體介導的主動轉運被肝癌細胞所攝取，而雙配體修飾的GCGA納米粒子有兩種配體-受體(ASGP-R和甘草次酸受體)結合的方式，使它有更多的途徑通過受體介導的內吞作用進入細胞內，從而提高了肝癌細胞膜表面受體特異性識別配體的機率。為了進一步的證實雙配體修的GCGA納米粒子對BEL-7402細胞有著更強的親和性，通過共聚焦顯微鏡觀察FITC標記的納米粒子作用細胞4 h後的肝癌細胞攝取納米粒子 的情況，圖12為BEL-7402細胞與FITC標記的CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子，孵育4 h後的雷射共聚焦顯微鏡掃描照片。由圖片清晰可見，細胞攝取4 h後，雙配體修飾的GCGA納米粒子在BEL-7402細胞中可觀察到較強的綠色螢光亮點，而且大量納米粒子被內化進細胞內部，單配體修飾的GA-CTS的納米粒子有中等強度的綠色螢光亮點，而無配體修飾的殼聚糖納米粒子僅能看到少量的綠色螢光點，共聚焦顯微鏡的分析結果與流式細胞儀一致，證實雙配體修飾的GCGA納米粒子具有最強的肝癌細胞靶向性，通過受體介導的內吞作用，內化進細胞。2. 3. 2 GCGA納米粒子的靶向細胞攝取
本節對比研究了 BEL-7402人肝癌細胞和L02人正常肝細胞(有甘草次酸受體缺陷的細胞株)對雙配體修飾的GCGA納米粒子的攝取情況，以深入研究GCGA納米粒子對肝癌細胞的特異靶向性。如圖13所示，與陰性對照組(BEL-7402細胞中無GCGA納米粒子)相比，含GCGA納米粒子組中BEL-7402肝癌細胞中的的螢光強度有著顯著性的位移，其平均螢光強度為對照組的164. 15倍；而L02正常肝細胞中螢光強度有一個不顯著的位移，其平均螢光強度僅是對照組(L02細胞中無GCGA納米粒子)的9. 08倍，這意味著BEL-7402肝癌細胞攝取GCGA納米粒子的能力是L02正常肝細胞的18. 08倍，GCGA納米粒子對人肝癌細胞具有更強的親和性和特異性，這是由於肝細胞表面存在甘草次酸和半乳糖(乳糖酸含半乳糖殘基)受體，而在在病理條件下(如腫瘤)，半乳糖受體的結合活性會有所下降，而甘草次酸受體在癌細胞中的表達量要更高，GCGA同時存在這兩種具有靶向至肝癌細胞的配體，提高了肝癌細胞靶向的可靠性。兩種細胞的螢光圖片用共聚焦顯微鏡得到，如圖14所示，在被FITC標記的GCGA納米粒子處理後的BEL-7402肝癌細胞中，能夠觀察到較強的綠色螢光，納米粒子被大量內化進入細胞，而在L02正常肝細胞中，只能觀察到微弱的螢光信號。以上結果說明，較正常肝細胞，雙配體(甘草次酸和乳糖酸)的引入能夠極大地增強GCGA與肝癌細胞的親和性，誘導納米粒子在肝癌細胞膜表面富集並實現內吞進入細胞。
2. 4 CTS、GA-CTS及GCGA納米粒子靜注後在大鼠體內分布研究
將無配體修飾的CTS、單配體修飾的GA-CTS及雙配體修飾的GCGA三種納米粒子懸浮液經大鼠尾靜脈注射4 h後，取其肝、脾、腎、心、肺、腦和骨骼肌組織，通過共聚焦螢光顯微鏡觀察大鼠各臟器組織螢光強度的強弱來研究各納米粒子的生物分布，形態學上說明其肝靶向性。圖15顯示了 FITC標記的CTS 、GA-CTS和GCGA納米粒子(NPs)靜脈注射4 h後，不同組織的螢光顯微圖像。結果顯示，與對照組相比(數據沒有顯示，對照組為無納米粒子處理的細胞，螢光圖像中沒有綠色螢光亮點)，除心、腦和骨骼肌外，三實驗組的其他組織切片均顯示了不同程度的螢光亮點，而心、腦和骨骼肌中基本沒有螢光被觀察到，這表明CTS、GA-CTS和GCGA納米粒子基本不被心、腦和骨骼肌吸收，因此對這些組織沒有毒副作用。在肝、脾、腎和肺中有不同程度的分布。圖中可見三種納米粒子在腎臟中均有顯著的螢光亮點，無配體修飾的CTS納米粒子有最強的螢光強度，單配體修飾的GA-CTS納米粒子有中度的螢光強度，而雙配體修飾的GCGA納米粒子的螢光強度最弱，這意味著這些納米粒子一部分會很快的代謝到腎臟和尿液中，並排出大鼠體外，這是由於納米粒子基質的ー些特殊性質所致(如生物降解性、粘附性等)，另外，納米粒子的粒徑要在適當的範圍內，才能避免被腎臟、肺和脾過濾掉，對於粒徑分布中的較小的納米粒子會被過濾掉，並且無配體修飾的納米粒子被細胞內吞的途徑主要取決於其粒徑的大小(被動靶向)，不具備主動到達靶細胞的能力，而有配體修飾的納米粒子主要通過相應受體特異性的識別、結合、內化進入細胞，對靶細胞具有高度的識別能力。進ー步的發現，在大鼠的脾、肺和腎的組織切片中，無配體修飾的CTS納米粒子組的螢光強度要稍強於單配體修飾的GA-CTS納米粒子組，而雙配體修飾的GCGA納米粒子組的螢光強度較後者要更弱，然而，對比大鼠的肝組織切片的螢光圖像可以發現ー個獨特的現象三種納米粒子的在肝臟中的螢光強度與脾、肺和腎的相比，呈現ー個反向趨勢，肝臟攝取能力佔據主導地位，即雙配體修飾的GCGA納米粒子的螢光強度卻顯著增加，強於單配體修飾的GA-CTS納米粒子，而無配體修飾的CTS納米粒子的的螢光信號最弱，這表明有配體修飾的GA-CTS和GCGA納米粒子在動物體內具有很好的肝靶向性，雙配體修飾的GCGA納米粒子較單配體GA-CTS具有更強的趨肝性，這是由於在由受體介導的主動靶向作用中，隨著雙配體(甘草次酸和乳糖酸)的引入，一種配體的主動靶向作用因某種病理或生理原因受阻吋，另ー種配體-受體的相互作用會成為主要途徑，與肝細胞上的受體進行特異性結合，進而提高了肝靶向的可靠性。實施例3載藥納米粒子的製備條件優化、理化性質及體外釋放研究
I.實驗方法
1.1實驗試劑與儀器
主要藥品五氟尿嘧啶(5-FU)，殼聚糖(CTS)，甘草次酸殼聚糖(GA-CTS)，乳糖酸化甘草次酸殼聚糖(GCGA)，多聚磷酸鈉(TPP)，PBS緩衝液，醋酸(HAc)，鹽酸(HCl )，氫氧化鈉(NaOH),透析袋。主要儀器全溫振蕩培養箱，場發射掃描電子顯微鏡，紫外可見分光光度計，動態光散射雷射粒度和ZETA電位分析儀，生物醫學冷凍櫃，生化培養箱，磁力加熱攪拌器，智能磁力攪拌器，冷凍乾燥機，PH計，理化乾燥箱，分析天平。I. 2 CTS、GA-CTS和GCGA載5_Fu納米粒子的製備通過離子交聯的方法製備三種材料的載5-Fu納米粒子。分別稱取一定質量的CTS、GA-CTS和GCGA材料溶於一定體積的醋酸溶液中，並用NaOH調節其pH值後，加入預定質量比的5-FU於上述溶液中溶解。然後逐滴滴加TPP溶液於上述均勻混合的溶液中，室溫低速磁力攪拌進行離子交聯反應，並自發形成納米粒子。將得到的納米粒子懸浮液以10000轉/分離心30分鐘，然後用大量去離子水洗殘留物，分散後再離心洗滌，以除去NaOH和5-Fu等，然後重新分散在去離子水中，冷凍乾燥，保存備用。I. 3納米粒子的表徵
I.3. I納米粒子的粒徑分析
粒徑分布和zeta電位由納米粒度及zeta電位儀測定,取製備的載藥納米粒子懸浮液原液於比色皿中，將比色皿放入樣品池中測定納米粒子的粒徑大小及其粒徑分布；用5 ml的注射器吸取納米粒子懸浮液，注入zeta電位的管道中，進行zeta電位的測定。1.3.2納米粒子的形態學觀察
取製備後的納米粒子懸浮液，低速離心後，用去離子水洗滌再分散，重複三次，然後將分散後的納米懸浮液滴在錫箔紙上，烘箱中烘乾後用掃描電子顯微鏡進行形貌觀察。I. 3. 3納米粒子載藥量的測定
首先繪製5-Fu—HCl的標準曲線精密稱取5-Fu 10 mg，用HCl溶解，並定容至100 ml。然後分別準確吸取O. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5和4. O mL的原液於容量瓶中，再用O. IM的HCl稀釋定容後得到不同濃度的標準液。於此系列濃度中取樣，用紫外分光光度計于波長265 nm處測定A值(以HCl溶液作參比)，得標準曲線方程。稱取一定量的凍幹的載藥納米粒子(或5-Fu)，超聲分散在HCl溶液中溶解，設定溫度為37°C，5小時之後再離心收集上清液，並用去離子水稀釋後，通過紫外分光光度計在265 nm測定其吸光度，由其標準曲線得到對應的5_Fu濃度，然後按以下公式計算其載藥量。載藥量=納米粒中5-FU含量/納米粒質量X 100%
1.4中心複合設計試驗
中心複合設計(central composite design, CCD)是響應曲面法(response surfacemethodology, RSM)中應用最為廣泛的ー種試驗設計方法，即採用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關係，通過對回歸方程的分析來尋求最優エ藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。近年來，由於它能用最少的試驗次數提供了最多的實驗信息，其在優化實驗條件和分析中得到越來越多的研究和應用。本研究中，為了考察GCGA載藥納米粒子的理化性質，以殼聚糖載藥納米粒子為模型，運用中心複合設計優化其製備エ藝，以得到的優化條件製備GCGA載藥納米粒子。I. 5 GCGA載5_Fu納米粒子的體外釋放
5-Fu在PBS緩衝溶液中(pH=7. 4)的標準曲線的建立精密稱取5_Fu 10 mg，用PBS溶液溶解，並定容至100 mL。然後分別準確吸取0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5和4. O mL,用PBS溶液定容至25 mL。再取樣用紫外分光光度計於λ =266 nm處測定A值(以PBS溶液作參比)，得標準曲線方程。GCGA載5-Fu納米粒子的製備條件採用由中心複合設計優化的殼聚糖載藥納米粒子的製備エ藝。稱取20 mg製備的GCGA載5-Fu納米粒子於截留分子量為8000-140 00的透析袋，並密封。將透析袋浸泡在裝有100 ml的PBS溶液的錐形瓶中。加塞密閉後放入溫度為37±1で、振蕩速度為100±5次/min的恆溫振蕩箱中，每隔預定的時間於透析袋外介質中取5ml的溶液，同時補充等量新鮮的PBS緩衝溶液。然後用紫外可見分光光度計測定其吸光度(以純5-Fu的釋放作為對照組)。根據標準曲線計算5-Fu的含量，並按下式計算出藥物的累積釋放率。包封率=納米粒中5-FU含量/ 5-FU投料量X 100%
2.結果與討論
2.1 GCGA載藥納米粒子的製備
通過中心複合實驗優化了殼聚糖載5-Fu納米粒子的製備，得到其最佳エ藝條件為CTS與TPP的質量比為5 I, 5-Fu與CTS的質量比為I 1，TPP的濃度為O. 05% (w/v), 交聯時間為50 min。對於GCGA載5-Fu納米粒子的製備，是以CTS載5-Fu納米粒子為模型參考設計エ藝條件為CTS ΤΡΡ=5 I, 5-Fu CTS=I 1，TPP的濃度為O. 05%(w/v)，交聯時間為50 min。為了便於參考，同樣的條件下製備了 GA-CTS載5-Fu納米粒子。三種載藥納米粒子的實驗結果如表2所示
表2優化條件CTS、GA-CTS和GCGA載5_Fu納米粒子的實驗結果
權利要求
1.ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，其特徵在幹，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料是選用殼聚糖作為載體，甘草次酸和乳糖酸作為配體，通過N-醯化反應，合成的甘草次酸和乳糖酸共修飾的殼聚糖材料。
2.根據權利要求I所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，其特徵在於，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法包括以下步驟 a、首先稱取甘草次酸溶於DMF溶液中，並加入EDOHCl和NHS進行活化，在磁力攪拌的條件下，將活化的甘草次酸溶液加入到殼聚糖溶液中，並在室溫下反應，用丙酮靜置沉澱後，再用こ醇、こ醚洗滌沉澱，室溫真空乾燥即得到甘草次酸殼聚糖材料； b、將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。
3.根據權利要求2所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，其特徵在於，所述的步驟a中甘草次酸殼聚糖合成的條件為=EDOHCl與GA的摩爾比為O. 6-2. 4:1，EDOHCl與NHS的摩爾比為O. 4-2. 5:1, GA與CTS的摩爾比為O. 8-1. 5:1，反應時間為1-3 d。
4.根據權利要求2所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，其特徵在於，所述的步驟b為將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應中72小時後，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析4天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。
5.ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法，其特徵在於，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料的製備方法包括以下步驟 a、首先稱取甘草次酸溶於DMF溶液中，並加入EDOHCl和NHS進行活化，在磁力攪拌的條件下，將活化的甘草次酸溶液加入到殼聚糖溶液中，並在室溫下反應，用丙酮靜置沉澱後，再用こ醇、こ醚洗滌沉澱，室溫真空乾燥即得到甘草次酸殼聚糖材料； b、將乳糖酸溶於TEMED*HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述的步驟a中甘草次酸殼聚糖合成的條件為EDC*HC1與GA的摩爾比為O. 6-2. 4:1，EDOHCl與NHS的摩爾比為O. 4-2. 5:1,GA與CTS的摩爾比為O. 8-1. 5:1，反應時間為1-3 d。
7.根據權利要求5所述的製備方法，，其特徵在幹，所述的步驟b為將乳糖酸溶於TEMED-HC1溶液中，並加入EDOHCl和NHS對乳糖酸的羧基進行活化，同時將GA-CTS溶液與被活化的乳糖酸溶液在磁力攪拌的條件下室溫反應中72小時後，溶液置於透析袋中用蒸餾水透析4天，每隔24小時更換一次透析液，冷凍乾燥得到乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料。
8.根據權利要求1-4任一所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料作為載體材料在製備治療肝靶向治療藥物中的應用，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖的濃度為O. 005-0. 05 mg/ml ο
9.ー種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖/5-氟尿嘧啶載藥納米粒子，其特徵在幹，所述的載藥納米粒子是由權利要求1-4任一所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料，通過離子交聯的方法，製成的載5-氟尿喃唳的載藥納米粒子。
10.根據權利要求9所述的載藥納米粒子，其特徵在幹，所述的載藥納米粒子的製備方法稱取乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料溶於醋酸溶液中，並用NaOH調節其pH值後，加入5-氟尿嘧啶於上述溶液中溶解，然後逐滴滴加TPP溶液於上述均勻混合的溶液中，室溫低速磁力攪拌進行離子交聯反應，並自發形成納米粒子；將得到的納米粒子懸浮液以10000轉/分離心30分鐘，然後用大量去離子水洗殘留物，分散後再離心洗滌，然後重新分散在去離子水中，冷凍乾燥，保存備用。
全文摘要
本發明涉及一種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料及其製備方法和應用，所述的乳糖酸化甘草次酸殼聚糖材料是選用殼聚糖作為載體，甘草次酸和乳糖酸作為配體，通過N-醯化反應，合成的甘草次酸和乳糖酸共修飾的殼聚糖材料。本發明還提供一種乳糖酸化甘草次酸殼聚糖/5-氟尿嘧啶載藥納米粒子。本發明優點在於首次合成雙配體共修飾的殼聚糖材料，並製成納米粒子，進行靶向研究；乳糖酸化甘草次酸殼聚糖製備成納米粒子後，比GA-CTS和CTS具有更強的肝靶向性和肝癌細胞受體介導的主動靶向性，能顯著減少在其他臟器的分布，提高了肝癌靶向的可靠性，可以作為一種在醫學臨床中對肝癌的靶向治療具有廣闊應用前景的載體材料。
文檔編號A61K47/36GK102863556SQ20121037337
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者程明榮, 何秉, 洪洋, 黃陶承, 顧勇 申請人:復旦大學附屬上海市第五人民醫院