一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體及構建方法和應用的製作方法

2023-06-01 00:31:26

專利名稱：：一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體及構建方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體，同時還涉及一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體的構建方法，還涉及一種外源基因的四膜蟲轉基因表達載體的用途。特別適用於構建真核蛋白質的四膜蟲rDNA表達載體，並於四膜蟲中高效表達。還涉及到其在蛋白質相互作用研究上的應用。
背景技術：
：無論是作為食品、食品添加劑、工業原料、藥品還是其他，蛋白質都跟我們的日常生活息息相關，其應用是十分廣泛的。如具有廣泛用途的澱粉酶，存在於人體內起著各種生理功能的含量很少以至微量的肽、蛋白質、糖肽，作為抗生素的抗菌肽等，然而由於天然存在的某些蛋白質產量、純度低或是活性不高，難以滿足需求；此外為了更深入地了解一些新發現的蛋白質分子的一級和二級結構及其生物學功能的研究，也需要得到大量蛋白產品才能得以實現。目前生產蛋白質的技術主要有從動物和植物中提取；化學合成；用蛋白質重組技術表達，並用發酵技術生產。從動物和植物中提取的優點是蛋白質的活性高、穩定，專一性強，技術難度相對較小，但動植物組織中抗菌肽含量有限，而且提取方法繁瑣卻產量和回收率都很低，並且成本昂貴。化學合成蛋白質成本太高，對環境的汙染很大，而且產業化困難。因此由於成本的原因，用提取和化學合成技術生產蛋白質往往很難在實際生產上應用。蛋白質重組技術和發酵工程技術的發展，使得科學家能夠利用這些技術提高蛋白質的產量，克服提取和化學合成技術上遇到的難題。因此蛋白質重組技術和發酵工程技術是蛋白生產技術的發展趨勢。由於動物細胞表達系統成本高，不適用大規模生產蛋白質，到目前為此，用於表達外源蛋白的表達系統主要有大腸桿菌表達系統和酵母表達系統。而大腸桿菌表達系統雖然具有外源基因表達產物的水平高等優點，但是因其缺乏真核轉錄後加工及翻譯後加工等功能，其表達的產物往往活性不高或是無活性等(特別是用其表達真核蛋白時)，使其應用受到限制(孫柏欣，劉長遠，陳彥，趙華，趙彤華，李柏宏.基因表達系統研究進展.2008年第2期，205-209;謝磊，孫建波，張世清等.大腸桿菌表達系統及其研究進展[J].華南熱帶農業大學學報，2004，1(K2):16-20)；酵母表達系統因為酵母菌是真核生物，與動物細胞一樣具有轉錄、翻譯後的多種加工過程，能夠表達出多種具有活性的外源蛋白而備受關注。但也存在著明顯的局限，如以釀酒酵母為主體的表達系統中缺乏強有力的啟動子、分泌效率差、質粒不穩定、難以達到很高發酵密度、只能分泌少量蛋白、其翻譯後加工與高等真核生物有所不同等(鄭光宇.真核生物表達系統研究進展[J].喀什師範學院學報，2004，25(6)33-36;李豔，王正祥.酵母作為外源基因表達系統的研究進展[J].生物工程進展，2001，21(2):10-14.)0總之，各種表達系統各有優缺點。隨著基因重組技術的發展，選擇表達系統對於目的產物製備是相當重要的，因為表達系統決定了細胞培養過程中產物的性質以及可能產生的雜蛋白，純化重組蛋白質和普通蛋白質的不同就在於要選擇合適的表達系統，重組蛋白質在分離純化的過程中，必須維持一定的濃度和生物活性形式，以及防止被降解。研發新型外源蛋白的高效表達系統一直是相關領域的研究熱點。四膜蟲(Tetrahymena)隸屬於原生動物亞門、纖毛亞門、寡膜綱、膜口目、四膜科屬，是單細胞真核生物；過去50年中，以四膜蟲為實驗對象取得的一系列突破性的成果包括核酶的發現(獲1989年諾貝爾化學獎)、端粒與端粒酶的發現(獲2009年諾貝爾生理與醫學獎)、組蛋白和微管蛋白翻譯後修飾功能、發育中大核DNA重整中的RNAi模型等等，說明四膜蟲雖然是單細胞生物，但其具備真核生物基本生命特徵。四膜蟲蛋白表達系統中二硫鍵的正確配對和蛋白修飾作用克服了大腸桿菌表達的蛋白一般不會形成正確的二硫鍵和缺少翻譯後的修飾的缺點，同時四膜蟲中表達蛋白只有簡單的N-糖基化，不存在如酵母中豐富的甘露糖殘基修飾，植物中豐富的木糖殘基修飾等非哺乳動物中的修飾類型，這些生物學特性使其能夠作為理想的真核表達系統(潘惟鈞，樊啟昶.四膜蟲——分子生物學研究的理想材料.生物學通報，1990年第2期13-16.)。自然界中，四膜蟲主要以水中的細菌和其它有機質為食，目前還沒有發現它能引起人體疾病或危害人類健康，以四膜蟲為表達系統安全可靠。實驗室中，四膜蟲營養生長快速小時一代)，且作為第一種進行無菌純培養並且實現細胞同步化的真核細胞，相比其它模式生物或細胞系(如秀麗線蟲、魚類和哺乳動物體細胞)，其培養簡單、經濟，操作精確度高和可控性強，而且可以實現工業化大規模培養，細胞密度最高可到IO7個/毫升。利用四膜蟲發酵技術生產重組蛋白國外已有報導，在四膜蟲中可表達疫苗，單克隆抗體等蛋白。如Guberman等人進行了在四膜蟲中大規模生產憐月旨醇Al的研究(A.Guberman,M.Hartmann,A.Tiedtke,J.Florin-Christensen,M.Florin-Christensen.AmethodforthepreparationofTetrahymenathermophilaphospholipaseAlsuitableforlarge-scaleproduction.JournalofAppliedMicrobiology1999，86，226-230)。2005年底嗜熱四膜蟲大核基因組測序計劃(TetrahymenathermophilaMacronuclearGenomeSequencingProject)已經完成、相應的預測基因資料庫(TetrahymenaGenomeDatabase,TGD)也已公布、另有近5萬條基因表達序列標籤(expressedsequencetag,EST)的數據支持。比較基因組學的研究表明，擁有MOOO多個大核基因的嗜熱四膜蟲較酵母與人類具有更高程度的功能保守性，是開展真核生物基因功能研究的良好材料，即有利於表達包括水產動物抗菌肽基因在內的真核生物蛋白。2007-2008年，對嗜熱四膜蟲構建了世界上第一個纖毛蟲全基因組基因表達晶片分析平臺，完成了嗜熱四膜蟲在3種典型生理或發育狀態下共20個時期的全基因組表達數據的採集和分析，以此為基礎建立的四膜蟲基因表達資料庫CTetrahymenaGeneExpressionDatabase)和網站(http=ZVtgecLit1Lac.cn/)已成為四膜蟲基因組學研究的重要資源。四膜蟲全基因組基因表達數據分析也為我們找到安全、可控的高效四膜蟲啟動子提供了基礎。在四膜蟲中已經建立起一系列成熟的基因重組和細胞轉染的分子遺傳學操作方法和技術，使得在嗜熱四膜蟲中進行基因敲除/插入、基因表達抑制和基因過表達等十分方便快捷。其中通過真核生物最高效啟動子(四膜蟲金屬硫蛋白基因MTTl的啟動子大於300倍的誘導表達)和四膜蟲特有的高拷貝載體(四膜蟲rDNA載體9，000-10，000個/細胞)可實現異源基因的過表達和可控誘導表達。國外已報導有多種外源基因在嗜熱四膜蟲體內成功表達，其中包括多子小瓜蟲的I-抗原基因、惡性瘧原蟲的子環孢子蛋白基因，人的DNaseI等(ffeideT,BockauU,RaveA,HerrmannL,HartmannMW.ArecombinasesystemfacilitatescloningofexpressioncassettesintheciliateTetrahymenathermophila.BMCMicrobiol.2007Mar1；7:12)。熱激蛋白(HeatStressProteins,HSPs)，又稱熱休克蛋白(HeatShockProteins,HSPs)或應激蛋白(StressProteins，SP)，是動物機體細胞在一些應激原，如環境高溫、缺氧、重金屬中毒、氧化應激、感染、飢餓、創傷、代謝毒物等條件誘導下，激活HSP基因，高效表達的一組進化上高度保守的蛋白質。根據其相對分子質量，可將HSP分成6個家族，其中熱休克蛋白70(Hsp70)是在大多數生物中含量最多，細胞應激後生成最顯著，具有高度的保守性，因此在HSP中最受關注、研究最為深入。從功能上看，HSP70家族可分為組成型和熱誘導型2種，它們主要參與新生肽的成熟與分揀(maturingandsorting)以及分泌蛋白向細胞器或胞外的轉運等細胞活動，在脅迫條件下HSP70能防止蛋白降解，有利於變性蛋白的復性。高溫是誘導HSP70表達的主要因素。熱誘導HSP70的表達是通過熱激轉錄因子(heatshockfactors,HSFs)禾口某些相應的熱激元件(heatshockelements,HSEs)起作用的(張俠，尹海波，熊冬金，張慧，趙彥修.植物熱激蛋白70，植物生理學通訊，2004，40(4)，500-504)。在正常細胞中不表達或表達量很少，應激條件下表達迅速增高。正常情況下HSP70mRNA很不穩定，半衰期只有1530min，而熱應激下可長達4h(ThomasJ,Mcgarry,etal.ThepreferentialtransactionofdrosophilaHSP7OmRNArepuiressepuencesintheuntranslatedleader[J]·Cell，1985,42:311.)。熱應激條件下細胞內其它mRNA雖不被降解，但翻譯停止。HSP70mRNA則大量翻譯，其5非翻譯區有兩個保守序列，熱應激條件下可能與某些因子結合而促進其與核糖體結合，從而使HSP70mRNA優先翻譯，若將這一區域連在其它基因上在熱休克條件下該基因也能獲得高表達。可見熱應激下HSP70mRNA是通過增強穩定性和優先翻譯來保證機體需要。因此，用HSP70啟動子作為調控外源基因表達的啟動子，既有利於啟動外源基因的表達，也易於通過應激對外源基因的轉錄進行調控(程繼忠，皇甫永穆，馮作化，等.人結核桿菌熱休克蛋白70啟動子對外源基因在分枝桿菌中表達的影響[J]·中華微生物學和免疫學雜誌，1997;17(6)=410-415；BukauB,HorwichAL.TheHsp70andHsp60chaperonemachines.Cell.1998.92(3):351-366;〕SorensenJ.G.,KristensenT.N.andLoeschekeV.Theevolutionaryandecologicalroleofheatshockproteins.EcologicalLetters，2003，6:1025-1037；馮立芳，繆煒。不同緯度螅狀獨縮蟲耐熱能力及Hsp70mRNA表達水平的比較。動物學報。2008，54(:525-530)。在原核生物嗜熱四膜蟲中，在37°〇、391、411熱激條件下，hsp70-l、hsp70_2、hsp70_3、hsp70-4、hsp70-5這5個基因的表達水平高於正常生長時期的30°C。除hsp70_4外，其餘4個hsp70基因的表達水平並不隨著溫度的升高而增加，在41°C時它們的表達水平要低於39°C。在37°C、39°C、41°C這3個不同熱激條件下，hsp70-2對熱激響應最敏感，其表達水平在5個hsp70基因中是最高的。因此可選用嗜熱四膜蟲的hsp70-2啟動子構建高效表達且易於通過熱激對外源基因的轉錄進行調控的四膜蟲表達載體(馮立芳，暢悅，袁冬霞，繆煒·動物學研究.2011，32(3):1-10)。綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是1962年下村修和約翰森從維多利亞多管水母(Aequoreavictoria)中分離出來的，是一類存在於包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。當受到紫外或藍光激發時，GFP能發射綠色螢光。後來查爾菲向人們展示了綠色螢光蛋白作為發光的遺傳標籤的作用，而錢永健解釋了其機制並使科學家很容易地使用綠色螢光蛋白，他還將顏色標籤擴展至除綠色之外的顏色，以便可以用各種顏色標識不同的蛋白和細胞，這使綠色螢光蛋白技術的應用更加簡單(崔志芳，鄒玉紅，季愛雲.綠色螢光蛋白研究的三個裡程碑——2008年諾貝爾化學獎簡介.自然雜誌，2008,30(6):3328)。GFP所發射的綠色螢光性質穩定，無種屬限制。其獨特之處在於它產生螢光無需底物或輔因子，發色團是其蛋白質一級序列固有的(TrejcK，SixmaTK,KittsPA,etal.StructuralbasisfordualexcitationandphotOisOmerizatiOnoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein[J].Proc.NatLAcad·Sci·USA，1997,94:2306-2311)。綠色螢光蛋白對生物體無毒無害，分子量小，方便構建載體，同時在多種非水母的生物體中均可穩定表達並易於檢測，所以，作為一種生物分子標記(如載體的篩選標記等)，具有廣泛的應用前景。GFP作為良好的細胞、發育、分子生物學的活體標記，用於監測各種體系中的基因表達、蛋白定位以及多種細胞活動。利用GFP進行示蹤的研究範圍相當廣泛.從細胞生物學的基礎研究如細胞骨架和細胞分化、細胞器動力學和囊泡跟蹤，到一些熱門的前沿和學科和
技術領域：
，如器官移植、基因治療、神經生物學等等。因此，構建能高效穩定表達、轉染生物體的操作技術簡單、成功率高的含HSP70啟動子、並能方便外源基因插入和篩選的四膜蟲轉基因表達載體用於外源蛋白的表達，特別是針對具有生物活性的真核來源的蛋白質的表達具有重要的應用價值。
發明內容本發明的目的在於提供了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體，該載體具有大腸桿菌宿主正常複製所需的複製起始點及Amp抗性篩選標記；載體的可替代盒式結構HGFP中的含綠色螢光篩選標記篩選，可替代盒式結構HGFP兩側引入了兩個反向的識別序列長達18bp的稀有內切酶——歸位酶HceI作為克隆位點，使得載體的應用幾乎不受酶切位點的限制，且酶切後的載體不做去磷酸化處理，也可有效地防止載體自連，一步連接即可完成外源基因的四膜蟲表達載體的構建，一個PCR反應即可確定外源基因的插入方向；這一系列載體的rDNA骨架及HSP70-2啟動子能實現目標基因的遺傳轉化和高效表達。這一系列表達載體可在同一載體上完成基因克隆、測序和高效表達三種功能並能方便地篩選重組子，從而簡化了分子生物學操作步驟，節約了時間，減輕工作量，且成功率，可靠性都比較高，使用廣泛。本發明的另一個目的在於提供了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體的構建方法。這一系列載體的構建過程中均通過PCR及酶切連接的方法構建中間載體TH-HGFP或TH-HIS-HGFP或TH-GST-HGFP或TH-FLAG-HGFP，這些載體含兩端帶有反向互補的I-keI酶切位點的綠色螢光篩選標記HGFP，然後將各中間載體的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段通過NotI酶切位點引入到載體PD5H8，最後獲得一系列一步法引入外源基因、綠色螢光蛋白篩選和高效表達外源基因的四膜蟲轉基因克隆表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP。從而簡化了分子生物學操作步驟。本發明的再一個目的在於提供了一種一系列一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體在表達外源蛋白GFP中的用途。外源基因gfp的四膜蟲表達載體電轉到四膜蟲後，在巴龍黴素藥物篩選作用下，表達載體能替換掉四膜蟲體內原有的大部分rDNA，以實現目標基因的遺傳轉化，並在熱激條件下，HSP70-2強啟動子啟動高效表達該基因的非融合蛋白或HIS融合蛋白或GST融合蛋白或FLAG融合蛋白。因此一種一步法弓|入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體可被用於克隆、高效表達外源基因，特別是表達真核蛋白，如抗體，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等藥物等，這些蛋白質在治療藥物開發；診斷；人類和動物疫苗的開發；藥物設計，工業酶生產等方面具有廣泛的應用；還可根據需要任意選擇不帶標籤、帶GST標籤、帶HIS標籤或帶FLAG標籤的表達載體，可應用於蛋白質的表達純化及研究蛋白質相互作用等方面。本發明是這樣實現的本發明所述的一系列四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG_HGFP均是一種HSP70-2基因啟動子驅動外源基因的四膜蟲轉基因表達載體。四膜蟲的HSP70-2基因啟動子是一個強啟動子，能高效啟動下遊基因的表達。以39°C熱激處理條件下的四膜蟲cDNA為模板，採用實時定量PCR方法比較嗜熱四膜蟲HSP70-2基因與目前已報導嗜熱四膜蟲HSP70-1基因(BarchettaS，LaTerzaA，BallariniP,PucciarelliS,MiceliC.CombinationoftworegulatoryelementsintheTetrahymenathermophilaHSP70-lgenecontrolsheatshockactivation.EukaryotCell.2008，7(2):379-386.)，發現HSP70-2基因的相對表達量更高，相應的HSP70-2基因的啟動子效率也更高〔馮立芳，暢悅，袁冬霞，繆煒.動物學研究.2011(已接收)〕。基於此，本發明所述的一系列四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的四膜蟲HSP70-2基因啟動子是一個強啟動子，能夠實現外源基因的高效表達。本發明所述的一系列四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG-HGFP上含有的盒式結構HGFP是個可替換的盒式結構。該盒式結構HGFP兩側各含有一個稀有HceI酶切位點，並且該兩個HceI酶切位點的序列是反向的。首先將擬研究對象外源基因Y(可在四膜蟲體內表達的任何無毒外源基因)經PCR擴增，在其起始密碼子ATG前加上I-keI酶切位點，在其終止密碼子TGA前(不保留終止密碼子TGA)加上反向的HceI酶切位點。接著經HceI酶切將質粒pD5H8_HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP上的盒式結構HGFP替換為擬研究對象——外源基因Y，得到所需的質粒PD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST_Y或PD5H8-FLAG-Y(具體操作過程可參考本發明中所述表達載體pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP的構建方法)。並且盒式結構HGFP中含有綠色螢光篩選標記，因而可以通過該篩選標記來篩選重組子。最後用電穿孔法轉染所構質粒PD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST_Y或pD5H8-FLAG_Y到四膜蟲體內，便使四膜蟲成為一個表達外源基因Y的表達系統。以gfp為例，將載體pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP)通過電穿孔法轉染到四膜蟲體內後，在巴龍黴素藥物篩選作用下，使得外源基因gfp在四膜蟲體內拷貝數大量倍增。以Y-th-gfp-63F(IOuM)，Y-th-gfp-64R為引物，分別對PD5H8-GFP(或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)的四膜蟲表達株做WholeCellPCR驗證a.收集150_200ul細胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉速離心6-10分鐘或更長，倒掉上清。b.加80-100ulIXBufferK(2mMMg2+)到細胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，並轉移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時，99°C變性20分鐘。c.將上述裂解物置於冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgCl2(25mM)(Final3mM),0.5uldNTP(IOuM),IulY-th-gfp-63F(IOuM),IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq，0.4ulH20。PCR條件94°C2min，94°C，30sec，50°Clmin，68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0均能擴增得到約750bp的gfpPCR產物則說明相應的四膜蟲轉染成功，四膜蟲含有質粒pD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(詳情見28)。實現了目標基因的遺傳轉化。構建含HSP702啟動子和HGFP的四膜蟲轉基因表達載體pD5H8_HGFP或PD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP，及含HSP702啟動子的四膜蟲GFP表達載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP的具體實驗技術參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實驗指南》(黃培堂等譯，2002年8月第三版，北京科學出版社)。本發明中所用限制性內切酶購買自Τ0Υ0Β0公司及大連寶生物工程有限公司、膠回收試劑盒購買自Axygen公司、質粒DNA小量提取試劑盒購買自BioFlux公司、pGEM-T載體購買自Promega公司、DNA聚合酶購買自大連寶生物工程有限公司、T4連接酶購買自NewEnglandBiolabs公司、熱敏磷酸酶購買自NewEnglandBiolabs公司、轉化用大腸桿菌E.coliDH5α購買自天根生化公司、DNA分子量標記Marker均購買自天根生化公司及大連寶生物工程有限公司、瓊脂糖購買自Biowest公司、TBT購買自AcrosOrganic公司、所有離心管、吸頭均購買自Axygen公司、所用引物均由上海英駿生物技術有限公司完成，所有測序均由上海英駿生物技術有限公司及北京華大基因研究中心完成。本發明所用嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)株系信息參考Eisen等(EisenJA,CoyneRS,WuM,ffuD,ThiagarajanΜ,WortmanJR,BadgerJH,RenQ,AmedeoP,JonesKM,TallonLJ,DelcherAL,SalzbergSL,SilvaJC,HaasBJ,MajorosWH,FarzadM,CarltonJM,SmithRKJr,GargJ,PearlmanRE,KarrerKM,SunL,ManningG,EldeNC,TurkewitzAP,AsaiDJ,WilkesDE,WangY,CaiH,CollinsK,StewartBA,LeeSR,WilamowskaK,WeinbergZ,RuzzoWL,WlogaD,GaertigJ,FrankelJ,TsaoCC,GorovskyMA,KeelingPJ,WallerRF,PatronNJ,CherryJM,StoverNA,KriegerCJ,delToroC,RyderHF,WilliamsonSC,BarbeauRA,HamiltonEP,OriasE.MacronucleargenomesequenceoftheciliateTetrahymenathermophila,amodeleukaryote.PlosBiol.2006,4(9)e286.)，質粒pD5H8信息參考Gaertig等(GaertigJ,GorovskyMA.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200.)。本發明中含HSP70-2啟動子及綠色螢光篩選標記HGFP的一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HGFP或pD5H8_HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或PD5H8-FLAG-HGFP的構建方法及四膜蟲的GFP表達載體pD5H8_GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP的構建過程，一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體的構建方法，包括如下步驟A.利用引物Y-TGFP-I-SceI-41F5'GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3'Y-TGFP-I-SceI-42R5『GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT3『以質粒THX-HGFP為模板擴增獲得兩端帶HceI識別序列接頭的HGFP片段，並用I-keI處理，獲得帶HceI粘性末端的片段HceI-HGFP-I-SceI。B.利用引物Y-th-gfp-61F5『CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3『Y-th-gfp-62R5'GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質粒HSP702-GFP(本實驗室構建，申請號/專利號200910062093，發明名稱含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用，申請時間2009年5月15日)為模板反擴載體，並用HceI處理，獲得帶HceI粘性末端的載體片段I_SceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI。C.連接A步驟UceI處理的UceI-HGFP-I-SceI片段與B步驟UceI處理的載體片段HceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI得到重組質粒TH-HGFP。D.利用M13正反向引物，以TH-HGFP為模板，PCR擴增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的PCR片段，然後NotI處理得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。E.將質粒pD5H8(羅徹斯特大學的MartinA.Gorovsky教授贈送，質粒pD5H8信息同前參考文獻:GaertigJ,GorovskyMA.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200)經NotI單酶切後，回收單酶切片段，並用熱敏磷酸酶進行去磷酸化處理，得到去磷酸化的PD5H8載體。F.將步驟D中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達載體PD5H8-HGFP。G.利用引物Y-th-2gfp(his)_69F5'CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3'Y-th-2gfp(his)_70R5'CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質粒TH-HGFP為模板反擴載體，並用HindIII處理，得到帶MndIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII片段。H.將步驟G中帶HindIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13『UTR-HGFP-HindIII片段用連接酶處理，使其自連得到重組質粒TH-HIS-HGFP。I.利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP為模板，PCR擴增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的PCR片段，然後NotI處理得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。J.將步驟I中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25『UTR-HIS-HGFP-HSP70-13『UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達載體PD5H8-HIS-HGFP。K.利用引物Y-th-2gfp-(GST)7IF5'CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3'Y-th-2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質粒TH-HGFP為模板反擴載體，並用HindIII和BglII雙酶切處理，得到帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。L.利用引物Y-GST-73F5'GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3『Y-GST-74R5'CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'以質粒pET23a_GST(湖北大學馬立新教授贈送)為模板擴增獲得GST片段，並用HindIII和BglII雙酶切處理，得到帶HindIII和BglII接頭的GST片段。M.連接步驟L中帶HindIII和BglII接頭的GST片段與步驟K中帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII片段得到重組質粒TH-GST-HGFP。N.利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP為模板，PCR擴增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的片段，然後NotI處理該PCR片度得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。0.將步驟M中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25『UTR-GST-HGFP-HSP70-13『UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達載體PD5H8-GST-HGFP。P.利用引物Y-FLAG-87F5'GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3『Y-FLAG-88R5'CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3『以質粒ρ⑶NA3.I-FLAG(湖北大學馬立新教授贈送)為模板擴增獲得FLAG片段，並用HindIII和BglII雙酶切處理。Q.連接步驟P中帶HindIII和BglII接頭的FLAG片段與步驟K中帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII片段得到重組質粒TH-FLAG-HGFP。R.利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP為模板，PCR擴增獲得含NotI_HSP70_25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的片段，然後NotI處理該PCR片段得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。S.將步驟R中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25『UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13『UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達載體PD5H8-FLAG-HGFP。T.利用引物Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3'Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'以質粒HSP702-GFP(同前)為模板，擴增獲得兩端帶HceI識別序列接頭的GFP片段，並用HceI處理，獲得帶HceI粘性末端的片段HceI-GFP-I-SceI。U.將載體pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS_HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP經I-SceI雙酶切後，回收長度分別約為15200bp,15200bp,15700bp,15200bp的大片段。V.將步驟P中帶HceI接頭的HceI-GFP-I-SceI片段與步驟Q中用I-SceI處理後的pD5H8-HGFP或pD5H8_HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP載體連接得到GFP的四膜蟲表達載體PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP。本發明提供了一系列含HSP70-2啟動子和HGFP的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HGFP,pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP，這些載體將四膜蟲熱休克蛋白70啟動子、含綠色螢光篩選標記的盒式結構HGFP、四膜蟲熱休克蛋白70終止子連接進嗜熱四膜蟲的rDNA載體pD5H8中，連入的三部分序列分別為SEQIDNO.1,SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。用gfp替換掉原有表達載體pD5H8_HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP載體中盒式結構HGFP獲得gfp的四膜蟲表達載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP，這些表達載體將四膜蟲熱休克蛋白70啟動子、編碼綠色螢光蛋白ORF序列、四膜蟲熱休克蛋白70終止子連接進嗜熱四膜蟲的rDNA載體pD5H8中，連入的三部分序列分別為SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8所示的核苷酸序列。這一系列gfp的四膜蟲表達載體轉染四膜蟲後，經熱激誘導各能表達得到一種分離的蛋白質，其蛋白質的核苷酸序列分別為SEQIDN0.5中1127-1858核苷酸序列，SEQIDN0.6中1109-1882核苷酸序列，SEQIDN0.7中1115-2538核苷酸序列，SEQIDN0.8中1115-1939核苷酸序列(四膜蟲中密碼子TAAjTAG非終止子，均編碼胺基酸穀氨醯胺)，所有序列由上海英駿生物技術有限公司測序確認，具體位置信息描述如下A.一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HGFP中HSP70-2啟動子+盒式結構HGFP+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR全長3U9bp，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和3122-3129；I-SceI酶切位點為1109-1126和2617-2634；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105；盒式結構HGFP中gfp基因起始密碼子(ATG):1637-1639；終止密碼子(TGA)2351-2353；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):2644-3121B.一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-HIS-HGFP中HSP70-2啟動子+盒式結構HGFP+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR全長315!3bp，其序列為SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和3146-3153；I-SceI酶切位點為1133-1150和2640-2659；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;His標籤1109-1126；HindIII酶切位點:1127-1132；盒式結構HGFP中gfp基因起始密碼子(ATG):1661-1663；終止密碼子(TGA)2375-2377；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):2668-3145C.一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-GST-HGFP中HSP70-2啟動子+盒式結構HGFP+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR全長3709bp，其序列為SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和3699-3709；I-SceI酶切位點為:1789-1807和3197-3214；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點1109-1114；Gst標籤1115-1783；HindIII酶切位點:1784-1789；盒式結構HGFP中gfp基因起始密碼子(ATG):2217-2219；終止密碼子(TGA)2930-2933；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):3224-3701。D.一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體pD5H8-FLAG-HGFP中HSP70-2啟動子+盒式結構HGFP+HSP70-1終止子的結構HSP70-25『UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR全長3109bp，其序列為SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和31020-3109；I-SceI酶切位點為1190-1207和2597-2614；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點1109-1114；FLAG標籤1115-1183；HindIII酶切位點:1184-1189；盒式結構HGFP中gfp基因起始密碼子(ATG):1617-1619；終止密碼子(TGA)2331-2333；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):2624-3101Ε.一種分離的蛋白質GFP的四膜蟲表達載體pD5H8-GFP中HSP70-2啟動子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR全長2353bp，其序列為SEQIDN0.5所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和2346-2353；I-SceI酶切位點為:1109-1126和1841-1858；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;gfp基因起始密碼子(ATG):1127-1129；終止密碼子(TGA):1859-1861；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):1868-2345。F.一種分離的蛋白質GFP的四膜蟲表達載體pD5H8-HIS-GFP中HSP70-2啟動子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-HIS-GFP-HSP70-13'UTR全長2377bp，其序列為SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和2370-2377；I-SceI酶切位點為1133-1150和1865-1882；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;His標籤1109-1126；HindIII酶切位點:1127-1132；gfp基因起始密碼子(ATG):1151-1153；終止密碼子(TGA):1883-1885；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):1892-2377。G.一種分離的蛋白質GFP的四膜蟲表達載體pD5H8-GST-GFP中HSP70-2啟動子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-GST-GFP-HSP70-13'UTR全長3034bp，其序列為SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和3027-3034；I-SceI酶切位點為1790-1807和2522-2539；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點1109-1114；Gst標籤1115-1783；HindIII酶切位點:1784-1789；gfp基因起始密碼子(ATG)=1808-1810；終止密碼子(TGA)=2540-2542；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):2549-3026。H.一種分離的蛋白質GFP的四膜蟲表達載體pD5H8-FLAG-GFP中HSP70-2啟動子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結構HSP70-25'UTR-FLAG-GFP-HSP70-13'UTR全長M34bp，其序列為SEQIDNO.8所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點為1-8和2427-2434；I-SceI酶切位點為:1190-1207和1922-1939；HSP70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點1109-1114；FLAG標籤1115-1183；HindIII酶切位點:1184-1189；gfp基因起始密碼子(ATG)=1208-1210；終止密碼子(TGA)=1940-1942；HSP70-1基因終止信號(HSP70-13'UTR):1949-2426。將本發明的表達載體pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP經電穿孔法轉染到四膜蟲體內，39°C熱激誘導1小時後，可通過westernblotting及螢光顯微鏡觀察綠色螢光檢測其表達情況。本發明中所用不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)B2086與CU^8株系信息參考JacekGaertig,Hamilton,Orias與ColeES等(JacekGaertigandMartinaA.Gorovaky.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,19920ctober,Vol.89,9196-9200；(HamiltonEP,OriasE.Geneticcrosses:settingupcrosses,testingprogeny,andisolatingphenotypicassortants.MethodCellBiolTetrahymenathermophila.Academicpress.2000,vol62:219-228；ColeESetal.AmutationalanalysisofconjugationinTetrahymenathermophila.2.Phenotypesaffectingmiddleandlatedevelopmentthirdprezygoticnucleardivision,pronuclearexchange,pronuclearfusion,andpostzygoticdevelopment.DevBiol.1997Sep15；189(2):233-45.)；SPP培養基配方參考Orias等(OriasE,HamiltonEP,OriasJD.Tetrahymenaasalaboratoryorganism:usefulstrains,cellculture,andcelllinemaintenance.MethodCellBiol:Tetrahymenathermophila.Academicpress.2000.vol62:194.)；電穿孔技術方法參考GaertigJ等(GaertigJ,GorovskyMA.GenetransferbyelectroporationinTetrahymena.MethodsMolBiol.1995；47:331-48；JGaertig,LGu,BHai,andMAGorovsky.Highfrequencyvector-mediatedtransformationandgenereplacementinTetrahymena.NucleicAcidsRes.1994December11；22(24):5391-5398.)；四膜蟲細胞的固定、計數方法參考章宗涉、黃祥飛編著的《淡水浮遊生物研究方法》(北京科學出版社。1991:334-339。)。利用一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HGFP或PD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP構建的外源蛋白GFP表達載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP在四膜蟲中表達外源蛋白GFP中的應用，其步驟是(1)外源蛋白GFP的表達載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP，經電穿孔法轉染到四膜蟲體內。A.將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(^Tetrahymenathermophila)B2086與⑶428(兩株四膜蟲均由羅徹斯特大學的MartinA.Gorovsky教授贈送)株系分別接種至50mlSPP培養基於250ml的錐形瓶內，30°C適中振蕩，細胞生長至密度為3_5X105/ml。B.800_1500g離心^iiin收集細胞，用50ml飢餓Buffer清洗、重離心，並重懸細胞於50ml飢餓Buffer，30°C孵育。C.48小時後細胞計數，調整密度至3X105/ml。D.將各自50ml細胞置於同一個2L錐形瓶內，30°C以100-180rpm速度振蕩(以避免細胞配對)。在電轉前IOh停止振蕩，停止後Ih細胞開始配對。E.細胞配對開始4h後，檢查配對效率。如果需要高效的轉化率，則需要80%以上的配對率。F.將轉化用的DNA重懸於125ul的電轉Buffer。若DNA保存在H2O或TE裡，則加入相應的電轉Buffer至總體積為125ul。G.在停止振蕩(或者是混合細胞)10-10.5h後，於800g離心5min，去上清，將細胞重懸於100ml電轉液，離心(同上Hmin。H.重懸細胞至Iml電轉Buffer(約3X107ml)，立即使用細胞進行電轉。CET效率在低溫下會降低，因此細胞與轉化用的DNA不應放在冰上。I.將富集的125μ1四膜蟲與50μg相同體積的30°C溫育的質粒(pD5H8_GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)分別混勻，並迅速轉移到30°C溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產品)中，用Bio-Rad電穿孔儀進行電擊，電擊參數為300V，25μF，50Ω，電擊後的電擊杯於室溫Q0-25°C，以下相同)靜置lmin。(2)轉染後四膜蟲的培養及篩選A.將電擊後的四膜蟲轉移到96mlSPP培養基中，於30°C恆溫箱靜置1小時，然後均勻分裝到96孔一次性培養皿。B.電擊1216小時後向96孔培養皿內加巴龍黴素(Sigma公司產品)，使每孔內的巴龍黴素濃度達到100μg/ml。C.電擊後第3天，將長勢良好的四膜蟲轉移至新的96孔一次性培養皿中，並將巴龍黴素濃度提高至200μg/ml。此後每兩天增加的巴龍黴素濃度梯度為200μg/ml，直至1000μg/ml。D.從1000μg/ml巴龍黴素濃度下長勢良好的四膜蟲培養液中挑取單個四膜蟲細胞到96孔一次性培養皿中。E.單細胞挑選3天後，從96孔一次性培養皿內選取長勢良好的四膜蟲轉移到含有200μISPP培養基的96孔一次性培養皿中30°C恆溫培養，保持培養基內巴龍黴素濃度為1000μg/ml。(3)WholeCellPCR鑑定轉染四膜蟲A.M孔一次性培養皿培養用巴龍黴素篩選至1000μg/ml的轉染四膜蟲單克隆至對數期。B.WholeCellPCR驗證、篩選陽性克隆a.收集150_200ul轉染四膜蟲細胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉速離心6-10分鐘或更長，倒掉上清。b.加SO-IOOulIXBufferK(2mMMg2+)到細胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，並轉移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時，99°C變性20分鐘。C.將上述裂解物置於冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgCl2(25mM)(Final3mM)，0.5uldNTP(IOuM)，IulY_th-gfp_63F(IOuM)，IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq，0.4ulH2O0PCR條件94°C2min，94°C30sec，50°Clmin，68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0C.以Y-th-gfp-63F，Y_th-gfp-64R為引物，能擴增得到約750bp的gfpPCR產物則說明相應的培養皿孔內篩選到的四膜蟲轉染成功，對應四膜蟲含有質粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(鑑定結果如圖28)。(4)免疫印記檢測轉染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達A.將轉染成功的四膜蟲轉接至裝有50mlSPP培養基的錐形瓶中於30°C培養，巴龍黴素濃度為1000μg/ml。待四膜蟲密度長至3XIO5個/ml，39°C熱激，處理1小時。B.40C，1800rpm離心3min，收集細胞。C.加入PBS，重懸細胞，1800rpm離心5min，棄上清。D.加入PBS，稀釋細胞至5XIO7個/ml，轉移至1.5ml離心管，超聲破細胞。破細胞參數frequency:22%,Time:60S,Pause:lsecond，lsecond破至菌體懸液由渾濁變為澄清。E.按比例加入5X蛋白電泳緩衝液，在沸水中煮:3min，離心，取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳。F.蛋白質電泳完成，將分離膠從玻璃板上取下，於電轉液中平衡半小時，與凝膠同樣大小的NC膜和3mm濾紙按海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結構裝入轉印夾。轉印時凝膠接負極，NC膜接正極。電轉移條件恆壓90V，電轉池。G.轉印結束，將NC膜至於PBST中洗滌三次，每次5min。H.將NC膜至於封閉液中封閉l_2h，然後用PBST中洗滌三次，每次5min。I.將NC膜與適當稀釋的第一抗體(GFP抗體)，在37°C反應lh，然後用PBST中洗滌三次，每次5min。J.將NC膜與適當稀釋的第二抗體，在37°C反應lh，然後用PBST中洗滌6次，每次5min。K.將NC膜至於顯色液中顯色5min，用UVP冷光CXD爆光檢測。免疫印記檢測檢測轉染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達結果如圖四所示。能檢查到27KD的蛋白說明對應轉染四膜蟲中有GFP表達。(5)螢光顯微鏡觀察轉染質粒PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP四膜蟲中的GFP蛋白的表達A.M孔一次性培養皿培養(30°C)WholeCellPCR鑑定正確的轉染四膜蟲單克隆至對數後，一份39°C熱激，處理1小時，另一份不做處理。B.各取未熱激處理和39°C熱激處理後的Iml四膜蟲富集至50μ1，離心條件為1500rpm、30°C、2min，然後用ZEISS顯微鏡在藍色激發光下(濾光片FITC)對誘導的四膜蟲進行螢光觀察，並用ZEISS顯微鏡配套的數碼成像系統拍照記錄，如圖30所示。未熱激處理的轉染四膜蟲無法觀察到綠色螢光，熱激處理後四膜蟲能觀察到綠色螢光，則說明對應的轉染四膜蟲中有GFP的表達。綜上所述，所述一系列表達載體PD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有四膜蟲HSP70-2基因啟動子序列、綠色螢光篩選標記HGFP、與四膜蟲rDNA序列高度相似的pD5H8載體序列；所述一系列gfρ表達載體pD5H8_GFP，pD5H8-HIS-GFP，pD5H8-GST-GFP，pD5H8-FLAG-GFP上含有四膜蟲HSP70-2基因啟動子序列、編碼綠色螢光蛋白ORF序列、與四膜蟲rDNA序列高度相似的pD5H8載體序列，他們分別具有如下特徵(1)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有可替換的盒式結構HGFP，通過替換為不同的外源基因，以實現四膜蟲作為一個外源基因表達系統；(2)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替換的盒式結構HGFP，是通過稀有HceI酶切位點來被替換的，外源基因的選擇幾乎不受限制性內切酶的限制，且一步即可替換完成。(3)外源基因的插入到這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG_HGFP上方向均分別只需一個PCR反應即可驗證。(4)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替換的盒式結構HGFP兩側的HceI酶切位點是反向的，替換不同的外源基因時，可有效地防止載體自連。(5)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有可替換的盒式結構HGFP含有綠色螢光篩選標記，故可以通過綠色螢光篩選標記來篩選外源基因的重組子，重組子的鑑定方便。(6)在巴龍黴素藥物篩選作用下，這一系列表達載體pD5H8-HGFP，PD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP能使正確克隆至其中的外源基因於四膜蟲中大量擴增，實現目標基因的遺傳轉化。如gfp的四膜蟲表達載體PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或pD5H8-FLAG_GFP轉染四膜蟲後，在巴龍黴素藥物篩選作用下，可替換掉四膜蟲體內原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內大量倍增(見圖28)。(7)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有高效表達啟動子四膜蟲HSP70-2基因啟動子，是一個強啟動子，在四膜蟲中，能高效啟動正確克隆至下遊的外源基因的表達。與現已報導的四膜蟲HSP70-1基因相比，在熱激條件下，效率高1.9倍，實現下遊基因的大量表達。如gfp的四膜蟲表達載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP轉染四膜蟲後，通過免疫印記均檢測到了gfp蛋白的表達。(8)這一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP不僅能使正確克隆至其中的外源基因於四膜蟲中大量表達，而且所表達的蛋白還具有生物活性。如gfp的四膜蟲表達載體PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP轉染四膜蟲後，螢光顯微鏡還能觀察到39°C熱激處理後四膜蟲能發出綠色螢光，說明該gfp蛋白具有生物活性。所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體，其特徵在於所述的表達載體含有可替代的綠色螢光篩選標記HGFP。所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體，其特徵在於所述的表達載體的盒式結構HGFP兩側含有反向的HceI稀有酶切位點，一步引入外源基因時用於克隆的外源片段的正反向引物接頭中含有相應的反向互補HceI酶切位點。利用本發明所述的一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP構建的外源蛋白的四膜蟲表達載體經電穿孔法轉染到四膜蟲體內後用於蛋白質表達具有以下優點(1)四膜蟲廣泛分布於全球各地的淡水環境中，以攝取水中的細菌與其他有機質維生，尚未發現對造成人體疾病或對人類健康造成危害。以四膜蟲為表達系統，安全性可罪。(2)嗜熱四膜蟲作為真核生物，較酵母等模式生物和人類具有更高程度的功能保守性，因此一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體可被用於克隆表達外源基因，特別是表達真核蛋白，如抗體，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等藥物等，這些蛋白質在治療藥物開發；診斷；人類和動物疫苗的開發；藥物設計，工業酶生產等方面具有廣泛的應用。(3)作為單細胞生物，四膜蟲與其它細胞系(如哺乳動物體細胞)相比，四膜蟲作為第一種實現細胞同步化的真核生物可以進行無菌純培養，培養更簡單、快速和經濟，操作精確度和可控制性強；同時四膜蟲生活周期短且具備真核生物基本生命過程，並且不具有類似於酵母的複雜胞壁結構，卻含有可觀的細胞膜轉運蛋白系統。四膜蟲中表達蛋白只有簡單的N-糖基化，不存在如酵母中豐富的甘露糖殘基修飾，植物中豐富的木糖殘基修飾等非哺乳動物中的修飾類型，其獨特的生物學使其能夠作為理想的表達系統。(4)只需將外源蛋白的四膜蟲表達載體經電穿孔法轉染到四膜蟲體內即可。(5)可根據需要任意選擇不帶標籤，帶GST標籤或帶HIS標籤的表達載體，可用於蛋白質的表達純化，蛋白質的功能或相互作用的研究等。(6)一系列表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP上含有高效表達啟動子。加之巴龍黴素藥物篩選作用下，表達載體可替換掉四膜蟲體內原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內大量倍增(見圖28)，因此外源基因能得到高效的表達。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步的詳細說明。圖1為一種THX-HGFP質粒2為一種HSP702-GFP質粒3為一種質粒TH-HGFP構建示意4為一種質粒pD5H8-HGFP構建示意5為一種質粒TH-HIS-HGFP構建示意6為一種質粒pD5H8-HIS-HGFP構建示意7為一種質粒TH-GST-HGFP構建示意8為一種質粒pD5H8-GST-HGFP構建示意9為一種質粒TH-FLAG-HGFP構建示意10為一種質粒pD5H8-FLAG-HGFP構建示意11為一種質粒pD5H8-GFP構建示意12為一種質粒pD5H8-HIS-GFP構建示意13為一種質粒pD5H8-GST-GFP構建示意14為一種質粒pD5H8-FLAG-GFP構建示意15為一種質粒PD5H8的NotI酶切結果示意圖。泳道1為pD5H8質粒對照；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道3-5為pD5H8的NotI單酶切後的條帶，大小約為13.81Λ。圖16為一種質粒pD5H8-HGFP的電泳示意圖。泳道1-5為質粒pD5H8-HGFP，大小約為16.9kb；泳道6為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp0圖17為一種質粒pD5H8_HIS-HGFP電泳示意圖。泳道1-3為質粒pD5H8-HIS-HGFP，大小為16.9kb；泳道4為λ-HindIIIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為23130bp，941^3ρ，6557bp，4361bp，2322bp,2027bp。圖18為一種質粒pD5H8-GST_HGFP電泳示意圖。泳道1-8為質粒pD5H8-GST-HGFP，大小約為17.51Λ；泳道9為λ-EcoTHIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp，7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bpo圖19為一種質粒pD5H8-FLAG_HGFP電泳示意圖。泳道1-4為質粒pD5H8-FLAG-HGFP，大小為16.9kb；泳道5為λ-EcoTHIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp0圖20為一種質粒pD5H8_HGFP的HceI酶切結果示意圖。泳道1為對照質粒pD5H8-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質粒pD5H8-HGFP被HceI雙酶切後所得兩個片段，大小分別約為15.2kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖21為一種質粒pD5H8-HIS-HGFP的HceI酶切結果示意圖。泳道1為對照質粒pD5H8-HIS-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質粒pD5H8-HIS-HGFP被HceI雙酶切後所得兩個片段，大小分別約為15.2kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖22為一種質粒pD5H8-GST-HGFP的HceI酶切結果示意圖。泳道1為對照質粒pD5H8-GST-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質粒pD5H8-GST-HGFP被HceI雙酶切後所得兩個片段，大小分別約為15.7kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖23為一種質粒pD5H8-FLAG-HGFP的HceI酶切結果示意圖。泳道1-2為質粒pD5H8-FLAG-HGFP被HceI雙酶切後所得兩個片段，大小分別約為15.2kb，1.5kb，其中小片段為HGFP片段。泳道3為對照質粒pD5H8-FLAG_HGFP；泳道4為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp,2690bp,1882bp,1489bp，925bp。圖M為一種質粒pD5H8_GFP的PCR驗證的結果示意圖。泳道1-6為以質粒pD5H8-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴得的約850bp的片段，表明對應質粒pD5H8-GFP為GFP正向插入的正確質粒；泳道7為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp，2690bp，1882bp,1489bp，925bp。圖25為一種質粒pD5H8_HIS-GFP的PCR驗證的結果示意圖。泳道1為X-EcoT14IdigestDNAmaker+λ-HindIIIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為23130bp,19329bp,9416bp,7743bp,6557bp,6223bp,4361bp,4254bp,3472bp，2690bp，2322bp，2027bp，1882bp,1489bp,925bp,564bp,421bp；泳道2-5為以質粒PD5H8-HIS-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴得的約850bp的片段，表明對應質粒pD5H8-HIS-GFP為GFP正向插入的正確質粒。圖沈為一種質粒pD5H8-GST-GFP的PCR驗證的結果示意圖。泳道1為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp,489bp,925bp,421bp；泳道2-5為以質粒PD5H8-GST-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴得的約850bp的片段，表明對應質粒pD5H8-GST-GFP為GFP正向插入的正確質粒。圖27為一種質粒pD5H8-FLAG-HGFP的PCR驗證的結果示意圖。泳道1為λ-EcoTHIdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道2-6為以質粒PD5H8-FLAG-HGFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴得的約850bp的片段，表明對應質粒PD5H8-FLAG-HGFP為GFP正向插入的正確質粒。圖沘為一種轉染質粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP)的四膜蟲WholeCellPCR鑑定結果示意圖。泳道1-3轉染質粒pD5H8-GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑑定結果；泳道4為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道5_7為轉染質粒pD5H8-HIS_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑑定結果；泳道5_7為轉染質粒pD5H8-HIS_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑑定結果；泳道8-10為轉染質粒pD5H8-GST_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑑定結果。泳道11為λ-EcoTHIdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道12-14為轉染質粒PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑑定結果。結果表明以Y_th-gfp-63F，Y-th-gfp-64R為引物，分別對轉染質粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜蟲做WholeCellPCR鑑定，均能擴增得到約750bp的GFP片段，則說明相應的四膜蟲轉染成功，四膜蟲對應含有質粒PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP(詳情見28)。實現了目標基因的遺傳轉化。圖四為一種免疫印記檢測檢測轉染質粒pD5H8-GFP(或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP)的四膜蟲中GFP蛋白的表達結果示意圖。圖中結果表明轉染質粒pD5H8-GFP的四膜蟲表達的GFP蛋白用一抗GFP，能檢測到明顯的約27KD目的條帶，而轉染質粒PD5H8的四膜蟲表達的蛋白用一抗GFP，並不能檢測到目的條帶；轉染質粒PD5H8-HIS-GFP的四膜蟲表達的GFP蛋白用一抗GFP或HIS，均能檢測到明顯的約27KD目的條帶，而轉染質粒pD5H8的四膜蟲表達的蛋白用一抗GFP或HIS,並不能檢測到目的條帶；轉染質粒PD5H8-GST-GFP的四膜蟲表達的GFP蛋白用一抗GFP或GST，均能檢測到明顯的約52KD目的條帶，而轉染質粒pD5H8的四膜蟲表達的蛋白用一抗GFP或GST，並不能檢測到目的條帶；轉染質粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲表達的GFP蛋白用一抗GFP或FLAG，均能檢測到明顯的27KD目的條帶，而轉染質粒pD5H8的四膜蟲表達的蛋白用一抗GFP或FLAG，並不能檢測到目的條帶。說明本發明中的載體PD5H8-GFP，PD5H8-HIS-GFP，pD5H8_GST_GFP，pD5H8_FLAG_GFP均能在四膜蟲體內順利表達出綠色螢光蛋白。圖30為一種不同處理的轉染質粒pD5H8(或pD5H8_GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP)的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。其中Al為39°C處理轉染質粒pD5H8-GFP的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；A2為未處理轉染質粒pD5H8-GFP的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。Bl為39°C處理轉染質粒pD5H8-HIS-GFP的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；B2為未處理轉染質粒pD5H8-HIS-GFP的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。Cl為39°C處理轉染質粒pD5H8-GST-GFP的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；C2為未處理轉染質粒pD5H8-GST-GFP的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。Dl為39°C處理轉染質粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；D2為未處理轉染質粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。El為39°C處理轉染質粒pD5H8的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；E2為為未處理轉染質粒PD5H8的四膜蟲，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。可以看到，本發明中的載體pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)能在四膜蟲體內順利表達出具有活性的綠色螢光蛋白，這就利用用四膜蟲表達外源蛋白打下了基礎。具體實施例方式下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步的詳細說明。具體實施例用於說明目的面並非用於限定本發明的範圍。實施例1質粒TH-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-TGFP-I-SceI-41F:5'GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3',Y-TGFP-I-SceI-42R5'GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAA3『(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為I-SceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒THX-HGFP。(c)PCR反應體系組分:5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上遊弓丨物(10μΜ)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約1500bp的目的DNA片段HGFP。(g)將回收的目的片段HGFP用HceI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段HGFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收UceI酶切後的片段UceI-HGFP-I-SceI。(2)(a)所用引物為Y_th-gfp-61F5'CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3'，Y_th-gfp_62R:5『GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中ATTACCCTGTTATCCCTA為I-SceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒HSP702-GFP。(c)PCR反應體系組分5μIlOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上遊弓丨物(10μΜ)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C5min循環35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約4700bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HceI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切後的片段HceI-HSP70-25『UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI。(3)連接(1)步HceI處理得到的的HceI-HGFP-I-SceI片段與(2)步I-SceI處理得到的載體片段HceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI，16°C過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的固體培養基上培養16小時。(5)從中挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒TH-HGFP。(7)質粒TH-HGFP經HceI雙酶切在37°C反應2小時，電泳鑑定表明質粒TH-HGFP構建正確。(8)將經酶切鑑定的TH-HGFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明HGFP序列通過I-keI位點插入至載體中。具體克隆過程見圖3。實施例2質粒pD5H8-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為:M13正反向引物。(b)所用模板為構建質粒TH-HGFP0(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(10mM),ly1上遊引物(10μM)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C3.5min循環；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切後的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質粒pD5H8經NotI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ110XBuffer,10口8質粒？05!18，5111NotI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道「2」所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對步驟O)中的13.Skb大片段回收產物進行去磷酸化處理，反應在含IX熱敏磷酸酶緩衝液的50μ1體系中進行，37°C作用30min，然後65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.Ikb小片段NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經去磷酸化酶處理後的13.81Λ大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(6)挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(7)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8_HGFP。(8)將上步所提取的質粒跑電泳看大小，若無其他汙染，則大小為16.9kp的質粒所對應的發綠色螢光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖16中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒PD5H8-HGFP構建正確。挑取其中3個質粒大小正確的克隆測序結果均正確。具體克隆過程見圖4。實施例3質粒TH-HIS-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp(his)-69F5'CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3'，Y-th-2gfp(his)-70R:5'CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中AAGCTT為HindIII位點)。(b)所用模板為構建質粒TH-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環35次；72V延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ1IOXBuffer,30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII酶切後的片段的HindIII-HIS-HSP70-25『UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII。(2)將步驟(1)中帶HindIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII片段2ul用加T4連接酶16°C過夜連接。(3)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的固體培養基上培養16小時。(4)從中挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(5)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒TH-HIS-HGFP。(6)質粒TH-HIS-HGFP經HindIII酶切在37°C反應2小時，電泳鑑定表明質粒TH-HIS-HGFP構建正確。(7)將經酶切鑑定的TH-HIS-HGFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明載體中含正向插入的HIS標籤序列。具體克隆過程見圖5。實施例4質粒pD5H8-HIS-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為M13正反向引物。(b)所用模板為構建質粒TH-HIS-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C3.5min循環；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切後的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質粒pD5H8經NotI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ110XBuffer,10口8質粒？05!18，5111NotI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對步驟O)中的13.Skb大片段回收產物進行去磷酸化處理，反應在含IX熱敏磷酸酶緩衝液的50μ1體系中進行，37°C作用30min，然後65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.Ikb小片段NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經去磷酸化酶處理後的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(6)挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(7)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8_HIS-HGFP。(8)將上步所提取的質粒跑電泳看大小，若無其他汙染，則大小為16.9kp的質粒所對應的發綠色螢光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖17中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒PD5H8-HIS-HGFP構建正確。挑取其中3個質粒大小正確的克隆測序結果均正確。具體克隆過程見圖6。實施例5質粒TH-GST-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp-(GST)71F:5'CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3『，Y_th_2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中AAGCTT為HindIII位點，AGATCT為BglII位點)。(b)所用模板為構建質粒TH-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37V雙酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切後的片段的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。(2)a)所用引物為Y-GST_73F5『GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3『，Y-GST-74R5『CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'(其中AAGCTT為HindIII位點，AGATCT為BglII位點)。(b)所用模板為質粒pET23a_GST(湖北大學馬立新教授所贈)。(c)PCR反應體系組分5μ110\8肚化1~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μM)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約680bp的目的DNA片段GST。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時，酶切體系為5μ1IOXBuffer,30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切後的片段的HindIII-GST-BglII。(3)將步驟(1)中帶HindIII及BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII載體片段與步驟U)中帶HindIII及BglII接頭的GST片段加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的固體培養基上培養16小時。(5)從中挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒TH-GST-HGFP。(7)質粒TH-GST-HGFP經HindIII，BglII雙酶切在37°C反應2小時，電泳鑑定表明質粒TH-GST-HGFP構建正確。(8)將經酶切鑑定的TH-GST-HGFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，表明載體中含有正向插入的正確的GST標籤序列。具體克隆過程見圖7。實施例6質粒pD5H8-GST-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為M13正反向引物。(b)所用模板為構建質粒TH-GST-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C4min循環；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約4000bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切後的約3700bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質粒pD5H8經NotI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer,10口8質粒？05!18，5111NotI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對步驟O)中的13.Skb大片段回收產物進行去磷酸化處理，反應在含IX熱敏磷酸酶緩衝液的50μ1體系中進行，37°C作用30min，然後65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.7kb小片段NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經去磷酸化酶處理後的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(6)挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(7)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8-GST-HGFP。(8)將上步所提取的質粒跑電泳看大小，若無其他汙染，則大小為17.5kp的質粒所對應的發綠色螢光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖18中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒PD5H8-GST-HGFP構建正確。挑取其中3個質粒大小正確的克隆測序結果均正確。具體克隆過程見圖8。實施例7質粒TH-FLAG-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp-(GST)71F5『CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3',Y-th-2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3『(其中AAGCTT為HindIII位點，AGATCT為BglII位點)。(b)所用模板為構建質粒TH-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收Hindlll，BglII雙酶切後的片段的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。(2)a)所用引物為Y-FLAG-87F:5『GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3『，Y-FLAG-88R5『CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3『(其中AAGCTT為HindIII位點，AGATCT為BglII位點)。(b)所用模板為pCDNA3.1-FLAG(湖北大學馬立新教授所贈質粒)。(c)PCR反應體系組分5μ1lOXBuffer(含MgC12)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上遊弓丨物(10μΜ)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIU-MTMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°CImin循環35次；72°C延伸IOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約87bp的目的DNA片段FLAG。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切後的片段的HindIII-FLAG-BglII。(3)將步驟(1)中帶HindIII及BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII載體片段與步驟U)中帶HindIII及BglII接頭的FLAG片段加T4連接酶16°C過夜連接。(9)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的固體培養基上培養16小時。(10)從中挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(11)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒TH-GST-HGFP。(12)質粒TH-FLAG-HGFP經HindIII，BglII分別單酶切在37°C反應2小時，電泳鑑定表明質粒TH-FLAG-HGFP構建正確。(13)將經酶切鑑定的TH-FLAG-HGFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明載體含有正向插入的FLAG標籤序列。具體克隆過程見圖9。實施例8:質粒pD5H8-FLAG-HGFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為:M13正反向引物。(b)所用模板為構建質粒TH-FLAG-HGFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1「1dNTP(IOmM)，1μ1上遊引物(10μΜ)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C4min循環；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切後的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質粒pD5H8經NotI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ1lOXBuffer,10口8質粒？05!18，5111NotI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對步驟O)中的13.Skb大片段回收產物進行去磷酸化處理，反應在含IX熱敏磷酸酶緩衝液的50μ1體系中進行，37°C作用30min，然後65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.7kb小片段NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經去磷酸化酶處理後的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(6)挑取發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(7)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8-FLAG_HGFP。(8)將上步所提取的質粒跑電泳看大小，若無其他汙染，則大小為17.5kp的質粒所對應的發綠色螢光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖19中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒pD5H8-FLAG-HGFP構建正確。挑取其中3個質粒大小正確的克隆測序結果均正確。具體克隆過程見圖10。實施例9質粒pD5H8-GFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒HSP702-GFP。(c)PCR反應體系組分5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上遊弓丨物(10μΜ)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用I-keI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer,30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切後的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質粒pD5H8-HGFP經HceI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ110XBuffer，10yg質粒pD5H8-HGFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖20中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(5)挑取不發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8_GFP。(7)質粒pD5H8-GFP用引物Y-th-gfp_63F5『CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',TH-GFP-R5'CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3'驗證GFP片段及其插入方向。PCR產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳鑑定得到圖M中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒pD5H8-GFP構建正確。(8)將經PCR鑑定的pD5H8-GFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-HGFP。具體克隆過程見圖11。實施例10質粒pD5H8-HIS-GFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒HSP702-GFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8肚作1~(含]\%(12)，1口1dNTP(10mM)，ly1上遊引物(10μM)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用HceI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切後的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質粒pD5H8-HIS-HGFP經HceI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ110父8吐€61~，1(^8質粒？05!18-!115-邢？，2「1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖21中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(5)挑取不發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8_HIS-GFP。(7)質粒pD5H8-HIS-GFP用引物Y_th-gfp_63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3『，TH-GFP-R5『CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3『驗證GFP片段及其插入方向。PCR產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳鑑定得到圖25中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒pD5H8-HIS-GFP構建正確。(8)將經PCR鑑定的pD5H8-HIS-GFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-HIS-HGFP。具體克隆過程見圖12。實施例11質粒pD5H8-GST-GFP構建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒HSP702-GFP。(c)PCR反應體系組分5μ110\8肚作1~(含]\%(12)，1口1dNTP(10mM)，ly1上遊引物(10μM)，1μ1下遊引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用HceI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切後的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質粒pD5H8-GST-HGFP經HceI在37°C酶切10小時，酶切體系為5μ110父8吐€61~，1(^8質粒？05!18-6511-邢？，2「1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收約15.7kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖22中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.7kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(5)挑取不發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8-GST_GFP。(7)質粒pD5H8-GST-GFP用引物Y-th-gfp_63F5『CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3『，TH-GFP-R5『CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3『驗證GFP片段及其插入方向。PCR產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳鑑定得到圖沈中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒pD5H8-GST-GFP構建正確。(8)將經PCR鑑定的pD5H8-GST-GFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-GST-HGFP。具體克隆過程見圖13。實施例12質粒pD5H8-FLAG-GFP構建，其步驟是(9)(a)所用引物為Y_th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點)。(b)所用模板為實驗室構建質粒HSP702-GFP。(c)PCR反應體系組分5μ110XBuffer(含MgC12)，1μ1dNTP(IOmM),1μ1上遊弓丨物(10μΜ)，1μ1下遊弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(e)PCR反應條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用I-keI在37°C酶切2小時，酶切體系為5μ110XBuffer,30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切後的片段HceI-GFP-I-SceI。(10)將質粒pD5H8-FLAG-HGFP經HceI在37°C酶切10小時，酶切體系為5口110\811打61~，1(^8質粒？05!18寸1^6-邢？卩，2口1I-SceI酶，補無菌水至50μ1。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖23中的泳道所示DNA條帶位置。(11)將步驟(1)中回收的750bp小片段I-SceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(12)連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，在含50μg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(13)挑取不發綠色螢光的單個菌落轉入含50μg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(14)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒pD5H8-FLAG_GFP。(15)質粒pD5H8-FLAG-GFP用引物Y_th-gfp_63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3『,TH-GFP-R5'CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3『驗證GFP片段及其插入方向。PCR產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳鑑定得到圖27中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質粒pD5H8-FLAG-GFP構建正確。(16)將經PCR鑑定的pD5H8-FLAG-GFP質粒送往北京華大基因研究中心測序，測序結果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-FLAG-HGFP。具體克隆過程見圖14。實施例13利用一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體構建的gfp四膜蟲表達載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP轉染四膜蟲的步驟是(1)將含有質粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的菌液轉接到含50mlLB(50μg/ml氨苄青黴素)液體培養基的250ml錐形瓶中，在轉速為200rpm的搖床上，37°C培養16小時。(2)用Ε·Z.N.A.Endo-FreePlasmidMiniKit(Omega公司產品)去內毒素質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP，最後用100μ1IOmMρΗ7·5的H印es緩衝液(Sigma公司產品)洗脫回收柱上的質粒。並用Biophotometer分光光度計(Eppendorf公司產品)測定提取的質粒PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP的DNA濃度，確認提取的質粒DNA濃度大於或等於0.4μg/ml，若低於該濃度，則需用3M醋酸鈉加無水乙醇進行共沉澱來富集DNA，提高質粒DNA濃度(具體操作過程參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實驗指南》，黃培堂等譯。2002年8月第三版，北京科學出版社1688-1689。)。(3)四膜蟲的培養。將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)B2086與CU^8株系分別轉接到50mlSPP培養基於250ml的錐形瓶內。在轉速為160rpm的搖床上，30°C培養，直至細胞密度長到3_5XIO5個/ml。SPP培養基配方為1%(質量比)Proteosepeptore(Difco公司產品)，0·1%(質量比)yeastextract(Oxoid公司產品)，0·2%(質量比)glucose(分析純，廣州化學試劑廠產品)，0.003%Ferriccitrate(Sigma公司產品)。Beckman庫爾特細胞計數儀計算細胞密度。(4)四膜蟲的清洗。將50ml四膜蟲轉到50ml離心管內，用水平轉子離心機(湘儀TDZ5-WS多管架自動平衡離心機，本發明中所有四膜蟲細胞的離心均用此離心機)800-1500g在30°C離心2min，倒去上清。用50ml於30°C溫育過的Tris緩衝液清洗四膜蟲2次。(5)四膜蟲的飢餓處理。清洗後向離心管中加入少量IOmMpH7.530°C溫育的Tris緩衝液，輕緩振蕩開沉澱四膜蟲，然後將管內液體及四膜蟲全部轉移到無菌錐形瓶中，並於30°C恆溫水浴靜置2小時後計數，最後用IOmMpH7.530°C溫育的Tris緩衝液調整四膜蟲密度至3XIO5個/ml。(6)不同交配型的四膜蟲配對。將第(5)步中不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲B2086與⑶4按11四膜蟲細胞數目在2L容量的滅菌錐形瓶內混合，使瓶內液體在80IOOml之間。2L錐形瓶置於30°C水浴搖床160rpm振蕩18小時後停止。停止振蕩4小時後，取出0.5ml四膜蟲，計算配對效率。若配對效率在80%以上，有利於提高後續的電穿孔實驗效率。停止振蕩10小時後，取25ml混合的配對四膜蟲於50ml離心管中，800_1500g在30°C離心2min。小心倒去上清，然後加入IOmMpH7.530°C溫育的H印es緩衝液(Sigma公司產品)清洗四膜蟲一次。再次於800-1500g在30°C離心aiiin，棄去上清液，富集四膜蟲至125μ1。(7)質粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP通過電穿孔法進入四膜蟲。將富集的125μ1四膜蟲與50yg相同體積的30°C溫育的質粒HSP702-GFP-pD5H8在滅菌離心管中混勻，並迅速轉移到30°C溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產品)中，然後立即放入電穿孔儀(Bio-Rad公司產品)進行電擊，電擊參數為300V，25μF，50Ω，電擊後的電擊杯於室溫靜置Imin。實施例14轉染後四膜蟲的培養及篩選本發明中的轉染質粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲培養、篩選過程必須無菌操作，四膜蟲的培養、篩選環境為30°C恆溫箱內。具體步驟如下(1)將電擊杯內的四膜蟲用粗口吸管輕緩轉移到30°C溫育的裝有2細1SPP培養基的錐形瓶中，接著在30°C恆溫箱靜置1小時，然後均勻分裝到M孔一次性培養皿中。(2)電擊1216小時後加巴龍黴素(Sigma公司產品)，使每孔內的巴龍黴素濃度達到100μg/ml。(3)電擊後第3天，觀察培養皿內細胞生長情況，取20μ1生長良好的四膜蟲轉移至新的96孔一次性培養皿中，加200μ1SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到200μg/mlο(4)電擊後第4天，取20μ1含巴龍黴素濃度為200μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養皿，加200μ1SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到400μg/ml。(5)電擊後第5天，取20μ1含巴龍黴素濃度為400μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養皿，加200μ1SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到600μg/ml。(6)電擊後第6天，取20μ1含巴龍黴素濃度為600μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養皿，加200μ1SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到800μg/ml。(7)電擊後第7天，取20μ1含巴龍黴素濃度為800μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養皿，加200μ1SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到1000μg/ml。(8)電擊後第8天，在解剖鏡(kiss)下，從含巴龍黴素濃度為1000μg/ml的四膜蟲培養液中，用微毛細吸管(Sigma-Aldrich公司產品)挑取單個四膜蟲到96孔一次性培養皿(CellMar公司產品)中，每孔內含一個四膜蟲細胞和1000μg/ml巴龍黴素的200μ1SPP培養基。(9)單細胞挑選3天後，從96孔一次性培養皿內選取長勢良好的四膜蟲轉移到含有200μ1SPP培養基的96孔一次性培養皿中30°C恆溫培養，保持培養基內巴龍黴素濃度為ΙΟΟΟμg/ml。實施例15WholeCellPCR鑑定轉染質粒pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲。(1)24孔一次性培養皿培養用巴龍黴素篩選至ΙΟΟΟμg/ml的轉染四膜蟲單克隆至對數期。(2)WholeCellPCR驗證、篩選陽性克隆a.收集150_200ul轉染四膜蟲細胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉速離心6-10分鐘或更長，倒掉上清。b.加SO-IOOulIXBufferK(2mMMg2+)到細胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，並轉移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時，99°C變性20分鐘。c.將上述裂解物置於冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgC12(25mM)(Final3mM)，0.5uldNTP(IOuM)，lulY_th-gfp-63F(IOuM)，IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq,0.4ulH2O0PCR條件:condition-M°C2min,94°C30sec,50°Clmin,68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0(3)以Y-th-gfp_63F，Y_th-gfp-64R為引物，能擴增得到約750bp的gfpPCR產物則說明相應的培養皿孔內篩選到的四膜蟲轉染成功，對應四膜蟲含有質粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(鑑定結果如圖28)。實施例16Westernblotting檢測轉染質粒pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜蟲中的GFP蛋白質的表達。(1)將轉染成功的四膜蟲轉接至裝有50mlSPP培養基的錐形瓶中於30°C培養，巴龍黴素濃度為ΙΟΟΟμg/ml。待四膜蟲密度長至3XIO5個/ml，39°C熱激，處理1小時。(2)4"C，1800rpm離心3min，收集細胞。(3)加入PBS，重懸細胞，1800rpm離心5min，棄上清。(4)加入PBS，稀釋細胞至5XIO7個/ml，轉移至1.5ml離心管，超聲破細胞。破細胞參數frequency:22%,Time:60S,Pause:lsecond，lsecond破至菌體懸液由渾濁變為澄清。(5)按比例加入5X蛋白電泳緩衝液，在沸水中煮:3min，離心，取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳。(6)蛋白質電泳完成，將分離膠從玻璃板上取下，於電轉液中平衡半小時，與凝膠同樣大小的NC膜和3mm濾紙按海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結構裝入轉印夾。轉印時凝膠接負極，NC膜接正極。電轉移條件恆壓90V，電轉池。(7)轉印結束，將NC膜至於PBST中洗滌三次，每次5min。(8)將NC膜至於封閉液中封閉l_2h，然後用PBST中洗滌三次，每次5min。(9)將NC膜與適當稀釋的對應第一抗體(GFP抗體、HIS抗體、GST抗體或FLAG抗體)，在37°C反應Ih，然後用PBST中洗滌三次，每次5min。(10)將NC膜與適當稀釋的第二抗體，在37°C反應lh，然後用PBST中洗滌6次，每次5min。(11)將NC膜至於顯色液中顯色5min，用UVP冷光C⑶爆光檢測。免疫印記檢測檢測轉染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達結果如圖四所示。轉染質粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP四膜蟲的westernblotting中用相應的抗體均分別能檢測到約27KD，27KD，52KD，27KD的條帶(見表1)，則說明對應四膜蟲中均有GFP蛋白表達。表1:ffesternblotting檢測結果權利要求1.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HGFP，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-HIS-HGFP，其序列為SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-GST-HGFP，其序列為SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。4.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉基因表達載體PD5H8-FLAG-HGFP，其序列為SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。5.權利要求1至4項所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體，其特徵在於所述的表達載體含有可替代的綠色螢光篩選標記HGFP。6.權利要求1至4項所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體，其特徵在於所述的表達載體的盒式結構HGFP兩側含有反向的HceI稀有酶切位點，一步引入外源基因時用於克隆的外源片段的正反向引物接頭中含有相應的反向互補^ceI酶切位點。7.權利要求1至4任一項所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體的構建方法，其步驟是(1)利用引物Y-TGFP-I-SceI-41F；·5『GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3『Y-TGFP-I-SceI-42R；·5'GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT3'；以質粒THX-HGFP為模板擴增獲得兩端帶HceI識別序列接頭的HGFP片段，並用I-SceI處理；(2)利用引物Y-th-gfp-61F·5『CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3『；Y-th-gfp-62R·5『GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3『；以質粒HSP702-GFP為模板反擴載體，並用HceI處理；(3)連接步驟(1)I-SceI處理的HGFP片段與步驟O)I-SceI處理的載體片段得到重組質粒TH-HGFP；(4)利用M13正反向引物，以TH-HGFP為模板，PCR擴增獲得NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然後NotI處理該PCR片度；(5)將質粒pD5H8經NotI單酶切後，回收單切片段，並用熱敏磷酸酶對該回收片段進行去磷酸化處理；(6)將步驟(4)中NotI處理後的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經去磷酸化酶處理後得到載體連接，得到所述表達載體PD5H8-HGFP。(7)利用引物Y-th-2gfp(his)-69F·5『CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3『Y-th-2gfp(his)-70R.5『CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3『以質粒TH-HGFP為模板反擴載體，並用HindIII處理；(8)將步驟(7)HindIII處理過的的載體片段用連接酶處理，使其自連得到重組質粒TH-HIS-HGFP；(9)利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP為模板，PCR擴增獲得NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然後NotI處理該PCR片度；(10)將步驟(10)中NotI處理後的NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經去磷酸化酶處理後得到載體連接，得到所述表達載體PD5H8-HIS-HGFP；(11)利用引物Y-th-2gfp-(GST)71F.5『CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3『Y-th-2gfp-(GST)72R.5『GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3『以質粒TH-HGFP為模板反擴載體，並用HindIII和BglII雙酶切處理；(12)利用引物Y-GST-73F5'GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3'Y-GST-74R5'CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'以質粒pET23a-GST為模板擴增獲得GST片段，並用HindIII和BglII雙酶切處理；(13)連接步驟(12)HindIII和BglII雙酶切處理後的GST片段與步驟(Il)HindIII和BglII雙酶切處理後的載體片段得到重組質粒TH-GST-HGFP；(14)利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP為模板，PCR擴增獲得NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然後NotI處理該PCR片度；(15)將步驟(14)中NotI處理後的NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經去磷酸化酶處理後得到載體連接，得到所述表達載體PD5H8-GST-HGFP；(16)利用引物Y-FLAG-87F5『GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3『Y-FLAG-88R5『CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3『以質粒ρ⑶NA3.I-FLAG為模板擴增獲得FLAG片段，並用HindIII和BglII雙酶切處理；(17)連接步驟(16)HindIII和BglII雙酶切處理後的FLAG片段與步驟(Il)HindIII和BglII雙酶切處理後的載體片段得到重組質粒TH-FLAG-HGFP；(18)利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP為模板，PCR擴增獲得NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然後NotI處理該PCR片度；(19)將步驟(14)中NotI處理後的NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經去磷酸化酶處理後得到載體連接，得到所述表達載體PD5H8-FLAG-HGFP。8.權利要求1至4任一項所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體在表達外源蛋白GFP中的應用。全文摘要本發明公開了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達載體及構建方法和應用。利用質粒HSP702-GFP和THX-HGFP，通過PCR和酶切連接等方法構建中間載體TH-HGFP；利用質粒TH-HGFP、PET23a-GST和pCDNA3.1-FLAG，通過PCR和酶切連接等方法分別構建中間載體TH-HIS-HGFP、TH-GST-HGFP和TH-FLAG-HGFP；利用上述中間載體分別與質粒pD5H8，通過PCR和酶切連接等方法構建四膜蟲表達載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP。該系列載體均含有綠色螢光篩選標記HGFP，可用於重組子的高通量篩選；該系列載體可替代盒式結構HGFP兩側均含反向的I-SceI稀有酶切位點，引入外源基因時，將帶I-SceI接頭的外源基因片段與用I-SceI處理後的該系列載體一步連接，即可得到含外源基因的四膜蟲表達載體。本發明操作方便快捷，引入外源基因的四膜蟲表達載體轉染四膜蟲後可實現外源基因的高效表達。文檔編號C07K14/435GK102286530SQ20111016265公開日2011年12月21日申請日期2011年6月16日優先權日2011年6月16日發明者繆煒,袁冬霞申請人:中國科學院水生生物研究所