糖元合成酶激酶3的基於吡嗪的抑制劑的製作方法

2023-05-30 22:26:16

專利名稱:糖元合成酶激酶3的基於吡嗪的抑制劑的製作方法
發明領域本發明涉及抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)的吡嗪化合物，和含有這些化合物的藥物組合物，以及該化合物和組合物單獨或聯合其它藥物學上活性的藥劑的用途。本發明提供的化合物和組合物具有在治療由GSK3活性介導的疾病，如糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、肥胖、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血(特別是大腦缺血)、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙，免疫缺陷或癌症等疾病中的實用性。
發明背景糖元合成酶激酶3(GSK3)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，對其已鑑別出了兩種同工型α和β。Woodgett，Trends Biochem Sci.，16177-81(1991)。兩種GSK3同工型在靜止細胞中都具有組成型活性。最初，GSK被鑑定為通過直接磷酸化而抑制糖元合成酶的激酶。在胰島素活化時，GSK3被滅活，從而能夠激活糖元合成酶，並可能還有其它胰島素依賴性的事件，如葡萄糖運輸。後來，已顯示其它生長因子，它們像胰島素一樣，通過受體酪氨酸激酶(RTK)發出信號也滅活GSK3活性。這些信號分子的例子包括IGF-1和EGF。Saito等，Biochem J.，30327-31(1994)；Welsh等，Biochem J.，294625-29(1993)；和Cross等，Biochem J.，30321-26(1994)。
抑制GSK3活性的藥劑在治療由GSK3的活性介導的疾病中是有用的。另外，GSK3的抑制模仿生長因子信號傳遞途徑的活化，因此GSK3抑制劑對治療這些途徑活性不足的疾病是有用的。下文描述了可用GSK3抑制劑治療的疾病的例子。
糖尿病2型糖尿病是老化過程中持續增長的普遍疾病。其最初特徵是對胰島素敏感性的降低，和循環的胰島素濃度的補償性上升，後者是維持正常的血糖水平所必需的。胰腺β細胞的分泌的增加導致了胰島素水平提高，而導致的高胰島素血症是與糖尿病的心血管併發症相關的。隨著胰島素抗性惡化，對胰腺β細胞的要求穩定提高，直到胰腺不再能提供足夠水平的胰島素，導致血糖水平提高。最終，發生明顯的高血糖症和高血脂症，導致與糖尿病有關的破壞性的長期併發症，包括心血管疾病、腎衰竭和失明。尚未了解導致2型糖尿病的確切機制，但該機制導致葡萄糖對骨骼肌的運輸受到損害，肝葡萄糖生產增加，和胰島素應答不充分。膳食改善通常是無效的，因此大多數病人最終需要藥物幹涉，來有效防止和/或減緩疾病併發症的發展。可用一種或多種可購得的口服抗一糖尿病藥劑治療許多病人，包括磺脲，來提高胰島素分泌。磺脲藥物的例子包括抑制肝葡萄糖生產的甲福明，和曲格列酮，一種胰島素敏化藥物。儘管利用這些藥劑，30-40％的糖尿病不能用這些藥物充分控制，而需要皮下胰島素注射。另外，這些治療各有副作用。例如，磺脲能導致低血糖，而曲格列酮能導致嚴重的肝中毒。目前，需要新穎和改良的藥物來治療前驅糖尿病和糖尿病病人。
如上所述，GSK3抑制刺激胰島素依賴性的過程，而且因此在治療2型糖尿病中是有用的。最近用鋰鹽獲得數據提供了支持該觀點的證據。最近已報導鋰離子能抑制GSK3活性。Klein等，PNAS 938455-9(1996)。1924年以來，已報導鋰具有抗糖尿病效果，包括減少血漿葡萄糖水平，提高吸收，加強胰島素，上調葡萄糖合成酶活性和刺激皮膚、肌肉和脂肪細胞中的糖元的合成。然而，在抑制GSK3活性的使用中鋰還未被廣泛接受，可能是因為其文獻記載的對GSK3以外的分子靶的效果。嘌呤類似物5-碘結核菌素(也是GSK3抑制劑)，在大鼠肝細胞中也刺激糖元合成並拮抗胰高血糖素和後葉加壓素對糖元合成酶的滅活。Fluckiger-Isler等，Biochem J，29285-91(1993)；和Massillon等，Biochem J 299123-8(1994)。然而，也已顯示該化合物抑制其它絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶。Massilion等，Biochem J 299123-8(1994)。
阿耳茨海默氏病GSK3也涉及與阿耳茨海默氏病(AD)相關的生物途徑。AD的病理學特徵是澱粉樣前體蛋白(APP)的非正常加工形式的胞外斑，稱為β-澱粉肽(β-AP)，和含有大部分由高磷酸化τ蛋白組成的成對螺旋纖絲的胞內神經纖維纏結的發展。GSK3是已發現的許多在PHFτ特徵性非正常位點上體外磷酸化τ蛋白的激酶之一，而且是已被證明在活細胞和動物體內進行該作用的唯一激酶。Lovestone等，Current Biology 41077-86(1994)；和Brownlees等，Neuroreport 83251-3255(1997)。另外，GSK3激酶抑制劑，LiCl，在細胞中封閉τ高磷酸化。Stambolic等，Current Biology 61664-8(1996)。因此GSK3活性可能對於神經纖維纏結的產生和因此對於疾病的發展作出貢獻。近來已顯示GSK3β和另一種AD發病機理中的關鍵蛋白，早老蛋白1(PS1)有關。Takashima等，PNAS 959637-9641(1998)。PS1基因中的突變導致β-AP產生的增加，但該文作者也證明突變的PS1蛋白與GSK3β結合得更緊密，並且加強τ的磷酸化，其與PS1的相同區域結合。
有趣的是，也已顯示另一種GSK3底物，β一連環蛋白，與PS1結合。Zhong等，Nature 395698-702(1998)。GSK3磷酸化時降解的目標是胞液β-連環蛋白，而降低的β-連環蛋白活性與神經元細胞對β-AP誘導的神經元凋亡敏感性的增加有關。因此，GSK3β和突變PS1增加的締合可說明在PS1突變性AD病人大腦中已觀察到的β一連環蛋白水平的降低，和疾病相關的神經元細胞死亡的增加。與這些觀察一致，顯示注射反義而不是有義GSK3在體外封閉了β-AP對神經元的病理學作用，導致細胞死亡開始延遲24小時，並使1小時的細胞存活率從12提高到35％。Takashima等，PNAS 907789-93(1993)。在這些後來的研究中，胞內GSK3活性的加倍先於細胞死亡作用(施用β-AP3-6小時內)，提示除了提高GSK3與其底物的接近性的遺傳機制外，β-AP確實能提高GSK3活性。通過觀察到GSK3蛋白質表達水平(但就此而言，不是比活性)在AD的突觸後上清液中，比在正常腦組織中增加了50％提供了GSK3對AD的作用的進一步證據。Pei等，J Neuropathol Exp 5670-78(1997)。因此，相信GSK3的特異性抑制劑將對緩解阿耳茨海默氏病的發展起作用。
其它CNS疾病除了鋰鹽對上述疾病的作用，使用鋰鹽治療雙向性精神障礙疾病(躁狂抑鬱症候群)已有很長的歷史。該對鋰的臨床反應可反映GSK3活性和雙向性精神障礙的病源有關，在該情況下GSK3抑制劑將與該指標有關。為了支持該觀點，最近已顯示2-丙基戊酸鹽(valproate)(另一種常用於治療雙向性精神障礙的藥物)也是GSK3抑制劑。Chen等，J.Neurochemistry 721327-1330(1999)。鋰和其它GSK3抑制劑可對治療雙向性精神障礙起作用的一種機制是提高經受反常高水平的，由神經遞質穀氨酸誘導的興奮的神經元的存活率。Nonaka等，PNAS，952642-2647(1998)。還相信穀氨酸誘導的神經元興奮毒性是與急性損傷，如腦缺血、外傷性腦損傷和細菌感染等有關的神經變性的主因。另外，相信過量穀氨酸信號是阿耳茨海默氏病，杭廷頓氏舞蹈病、帕金森氏病、AIDS相關性痴呆、肌萎縮性側索硬化症(AML)和多發性硬化(MS)等疾病中可見的慢性神經元損傷的因子。Thomas，J.Am.Geriatr.Soc 431279-89(1995)。因此相信GSK3抑制劑是對這些疾病和其它神經變性疾病治療是有用的。
免疫加強
GSK3使轉錄因子NF-AT磷酸化，並促進其從核中運出，和鈣調磷酸酶的作用正相反。Beals等，Science 2751930-33(1997)。因此，GSK3通過NF-AT封閉早期免疫應答的基因活化，而且GSK3抑制劑可允許並延長免疫應答的活化。因此，相信GSK抑制劑能延長和加強某些細胞因子的免疫刺激作用，而且這種作用能加強那些用於腫瘤免疫治療或一般用於免疫治療的細胞因子的能力。
其它疾病鋰還有其它生物學上的作用。它在體外和在體內都是造血作用的強刺激劑。Hammond等，Blood 5526-28(1980)。在犬中，碳酸鋰消除了嗜中性白血球減少症的復發，並使其它血細胞計數正常化。Doukas等，Exp Hematol 14215-221(1986)。如果鋰的這些作用是通過GSK3的抑制介導的，則GSK3抑制劑將具有更廣泛的治療用途。
由於GSK3的抑制劑能用於治療許多疾病，新穎GSK3抑制劑的鑑定是非常需要的。
發明簡述現在，已驚人的發現糖元合成酶激酶3(GSK3)活性能在體外或在體內被本發明提供的一些基於吡嗪的衍生物抑制。發現本發明的吡嗪化合物對GSK3具有特異性。因此，本發明提供了用於在體外抑制GSK3活性和在體內治療GSK3介導的疾病的新穎化合物、組合物和方法。在一個方面，本發明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新穎化合物 其中X和Y分別選自氮、氧和可任選取代的碳；A1和A2是可任選取代的芳基或雜芳基；R1、R2、R3和R4分別選自氫、羥基、和可任選取代的低級烷基、環狀低級烷基、烷基氨基烷基、低級烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、芳基和雜芳基；
R1』、R2』、R3』和R4』分別選自氫和可任選取代的低級烷基；R5、R6分別選自氫、羥基、滷素、羧基、硝基、氨基、醯氨基、脒基、亞醯胺基、亞脒基、氰基和取代或未取代的低級烷基、低級烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲醯基、低級烷基羰基、低級烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺醯基、磺醯氨基(sulfonylamino)、亞磺醯氨基(sulfonamido)、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、雜芳基氨基、雜芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、脒基、環烷基、環醯氨基、環硫代醯氨基、環脒基、雜環脒基、環亞醯氨基、雜環亞醯氨基、胍基、氰基胍基、芳基、聯芳基、雜芳基、雜聯芳基、雜環基、雜環烷基、芳基磺醯基和芳基磺醯氨基；和其藥物學上可接受的鹽。
本發明的方法、化合物和組合物可單獨，或與其它藥理學活性劑聯用，可應用在治療GSK3活性介導的疾病，如治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙，免疫缺陷或癌症等。
發明詳述根據本發明，提供了在體外或體內抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)活性的化合物、組合物和方法。在一個方面，本發明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新穎化合物 其中X和Y分別選自氮、氧和可任選取代的碳；A1和A2是可任選取代的芳基或雜芳基；R1、R2、R3和R4分別選自氫、羥基、和可任選取代的低級烷基、環狀低級烷基、烷基氨基烷基、低級烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、芳基和雜芳基；R1』、R2』、R3』和R4』分別選自氫和可任選取代的低級烷基；R5、R6分別選自氫、羥基、滷素、羧基、硝基、氨基、醯氨基、脒基、亞醯胺基、亞脒基、氰基和取代或未取代的低級烷基、低級烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲醯基、低級烷基羰基、低級烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺醯基、磺醯氨基(sulfonylamino)、亞磺醯氨基(sulfonamido)、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、雜芳基氨基、雜芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、脒基、環烷基、環醯氨基、環硫代醯氨基、環脒基、雜環脒基、環亞醯氨基、雜環亞醯氨基、胍基、氰基胍基、芳基、聯芳基、雜芳基、雜聯芳基、雜環基、雜環烷基、芳基磺醯基和芳基磺醯氨基；和其藥物學上可接受的鹽。
在本發明的一個目前的優選例中，X和Y中至少一個是氮。該組的代表性化合物包括其中X和Y之一是氮，而X和Y中另一個是氧或可任選取代的碳的那些化合物。優選X和Y都是氮。
構成部分A1和A2分別可以是具有3-10個環上原子和可任選的一個或多個環上雜原子的芳環。因此在一個實施例中，A1和/或A2可以是任選取代的碳環芳基。另外，A1和/或A2是任選取代的雜芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、吡嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯並噻唑基、苯並吡啶基和苯並咪唑基，其可被至少一個，不多於三個取代基團取代。代表性取代基團可選自例如硝基、氨基、氰基、滷素、硫代醯氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亞脒基、胍基、磺醯氨基、羧基、甲醯基、低級烷基、滷代低級烷基、低級烷氧基、滷代低級烷氧基、低級烷氧基烷基、低級烷基氨基低級烷氧基、低級烷基羰基、低級芳烷基羰基、低級雜芳烷基羰基、烷硫基，氨基烷基和氰基烷基。
在本發明的一個目前特別優選例中，A1和/或A2具有式
其中R8和R9分別選自氫、硝基、氨基、氰基、滷素、硫代醯氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亞脒基、胍基、亞磺醯氨基、羧基、甲醯基、低級烷基、滷代低級烷基、低級烷氧基、滷代低級烷氧基、低級烷氧基烷基、低級烷基氨基低級烷氧基、低級烷基羰基、低級芳烷基羰基、低級雜芳烷基羰基、烷硫基、芳基和芳烷基。最優選的A是選自硝基吡啶基、氨基硝基吡啶基、氰基吡啶基、氰基噻唑基、氨基氰基吡啶基、三氟甲基吡啶基、甲氧基吡啶基、甲氧基硝基吡啶基、甲氧基氰基吡啶基和硝基噻唑基。
在本發明的其它實施例中，R1、R2、R3和R4的至少一個是氫、未取代或取代的低級烷基，選自滷代低級烷基、雜環氨基烷基和低級烷基氨基低級烷基；或低級烷基氨基低級烷基。目前本發明優選例包括其中R1、R2和R3是氫，而R4選自氫、甲基、乙基、氨基乙基、二甲基氨基乙基、吡啶基乙基、哌啶基、吡咯烷基乙基、哌嗪基乙基和嗎啉基乙基的化合物。
目前，本發明的其它優選化合物包括式(I)的化合物，其中R5和R6的至少一個選自取代和未取代的芳基、雜芳基和聯芳基。在目前的優選例中，R5和R6的至少一個是取代或未取代的下式的基團 其中R10、R11、R12、R13和R14分別選自氫、硝基、氨基、氰基、滷素、硫代醯氨基、羧基、羥基和可任選取代的低級烷基、低級烷氧基、低級烷氧基烷基、滷代低級烷基、滷代低級烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷硫基、烷基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、氨基羰基、低級烷基氨基羰基、氨基芳烷基、低級烷基氨基烷基、芳基、雜芳基、環雜烷基、芳烷基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、芳基羰氧基烷基、烷基羰氧基烷基、雜芳基羰氧基烷基、芳烷基羰氧基烷基、和雜芳烷基羰氧基烷基。目前獲得的特別優選的化合物是其中R10、R11R13和R14是氫，而R12是選自滷素、低級烷基、羥基、低級烷氧基、滷代低級烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、嗎啉代基、哌啶基和氰基；R11、R13和R14是氫，而R10和R12分別選自滷素、低級烷基、羥基、低級烷氧基、滷代低級烷基、嗎啉代基、哌啶基和氰基；R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜芳基；R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜環烷基；和其中R10、R11、R12、R13和R14的至少一個是滷素，而R10、R11、R12、R13和R14的剩下基團是氫。優選的，R5和R7中的至少一個選自氯苯基、二氯苯基、氟苯基、二氟苯基、溴苯基、二氯氟苯基、三氟甲基苯基、氯氟苯基、溴氯苯基、溴氟苯基、乙基苯基、甲基氯苯基、乙基氯苯基、咪唑基苯基、氰基苯基、嗎啉代苯基和氰基氯苯基。
在本發明的代表性實施例中，R5和R6可以是芳烷基、羥基烷基、氨基烷基、氨基芳烷基、羰基氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、芳基羰基氨基烷基、芳烷基羰基氨基烷基、氨基烷氧基烷基和芳基氨基烷基等取代烷基；烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳基烷基氨基、芳基羰基氨基、烷硫基羰基氨基、芳基磺醯基氨基、雜芳基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基和雜芳烷基羰基氨基等取代氨基；或未取代或取代的氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基和烷基氨基烷氧基羰基等取代羰基。在其它實施例中，R6可選自脒基、胍基、環醯亞氨基、雜環醯亞氨基、環醯氨基、雜環醯氨基、環硫代醯氨基和雜環低級烷基。在其它優選例中，R6可以是芳基或雜芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、吡咯基吡啶基、苯並噻唑基、苯並吡啶基、苯並三唑基和苯並咪唑基。本文所用的代表性雜環基團包括例如下列所示基團(其中取代基團和其它下文所示的取代基團的結合點，是通過上部的左手鍵)。這些雜環基團可進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性雜芳基基團包括下文所示的那些。這些雜芳基基團可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性環亞醯氨基和雜環醯亞氨基基團包括下文所示的那些。這些環醯亞氨基和雜環醯亞氨基可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性取代脒基和雜環脒基基團包括下文所示的那些。這些取代脒基和雜環脒基基團可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性取代烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、氨基烷氧基羰基氨基和芳基羰基氨基基團包括例如下文所示的那些。這些基團可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性取代氨基羰基基團包括例如下文所示的那些。這些雜環基團可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
代表性取代烷氧基羰基基團包括例如下文所示的那些。這些烷氧基羰基基團可被進一步取代，並可在如對於有機和醫學化學領域的技術人員結合本文公開的內容是明顯的不同位置結合。
目前優選的該組的代表性化合物包括例如{2-[(3-氨基-4-硝基苯基)氨基]乙基}[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]胺、[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]{2-[(4-硝基苯基)氨基]乙基}胺、4-[(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)氨基]苯甲腈、[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]甲基{2-[(4-硝基-苯基)氨基]乙基}胺、N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}-氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]乙醯胺、N-(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)(叔丁氧基)羧醯胺、[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺和N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]-2-(甲基氨基)乙醯胺。
在另一方面，本發明提供了組合物，該組合物含有一定量的式(I)的化合物(該量的化合物當被施用到在人或動物體內時，能有效調節GSK3的活性)和藥物學上可接受的載體。
在另一個實施例中，本發明提供了在人或動物中抑制GSK3活性的方法，包括對人或動物個體施用GSK3抑制量的結構(I)的化合物。
本發明還提供了治療患GSK3介導的疾病的人或動物個體的方法，包括將治療有效量的上式(I)的化合物，單獨或聯合其它治療上活性的藥劑一起施給人或動物個體。
在其它實施例中，本發明提供了用作藥物的如上文限定的式I的化合物，以及在製造用於治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、肥胖、動脈硬化性心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血(特別是腦部缺血)、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌症的藥劑中使用這些化合物的方法。
如上文和本文其它地方所用，下列術語具有如下定義的意義「糖元合成酶激酶3」和「GSK3」可在本文中交替使用，指任何與人GSK3β胺基酸序列(Genbank登錄號L33801)的56和340位之間的胺基酸具有60％以上的序列同源性的蛋白質。為了測定兩條胺基酸序列或兩條核酸之間的同源性百分數，按最佳比較目的排列該序列(如，可在一條多肽或核酸中引入缺口，來與另一條多肽或核酸最佳排列)。然後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當一條序列中的一個位置被另一條序列中對應位置上的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，分子在那一個位置是同源的(即，如本文所用胺基酸或核酸「同源」等價於胺基酸或核酸「等同」)。兩條序列之間的同源性百分數是2條序列共有的相同位置數的函數(即，％同源性＝#相同位置/總#位置x100)。如Woodgett，Trends Biochem Sci.，16177-81(1991)所述(在此引入以供參考)，最初通過其使糖元合成酶磷酸化作用鑑定了GSK3。通過調節GSK3激酶活性，可抑制或可刺激GSK活性的下遊活性。例如，當GSK3活性被抑制時，可活化糖元合成酶，使糖元的生產增加。也知道GSK3能在各種其它環節(包括例如c-jun、β-連接蛋白和τ-蛋白)中作為激酶。可理解，GSK3激酶活性的抑制可在不同的生物學環節中導致各種效果。然而，本發明不受任何本發明運作機制的理論限制。
本文所用的「GSK3抑制劑」指顯示在下文一般描述的對GSK3抑制劑活性的無細胞試驗中測量的，與GSK3相關的IC50不大於約100μM，更典型的不大於約50μM的化合物。「IC50」是將酶(如GSK3)活性降低到最大值一半的水平的抑制劑濃度。已發現，本發明代表性的化合物展示對GSK3的抑制劑活性。本發明的化合物優選展示如在無細胞GSK3激酶試驗中測量得到的，對GSK3的IC50不大於約10μM、更優選不大於5μM，而更優選不大於約1μM，而最優選不大於200nM。
「可任選取代」指用單價或二價基團取代氫。合適的取代基團包括例如羥基、硝基、氨基、亞氨基、氰基、滷素、硫代、硫代醯氨基、脒基、亞脒基、氧代、氨肟基、甲氧肟基、亞脒基、胍基、亞磺醯氨基、羧基、甲醯基、低級烷基、滷代低級烷基、低級烷氧基、滷代低級烷氧基、低級烷氧基烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基等。
取代基團自身可被取代。取代取代基團的基團可以是羧基、滷素、硝基、氨基、氰基、羥基、低級烷基、低級烷氧基、氨基羰基、-SR、硫代醯氨基、-SO3H、-SO2R或環烷基、其中R通常是氫、羥基或低級烷基。
當被取代的取代基包含直鏈基團時，取代可在鏈內(如2-羥基丙基、2-氨基丁基等)或在鏈末端(如2-羥乙基、3-氰基丙基等)發生。被取代的取代基可以是共價鍵合的碳或雜原子的直鏈、支鏈或環狀排列。
本文所用的「低級烷基」指支鏈或直鏈烷基基團，包含1到10個未取代或取代(如用1個或多個滷素、羥基或其它基團，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、三氟甲基、五氟乙基等)的碳原子。
「亞烷基」指具有1到20個碳原子的二價直鏈或支鏈飽和脂族基團。本發明化合物中使用的典型亞烷基基團是低級亞烷基基團(在骨架中具有1到約6個碳原子)。本文的「烯基」指具有1個或多個雙鍵和2到20個碳原子的直鏈、支鏈或環狀基團。本文的「炔基」指具有1或多個三鍵和2到20個碳原子的直鏈、支鏈或環狀基團。
本文所用的「低級烷氧基」指RO-，其中R是低級烷基。低級烷氧基的代表例包括甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、三氟甲氧基等。
「環烷基」指單一或多環、雜環或碳環烷基取代基。典型環烷基取代基具有3到8個骨架(即環)原子，其中各骨架原子是碳或雜原子。本文的術語「雜環烷基」指在環結構中具有1到5、更典型是1到4個雜原子的環烷基取代基。本發明化合物中使用的合適雜原子是氮、氧和硫。代表性雜環烷基基團包括嗎啉代、哌嗪基、哌啶基(Piperadinyl)等。碳環烷基基團是環烷基基團，其中所有的環上原子都是碳。當與環烷基取代基聯用時，術語「多環」在本文中指稠合或非稠合的烷基環狀結構。
本文的「滷素」指滷素基團，如氟、氯、溴或碘。「滷代烷基」指被一個或多個滷素原子取代的烷基基團。術語「滷代低級烷基」指被一個或多個滷素原子取代的低級烷基基團。術語「滷代烷氧基」指被一個或多個滷素原子取代的烷氧基基團。術語「滷代低級烷氧基」指被一個或多個滷素原子取代的低級烷氧基基團。
「芳基」指具有3到14個骨架碳或雜原子的單環和多環芳族基團，同時包括碳環芳族基團和雜環芳族基團。碳環芳基是芳環中的所有成環原子都是碳的芳基。本文術語「雜芳基」指具有1到4個在芳族環中作為環上原子的雜原子，而剩下的環上原子是碳原子的芳基。當與芳基取代基聯用時，本文的術語「多環」指稠合和非稠合的環狀結構，其中至少一個環狀結構是芳族的，如苯並二噁唑基(具有與苯基稠合的雜環，即
)萘基等。本發明化合物中用作取代基的示範性芳基基團包括苯基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯並噻唑基、苯並吡啶基和苯並咪唑基等。
「芳烷基」指被芳基取代的烷基基團。通常，本發明化合物中使用的芳烷基基團具有結合在芳烷基基團的烷基部分的1到6個碳原子。本發明化合物中使用的合適芳烷基包括例如苄基、甲基吡啶基等。
本文的「氨基」指-NH2基團。本文術語「烷基氨基」指-NRR』基團，其中R和R』分別是選自氫或低級烷基。本文術語「芳基氨基」指-NRR』基團，其中R是芳基而R』是氫、低級烷基或芳基。本文的術語「芳烷基氨基」指-NRR』基團，其中R是低級芳烷基，而R』是氫、低級烷基、芳基、或低級芳烷基。
本文的術語「芳基環烷基氨基」指芳基-環烷基-NH-基團，其中環烷基是二價環烷基基團。通常，環烷基具有3到6個骨架原子，其中可任選1到約4個為雜原子。術語「氨基烷基」指末端被氨基取代的烷基基團。
術語「烷氧基烷基」指-烷基1-O-烷基2基團，其中烷基1指亞烷基或鏈烯基，而烷基2是烷基或鏈烯基。術語「低級烷氧基烷基」指烷氧基烷基，其中烷基1是低級亞烷基或低級鏈烯基，而烷基2是低級烷基或低級鏈烯基。術語「芳氧基烷基」指-亞烷基-O-芳基基團。術語「芳烷氧基烷基」指-亞烷基-O-芳烷基基團，其中芳烷基是低級芳烷基。
本文的術語「烷氧基烷基氨基」指-NR-(烷氧基烷基)基團，其中R通常是氫、低級芳烷基或低級烷基。本文的術語「氨基低級烷氧基烷基」指氨基烷氧基烷基，其中烷氧基烷基是低級烷氧基烷基。
本文的術語「氨基羰基」指-C(O)-NH2基團。本文的術語「取代的氨基羰基」指-C(O)-NRR』基團，其中R是低級烷基，而R』是氫或低級烷基。本文的術語「芳基氨基羰基」指-C(O)-NRR』基團，其中R是芳基而R』是氫、低級烷基或芳基。本文的「芳烷基氨基羰基」指-C(O)-NRR』基團，其中R是低級芳烷基，而R』是氫、低級烷基、芳基或低級芳烷基。
本文的「氨基磺醯基」指-S(O)2-NH2基團。本文的「取代的氨基磺醯基」指-S(O)2-NRR』基團，其中R是低級烷基，而R』是氫或低級烷基。本文的術語「芳烷基氨基磺醯基芳基」指-芳基-S(O)2-NH-芳烷基基團，其中芳烷基是低級芳烷基。
「羰基」指二價-C(O)-基團。
「羰氧基」一般指-C(O)-O-基團，這些基團包括酯-C(O)-O-R，其中R是低級烷基、環烷基、芳基或低級芳烷基。本文的術語「羰氧基環烷基」一般同時指「羰氧基碳環烷基」和「羰氧基雜環烷基」，即，其中R分別是碳環烷基或雜環烷基。本文的術語「芳基羰氧基」指-C(O)-O-芳基基團，其中芳基是單-或多環，碳環芳基或雜環芳基。本文的術語「芳烷基羰氧基」指-C(O)-O-芳烷基基團，其中芳烷基是低級芳烷基。
本文的術語「磺醯基」指-SO2-基團。「烷基磺醯基」指結構為-SO2R-的取代的磺醯基，其中R是烷基。本發明化合物中使用的烷基磺醯基基團通常是低級烷基磺醯基基團，在其骨架結構中具有1到6個碳原子。因此，本發明化合物中使用的典型烷基磺醯基基團包括例如甲基磺醯基(即，R是甲基)，乙基磺醯基(即，其中R是乙基)，丙基磺醯基(即，其中R是丙基)等。本文的術語「芳基磺醯基」指-SO2-芳基基團。本文的術語「芳烷基磺醯基」指-SO2-芳烷基基團，其中芳烷基是低級芳烷基。本文的術語「磺醯氨基」指-SO2NH2。
本文所用的術語「羰基氨基」指二價-NH-C(O)-基團，其中羰基氨基基團的醯胺氮的氫原子可被低級烷基、芳基或低級芳烷基基團取代。這些基團包括氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-R)和醯胺-NH-C(O)-NR』-R，其中R和R』是直鏈或支鏈低級烷基，環烷基、或芳基、或低級芳烷基。術語「低級烷基羰基氨基」指烷基羰基氨基，其中R是在骨架結構中具有1到6個碳原子的低級烷基。術語「芳基羰基氨基」指-NH-C(O)-R基團，其中R是芳基。相似的，術語「芳烷基羰基氨基」指羰基氨基，其中R是低級芳烷基。
本文所用的術語「胍基(guanidino)」或「胍基(guanidyl)」指衍生自胍H2N-C(＝NH)-NH2的基團。這些基團包括鍵合在帶有形式雙鍵的氮原子上的(胍的「2」一位，如二氨基亞甲基氨基，(H2N)2C＝NH-))和鍵合在帶有形式單鍵的各氮原子上的(胍的「1-」位和/或「3-」位，如H2N-C(＝NH)-NH-)。任一這些氮原子上的氫原子可被合適的取代基，如低級烷基、芳基、或低級芳烷基取代。
本文所用的術語「脒基」指基團R-C(＝N)-NR』(基團在「N1」氮上)和R(NR』)C＝N-(基團在「N2」氮上)，其中R和R』可以是氫、低級烷基、芳基、或低級芳烷基。
可用本文所述的方法，或其它本領域熟知的方法輕易合成本發明的化合物。
可用已知方法，如層析、結晶等純化本發明的GSK3抑制劑化合物。
和至少一種其它激酶比較，本發明的化合物優選展現對GSK3相對充分選擇性的抑制劑活性。本文所用的術語「選擇性」指和至少一種其它激酶比較，更高的對GSK3的抑制性。優選本發明的GSK3抑制劑與其它兩類激酶比較，對GSK3是選擇性的。對GSK3以外的其它激酶的激酶活性試驗是公知的。見Havlicek等，J.Med.Chem.，40408-12(1997)，在此引入以供參考。可根據下式定量GSK3選擇性GSK3選擇性＝IC50(其它激酶)÷IC50(GSK3)，其中當IC50(其它激酶)＞IC50(GSK3)時，GSK3抑制劑對GSK3是選擇性的。因此，對GSK3有選擇性的GSK3抑制劑展示的GSK3選擇性比對GSK3以外的其它激酶的抑制性的選擇性大1倍以上。在本文中，術語「其它激酶」指GSK3以外的激酶。這種選擇性通常用實施例20中所述的無細胞試驗測量。
通常，本發明的GSK3抑制劑對GSK3比對其它激酶展示至少約2倍(即IC50(其它激酶)÷IC50(GSK3))以上的選擇性，而更典型的是它們至少展示約5倍的選擇性。通常，本發明的GSK3抑制劑展示的對GSK3的選擇性，是至少一種其它激酶的至少約10倍，理想的至少約100倍，而更優選的，至少約1000倍。
可用本文所述的試驗，以及本領域普通技術人員公知的試驗輕易的檢測出GSK3抑制劑活性。鑑定GSK3特異性抑制劑的示範性方法包括無細胞和基於細胞的GSK3激酶試驗。無細胞GSK3激酶試驗檢測通過與多肽GSK3直接相互作用起作用的抑制劑，而基於細胞的GSK3激酶試驗可鑑定通過與GSK自身直接相互作用，或幹擾GSK3表達或幹擾產生成熟活性GSK3的轉錄後加工起作用的抑制劑。
一般，無細胞GSK3激酶試驗可容易地通過下列步驟進行(1)將GSK3與肽底物、放射性標記的ATP(如γ33P-或γ32P-ATP，兩者都購自Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)、鎂離子、和可任選的一種或多種候選抑制劑一起培育；(2)將混合物培育一段時間，使放射性標記的磷酸通過GSK3活性摻入肽底物中；(3)將全部或部分酶反應混合物轉移到另一個容器中，一般是微量滴定孔中，其含有均一量的捕獲配體，它結合到在肽底物上的錨定配體上；(4)洗滌，以除去未反應的放射性標記ATP；然後(5)對留在各孔中的33P或32P定量。該量代表摻入肽底物的放射性標記磷酸的量。抑制作用被觀察為摻入肽底物的放射性標記的減少。
用於無細胞試驗的合適肽底物可以是任何肽、多肽或合成的肽衍生物，其在適量ATP存在下可被GSK3磷酸化。合適的肽底物可基於GSK3的各種天然蛋白底物序列的部分，而且還可含有N-末端或C-末端修飾或延伸，包括間隔序列和錨定配體。因此，肽底物可置於較大的多肽中，或可是為GSK3磷酸化而設計的孤立的肽。
例如，可基於DNA結合蛋白CREB的亞序列，如Wang等，Anal.Chem.，220397-402(1994)(在此引入以供參考)中所述的CREB DNA結合蛋白中的SGSG-連接的CREB肽序列，來設計肽底物。在Wang等報導的試驗中，CREB肽SXXXS基元的C-末端絲氨酸是可被cAMP-依賴典型蛋白激酶(PKA)酶促預磷酸化的，這是一個使基元N-末端絲氨酸能被GSK3磷酸化的步驟。或者，可用修飾的CREB肽底物(其具有同樣的SXXXS基元，而且也含有N-末端錨定配體，但其合成時C-末端絲氨酸是被預磷酸化的(這樣的底物可從Chiron Technologies PTY Ltd.，Clayton，Australia商業購得))。當肽合成時，在SXXXS基元中第二個絲氨酸的磷酸化免除了對作為獨立步驟的，用PKA酶促磷酸化該殘基的需要，而且錨定配體的摻入促進了在其與GSK3反應後肽底物的捕獲。
一般，用於激酶活性試驗的肽底物可含有一個或多個可被GSK3磷酸化的位點，和一個或多個可被其它激酶，但不被GSK3磷酸化的位點。因此，這些其它位點可被預磷酸化，來產生可被GSK3磷酸化的基元。本文的術語「預磷酸化」指在用底物肽進行激酶試驗之前，用非放射性標記的磷酸磷酸化底物肽。在肽底物合成中，可方便的進行這種預磷酸化。
SGSG-連接的CREB肽可與錨定配體(如生物素)連接，其中P和Y之間靠近C末端的絲氨酸被預磷酸化。本文所用的術語「錨定配體」指可與肽底物結合，使肽底物易於被捕獲配體捕獲的配體，它能在洗滌步驟中固定肽底物，從而能除去未反應的放射性標記的ATP。示範性錨定配體是生物素。本文的術語「捕獲配體」指能以高親和力結合錨定配體的分子，其與固體結構結合。結合捕獲載體的例子包括例如抗生素蛋白或抗生蛋白鏈菌素塗布的微量滴定孔或瓊脂糖珠。帶有捕獲配體的珠還可以與閃爍材料聯合，來提供檢測捕獲到的放射性標記的底物肽的工具，或可在以後步驟中將閃爍材料加到捕獲的肽中。
用已知方法可在閃爍計數器中定量捕獲到的放射性肽底物。如果酶反應在僅有限部分(如少於20％)肽底物被磷酸化的條件下進行，在閃爍計數器中檢測到的信號將與GSK3的活性成正比。如果在反應中存在抑制劑，GSK3活性將降低，因此摻入肽底物的放射性標記的磷酸量將變少。因此，將檢測到較低的閃爍信號。結果，GSK3抑制劑活性將作為閃爍信號，與陰性對照(在反應中不存在抑制劑)比較的降低被檢測出來。下文實施例16中更詳細描述了該試驗。
基於細胞的GSK3激酶活性測試通常利用能同時表達GSK3和GSK3底物的細胞，如用編碼GSK3及其底物的基因，包括表達該基因的調控序列轉化的細胞。為了實施基於細胞的試驗，在本發明化合物存在下培育能表達這些基因的細胞。細胞被裂解，通過觀察其相對於未磷酸化形式在SDS PAGE上的泳動性，或通過測定對底物的磷酸化形式特異性的抗體識別的底物量來測定磷酸化形式的底物比例。底物磷酸化的量是化合物抑制劑活性的指標，即，作為與不存在抑制劑下進行的試驗比較，磷酸化的減少檢測了抑制作用。在基於細胞的試驗中檢測到的GSK3抑制活性可以是由於GSK3表達的抑制，或通過對GSK3激酶活性的抑制。
因此，基於細胞的試驗還可用來具體測試與GSK3抑制有關的活性，如τ蛋白磷酸化的抑制、胰島素信號的加強等。例如，為了評估GSK3抑制劑抑制阿耳茨海默氏病類微管相關蛋白τ的磷酸化，可用人GSK3β和人τ蛋白共轉染細胞，然後與一種或多種候選抑制劑一起培育。對於這類試驗可用各種哺乳動物細胞系和表達載體。例如，可同時用人GSK3β表達質粒(根據Stambolic等，1996，CurrentBiology，61664-68中所述的方案(在此引入以供參考))和含有在SV40早啟動子下的人τ蛋白編碼序列的表達質粒，如pSG5轉染COS細胞。還可見Goedert等，EMBO J，8393-399(1989)，在此引入以供參考。可用特異性抗體，如AT8，其可從Polymedco Inc.(Cortlandt Manor，New York)購得，在裂解細胞後容易的檢測出τ的阿耳茨海默氏病類磷酸化。該下文實施例中更詳細描述了該試驗。
類似的，GSK3抑制劑化合物通過活化糖元合成酶加強胰島素信號的活性可容易的用基於細胞的糖元合成酶活性試驗來確定。該試驗使用通過提高糖元合成酶活性，來響應胰島素刺激的細胞，如CHO-HIRC細胞系，其過度表達野生型胰島素受體(～100,000結合位點/細胞)。可如Moller等，J Biol.Chem.，26514979-14985(1990)和Moller等，Mol.Endocrinol.，41183-1191(1990)(兩者都在此引入以供參考)所述產生CHO-HIRC細胞系。試驗可通過在培養基中存在各種濃度的本發明化合物的條件下，培育血清-飢餓的CHO-HIRC細胞來進行，然後在培育期終點裂解細胞。如Thomas等，Anal.Biochem.，25486-499(1968)所述，在裂解液中檢測到糖元合成酶活性。對各樣品作為最大糖元合成酶活性的百分數，計算糖元合成酶活性，如Thomas等，同上所述，並作為候選GSK3抑制劑濃度的函數作圖。可用本領域一般技術人員熟知的常規擬合方法擬合一條四參數S形曲線，來計算將糖元合成酶活性提高到其最高水平一半(即，EC50)的候選GSK3抑制劑濃度。這在下文實施例17中更詳細的描述。
用本領域一般技術人員熟知的方法可輕易的篩選GSK3抑制劑的體內活性。例如，可通過檢測在2型糖尿病動物模型中提高葡萄糖耐受性的能力來方便的鑑定在2型糖尿病治療中具有加強的治療活性的候選化合物。特別是，可在糖尿病小鼠(如KK、db/db、ob/ob)或糖尿病大鼠(如Zucker Fa/Fa或GK)中施用葡萄糖丸前，用數種途徑之任一施給候選化合物。施用候選化合物和葡萄糖後，在預定時間間隔取血，並評估血清葡萄糖和胰島素水平。在不存在內源胰島素分泌水平的升高的情況下，葡萄糖處理的改善可看作胰島素敏化和可指示化合物效力。下文實施例中更詳細描述了該試驗。
可以衍生自無機或有機酸的鹽形式使用本發明的化合物。這些鹽包括但不限於下列乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、環戊烷丙酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)、果膠酸鹽(pectinate)、硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。含氮基團還可用低級烷基滷化物(如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘化物)；硫酸二烷酯(如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯)；長鏈滷化物(如癸基、十二烷基、肉豆蔻基和十八烷基氯、溴和碘化物)；芳烷基滷化物(如苄基和苯乙基溴化物)等試劑季銨化。從而獲得可溶或可分散於水或油的產物。
可用來形成藥物學上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括鹽酸、硫酸和磷酸等無機酸，和草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸等有機酸。可在式(I)的化合物最後分離和純化中原位製備鹼加成鹽，或獨立的通過使羧酸分子與合適的鹼，如藥物學上可接受的金屬陽離子或銨的氫氧化物、羧酸鹽或羧酸氫鹽，或有機的伯、仲或叔胺反應。藥物學上可接受的鹽包括但不限於基於鹼金屬和鹼土金屬的陽離子，如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、鋁鹽等，以及無毒的銨鹽、季銨鹽和胺陽離子，包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙胺、乙胺等。其它可用來形成鹼加成鹽的代表性有機胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
可用各種途徑，包括腸內、腸道外和外用途徑施藥來施用本發明的化合物。例如，施藥的合適模式包括經口腔、皮下、透皮、經黏膜、電離子透入、靜脈內、肌肉內、腹腔內、鼻內、硬膜下、直腸等。
根據本發明的其它實施例，提供了一種含有本發明的GSK3抑制劑化合物和藥物學上可接受的載體或賦形劑的組合物。
合適的藥物學上可接受的賦形劑包括加工劑和藥物傳遞調節劑和增強劑，如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、單糖、二糖、澱粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、羥基丙基-β-環糊精、聚乙烯基吡咯烷酮、低熔點蠟、離子交換樹脂等，以及其中兩種或多種的聯合體。在「Remingtong’sPharmaceutical Science」Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，在此引入以供參考。
含有本發明GSK3抑制劑化合物的藥物組合物可以是任何適於預期施藥方法的形式，包括例如溶液、懸液或乳液等。通常在製備溶液、懸液和乳液中使用液相載體。考慮在本發明的實施中使用的液相載體包括例如水、鹽水、藥物學上可接受的有機溶劑，藥物學上可接受的油或脂等，以及其中兩種或更多種的混合物。液相載體可含有其它合適的藥物學上可接受的添加劑，如增溶劑、乳化劑、營養素、緩衝液、防腐劑、懸浮劑、增稠劑、粘度調節劑、穩定劑等。合適的有機溶劑包括單羥基醇(如乙醇)，和多羥基醇(如二醇)。合適的油包括例如大豆油、椰子油、橄欖油、紅花油、棉籽油等。對於腸道外施藥，載體還可以是油性酯(如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯等)。本發明的組合物也可以是微粒、微膠囊、脂質體包裹物等，和其中兩種或多種的聯合體的形式。
可經口、胃腸外、舌下、動脈內、頰內，通過吸入噴劑、直腸或外用給藥，以含有所需的常規無毒性的藥物學上可接受的載體、佐劑和賦形劑的配成劑量單位的形式來施用本發明的化合物。外用也包括透皮施藥(如透皮貼片或電離子透入裝置)。本文所用的術語胃腸外包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、胸骨內注射或輸液技術。
可注射的製劑(如無菌可注射水性或油質懸液)可根據已知技術，用合適的分散或溼潤劑、或懸浮劑配製。無菌可注射製劑還可以是在無毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，如1，3-丙二醇中的溶液。在可使用的可接受的載體和溶劑中有水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，常規使用無菌的不揮發性油作為溶劑或懸浮基質。為了該目的，可使用任何無刺激性的不揮發性油，包括合成的單-或二甘油酯。另外，油酸等脂肪酸可用於製備可注射物中。
藥物直腸內施用的栓劑可通過將藥物與合適的無刺激性賦形劑(如椰子油脂和聚乙二醇)混合來製備。該賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，而且將因此在直腸中融化並釋放藥物。
口腔施藥的固體劑量形式可包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒。在這些固體劑量形式中，可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑(如蔗糖、乳糖或澱粉)混合。這些劑量形式還可包括(如正常實施中所用的)，除惰性稀釋劑以外的額外物質，如硬脂酸鎂等潤滑劑。就膠囊、片劑和丸劑而言，劑量形式還可含有緩衝劑。還可用腸衣製備片劑和丸劑。
口腔施藥的液體劑量形式可包括藥物學上可接受的含有本領域常用的惰性稀釋劑(如水)的乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑。這些組合物還可含有佐劑(如溼潤劑、乳化劑和懸浮劑、環糊精和甜味劑、調味劑和加香劑。
根據其它實施例，本發明提供了在人或動物體內抑制GSK3活性的方法，所述方法包含施給個體一定量的具有結構(I)、(IV)或(V)的GSK3抑制劑化合物(或含有這些化合物的組合物)，其量在該個體內能有效抑制GSK3活性。其它實施例提供了治療細胞或在人或動物體內治療GSK3-介導的疾病的方法，包含施給細胞或人或動物一定量的本發明的化合物或組合物，其量在該細胞或個體內能有效抑制GSK3的活性。優選個體是人或非人動物個體。GSK3活性的抑制包括與對照比較或與所期望的GSK3活性比較，GSK3活性可檢測的抑制。
本發明化合物的有效量一般包括通過任何本文所述試驗，通過本領域一般技術人員已知的其它GSK3激酶活性試驗，或通過檢測在患GSK3-介導疾病的個體內症狀的減輕，檢測到的任何足夠引起抑制GSK3活性的量。
根據本發明可治療的GSK3-介導的疾病包括任何生物學或醫學疾病，其中涉及GSK3活性，或其中GSK3的抑制加強了信號通過一途徑傳遞，而這是要治療的疾病的特徵性缺陷。異常GSK3活性可以是該情況或疾病的原因或特徵。代表性GSK3-介導的疾病包括2型糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、肥胖、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、特別腦部缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌症等。
根據本發明，對個體的成功治療可導致患醫學或生物學疾病的個體體內症狀減輕或緩和，如，疾病進一步進展停止，或疾病被預防。因此例如，對糖尿病的治療可使病人中葡萄糖或HbA1c水平下降。類似的，對阿耳茨海默氏病的治療可導致通過測量痴呆增強速率的下降，而檢測到疾病發展速率的減緩。
可聯合載體材料來產生單劑形式的活性組分量將根據治療的宿主和具體施藥模式而變化。然而可理解，任何具體病人的特定劑量水平將根據各種因素，包括使用的特定化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、施藥時間、施藥途徑、排洩率、藥物配伍和經受治療的具體疾病的嚴重程度而定。對於給定情況的治療有效量可輕易的由常規實驗測定，並在普通技術人員的技能和判斷能力的範圍內。
對於本發明，治療有效量一般將是約0.1mg/kg/日到100mg/kg/日，優選約1mg/kg/日到約20mg/kg/日，和最優選的約2mg/kg/日到約10mg/kg/日本發明的GSK3抑制劑化合物，其可用單劑或多劑施用。
還可用脂質體的形式施用本發明的化合物。如本領域已知的，脂質體一般是衍生自磷脂或其它脂類物質。脂質體是由分散在水基質中的單-或多層水合液狀晶體形成的。可用任何無毒性的，生理學上可接受的，並且是可代謝的能形成脂質體的脂類。脂質體形式的本組合物除了本發明的化合物以外，還可含有穩定劑、防腐劑、賦形劑等。優選脂類是磷脂和磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，天然和合成的均可。形成脂質體的方法是本領域已知的。見例如，Prescott編，細胞生物學方法，卷XIV，Academic Press，New York，N.W.，p.33以及下列等等(1976)。
雖然本發明的化合物可作為單一的活性藥物學試劑施用，它們也可與一種或多種在治療疾病中使用的其它藥劑聯用。對於治療2型糖尿病，代表性的可與本發明的化合物聯用的藥劑包括胰島素、曲格列酮、羅格列酮(rosiglitazone)、匹格列酮、格列甲嗪、甲福明、阿卡波糖等。對於治療阿耳茨海默氏病，代表性的可與本發明的化合物聯用的藥劑包括donepezil、他克林等。對於治療雙向性精神障礙，代表性的可與本發明的化合物聯用的藥劑包括鋰鹽、2-丙基戊酸鈉、卡巴米嗪等。對於治療中風，代表性的可與本發明的化合物聯用的藥劑包括組織血纖維蛋白溶酶原激活劑。
當其它活性試劑與本發明化合物聯用時，一般如PHYSICIANS』DESKREFERENCE(PDR)53rd版(1999)(在此引入以供參考)使用這些額外的活性試劑，或這些治療上有用的量是本領域一般技術人員已知的。
可以推薦的最大臨床劑量或以較低的劑量施用本發明的化合物和其它治療上的活性藥劑。本發明組合物中活性化合物的水平是可變的，因此可根據施藥途徑、疾病嚴重程度和病人的反應獲得所要的治療反應。可將聯合體作為獨立組合物或作為含有這些藥劑的單劑施用。當作為聯合體施用時，可將治療劑配製成獨立的、在相同時間或不同時間施給的組合物，或治療劑可作為單一組合物給藥。
聯繫下列代表例，可更好的理解本發明的前述和其它部分。
實施例實施例1實施例1表徵和純化方法通過高效液相層析(HPLC)，用帶有2690分離模塊的Waters Millennium層析系統(Milford，Massachusetts)確定了本發明化合物的特徵。分析柱是來自Alltech的Alltima C-18反相柱，4.6×250mm(Deerfield，Illinois)。使用梯度洗脫，通常用5％乙腈/95％水開始，並在40分鐘內進行到100％乙腈。所有溶劑均含有0.1％的三氟乙酸(TFA)。通過在220或254納米處的紫外光(UV)吸收檢測化合物。HPLC溶劑來自Burdick and Jackson(Muskegan，Michigan)，或fisherScientific(Pittsburgh，Pennsylvania)。在一些情況下，通過薄層層析(TLC)，使用襯有玻璃或塑料的矽膠板，如Baker-Flex Silica Gel 1B2-F可彎曲片評估了純度。可在紫外光下目測TLC結果，或使用熟知的碘蒸汽和其它各種染色技術。
在Fisons VG Electrospray Mass Spectrometer上進行質譜分析。作為質子化的母離子報導了所有的質量。
用Varian 300MHz NMR(Palo Alto，California)進行了核磁共振分析。光譜參照是TMS或已知的溶劑化學位移。在提高的溫度(即，75℃)下分析一些化合物樣品，來促使樣品溶解度提高。
可用元素分析(Desert Analytics，Tucson，Arizona)來評估本發明的一些化合物的純度。
在Laboratory Devices Mel-Temp apparatus(Holliston，Massachusetts)上測定了熔點。
用Flash 40層析系統和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，Virginia)、Chromatotron徑向色譜裝置(Harrison Research，Palo Alto，California)、或通過HPLC使用-18反相柱進行製備性分離。通常使用的溶劑是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯和三乙胺。
實施例23，5-二溴吡嗪-2-基胺的合成 將11.2毫升溴的38毫升乙酸溶液在15℃一邊攪拌一邊緩慢加到2-氨基吡嗪(9.5克，100毫摩爾)和三水合乙酸鈉(32.6克)的150毫升乙酸溶液中。加入需要約1-2小時，在暗處進行。室溫下將混合物攪拌過夜。真空濃縮溶液，將棕色粘性殘餘物一邊攪拌一邊倒入冰水(150毫升)中。加入20％氫氧化鈉水溶液，獲得pH8，用乙酸乙酯(4×75毫升)萃取。合併的有機層用水(2×50毫升)和鹽水(1×50毫升)洗滌，乾燥並濃縮。柱層析(2∶1己烷和乙酸乙酯)純化粗產物，得到所需化合物。
HPLC8.7分鐘(98％純)；MS:MH+＝251.8C4H3Br2N3＝250.8g/mol實施例33-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基胺的合成 在二溴吡嗪胺(1克，3.95毫摩爾)的苯(25毫升)溶液中加入Pd(PPh3)4(230毫克，0.02毫摩爾)、碳酸鈉(840毫克，7.9毫摩爾)在4毫升水中的溶液和二氯苯基硼酸(830毫克，4.3毫摩爾)在1毫升乙醇中的溶液。劇烈振搖回流混合物過夜。濃縮溶液，吸收入乙酸乙酯(50毫升)和水(20毫升)中。分離有機層，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水層。用水(1×25毫升)和鹽水(1×30毫升)洗滌合併的有機物，乾燥並濃縮。柱層析(4∶1己烷和乙酸乙酯)純化粗產物，得到所需的作為唯一異構體的化合物。
HPLC13.6分鐘(98％純)；MS:MH+＝317.9C10H6BrCl2N3＝316.9g/mol實施例4(1Z)-1-氮雜-1-[3-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基]-2-甲基-2-硫雜丙-1-烯的合成
在二甲亞碸(1.6毫升，22.3毫摩爾)的無水二氯甲烷(16毫升)溶液中，-78℃在氮氣下滴加三氟甲磺酸酐(3.6毫升，20.8毫摩爾)，形成白色沉澱。在其中加入溴化氨基吡嗪(4.7克，14.9毫摩爾)的二氯甲烷(30毫升)和二甲基亞碸(15毫升)的溶液，將得到的溶液溫至室溫，攪拌1小時。用1N氫氧化鈉淬滅反應混合物，在0℃攪拌15分鐘。用二氯甲烷(3×30ml)萃取溶液，並用水(2×30ml)、鹽水(30ml)洗滌有機層，乾燥並濃縮。
實施例53-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪的合成 在硫亞胺的二氯甲烷(15毫升)溶液中在0℃加入間-氯過苯甲酸(5.1克，29.8毫摩爾)的15毫升二氯甲烷溶液。室溫攪拌混合物2小時，然後加入2毫升二甲硫，攪拌另10分鐘。快速過濾溶液，得到亞硝基衍生物的澄清溶液。將該溶液冷至0℃，冒泡通臭氧20分鐘，用飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌得到的溶液，乾燥，濃縮並用柱層析純化，得到硝基化合物。
HPLC15.2分鐘(88％純)；MS:MH+＝347.7 C10H4BrCl2＝346.9g/mol實施例6N6-(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)-3-硝基吡啶-2，6-二胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))胺(12.3毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。80℃攪拌反應混合12小時。真空濃縮粗混合物，進行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態的標題化合物。
HPLC13.0分鐘(99％純)；MS:MH+＝465.2 C17H14Cl2N8O4＝464.0g/mol實施例7N-[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]-N』-(5-硝基吡啶-2-基)乙烷-1，2-二胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(5-硝基(2-吡啶基))胺(11.3毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。80℃攪拌反應混合物12小時。真空濃縮粗混合物，進行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態標題化合物。
HPLC14.0分鐘(99％純)；MS:MH+＝450.9 C17H13Cl2N7O4＝449.0g/mol實施例86-[(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)氨基]吡啶基-3-腈的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入6-[(2-氨基乙基)氨基]吡啶-3-腈(10.0毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。反應混合物在80℃攪拌12小時。真空濃縮粗混合物，進行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)得到淡黃色固態標題化合物。
HPLC12.9分鐘(90％純)；MS:MH+＝430.2 C18H13Cl2N7O2＝429.0g/mol實施例9
N-[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]-N-甲基-N』-(5-硝基吡啶-2-基)乙烷-1，2-二胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)甲基(5-硝基(2-吡啶基))胺(12.0毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。反應混合物在80℃攪拌12小時。真空濃縮粗混合物，進行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態標題化合物。
HPLC14.3分鐘(95％純)；MS:MH+＝464.2 C18H15Cl2N7O4＝463.0g/mol實施例10N-[3-(2，4-二氯苯基)-6-溴吡嗪-2-基]乙醯胺的合成回流3-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基胺(200毫克，0.63毫摩爾)的乙酸酐(3毫升)溶液2天。真空濃縮混合物，得到標題化合物。
實施例11N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(吡啶-2-基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]乙醯胺的合成 在N-[3-(2，4-二氯苯基)-6-溴吡嗪-2-基]乙醯胺(57毫克，0.14毫摩爾)的DMF(2毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))胺(28毫克，0.141毫摩爾)、叔丁醇鈉(20毫克，0.21毫摩爾)、BINAP(38毫克，0.06毫摩爾)和乙酸鈀(10毫克，0.04毫摩爾)。80℃攪拌反應混合物過夜。冷卻溶液至室溫，收集於乙酸乙酯和水中。分離層，用水和鹽水洗滌有機層，乾燥，濃縮並純化得到標題產物。
HPLC3.3分鐘(98％純)；MS:MH+＝476.1 C19H18Cl2N8O3＝477.3g/mol實施例12
叔丁氧基2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基羧醯胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(1.4克，4.0毫摩爾)的DMF(10毫升)溶液中加入Boc-乙二胺(960毫克，6.0毫摩爾)和DIPEA(1.5毫升)。80℃攪拌溶液過夜。冷卻溶液至室溫，收集於乙酸乙酯和水中。分離層並用水和鹽水洗滌有機層，乾燥，濃縮並純化得到標題產物。
HPLC12.9分鐘(95％純)；MS:MH+＝428.0 C17H19Cl2N5O4＝427.0g/mol實施例13[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基](2-氨基乙基)胺的合成 在N-(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)(叔丁氧基)羧醯胺(170毫克，0.39毫摩爾)的乙醇(2毫升)溶液中加入5％鈀碳和肼(250毫克，7.9毫摩爾)，70℃攪拌。冷卻溶液至室溫，用乙醇稀釋，過濾除去鈀碳，真空濃縮。將相應的胺吸收入10％TFA的二氯甲烷溶液(2毫升)，35℃攪拌6小時。真空濃縮溶液，提供所需化合物。
HPLC6.0分鐘(99％純)；MS:MH+＝298.0 C12H13Cl2N5＝297.0g/mol實施例14[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺的合成 根據實施例6所述的方法從[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基](2-氨基乙基)胺和6-氯-3-硝基-2-吡啶基胺製備本化合物。
HPLC8.9分鐘(98％純)；
MS:MH+＝435.2 C17H16Cl2N8O2＝434.0g/mol實施例15N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]-2-(甲基氨基)乙醯胺的合成 在[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺(30毫克，0.068毫摩爾)的THF(2毫升)溶液中加入肌氨酸(26毫克，0.138毫摩爾)、HBTU(104.5毫克，0.2756毫摩爾)和DIPEA(60微升)，80℃攪拌過夜。冷卻混合物至室溫，濃縮並收集於乙酸乙酯和水中。分離層，用水和鹽水洗滌有機層，乾燥，濃縮並純化獲得標題化合物。
HPLC7.2分鐘(98％純)；MS:MH+＝506.3 C20H18Cl2N8O3＝505.1g/mol實施例16用無細胞試驗篩選GSK3抑制性活性將本發明的嘧啶和吡啶化合物溶於DMSO，測試對人GSK3β的抑制(人GSK3β的核苷酸序列存於GenBank登錄號L33801)。在Hughes等，Eur.J.Biochem，203305-11(1992)(在此引入以供參考)中描述了GSK3β的表達。
將1等份的300微升底物緩衝液(30mM tris-HCl，10mM MgCl2，2mM DTT，3μg/ml GSK3β)和0.5μM生物素化的預磷酸化的SGSG-連接的CREB肽(Chiron Technologies PTY Ltd.，Clayton，Australia)加到96孔聚丙烯微量滴定板的各孔中去。每孔加入3.5微升含有要試驗的各種可變濃度的化合物的DMSO或星形孢菌素(一種已知的激酶抑制劑，用作陽性對照)，或陰性對照(即，僅加入DMSO)，並充分混合。然後，加入每孔50微升1μM未標記的ATP和1-2×107cpmγ33P-標記的ATP，來引發反應，使反應在室溫下進行三小時。
當反應在進行時，通過與每孔300微升含有1％牛血清清蛋白的PBS一起在室溫下培育至少1小時，封閉被鏈黴親和素包裹的Labsystems″Combiplate8″捕捉板(Labsystems，Helsinki，Finland)。然後抽吸除去封閉溶液，用100微升/孔中止試劑(50μM ATP/20mM EDTA)填充捕捉板。
當三小時酶反應結束時，將一式三份100微升等份的各反應混合物轉移到含有中止溶液的三個孔，三塊捕捉板上每塊1孔中，並將孔內容物充分混合。室溫下1小時後，抽吸倒空捕捉板的孔，用PBS和12管Corning 430474 ELISA板洗滌器洗5次。最後，將200微升Microscint-20閃爍液加到板的各孔中。用板密封劑塗布各板，然後在搖床上搖30分鐘.在Packard TopCount閃爍計數器(Meridian，Connecticut)中對各捕捉板進行計數，將結果標為化合物濃度的函數。
然後根據該試驗，篩選本發明化合物的對GSK3的抑制劑的活性。實施例3-14的化合物顯示了對該無細胞試驗中GSK3的1μM或更低的IC50。
因此，這些結果表明，本發明的化合物顯示對GSK3的抑制劑活性。
實施例17用基於細胞的糖元合成酶試驗篩選GSK3抑制劑活性將CHO-HIRC細胞維持在10釐米組織培養板的Ham’s F12培養液/10％透析過的胎牛血清中。收集來自匯合的10釐米平板的細胞，並分散到6孔組織培養板的6個孔中，最終體積是2毫升培養液。使細胞37℃生長24小時。然後在不含胎牛血清的Ham’s F12培養液中洗滌三次，最終使細胞在2毫升無血清的培養液中，37℃再生長24小時。
在該時間終點，在各孔中加入20微升溶於DMSO的化合物，並在37℃培育。20分鐘後，除去培養液，在室溫下用PBS洗滌細胞一次，然後在培養板中用液氮迅速冷凍。然後在每孔存在140微升裂解緩衝液(50mM Tris pH7.8；1mM EDTA，100mMNaF，25微克/毫升亮抑蛋白酶肽，1mM DTT，1mM PMSF)的條件下，在冰上融化細胞。從板上刮下細胞，凍在乾冰上的Eppendorf管中。然後融化裂解液，並在乾冰上重新凍結。
在重新融化後，14,000g離心裂解液15分鐘。然後取出上清液，存於冰上。將各上清液(45微升)加到45微升反應緩衝液(65mM Tris pH7.8；26mM EDTA，32.5mM KF，9.3mM UDP-葡萄糖；11mg/ml糖原；500nCi/ml14C-UDP-葡萄糖)中，並將另45微升加到45微升反應緩衝液/20mM葡萄糖-6-磷酸中。30℃培育反應物30分鐘，然後在2釐米方形31ET層析紙(Whatman)上點樣。用66％乙醇洗滌濾紙2次費時20分鐘，在丙酮中簡單漂洗，並在室溫下乾燥1小時。
將濾紙加到5毫升閃爍液中，在液體閃爍計數器中計數。將總糖元合成酶在任何裂解液中是活性的百分數表示成為100X(cpm-葡萄糖-6-磷酸)/(cpm+葡萄糖-6-磷酸)。對於5種不同濃度的化合物和單用DMSO一式兩份測定這些值，然後對濃度的對數標出這些值。通過對標出的點擬合一條S形曲線，確定了能刺激糖元合成酶活性至其最高水平的50％的化合物濃度。最高水平的定義是當試驗化合物的濃度增大至超過EC50時，糖元合成酶活性不變化的水平。
實施例18對τ蛋白磷酸化抑制性的篩選A.用GSK3表達質粒瞬時轉染COS細胞和τ表達質粒構建將COS細胞置於T25組織培養瓶中的高葡萄糖MEM培養液/5％胎牛血清中。收集來自匯合的T25瓶的細胞，以80,000細胞/孔接種於Corning6-孔組織培養板中，最終體積是每孔2毫升培養液。使細胞在37℃生長48小時。然後用不含胎牛血清的Opti-MEM洗滌兩次，最終將細胞保留在1毫升Opti-MEM中。
將編碼τ蛋白的多核苷酸亞克隆入在SV40早啟動子的控制下的質粒pSG5中，來產生τ表達質粒。在Goedert等，EMBO J，8(2)393-399(1989)，在此引入以供參考，一般描述了編碼τ蛋白的cDNA的克隆。通過將編碼GSK3β的多核苷酸亞克隆入pCG(它是Giese等，Gene Development，9995-1008(1995)和Matthias等，Nucleic Acid Research，176418(1989)(都在此引入以供參考)所述的ApEVRF衍生物)，製備了GSK3表達質粒。
在1.5毫升的Eppendorf管中製備了下列溶液溶液A對各轉染，將2微克DNA(τ表達質粒)和0.7微克DNA(GSK3表達質粒)稀釋於100微升Opti-MEM(Gibco BRL)中；溶液B對於各轉染，將8微升Lipofectamine試劑稀釋於100微升Opti-MEM中。合併這兩種溶液，溫和振蕩，並在室溫下培育45分鐘，使得形成DNA-脂質體複合物。對於各轉染，將0.8毫升Opti-MEM加到該複合物的試管中。溫和振蕩該稀釋好的溶液，鋪在漂洗過的細胞上。將細胞與複合的DNA/Lipofectamine在CO2培養箱中37℃培育6小時。培育後，在各孔加入1毫升生長培養液(高葡萄糖MEM)和20％FBS，並在37℃培育過夜。用新鮮的完全培養基在轉染開始的18小時後替換培養基，使細胞在37℃再生長48小時。
B.τ磷酸化抑制試驗收集前2小時，將溶於DMSO的2微升試驗化合物(GSK3抑制劑)加到各孔中，37℃培育。2小時後，除去培養液，在板上用乾冰迅速冷凍細胞，並儲藏在-70℃。在200微升裂解液(TritonX-100，20mM Tris pH7.5，137mM NaCl，15％甘油，25微克/毫升亮抑蛋白酶肽，1微克/毫升胃酶抑素-A，1μMPMSF，21微克/ml抑蛋白酶肽，50mM NaF，50mMβ-甘油磷酸酯，15mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉)的存在下，在冰上融合細胞。將各孔的內容物14,000g，4℃離心5分鐘，將上清液轉移到乾淨的試管中。這時可將裂解液儲藏於-20℃。
C.ELISA檢測細胞裂解液中的磷酸化τ用5微克/毫升溶於含有CA++和Mg++的PBS(每孔100微升)單克隆抗-磷酸化τ(AT8，Polymedco，Inc.)包裹Immulon4薄膜(Dunatech)。4℃培育過夜後，用洗滌緩衝液(含有0.05％Tween20的PBS)洗滌薄膜兩次，用含有1％BSA，5％正常小鼠血清和O.05％Tween20的PBS在室溫下封閉1小時。用洗滌緩衝液洗滌薄膜5次。在各孔中加入用含有1％BSA，0.1％NaN3的PBS110稀釋的裂解液(100微升)，在室溫下培育1小時。洗滌後，在各孔中加入100微升溶於PBS的0.5微克/毫升生物素化的單克隆抗-(未磷酸化的)τ(HT7，Polymedco，Inc.)。將薄膜洗滌5次，加入綴合HRP的鏈黴親和素，室溫培育30分鐘，並用洗滌緩衝液充分洗滌。用TMB底物(Pierce)顯色，通過加入等體積的O.8M的硫酸，中止反應。在ELISA平板閱讀儀上，用450納米濾色片對薄膜讀數。通過對標出的數據擬合出一條S形曲線，測定將τ磷酸化抑制到最高水平的50％的化合物濃度(即，IC50)。
實施例19測試GSK3抑制劑保護原代海馬細胞抵抗穀氨酸鹽興奮性中毒的能力從胚胎期18-19天的大鼠中剖分到海馬。將組織收集在Hibernate TM培養液(Gibco BRL)中，切成大約1毫米的小塊。用Papain DissociationSystem(Worthington Biochemical Corporation)解離組織。分離後，將細胞重新懸浮於由Neurobasal TM(Gibco BRL)，2％B27補充液(GibcoBRL)，L-穀氨醯胺和抗生素的無血清培養液中。將細胞置於用聚-L-賴氨酸塗布的35毫米組織培養板上(濃度為每培養皿7.5×104細胞)。37℃在5％CO2中培育10-14天後，漂洗細胞，用新鮮培養液餵養。第二天，在培養液中以最終濃度為1nM和100μM之間加入本發明的代表性化合物。加入化合物4到8小時後，從細胞中除去培養液，儲存在37℃。將培養物用含有10μM甘氨酸的HEPES緩衝平衡的鹽溶液(HBSS)漂洗培養物兩次。Grabb和Choi，J Neuroscience，191657-62(1999)。然後使培養物在室溫下接觸溶於同樣的HBSS的200μM穀氨酸。接觸後，用該緩衝液漂洗三次培養物，然後轉到它們原來條件下的，含有化合物的培養液中。接觸穀氨酸20-24小時後，用HBSS漂洗培養物，接觸酞酚藍10分鐘。該染料被死細胞吸收。漂洗培養物，然後在4％聚甲醛中固定30分鐘。通過相差顯微鏡對活的和死的(藍色核)大神經元進行計數，並拍照。用該方法，已顯示本發明的化合物能顯著降低穀氨醯胺誘導神經元細胞死亡的能力。
實施例20對糖尿病齧齒動物的效力的評估(葡萄糖耐受試驗)口服給藥的化合物配方對於口服強飼，通常將試驗化合物在施藥1天前配製成水溶液或在1％羧甲基纖維素/0.1％tween-80(都來自Sigma Chem.，MO)中的懸液。將一些早期化合物根據與下文相同的程序，配製成15％Captisol(一種改良的環化糊精，CyDex，Co.，IL)的溶液。對於水溶液，將乾燥和凍幹的試驗化合物粉末溶於蒸餾水，並通過旋轉和超聲充分混合。如需要，用1N NaOH或1N HCl調節試驗溶液的pH，並最終通過裝有0.2微米的乙酸纖維素酯膜(Millipore Co.，MA)注射器，來過濾除菌。對於口服懸液，用1％羧甲基纖維素/0.1％tween-80的新鮮懸液與試驗化合物粉末混合，並充分超聲，如需要，如上所述調節pH，並旋轉，直到粒度均一，並＜10微米。
糖尿病小鼠葡萄糖耐受試驗從Jackson Labs(Bar Harbor，ME)獲得8周齡的Obese db/db(雌C57B1Ks/J)小鼠，並在1-2周後用於效力測試。在試驗日的早晨，在清早除去食物(施用葡萄糖丸前7-8小時)。對尾末端使用局部麻醉劑(EMLA Creme，Astra Pharm.，MA)，剪斷尾巴尖取得50-100微升血樣，並收集在含有5微升500U/ml肝素鈉(Elkins-Sinn，NJ)的eppendorf管中，然後分離血漿。在該日的各個間隔時間(總的是6-8個時間點)獲得樣品。隨機將小鼠編入處理組，在施用葡萄糖4.5小時前首先口腔施用試驗化合物(0.2ml體積)，然後在通過口腔強飼(oGTT)或腹膜內注射施用0.2毫升50％葡萄糖(Abbott Lab，IL)之前0.5小時再次施用化合物。在葡萄糖施用2小時後取得最終血樣後，將食物再投給小鼠。
基礎高血糖症和胰島素血症的調控一般將試驗化合物以多日，多劑方案或作為單個丸劑經口施給db/db小鼠(見上)或ZDF大鼠(Genetic Models，Inc.；Indianapolis，IN)。ZDF大鼠是在8周齡時收到的，並在1-2周後用於效力試驗。在施藥30分鐘前移去食物，並施用一顆試驗化合物丸劑(劑量範圍在1-8毫克/毫升之間)如上所述，在後2-3小時中的1-6個時間點取血樣。取血樣後，將食物放回鼠籠。
主要終點從血漿和/或血樣測量了葡萄糖和胰島素。從全血，用One-Touch葡糖計(Lifescan Co.，CA)，和從血漿，用Beckman葡萄糖分析儀測量葡萄糖水平。一般葡萄糖結果反映了小鼠的血液值和大鼠研究的血漿值。根據供應商的方法，用ELISA(Crystal Chem.Co.，IL)測量了胰島素水平。
結果定量可用mg/dL葡萄糖或ng/ml胰島素，或用曲線下方的面積(AUC)表示對血漿葡萄糖(取自正常血糖基線100mg/dL上方)和胰島素(取自正常血液胰島素基線1ng/ml上方)的效力。一般，當用AUC表示時，實際上將結果表示成減少的AUC([(載體對照AUC一試驗組的AUC)/載體對照AUCX100])。與安慰劑對照組比較，這些表達提供了對葡萄糖分解提高和/或基礎高血糖血症或胰島素儲藏的減少的數量級的單一定量表達。
結果本發明的代表性化合物在體外顯示了良好的效力，而且當用captisol配製時並皮下施給小鼠(30mg/kg)時，在體內顯示高生物可用性和組織滲透性。觀察到就在葡萄糖耐受試驗之前，基礎高血糖血症的顯著降低，和在用葡萄糖攻擊後，葡萄糖分解的顯著改善。如果用測定血液葡萄糖曲線下方面積(AUC)來定量葡萄糖反應，可觀察到從-60分鐘到+120分鐘，與對照組比較，AUC減少了45-50％。這可與由曲格列酮(以每天60或100毫克/公斤口服施藥至少數天)得到的效力媲美。還觀察到在處理的動物中，胰島素水平顯著低於對照小鼠中的水平。
雖然已說明並描述了本發明的優選例，可理解的是，可進行各種改變，而不違背本發明的精神和範圍。
權利要求
1.一種化合物，其特徵在於，該化合物具有下式 其中A1是被硝基、氨基或氰基取代的吡啶基；A2是被滷素取代的苯基；R1、R2、R3和R4分別選自氫或C1-10烷基；R2』和R3』分別選自氫和C1-10烷基；R5選自硝基；C1-10烷基羰基氨基；C1-10烷基羰基氨基，其中氨基被C1-10烷基取代；C1-10烷基氨基；氨基；被C1-10烷基氨基取代的C1-10烷基羰基氨基，其中氨基被C1-10烷基取代或未取代；R6選自氫和C1-10烷基；或其藥物學上可接受的鹽。
2.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述A1是硝基吡啶基。
3.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述A1是氨基吡啶基。
4.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述A1是氰基吡啶基。
5.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述A1選自5-硝基-6-氨基-吡啶-2-基、5-硝基-吡啶-2-基、5-氰基-吡啶-2-基。
6.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述滷素選自氟、氯、溴、碘。
7.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，A1和A2中至少一個被至少一個，不多於三個取代基團取代。
8.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，R1、R2、R3和R4是氫。
9.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述R5選自硝基、-NHCOCH3，-NH2，-NHCOCH2NHCH3。
10.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述R6是氫。
11.如權利要求
1所述的化合物，其特徵在於，所述A2是2，4-二氯苯基。
12.一種組合物，其特徵在於，該組合物含有一定量的當施給人或動物個體時能有效調節GSK3活性的權利要求
1所述的化合物，和藥物學上可接受的載體。
13.權利要求
12所述組合物的用途，其特徵在於，該組合物用於製備在人或動物體內抑制GSK3活性的藥物。
14.權利要求
1的化合物的用途，其特徵在於，該化合物用於製備處理細胞，以抑制細胞中的GSK3活性的藥物組合物。
15.權利要求
12所述的組合物的用途，其特徵在於，該組合物用於製備在人或動物體內治療GSK3-介導的疾病的藥物。
16.如權利要求
15所述的用途，其特徵在於，所述藥物通過以下施藥模式口服、皮下、透皮、透黏膜、電離子透入、靜脈內、動脈內、頰內、舌下、鼻內或直腸施藥，來給藥。
17.如權利要求
15所述的用途，其特徵在於，所述GSK3-介導的疾病選自糖尿病、阿耳茨海默氏病、肥胖症、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷症和癌症。
18.如權利要求
17所述的用途，其特徵在於，所述藥物還包含一種或多種額外的活性藥劑。
19.如權利要求
18所述的用途，其特徵在於，所述GSK3-介導的疾病是II型糖尿病，而所述額外的活性藥劑選自胰島素、曲格列酮、羅格列酮、匹格列酮、格列甲嗪和甲福明。
20.權利要求
1所述的化合物在生產用於治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、肥胖症、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙或癌症的藥物中的用途。
專利摘要
提供了用於在體外抑制糖元合成酶激酶(GSK3)的活性，和在體內治療GSK3介導疾病的，新穎的基於雙環的化合物，組合物和方法。本發明的方法、化合物和組合物可單用，或和其它用於治療GSK3活性介導的疾病，如用於治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經變性疾病、動脈硬化心血管疾病、原發性高血壓、多囊卵巢症候群、X症候群、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌症等的藥物學上活性的藥劑聯用。
文檔編號C07D241/16GKCN1272328SQ00818941
公開日2006年8月30日 申請日期2000年12月14日
發明者J·M·努斯, S·拉穆西 申請人:希龍公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan