一種從小球藻中提取葉黃素的方法

2023-05-31 07:32:56 1

專利名稱：一種從小球藻中提取葉黃素的方法
技術領域：
本發明涉及一種從小球藻中提取葉黃素的方法。
背景技術：
葉黃素(lutein)屬含氧的四萜類類胡蘿蔔素，是人體眼睛黃斑區和血液中的主要類胡蘿蔔素，具有吸收有害藍色光保護視力及強的抗氧化活性，已經被運用到護眼功能飲料、化妝品、食品添加劑、醫藥、飼料等領域。利用微藻提取葉黃素是近年國際上開發的代替萬壽菊花為提取源的新方法，微藻生產葉黃素具有以萬壽菊花等植物為材料來源不可比擬的優勢快速異養代謝、培養時間短、能夠在生物反應器中實現高密度培養，不受氣候、季節和區域的限制。國內外主要利用光生物反應器和發酵兩種方式進行自養型及異養型微藻的生產。葉黃素的提取方法有有機溶劑浸提法、微波提取、膜分離、高速逆流色譜、雙水相等方法，實際應用中以有機溶劑浸提為主。葉黃素提取相關技術的專利主要以萬壽菊為原料，微藻具有與植物不同的生理及結構特徵，以微藻為原料的專利有CN1865242A以小球藻為材料，提取溶劑為甲醇與正己烷混合溶劑，通過細胞破碎儀及正己烷進行提取；專利CN101130513A以小球藻為材料，提取溶劑為乙醇與正己烷混合溶劑，皂化劑為NaOH，通過低溫離心分離葉黃素。

發明內容
本發明的目的是提供一種從小球藻中提取葉黃素的方法。本發明所提供的從小球藻中提取葉黃素的方法，包括下述步驟以乙醇或乙醇水溶液為提取劑，採用超聲波法提取小球藻藻粉中的游離葉黃素及其酯，然後加入氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液進行皂化反應；反應結束後，向反應體系中加入二氯甲烷或三氯甲烷進行萃取，通過低壓旋轉蒸發回收二氯甲烷或三氯甲烷，得到葉黃素粗提物。其中，所述乙醇水溶液具體可為質量濃度為80% — 100%的乙醇水溶液。所述超聲波法中，超聲波功率可為200-300W，優選210-240W ;超聲波提取時間可為30-60min ;超聲波提取溫度可為10_50°C，優選20_40°C，進一步優選30_40°C。所述皂化反應中，所述氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液的質量濃度10% -20%；所述皂化反應的溫度為可為10-50°C，優選20-40°C，進一步優選30-40°C ;皂化反應的時間為10-20min。所述皂化反應在超聲波輔助下進行，超聲波功率為200-300W。所述小球藻藻粉與所述提取劑的配比可為Ig (30-80)mL。所述小球藻藻粉與所述氫氧化鉀水溶液的配比可為Ig : (10-30)mL。所述萃取的方法是向所述反應體系中加入二氯甲烷或三氯甲烷混合均勻，然後在4°C 一 8°C以4000g-8000g的轉速離心5_10min，收集下相黃色液體，即為所述葉黃素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。所述方法還包括對葉黃素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液進行水洗、低壓旋轉蒸發回收二氯甲烷或三氯甲烷，得到葉黃素的步驟。通過條件優化，從小球藻中提取葉黃素的最優方法為以乙醇為提取劑，採用超聲波法提取藻粉中的游離葉黃素及其酯，其中，超聲波功率為240W，超聲波提取時間為30min，提取溫度為40°C，藻粉與乙醇的配比為Ig 50mL ;然後加入質量濃度為20%氫氧化鉀水溶液(藻粉與氫氧化鉀水溶液的配比為Ig 30mL)在40°C、240W超聲波輔助下進行皂化反應IOmin ;反應結束後，向反應體系中加入藻粉與二氯甲烷配比大於Ig 150mL的二氯甲烷進行萃取，4°C、5000g離心5min，蒸餾水洗二氯甲烷相，低壓旋轉蒸乾提取物，得到葉黃素。本發明中所用的原料藻粉是按照下述方法製備得到的將可用於葉黃素提取的小球藻藻泥進行冷凍乾燥得到藻粉。本發明以乙醇為溶劑，利用超聲波法進行小球藻葉黃素及其酯類的提取，以20%KOH為皂化劑將葉黃素酯類轉化為游離葉黃素，以二氯甲烷萃取游離葉黃素，達到與葉綠素等水溶性物質分離，採用低溫旋轉蒸發除去有機溶劑獲得葉黃素。用甲醇溶解後，通過紫外分光光度儀及HPLC對葉黃素進行檢測，葉黃素提取量可達到3. 02mg/g (乾重)。本發明實現了從小球藻中快速、高效提取葉黃素，為小球藻產業化生產葉黃素提供了技術支持。


圖I為實施例I對提取溶劑(a)、皂化劑(b)、萃取溶劑(C)的篩選柱形圖，橫坐標分別為溶劑種類，皂化劑及皂化先後順序，縱坐標為提取的總類胡蘿蔔素在444nm的紫外吸收值。圖2為實施例2對超聲波功率(a)、皂化時間(b)、提取及皂化溫度(C)、提取溶劑乙醇的濃度(d)提取的單因子優化圖。圖3為實施例3採用四因子三水平正交優化對小球藻葉黃素的提取工藝進行優化的效應曲線圖。圖4為實施例4從小球藻藻粉中對提取的葉黃素與標準品葉黃素HPLC對比圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明並不局限於此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。下述實施例中所用藻種為購買自天津豐年水產養殖有限公司的海水小球藻(Chlorella sp.)藻泥。藻泥冷凍乾燥得到小球藻藻粉。實施例I、從小球藻中提取葉黃素的工藝優化I、提取溶劑的篩選準確稱取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管,加入5mL待篩選提取溶劑進行超聲波(210W)提取30min，室溫20_30°C ;然後加入5mL，20% NaOH皂化IOmin ;再加入三氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢
測含量。上述待篩選的提取劑分別是甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、石油醚(沸程60_90°C)、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇/三氯甲烷的混合溶劑(3 I, v/v)採用紫外分光光度儀對濃縮液中總類胡蘿蔔素含量進行檢測，400-500nm波長掃描，比較最大吸收峰444nm處吸光度值。結果見圖la。由圖可知，以乙醇作為提取劑時,提 取的葉黃素濃度最聞。2、提取與皂化順序的篩選及皂化劑的篩選準確稱取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管，加入5mL乙醇進行超聲波(210W)提取30min，室溫20_30°C ;然後加入5mL質量濃度20% NaOH水溶液(或質量濃度20% KOH水溶液)皂化IOmin ;再加入三氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。準確稱取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於5OmL離心管,加入5mL質量濃度20% NaOH水溶液(或質量濃度20% KOH水溶液)皂化IOmin ;然後加入5mL乙醇進行超聲波(210W)提取30min，室溫20-30°C ;再加入三氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。採用紫外分光光度儀對濃縮液中總類胡蘿蔔素含量進行檢測，比較最大吸收峰444nm處吸光度值。結果見圖lb。由圖可知，以20% KOH溶液為皂化劑，採用先提取後皂化的方式，提取的葉黃素濃度最高。3、萃取溶劑的篩選準確稱取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管，加入5mL乙醇進行超聲波(210W)提取30min，室溫20_3(TC ;然後加入5mL質量濃度20% KOH水溶液皂化IOmin ;再加入20mL待篩萃取溶劑進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。上述待篩選的萃取溶劑分別是正己烷、石油醚(沸程60_90°C )、乙酸乙酯、二氯
甲烷、三氯甲烷。採用紫外分光光度儀對濃縮液中總類胡蘿蔔素含量進行檢測，比較最大吸收峰444nm處吸光度值。結果見圖lc。由圖可知，以二氯甲烷作為萃取溶劑提取的葉黃素濃度最聞。實施例2、對從小球藻中提取葉黃素方法中超聲波提取強度、提取劑乙醇濃度、皂化時間進行單因素考察I、不同超聲波強度對提取的葉黃素含量的影響。取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管，加入5mL乙醇進行超聲波提取30min，溫度25°C ;然後加入5mL質量濃度20% KOH水溶液皂化IOmin ;再加入20mL 二氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。考察的超聲波強度分別為180W、210W、240W、270W、300W。採用紫外分光光度儀對濃縮液中總類胡蘿蔔素含量進行檢測，比較最大吸收峰444nm處吸光度值。結果見圖2a。由圖可知，超聲波功率為240W提取的葉黃素濃度最高。2、皂化時間對提取的葉黃素含量的影響取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管，加入5mL乙醇進行超聲波(240W)提取30min，溫度25°C ;然後加入5mL質量濃度20% KOH水溶液進行皂化反應；反應結束，再加入20mL 二氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。考察的阜化時間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min。比較444nm處吸光度值。結果見圖2b。由圖可知，皂化時間為IOmin的提取效果最好。3、提取及皂化溫度對提取的葉黃素含量的影響準確稱取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管，加入5mL乙醇進行超聲波(240W)提取30min ;然後加入5mL質量濃度20% KOH水溶液皂化IOmin ;再加入20mL 二氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。考察的提取及皂化溫度分別為io°c、2o°c、3(rc、4(rc、5(rc。比較444nm處吸光度值。結果見圖2c。由圖可知，提取及皂化水浴溫度為40°C時，提取的葉黃素濃度最聞。4、提取劑乙醇濃度對提取的葉黃素含量的影響取O. Ig海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置於50mL離心管,加入5mL乙醇溶液進行超聲波(240W)提取30min，溫度40°C ;然後加入5mL質量濃度20% KOH水溶液進行阜化反應lOmin，再加入20mL 二氯甲烷進行萃取，離心，收集萃取液，濃縮至幹，提取物用甲醇5mL定容檢測含量。考察的提取劑乙醇溶液的質量濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%。比較444nm處吸光度值。結果見圖2d。由圖可知，乙醇濃度為100%的提取效果最好。實施例3、從小球藻中提取葉黃素最佳工藝條件的確定根據單因素試驗的結果，確定提取溶劑為乙醇，阜化劑為Κ0Η,阜化時間IOmin,萃取溶劑為二氯甲烷，超聲波頻率為240W，提取及皂化溫度為40°C後，對提取方法中料提取溶劑比、料皂化劑比、皂化劑濃度、超聲波時間進行四因子三水平正交優化。以總類胡蘿蔔素含量為提取效果考察指標，優選出最佳工藝條件，因素水平安排見表I。表I提取因素水平
權利要求
1.一種從小球藻中提取葉黃素的方法，包括下述步驟以乙醇或乙醇水溶液為提取齊U，採用超聲波法提取小球藻藻粉中的游離葉黃素及其酯，然後加入氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液進行皂化反應；反應結束後，向反應體系中加入二氯甲烷或三氯甲烷進行萃取，得到葉黃素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述乙醇水溶液為質量濃度為80% -100%的乙醇水溶液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述超聲波法中，超聲波功率為200-300W，優選210-240W ;超聲波提取時間為30_60min ;超聲波提取溫度為10_50°C，優選20-40。。。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於所述皂化反應中，所述氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液的為質量濃度10% -20% ;所述皂化反應的溫度為20-40°C，優選20-40°C，時間為10-20min ;所述皂化反應在超聲波輔助下進行，超聲波功率為200-300W。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於所述小球藻藻粉與所述提取劑的配比為1g (30-80)mL。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法,其特徵在於所述小球藻藻粉與所述氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液的配比為1g (10-30)mL。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特徵在於所述提取劑為乙醇；所述超聲波法中，超聲波功率為240W，超聲波提取時間為30min，提取溫度為40°C，所述小球藻藻粉與所述提取劑的配比為1g 50mL ； 所述皂化反應中，所述氫氧化鉀水溶液為質量濃度20%的氫氧化鉀水溶液；皂化反應的溫度為40°C，時間為1Omin ;所述皂化反應在超聲波輔助下進行，超聲波功率為240W ;所述小球藻藻粉與所述氫氧化鉀水溶液的配比為1g 30mL。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於所述萃取的方法是向所述反應體系中加入二氯甲烷或三氯甲烷混合均勻，然後在4°C以5000g的轉速離心5min，收集上清液，即為所述葉黃素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其特徵在於所述方法還包括對葉黃素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液進行水洗、除去二氯甲烷或三氯甲烷，得到葉黃素的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種從小球藻中提取葉黃素的方法。該方法包括下述步驟以乙醇或乙醇水溶液為提取劑，採用超聲波法提取小球藻藻粉中的游離葉黃素及其酯，然後加入氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液進行皂化反應；反應結束後，向反應體系中加入二氯甲烷或三氯甲烷進行萃取、離心、蒸餾水水洗後旋轉蒸發至幹，得到葉黃素。用甲醇溶解後，通過紫外分光光度儀及HPLC對葉黃素進行檢測，葉黃素提取量可達到3.02mg/g(小球藻乾重)。本發明實現了從小球藻中快速、高效提取葉黃素，為小球藻產業化生產葉黃素提供了技術支持。
文檔編號C07C403/24GK102976992SQ201210543578
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者林祥志, 馬伏寧, 林汝榕, 榮輝, 閆晉飛, 劉瀟, 楊善軍, 王昭凱 申請人:國家海洋局第三海洋研究所