一種基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法
2023-05-30 13:51:16 1
一種基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，包括以下步驟：步驟1)，移取納米金溶液和含有三聚氰胺的溶液於一離心管中，充分混勻，作用5分鐘使得納米金達到最佳的團聚態；步驟2)，移取上述納米金溶液和三聚氰胺溶液的混合溶液於化學發光池中，採用靜態注射的方式注入魯米諾–過氧化氫化學發光試劑，通過IFFL-D流動注射化學發光分析儀測定並記錄其化學發光強度，根據測定結果進行判定。本發明檢出限達到8.6×10–14g/mL，達到目前固相萃取-化學發光分析法的靈敏度，且較之簡單方便的多；分析測試時間縮短為10分鐘以內；整個操作實驗的條件較溫和，且完成在一均相的體系中，有利於自動化的分析操作。
【專利說明】-種基於納米金化學發光快速檢測H聚霞胺的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於化學檢測【技術領域】，具體的說，本發明涉及一種基於納米金化學發光 快速檢測H聚氯胺的方法。
【背景技術】
[000引S聚氯胺（melamine)化學名稱為2, 4, 6-S胺基-1，3, 5-S嗦（2,4,6-triamin0-l，3,5-triazine)或 1,3,5-H嗦-2,4,6-H胺 (1, 3, 5-triazine-2, 4, 6-triamino)，是一種H嗦類含氮雜環有機化合物，俗稱密胺、蛋白 精。作為一種重要的氮雜環有機化工原料，主要用途是與酵縮合，生產塑料。由於其形態酷 似蛋白粉，無異味，含氮量高達66%，遠高於普通蛋白質的含氮量，慢性毒性不容易被發現。 添加該品可引起凱氏定氮法測得的表觀上蛋白質質量分數提高，產品質量"合格"，同時大 幅降低生產成本，因此常被不法分子作為蛋白質替代品添加到乳品、飼料中。H聚氯胺本身 毒性較小，長期或反覆攝入可能對腎和膀脫產生影響，導致結石產生。鑑於H聚氯胺的人為 添加會對消費者造成危害，我國有關部口已發布了H聚氯胺限量值的公告。因此，對H聚 氯胺進行有效的檢測對於食品尤其乳製品的安全具有一定的意義。
[0003]目前國內外常用於H聚氯胺的檢測方法，主要有高效液相色譜法（HPLC)、液相色 譜-質譜聯用法、免疫分析法、毛細管電泳法、氣質聯用法、英光光度法等。該些方法及技術 各有各的優點和使用範圍。在該些分析方法中，HPLC法是最常用的檢測方法，具有高效、快 速、靈敏度高、檢出率高等特點；但由於前處理較複雜，所需儀器較昂貴，操作繁瑣、費時，所 用試劑毒性較大，汙染環境，且對實驗操作人員具有一定的技術要求，不適於H聚氯胺的快 速檢測。氣質聯用和液質聯用技術雖然是目前較先進的檢測方法，但其設備昂貴，試劑消耗 量大，檢測成本高，僅能於部分實驗室作為確證方法使用，不適合廣泛使用。毛細管電泳法 分離度高，分離效果好，所用試劑量小，價廉無汙染，但靈敏度不夠高。近紅外吸收法雖然選 擇性好，可實現在線檢測，但設備價格昂貴，需要不斷進行校準，樣品基質中的幹擾是近紅 外分析精度及重現性的一大障礙。免疫分析法靈敏度高，可適用於大量樣品的快速篩選，但 是操作繁瑣、費時。比色法方便快捷，價廉易操作，但只適用於H聚氯胺含量大時進行篩選， 無法進行痕量檢測，且當待測物鹼性大時誤差亦較大。拉曼光譜技術W及核磁共振法雖然 能夠滿足快捷簡易的要求，但是儀器本身比較昂貴。因此，發展簡便、快速且實用性強的用 於H聚氯胺檢測的分析方法顯得很有必要。
[0004] 針對現有技術存在的相對不足，提出本發明。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是解決了目前檢測H聚氯胺分析方法存在的局限性；包括使用大型 昂貴的儀器、分析成本高、靈敏度不能滿足各方面的需求；操作麻煩且對分析人員的要求較 高；分析測定時間較長。利用H聚氯胺能夠增強魯米諾-過氧化氨-納米金體系化學發光 信號，建立一種全新的簡單靈敏基於納米金催化化學發光分析測定H聚氯胺的方法。
[0006] 本發明提供的技術方案是；一種基於納米金化學發光快速檢測H聚氯胺的方法， 包括W下步驟：
[0007] 步驟1)，移取納米金溶液和含有H聚氯胺的溶液於一離也管中，充分混勻，作用 5分鐘使得納米金達到最佳的團聚態；所述的納米金溶液中的納米金的粒徑為2. 6皿，濃 度為5.OXl(T7mol/L。所述的2. 6nm納米金溶液的製備過程為；在室溫、強力攬拌的條件 下，將100血的HAuCl^O. 01%w/w)水溶液、1血的1 %巧樣酸H軸溶液和1血的0. 075% NaBH4/l%巧樣酸H軸溶液完全混合，混合後溶液攬拌30分鐘，完全反應後，於4°C冰箱保存 待用。所述的魯米諾-過氧化氨化學發光試劑選擇魯米諾的濃度為4Xl(r5mol/l，過氧化 氨濃度為4Xl(T2mol/l，魯米諾和過氧化氨的體積比為2:1。所述的魯米諾-過氧化氨化 學發光試劑的抑值為12.0。
[0008]步驟2)，移取上述納米金溶液和H聚氯胺溶液的混合溶液於化學發光池中，採用 靜態注射的方式注入魯米諾-過氧化氨化學發光試劑，通過IFFL-D流動注射化學發光分 析儀測定並記錄其化學發光強度，根據測定結果進行判定。
[0009] 本發明提供的另外的技術方案是；將步驟1)中所述的魯米諾-過氧化氨化學發 光試劑用魯米諾-高楓酸鍾化學發光試劑代替。
[0010] 本發明的有益效果是：
[0011] 化學發光分析因具有靈敏度高、線性範圍寬、試劑便宜及儀器操作簡單等優點已 廣泛應用於藥物分析中。而化學發光分析檢測H聚氯胺的研究報導很少。近年來，隨著納 米科學的迅猛發展，納米材料因其特有的光學和電學等理化性質已經W各種角色用於化學 發光生物分析中，開創了納米粒子化學發光生物分析的新鄰域。一度成為研究的熱點。然 而遺憾的是，基於納米金催化化學發光分析測定H聚氯胺的研究還未見報導。我們的研究 發現H聚氯胺能夠增強魯米諾-過氧化氨-納米金體系的化學發光信號，基於此建立了一 種納米金催化化學發光分析測定H聚氯胺的分析方法，該方法簡單靈敏，快速。整個分析測 定將會在10分鐘之內完成。
[0012] 本發明所建立的基於納米金催化化學發光分析檢測H聚氯胺的方法，解決了現 有檢測方法遇到的問題，具有W下優點；（1)檢出限達到8.6Xl(^l4g/mレ達到目前固相萃 取-化學發光分析法的靈敏度，且較之簡單方便的多；（2)該方法的分析測試時間縮短為10 分鐘W內；（3)整個操作實驗的條件較溫和，且完成在一均相的體系中，有利於自動化的分 析操作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 當結合附圖考慮時，通過參照下面的詳細描述，能夠更完整更好地理解本發明W 及容易得知其中許多伴隨的優點，但此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解， 構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發 明的不當限定，其中：
[0014] 圖1納米金濃度的優化示意圖；
[0015] 圖2魯米諾濃度的優化示意圖；
[0016] 圖3過氧化氨濃度的優化示意圖；
[0017] 圖4體系抑的選擇示意圖；
[0018] 圖5化學發光檢測H聚氯胺的靈敏度分析示意圖。
【具體實施方式】
[0019] 為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實 施方式對本發明作進一步詳細的說明。
[0020] 所用到的主要儀器設備和試劑：
[0021]IFFL-D流動注射化學發光分析儀及其配套設備（西安瑞邁分析儀器有限公司）， 5840R臺式高速大容量離也機巧ppendo計Ltd.德國），TU-1901型紫外-可見分光光度 儀（北京普析通用儀器有限公司），透射電子顯微鏡（日立公司，規格型號；H-600)。
[00過氯金酸（HAuCL?化0,AR,Au含量>47. 8%，國藥集團化學試劑有限公司）；將氯 金酸固體溶於二次去離子水中製備氯金酸儲備溶液，放於4C冰箱中保存。將4. 4：3g魯米諾 固體粉末溶解在20mL0.IOM化OH溶液中並稀釋至比，製備得到2. 5X10-2M魯米諾儲備溶 液。使用之前避光保存一星期W確保試劑性質的穩定。魯米諾的工作溶液通過儲備溶液的 稀釋而得到。&化的工作溶液在每次使用時從30 % (w/w)H2化（上海化學試劑公司）稀釋得 至IJ。稱取H聚氯胺（北京興福精細化學研究所）0. 0050g，加水溶解後，定容於IOOml容量瓶 中，配置lXl(T4g/mlH聚氯胺儲備液。實驗用水為二次去離子水。
[002引實驗條件的優化：
[0024]實驗中選用2. 6nm的納米金，考查了金的濃度的影響。如圖1，金的濃度越大，體系 的發光強度也越大，而當金濃度大於5. 0Xl(Tmol/L時，體系的化學發光強度有所減弱。本 發明選用納米金的粒徑為2. 6皿，濃度為5.OXICTmoi/L。
[00巧]考察了化學發光試劑的影響，如圖2和3,發現隨著魯米諾和過氧化氨濃度的 增加，體系的發光強度越大。考慮到化學發光強度和試劑的消耗，選擇魯米諾的濃度為 4Xl〇-5mol/L，過氧化氨濃度為 4Xl〇-2mol/L〇
[002引考察了體系抑值的影響，如圖4,當體系的抑值小於12時，隨著抑值的增加化學 發光強度增大；而當體系的抑值大於12時，隨著抑值的增加化學發光強度減弱。本發明 所用體系的抑值優化為12.0。
[0027] 2. 6皿納米金的製備：
[002引製備過程中所用的玻璃器皿均使用王水清洗（1:3HN03 -肥1)，然後用二次去離子 水徹底衝洗乾淨，烘乾備用。2. 6nm納米金的製備方法為測氨化軸還原法。製備過程簡述 如下；在室溫、強力攬拌的條件下，將100血的HAuCL化01%w/w)水溶液、1血的1 %巧樣 酸H軸溶液和ImL的0. 075%NaBH4/l%巧樣酸H軸溶液完全混合。混合後溶液攬拌30分 鍾，完全反應後，於4C冰箱保存待用。
[0029] 靜態注射化學發光分析測定H聚氯胺：
[0030] 本發明所建立的化學發光分析測定H聚氯胺的方法，採用靜態注射的方式進行。 整個過程分為兩個步驟；H聚氯胺和納米金的相互作用和化學發光分析的測定，而且該兩 個步驟是完全獨立的。具體的測定過程如下；（1)移取納米金和H聚氯胺的溶液於一離也 管中，充分混勻，作用5分鐘使得納米金達到最佳的團聚態；（2)移取上述納米金/H聚氯 胺溶液100yL於化學發光池（40X14mm石英管）中，注入200yL魯米諾-過氧化氨化學 發光試劑（4XICT5M魯米諾和4XICT2M過氧化氨的體積比為2:1)，通過IFFL-D流動注射化 學發光分析儀測定並記錄其化學發光強度。
[0031] H聚氯胺化學發光的分析性能：
[0032] 在上述優化的實驗條件下，實現了對H聚氯胺化學發光分析的測定。結果表明，隨 著H聚氯胺濃度的增加，化學發光信號逐漸增強。且在3. 8XIO42?2. 6XlCrWg/血的濃度 範圍內，H聚氯胺的濃度與化學發光信號的強度成良好的相關性，線性曲線如圖5所示，其 檢出限為8.6Xl(Ti4g/mL(S/N= 3)。並對1.6Xl(TWg/mL的H聚氯胺平行測定11次，其 相對標準偏差為3. 2%。實驗結果表明該方法檢出限低，精密度好。較目前僅有的化學發光 分析方法的靈敏度要高很多，已達到固相萃取-化學發光分析法的靈敏度，且較之簡單方 便的多。
[0033] 幹擾測定
[0034] 於8. 6X10 - 1VmLH聚氯胺溶液中，分別加入1000倍的 2護，Ca",Mg2+，N03_，COs]-,PC^-和葡萄糖，100 倍的AP，Na+,Cl-，SO42-，尿素和巧樣酸，10 倍 的Cu",Ba"等進行幹擾實驗，結果表明均不幹擾測定。
[00巧]樣品分析的結果：
[0036] 按國標法處理樣品。準確移取1血鮮牛奶樣品，加入5mL肥1酸化的己膳（pH= 2. 0)溶液，超聲15分鐘，使蛋白質沉澱，而後再W8000r/min離也10分鐘，轉移合併上 清液，向上述清液中加入20mL正己焼，振蕩、靜置、棄去上層有機相，將下層清液減壓蒸 幹，水溶、用微孔濾膜過濾，用水定容，潤旋混合1分鐘後得清液備用。
[0037] 採用標準加入法進行回收率的實驗，結果列於表1。實驗結果表明，本發明所建立 的方法具有較好的準確度和精密度，回收率分別為97. 79%?102. 13%，RSD在1. 8%? 4.6%,且樣品前處理簡單，分析時間短，不需使用大型儀器，可用於牛奶樣品中H聚氯 胺的快速檢測。
[0038] 表1牛奶中H聚氯胺的測定結果（n=5)
[0039]
【權利要求】
1. 一種基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 步驟1)，移取納米金溶液和含有三聚氰胺的溶液於一離心管中，充分混勻，作用5分鐘 使得納米金達到最佳的團聚態； 步驟2)，移取上述納米金溶液和三聚氰胺溶液的混合溶液於化學發光池中，採用靜態 注射的方式注入魯米諾-過氧化氫化學發光試劑，通過IFFL-D流動注射化學發光分析儀 測定並記錄其化學發光強度，根據測定結果進行判定。
2. 根據權利要求1所述的基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，其特徵在 於，所述的納米金溶液中的納米金的粒徑為2. 6nm，濃度為5. OX l(T7mol/L。
3. 根據權利要求1所述的基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，其特徵在 於，所述的魯米諾-過氧化氫化學發光試劑選擇魯米諾的濃度為4Xl(T5m〇l/L，過氧化氫 濃度為4X l(T2m〇l/L，魯米諾和過氧化氫的體積比為2:1。
4. 根據權利要求1所述的基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，其特徵在 於，所述的魯米諾-過氧化氫化學發光試劑的pH值為12. 0。
5. 根據權利要求1所述的基於納米金化學發光快速檢測三聚氰胺的方法，其特徵在 於，所述的魯米諾-過氧化氫化學發光試劑用魯米諾-高碘酸鉀化學發光試劑代替。
【文檔編號】G01N21/76GK104359897SQ201410576585
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】齊瑩瑩, 修福榮 申請人:福建工程學院