脂加氧酶活性降低的大麥的製作方法

2023-05-30 20:19:31

專利名稱：脂加氧酶活性降低的大麥的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術領域的進展，其公開了兩個脂加氧酶(LOX)LOX-I和 L0X-2的合成具有缺陷的大麥植物及其產品，由此提供了用於多種用途的新原料。當例如用於飲料生產中時，所述原料有利於開發用於生產更具特色且風味更穩定的啤酒的新生產能力，所述啤酒中累積的異味化合物反式-2-壬烯醛(T2N)水平顯著降低，並且還具有僅包含低水平T2N潛能(T2Np0tential)的額外優點。
背景技術：
大部分啤酒是以生長於世界許多地方的單子葉作物大麥(Hordeum vulgare, L.) 為基礎生產的。大麥的種植不僅是因為其作為工業產品(例如啤酒)的來源的經濟重要性， 而且還因為它是動物飼料的來源。遺憾的是，還沒有用於製備完全缺乏給定基因和相應蛋白的表達的轉基因大麥植物的方法。通常，對於大麥，反義技術的運用可用於產生仍然表達一些所述蛋白的轉基因植物(參見，例如Robbins等人，1998 Jtahl等人，2004 ；Hansen等人，2007)。此外，還沒有開發出在大麥植物中利用嵌合RNA/DNA或定點突變產生方法製備特定突變體的有效方法。事實上，沒有報導在大麥中由寡核苷酸成功引導基因靶向的單個實例。Iida和Terad乂2005) 指出已經在玉米、菸草和水稻中進行了由寡核苷酸引導的基因靶向，但卻沒有在大麥中進行，並且所有這些情況下都使用ALS基因作為靶標。部分研究結論是，經適當改進的策略是否可用於可直接選擇性基因(例如ALS基因)以外的其它基因中還有待觀察。利用鋅指核酶的靶向誘變代表了可在將來用於研究基礎植物生物學或修飾農作物的另一個工具 (Durai 等人，2005 ；Tzfira and White, 2005 ；Kumar 等人，2006)。在這種情況下，誘變也沒有繼續進行或者成功地應用於大麥。然而，可以通過利用化學處理或輻射，例如利用疊氮化鈉(NaN3,圖1)處理的隨機誘變法製備大麥突變體。一個實例是為了鑑定低肌醇六磷酸(phytate)突變體而用妝隊誘變大麥粒並選擇高水平游離磷酸(Rasmussen and Hatzack，1998)；從2，000個篩選的麥粒中總共鑑定出10個突變體。然而，在NaR處理後鑑定特定突變體需要有效的篩選方法，且並非總能成功。1970年，分離出了造成啤酒中紙板樣風味的分子，經鑑定為T2N，這是一種揮發性 C9烯烴醛(Jamieson and Gheluwe, 1970) 0由於人體內T2N的味覺閾值極低(之前測定為約0. 7nM或0. Ippb (Meilgaard，1975))，因此即使醛水平極低的產品也會因為該產品的異常味道而被認為是老化產品。然而，在新鮮啤酒中T2N水平通常非常低(Lermusieau等人， 1999)，因此推測在儲藏過程中，可從T2N加合物釋放游離T2N (Nyborg等人，1999)。隨後觀察到麥芽汁中的T2N潛能與產品儲藏後的T2N形成相關(Kuroda等人，2005)，該觀察結果支持了上述推測。
大麥粒包含三種LOX 酶=LOX-U L0X-2 和 L0X-3 (van Mechelen 等人，1999)。 L0X-1催化由亞油酸形成T2N和三羥基十八碳烯酸(縮寫為THA)兩者的前體9-氫過氧化十八碳二烯酸(9-HP0DE ；參見圖2中LOX通路的部分綜述)。L0X-2主要催化由亞油酸轉化為13-HP0DE，其進一步被代謝成具有約0. 4-ppm高味覺閾值的C6醛(Meilgaard，見上文)。L0X-3作用可能與本申請無關，原因有兩個大麥粒中相應基因的表達水平非常低，和 L0X-3的產物特異性仍不清楚。作為對上述數據的支持，數個報導已經指出T2N經由以下生化途徑而產生，其包括先通過L0X-1的催化將亞油酸轉化為9-HP0DE，然後通過9-過氧化氫物裂解酶作用裂解 9-HP0DE (參見，例如 Kuroda 等人，2003，2005 ；Noodermeer 等人，2001)。麥芽中的總LOX活性和麥芽汁的壬烯醛潛能之間似乎沒有關聯。然而，推測L0X-1 活性和麥芽汁T2N潛能之間具有顯著關聯，原因主要是認為L0X-2在麥芽汁中形成T2N潛能方面的活性較差(Kuroda等人，2005)。如上文所述，在圖2中顯示了集中於由亞油酸至T2N的生化反應的部分LOX通路。 L0X-1酶的主要活性涉及亞油酸至9-HP0DE的轉化，而9-HP0DE是導致T2N形成的生化通路的上遊代謝物。相比之下，L0X-2的主要活性涉及亞油酸至13-HP0DE的轉化，而13-HP0DE 獨立於上文提及的形成T2N的生化通路。注意，L0X-1和L0X-2酶可利用亞麻酸作為底物， 但由於相應通路不導致T2N形成，而使該活性在本申請的範圍之外。認為麥芽中的主要LOX活性由L0X-1產生(參見，例如Kuroda等人，2003)。已經開發出了特徵在於L0X-1活性降低或者沒有L0X-1活性的數種不同的大麥植物。例如，Douma, A. C.等人的PCT申請WO 02/053721中公開了低L0X-1活性的大麥粒和大麥植物。並且，在Breddam，K.等人的W02005/087934中關注了 L0X-1活性有缺陷的兩種不同大麥突變體剪接突變體和具有提前終止密碼子(premature translational stop codon)的突變體。如圖1所示，通過突變植物的繁殖和選擇鑑定出了這些突變體。上述突變體是通過篩選NaR誘變的大麥而鑑定出的，而Hirota，N.等人在EP 1609866中描述了通過篩選收集的大麥當地品種鑑定出的沒有L0X-1活性的大麥植物。已知合成低水平LOX的數個突變植物樣本。然而，沒有描述數個脂加氧酶活性具有缺陷的大麥植物，例如沒有描述L0X-1和L0X-2活性均有缺陷的大麥植物。能夠對植物進行遺傳操作的方法常特異於特定的植物種類，因此，儘管已知少數水稻植物、大豆植物或擬南芥植物包含低水平的L0X，但用於製備此類植物的方法不能用於產生低LOX活性或無 LOX活性的大麥植物。此外，一個植物物種的LOX突變體與另一植物物種的LOX突變體相比可能具有不同的性質。發明概述麥芽汁是生產基於麥芽的飲料(例如啤酒)過程中關鍵的複雜液體(參見圖3，其提供了對整個啤酒製備過程的概述)。由L0X-1活性具有缺陷的大麥植物製備的麥芽汁的實際特徵在於包含顯著水平的T2N潛能，雖然所述水平低於由野生型大麥製備的麥芽汁。 由於麥芽汁中的所述潛能與儲藏後啤酒中形成的T2N相關(Kuroda等人，2005)，因此需要可用於生產T2N潛能的水平顯著降低的麥芽汁的大麥植物。已經描述了通過熱處理降低LOX活性的方法。然而，所述熱處理通常在大麥發芽 (malting)和/或麥芽汁的製備過程中進行，因此，LOX活性的產物可以在大麥中聚集直至進行熱處理。大麥的分析表明，大麥中存在顯著量的LOX活性產物，甚至在大麥發芽前也是如此(ffackerbauer and Meyna, 2002)。本發明提供了 L0X-1和L0X-2活性具有缺陷的大麥植物，並公開了所述大麥植物具有數個意義深遠且驚人的優勢。如上文所述，Kuroda等人(見上文)描述了麥芽中的LOX 活性與麥芽汁中的T2N潛能之間缺乏關聯性，並將此歸因於L0X-2活性的存在。Kuroda等人Q005)因此認為L0X-2在T2N潛能形成方面的作用無關緊要。釀造領域的研究者已致力於了解控制游離T2N和T2N潛能形成的要素。因此，當本發明提供試驗證據以公開利用L0X-1和L0X-2活性均有缺陷的大麥植物在用於生產顯示出非常低水平的T2N潛能的麥芽汁中的有益作用時，這非常令人意外，甚至令人困惑。同時還發現，由L0X-1和L0X-2活性均有缺陷的大麥植物製備的麥芽汁中的游離T2N水平低於由L0X-1無效大麥製備的麥芽汁。本發明的一個目的是提供由大麥植物或其部分製備的飲料，其中所述飲料包含非常低水平的T2N潛能，並且其中所述大麥植物或其部分包含導致L0X-1活性的功能完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變，和導致L0X-2活性的功能完全喪失(例如活性L0X-2酶完全喪失)的第二突變。本發明還旨在提供用於製備本發明的飲料的大麥植物。因此，本發明描述了大麥植物或其部分的產生，其中，所述大麥植物或其部分包含導致L0X-1活性的功能完全喪失 (例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變，和導致L0X-2活性的功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變。此外，本發明還提供了包含經加工的大麥植物或其部分的植物產品，其中所述植物包含導致L0X-1活性功能完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變和導致 L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變。不受限制地，上述植物產品可以為，例如麥芽組合物，或麥芽汁組合物，或飲料(例如基於麥芽的飲料，如啤酒或基於無醇麥芽的飲料)，或者基於大麥的飲料，或者基於麥芽和大麥和任選地其它成分的混合物的飲料。所述植物產品還可以為大麥糖漿、麥芽糖漿、大麥提取物和麥芽提取物。此外，本發明還涉及用於生產特徵在於T2N潛能水平非常低的飲料的方法，所述方法包括以下步驟(i)製備包含大麥植物或其部分的組合物，其中所述大麥植物或其部分包含導致 L0X-1活性功能完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變；(ii)將(i)的組合物加工成飲料；由此獲得特徵在於T2N潛能水平非常低的飲料。本發明還涉及大麥植物，其除了包含導致L0X-1活性功能完全喪失的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失的第二突變外，還包含一個或多個其它有用的突變。


圖1顯示了如何繁殖NaN3-誘變的大麥粒的一個實例。MO代的麥粒生長成為產生 Ml代麥粒的植物。可以播種這些麥粒用於形成產生M2代新麥粒的Ml植物。接著，培育M2 代植物並產生M3代麥粒。可以使M3代麥粒萌芽，用於例如分析萌芽M3植物的胚鞘。此外，還可以將源於M3植物的麥粒的花用在與大麥系或栽培品種的雜交中以獲得M4代植物。類似的附圖顯示在Breddam，K.等人的PCT專利申請W02005/087934的圖IA中。圖2顯示了用於亞油酸至T2N的轉化和降解的生化通路的圖示。L0X-1主要催化亞油酸轉化為9-HP0DE，9-HP0DE被酶促降解為順式壬烯醛。該化合物經自發的化學異構化成為T2N。L0X-2主要催化亞油酸轉化為13-HP0DE，13-HP0DE可以轉化為2-E-己烯醛(未顯不)。圖3顯示了優選的啤酒生長工藝的簡化圖示概要，其包括浸泡大麥穀粒(1)、發芽O)、烘於(3)、研磨乾燥的麥芽、糖化(5)、過濾(6)、在添加酒花的情況下煮沸麥芽汁(7)、在存在酵母的情況下發酵(8)、啤酒熟化(9)、啤酒過濾(10)、包裝，例如包裝到瓶、 罐等中(11)和貼標籤(1 。這些獨立的步驟可以分組成包括生產麥芽(1-3)、生產麥芽汁 G-7)、發酵(8-9)和製備成品啤酒(10-12)的部分。雖然圖示的是優選的方法，但也可以涉及省略一些所述步驟(例如可以省略過濾或者可以不加入酒花)，或者加入額外步驟(例如添加輔料、糖、糖漿或碳酸鹽)的其他方法。圖4顯示了 M3代㈧、M4代⑶和M5代(C)的萌芽麥粒中總LOX活性的比較結果。在從雙無效LOX突變體A689、L0X-1無效突變體D112和L0X-1無效育種系Ca211901 的萌芽麥粒分離的胚的提取物中測定所述活性。將相同樣本的熱失活提取物試樣作為試驗對照[C中L0X-1無效原始突變體D112O，L0X-l無效育種系Ca21190lO]。還顯示了所分析的植物樣本的L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖5顯示了用於測定萌芽48小時的大麥胚中形成的9-HP0DE和13-HP0DE的HPLC 分析的色譜圖。通過測定234nm的吸光度來檢測HP0DE，結果以相對吸光度單位(AU)表示。 與9-HP0DE和13-HP0DE對應的洗脫譜的峰用箭頭顯示。(A) 9-HP0DE和13-HP0DE標準品的色譜圖。(B)在由L0X-1無效突變體D112的萌芽胚製備的提取物中形成的HPODE的色譜圖。(C)在由雙無效LOX突變體A689(M4代)的萌芽胚製備的提取物中形成的HPODE的色譜圖。圖6顯示了用於測定微發芽(miCrO-malted)72小時的麥粒的胚中形成的9-HP0DE 和13-HP0DE的HPLC分析的色譜圖。通過測定234nm的吸光度來檢測HP0DE，結果以相對吸光度單位(AU)表示。與9-HP0DE和13-HP0DE對應的洗脫譜的峰用箭頭顯示。㈧在野生型cv. Barke中形成的9-HP0DE和13-HP0DE的色譜圖。(B)在L0X-1無效突變體Dl 12的胚的提取物中形成的HPODE的色譜圖。(C)在雙無效LOX突變體A689 (M5代)的提取物中形成的HPODE的色譜圖。圖7顯示了在野生型大麥cv. Power、L0X-1無效突變體D112和突變體A689的三個潛在雙無效LOX系(M5代)的微發芽樣本中形成的游離T2N的水平。圖中還包括所分析的大麥樣本的L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖8顯示了在由野生型cv. Power、L0X-1無效突變體Dl 12和雙無效LOX突變體 A689(M5代)的微發芽麥粒產生的煮沸麥芽汁樣本中形成的游離T2N的水平。還顯示了所分析的大麥樣本的L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖9顯示了在由野生型cv. Power、L0X-1無效突變體Dl 12和雙無效LOX突變體 A689 (M5代)的微發芽麥粒產生的煮沸麥芽汁樣本中的T2N前體水平。圖10顯示了在利用cv. Power,L0X-1無效突變體D112和雙無效LOX突變體A689的麥芽的200升規模的釀造試驗中產生的啤酒中的T2N前體水平。顯示了所使用的麥芽的 L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖11顯示了從通過大麥釀造產生的，或者通過常規發芽和糖化產生的200升規模的煮沸麥芽汁中採集的所示樣本的試樣中游離T2N水平的比較。顯示了所使用的原材料的 L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖12顯示了從通過大麥釀造產生的，或者通過常規發芽和糖化產生的200升規模的煮沸麥芽汁(參見圖11)中採集的所示樣本的試樣中T2N前體水平的比較。還顯示了所使用的原材料的L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖13顯示了利用所示大麥栽培品種和突變體作為原材料的200升規模的釀造試驗獲得的啤酒中T2N的形成。(A)單獨的大麥釀造啤酒分析，集中於強制老化(forced aging)過程中游離T2N的形成。水平虛線表示T2N的品嘗閾值水平(50ppt)。在獨立試驗中比較了大麥釀造和常規釀造的新鮮啤酒中T2N前體的水平(B)；在(C)中顯示了與在 37°C下保藏2周後的啤酒中游離T2N水平(黑柱)相比，新鮮啤酒中游離T2N的水平(白柱)。還顯示了所使用的原材料的L0X-1和L0X-2基因型(wt 野生型)。圖14顯示了在大麥釀造啤酒㈧和利用正常麥芽生產的啤酒⑶中THA的水平和比例的比較。9，12，13-THA和9，10，13-THA分別通過LOX-1和L0X-2通路的部分未知的反應產生。圖15顯示了利用cv. Power (黑柱),L0X-1無效(灰柱)和雙無效L0X(白柱)原料的200升規模的大麥釀造啤酒中，隨時間形成的「紙質」異味(A)和「老化」異味的圖示。 專業啤酒品嘗小組利用0(無異味)至5(異味極大)的評分對啤酒進行了評價。圖16顯示了在大麥釀造啤酒(A)和基於麥芽的啤酒(B)中如何形成泡沫。在這兩個試驗中，利用商業化的儲藏啤酒作為對照(粗虛線)，對利用cv. Power (細虛線)、L0X-1 無效(細實線)和雙無效LOX(粗實線)為原料生產的啤酒進行了比較。圖17顯示了大麥基因組基因L0X-2的結構，集中於跨越起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)的區域。發現這個32^-bp序列由6個外顯子(實心框)和5個內含子 (線)組成。雙無效LOX突變體A689中經鑑定的L0X-2基因的突變用垂直箭頭表示。值得注意的是，雙無效LOX突變體A689在L0X-1基因中還包含提前終止密碼子(參見美國專利第7，420，105號圖15例示的突變體Dl 12)。圖18顯示了基因型分析如何能夠用於鑑定LOX無效突變體。焦點涉及雙無效LOX 大麥植物的SNP輔助檢測，即實現L0X-1基因的第3474位的G — A突變和L0X-2基因的第 2689位的G — A突變的組合檢測的方式。㈧利用所示引物對由所示模板DNA擴增的PCR 片段(即，可以使用引物FL1035和FL1039擴增野生型L0X-2基因，而可以使用引物FL1034 和FL1039擴增無效L0X-2突變基因)的瓊脂糖凝膠電泳圖。(B)說明在存在所述無效LOX 突變的情況下，分別利用引物對FL820和FL823 (包含與如星號所示的無效L0X-1特異性突變互補的3』鹼基)，和引物對FL1034(包含與如星號所示的無效L0X-2突變互補的3』鹼基)和FL1039的PCR如何能夠產生166bp和200bp的PCR產物的示意圖。(C)標準DNA (泳道1和4)以及利用上述用於檢測無效L0X-1和無效L0X-2突變的引物組合，對雙無效LOX 突變體A689進行PCR擴增的DNA (泳道幻的瓊脂糖凝膠電泳結果的描述。野生型大麥的 PCR反應不產生相應的PCR產物(泳道3)。
圖19顯示了對雙無效LOX大麥雜交的子代植物進行SNP輔助分析的實例。(A)利用上文圖18詳述的引物組合(S卩，用於基於PCR的無效L0X-1和無效L0X-2突變檢測的引物)的示意圖。從左開始的第一泳道(如泳道下方所示的條帶號「a」)不包含表示存在所述兩個突變的特異性PCR產物[即兩個模板區具有野生型(W)序列]，而下一泳道(條帶號 「b」)突出顯示了源自無效L0X-1突變植物(M)的PCR產物。第三泳道(條帶號「C」)源自 L0X-2無效植物，第四泳道(條帶號「d」)源自雙無效LOX植物。(B)野生型、L0X-1無效、 L0X-2無效和雙無效LOX大麥基因型的瓊脂糖凝膠電泳。對上文(A)中描述的條帶圖的分析表明，泳道2、6、10、12、18和22含有從攜帶了無效L0X-1突變的植物擴增的產物(泳道下方標有「b」)；而泳道1、3、9、11、19、21和23含有從攜帶了無效L0X-2突變的植物擴增的產物(泳道下方標有「C」)。泳道7、15和17含有來自攜帶了 L0X-1和L0X-2基因突變組合的雙無效LOX植物的產物(泳道下方標有「d」)。泳道4、5、8、13、14、16和20不含從具有任一無效LOX等位基因的植物擴增的產物(泳道下方標有「a」)，即所述植物的所測序列是野生型的。標準DNA在標記為「MW」的泳道分離。發明詳述定義在隨後的說明書、附圖和表格中使用了許多術語。為了提供包括給出這些術語的範圍的說明書和權利要求書，提供了下列定義本文使用的「一」可以指一個或多個，這取決於其使用的上下文。術語「農學特徵」描述了有助於形成所述植物的性能或經濟價值的植物表型或遺傳特徵。這種特徵包括抗病性、抗蟲性、抗病毒性、抗線蟲性、耐旱性、高鹽度耐受性、產量、 株高、成熟天數、麥粒分級(即麥粒的大小分級)和麥粒的含氮量等。「反義核苷酸序列」指方向與核苷酸序列正常編碼的5' -3'方向相反的序列。當存在於植物細胞中時，反義DNA序列優選降低內源基因核苷酸序列的正常表達，並且可以破壞對應天然蛋白的產生。在大麥植物中，反義核苷酸的表達通常僅降低所述天然蛋白的表達但不抑制其表達。與啤酒和基於大麥的飲料的製造工藝相關，特別是用於描述發芽(malting)過程時，術語「大麥」是指大麥粒。在其它所有情況下，除非另有說明，否則「大麥」是指包括任何培育品系或栽培品種或變種(variety)在內的大麥植物(Hordeum vulgare，L.)，而大麥植物的部分可以是大麥植物的任何部分，例如任何組織或細胞。「抗病性」指植物避免出現作為植物病原體相互作用的結果的疾病症狀。這樣阻止了病原體引起植物疾病和相關的疾病症狀。或者，由病原體引起的疾病症狀被減到最小，或降低，甚至被預防。本文使用的術語「雙無效L0X」是指完全喪失L0X-1活性功能並且完全喪失L0X-2 活性功能。因此，「雙無效L0X」可以表徵為完全喪失功能性L0X-1酶和完全喪失功能性 L0X-2酶。因此，「雙無效LOX大麥植物」是包含導致L0X-1活性功能完全喪失的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失的第二突變的大麥植物。因此，「雙無效LOX大麥植物」可以表徵為完全喪失功能性L0X-1酶和完全喪失功能性L0X-2酶。類似地，「雙無效LOX麥粒」是包含導致L0X-1活性功能完全喪失的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失的第二突變的麥粒，等等以此類推。因此，「雙無效LOX麥粒」可以表徵為完全喪失功能性L0X-1酶和完全喪失功能性L0X-2酶。在本文中定義的「穀類」植物是禾本科(Graminae)植物家族的成員，其中種植禾本科植物主要是為了獲取其含澱粉的種子或麥粒。穀類植物包括，但不限於大麥(Hordeum 屬)、小麥(Triticum屬)、稻(Oryza屬)、玉米(Zea屬)、黑麥(Secale屬)、燕麥(Avena 屬)、高梁(Sorghum屬)和黑小麥(Triticale，黑麥-小麥雜交種)。在有關特定核酸的上下文中，「編碼」或「編碼的」表示包含用於翻譯成特定蛋白的信息。編碼蛋白的核酸或多核苷酸可以包含位於核酸翻譯區中的非翻譯序列(例如內含子)，或者可以缺乏這種插入的非翻譯序列(例如在cDNA中)。利用密碼子對編碼蛋白的信息進行說明。本文在有關核酸的上下文中使用的「表達」應理解為來源於核酸片段的正義mRNA 或者反義RNA的轉錄和累積。在有關蛋白的上下文中使用的「表達」指將mRNA翻譯成多肽。術語「基因」指參與產生多肽鏈的DNA片段；其包括在編碼區之前和之後的區域 (啟動子和終止子)。此外，植物基因通常由被內含子中斷的外顯子組成。在轉錄成RNA之後，通過剪接除去內含子以產生成熟的信使RNA(mRNA)。通常通過充當剪接過程的剪接信號的共有序列確定外顯子和內含子之間的「剪接位點」，剪接過程由從初級RNA轉錄本刪除內含子和在切除去內含子的任一側連接或融合剩餘RNA的末端組成。在一些情況下，可選或不同的剪接模式可以從同一單個DNA延伸段產生不同的蛋白質。天然基因被可以稱為「內源基因」。本文使用的「異源」在指核酸時表示來源於外來物種的核酸，或者如果源於相同物種，則是通過人為幹預在組成和/或基因組位點方面對其天然形式進行充分修飾的核酸。本文使用的術語「萌芽(germination)」表示大麥粒在各種組合物中，例如在見於自然界的普通土壤中開始或恢復生長。因此，萌芽胚是正在萌芽的胚。萌芽也可以在置於培養室等的盆內土壤中進行，或者，例如可以在置於標準實驗室皮氏培養皿的溼過濾紙上進行，或者在發芽(malting)的過程中進行(例如麥芽製造廠的浸泡罐或萌芽盒內進行)。 按照一般理解，萌芽包括麥粒的水合作用、麥粒的膨脹和誘導胚生長。影響萌芽的環境因素包括溼度、溫度和氧水平。觀察根和芽的發育。本文使用的術語「分離(的)」表示所述物質是從其原始環境中移出的。例如，存在於活生物中的天然存在的多核苷酸或者多肽不是分離的，而與天然系統中的一些或全部共存物質分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或者多肽可以是組合物的一部分，但它們仍然是分離，原因是這種載體或組合物不是其天然環境的一部分。術語「麥粒」被定義為包括穀類穎果，也稱為內部種子(internal seed)、外稃和內稃。在大多數大麥品種中，外稃和內稃附著於穎果上，而且是脫粒後的麥粒的一部分。但是，還存在裸麥(naked barley)品種。在這些品種中，穎果沒有外稃和內稃，因此像小麥一樣脫粒。術語「麥粒」和「穀粒」在本文中可以互用。「穀粒發育」是指開始於花粉細胞對卵細胞受精的過程。在受精過程中，藉助或不藉助液泡尋靶(vacuole targeting)而將代謝儲備物(例如糖、寡糖、澱粉、酚類、胺基酸和蛋白)儲藏至麥粒(穀粒)的各種組織，例如胚乳、外種皮、糊粉和角質鱗片，由此導致麥粒 (穀粒)膨脹，麥粒(穀粒)飽滿，並且結束於麥粒(穀粒)乾燥。
術語「功能完全喪失」(完全喪失功能)是指缺乏給定酶活性。因此，L0X-1和L0X-2 活性「功能完全喪失」的大麥植物是沒有可檢測到的L0X-1和L0X-2活性的大麥植物。雖然L0X-1和L0X-2可具有其它活性，但在本發明中，L0X-1和L0X-2活性是通過測定由亞油酸形成9-HP0DE和13-HP0DE的試驗過程確定的。優選地，按照下文實施例4的描述測定由亞油酸形成的9-HP0DE和13-HP0DE。應該利用萌芽胚的蛋白提取物測定所述活性。在本發明中，當利用亞油酸作為底物，產生出的色譜峰對應於小於5%、優選小於3%的圖5A所示的標準品9-HP0DE峰，和/或產生出的色譜峰對應於小於5%，優選小於3%的圖5A所示的標準品13-HP0DE峰，則認為在使用實施例4所述的試驗時，沒有可檢測到的L0X-1和L0X-2 活性。實現LOX活性功能完全喪失的分子方法包括產生引起所述酶的轉錄本完全缺失或相應的編碼酶完全缺失的突變，或者產生使所編碼的酶完全失活的突變。術語「L0X-1活性」是指大麥L0X-1酶的酶活性。特別地，在本發明中，「L0X-1活性」是由亞油酸至9-HP0DE且較小程度地至13-HP0DE的酶促雙加氧作用。儘管L0X-1能夠催化其它反應，但為了確定本發明的L0X-1的活性，僅應考慮形成9-HP0DE和13-HP0DE的活性。圖2概述了亞油酸被轉化為9-HP0DE的生化通路。術語「L0X-2活性」是指大麥L0X-2酶的酶活性。特別地，在本發明中，「L0X-2活性」是由亞油酸至13-HP0DE且較小程度至9-HP0DE的酶促雙加氧作用。儘管L0X-2能夠催化其它反應，但為了確定本發明的L0X-2的活性，僅應考慮形成13-HP0DE和9-HP0DE的活性。圖2概述了亞油酸被轉化為13-HP0DE的生化通路。術語「麥芽飲料」或者術語「基於麥芽的飲料」是指利用麥芽製備的飲料，優選通過包括用熱水溫育麥芽的步驟的方法製備的飲料。麥芽飲料可以為，例如啤酒或無酒精麥芽飲料(maltinas)。術語「發酵的麥芽飲料」是指已經發酵的，即與酵母溫育的麥芽飲料。「 (麥粒)發芽」是在包括但不限於麥芽製造廠的浸泡池和萌芽箱內的受控環境條件下進行的特殊萌芽形式。根據本發明的方法，發芽在浸泡大麥粒期間和/或已經浸泡大麥粒之後開始發生。可以通過乾燥大麥粒，例如在烘乾過程中停止發芽過程。在還沒有烘乾的情況下，麥芽被稱為「綠色麥芽」。應理解，由雙無效LOX大麥製備的麥芽組合物包含雙無效LOX麥芽，例如純的雙無效LOX麥芽或者包含雙無效LOX麥芽的任何麥芽混合物。可以對麥芽進行加工，例如通過碾磨而加工，並由此被稱為「經碾磨的麥芽」或「麵粉」。「糖化」是經碾磨的麥芽在水中的溫育。優選在特定溫度和特定體積的水中進行糖化。水的溫度和體積是重要的，因為其影響來源於麥芽的酶活性的下降速率，並由此特別影響能夠發生的澱粉水解的量；蛋白酶作用也可具有重要性。糖化可以在輔料存在下發生，應該理解輔料包含除麥芽以外的任何碳水化合物源，例如但不限於作為完整麥粒或者經加工的產品(例如粗麵粉或澱粉)的大麥(包括雙無效LOX大麥)、大麥糖漿或玉米或水稻。上文提及的所有輔料都主要用作提取物的其它來源(在麥芽汁煮沸的過程中常添加糖漿)。 釀酒廠內輔料的加工要求取決於使用的輔料的狀態和類型，並且特別是澱粉膠化或液化的溫度。如果膠化溫度超過正常的麥芽糖化溫度，則澱粉在添加至醪液(mash)中之前就被膠化和液化。「突變」包括基因的編碼和非編碼區的缺失、插入、取代、顛換(transversion)和點突變。缺失可以是整個基因或者僅基因的一部分的缺失，其中，非編碼區優選為啟動子區或者終止區或者內含子。點突變可涉及一個鹼基或者一個鹼基對的變化，並且可產生終止密碼子、移框突變或胺基酸取代。體細胞突變是指僅發生在植物的某些細胞或組織中的且不遺傳至下一代的那些突變。生殖細胞突變可以見於植物的任何細胞中並且是遺傳的。參考本文的圖1，其顯示了在育種程序中如何繁殖突變大麥穀粒的概述，M3代穀粒和其直接繁殖的穀粒或者包括其植物在內的任意子代可以稱為「原始突變體(raw mutant)」。此外，仍然參照本文圖1，術語「育種系」是指M4代的穀粒和包括其植物在內的任意子代，其可能是與栽培品種植物的雜交結果，或者是與具有單獨的特定特徵的另一育種系雜交的結果。術語「無效LOX (或LOX無效)，，是指LOX編碼基因中存在引起所編碼的LOX酶 (L0X-1或L0X-2)的功能完全喪失的突變。在LOX編碼基因中產生提前終止(無義)密碼子的突變僅代表能夠實現LOX活性功能完全喪失的一種機制。實現LOX酶的功能完全喪失的分子方法包括產生引起所述酶的轉錄本完全缺失的突變，或者引起所編碼的酶完全失活的突變。與植物有關的「無效LOX(或LOX無效)」是指指定LOX酶的功能完全喪失的植物。「可操作地連接」是用以指兩個或更多個核酸片段在單個多核苷酸上的關聯，從而使一個片段的功能受另一個的影響的術語。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達，即編碼序列位於啟動子的轉錄控制下時，啟動子可操作地與編碼序列連接。可以以正義或反義方向將編碼序列可操作地與調節序列連接。「PCR」或「聚合酶鏈式反義」是本領域技術人員熟知的用於擴增特定DNA片段的技術(Mullis, K. B.等人的美國專利第4，683，195和4，800，159號)。「植物」或「植物材料」包括植物細胞、植物原生質體和可以再生出大麥植物的植物細胞組織培養物，包括植物愈傷組織和在植物中的完整植物細胞，或植物部分，例如胚、花粉、胚珠、花、麥粒、葉、根、根尖、花葯，或植物的任何部分或產品。術語「植物產品」表示由植物或植物部分的加工產生的產品。因此例如，所述植物產品可以是麥芽、麥芽汁、發酵或未發酵飲料、食品或飼料產品。本文使用「重組體」涉及蛋白時表示源於外來物種的蛋白，或者如果來源於相同物種，則表示通過有意的人為幹預對其天然形式的組成進行充分修飾的蛋白。本申請含義內的「啤酒品嘗專家小組」是在品嘗和表述啤酒風味(主要集中於醛、 紙樣味道和陳舊(old)味道)方面受過全面訓練的專家小組。雖然存在許多用於評價風味成分的分析工具，但難以通過分析來評價風味活性組分的相對顯著性。但是，此類複雜的性質可以由品嘗專家進行評價。品嘗專家的持續訓練包括品嘗並評價標準啤酒樣本。術語「剪接位點」表示基因的外顯子和內含子之間的界限。因此，剪接位點可以是從外顯子至內含子的邊界(被稱為「供體位點」)，或者是從外顯子分隔內含子的邊界(被稱為「受體位點」)。植物的剪接位點通常包括共有序列。內含子的5'末端通常由保守性GT 二核苷酸(mRNA中為⑶)組成，內含子的3'末端通常由保守性二核苷酸AG組成。因此，內含子的5'剪接位點包含內含子的5'末端，而3'剪接位點包含內含子的3'末端。優選地，在本發明中，內含子的剪接位點是由內含子的最5'端的二核苷酸(通常為GT)組成的 5'剪接位點，或者由內含子的最3'端的二核苷酸(通常為AG)組成的3'剪接位點。除非另有指明，否則「T2N」表示游離形式的反式-2-壬烯醛(T2N)。T2N有時還指 2-E-壬烯醛。術語「T2N潛能(T2N potential) 」描述的是能夠在一個或多個反應中釋放T2N，或者被轉化成T2N的化學物質。在本發明中，T2N潛能被定義為在100°C、pH4.0溫育2小時的過程中釋放至溶液，例如麥芽汁或者啤酒中的T2N的濃度。實際上，測定起始T2N濃度， 之後使溶液在100°C、pH4溫育2小時，然後測定T2N濃度。起始T2N濃度和最終T2N濃度之間的差異被稱為T2N潛能。熱處理、酸性處理引起T2N潛能例如「T2N加合物」釋放T2N， 其中T2N加合物用以描述與一種或多種物質，包括但不限於蛋白、亞硫酸鹽、細胞碎片或細胞壁等結合的T2N。T2N加合物本身通常不會被人感覺為異味。但是，從所述T2N加合物釋放的T2N可以產生異味。「組織培養物」表示包含相同或不同類型的分離細胞的組合物，和組織成為植物的部分(例如原生質體、愈傷組織、胚、花粉和花葯等)中的那些細胞的集合。「轉化」指將DNA插入生物體中以便將DNA作為染色體外元件(沒有整合併穩定遺傳)或染色體組成部分(在遺傳學上穩定遺傳)保持。除非另有說明，否則本文用於轉化大腸桿菌的方法是基於CaCl2的方法(Sambrook and Russel，見上文)。為了轉化大麥，除了使用另一個栽培種類作為宿主外，優選按照Tingay等人(1997)和Wang等人Q001)的描述進行農桿菌介導的轉化。「轉基因」是通過轉化過程導入基因組的基因。本文使用的「轉基因的」包括是指已經通過引入異源核酸而被修飾的細胞，或由如此修飾的細胞衍生而來的細胞。因此，例如，轉基因細胞表達未以相同形式見於天然形式的細胞中的基因，或者表達由於有意的人為幹預而異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。本文使用的與植物，特別是大麥植物有關的術語「轉基因」不包括通過傳統植物育種方法，例如基於NaN3的誘變，以及通過沒有刻意人工幹預的天然發生事件產生的細胞改變。術語「野生大麥」，即Hordeum vulgare ssp. spontaneum被認為是當今栽培形式大麥的祖先。認為大麥從野生至栽培狀態的轉變與該植物向「大麥當地品種」的馴化同時發生。這些大麥當地品種在遺傳上比野生大麥更接近於現代栽培品種。術語「野生(型)」大麥是指按照傳統方式產生的大麥植物。優選地，所述術語是指已經衍生出本發明大麥植物的大麥植物，即親本植物。野生型大麥粒通常可作為「栽培品種」或「變種/品種」(即那些由國家植物育種組織列出的在遺傳上相似的麥粒)而獲自例如種子公司。儘管可以獲得幾個L0X-1無效大麥栽培品種(例如cv. Chamonix和 cv. Charmay)，但為了更好地理解本發明，所有的L0X-1無效、L0X-2無效和雙無效LOX植物在本文中都被認為是突變植物而非野生型植物。術語「栽培品種」和「變種」在本文中可互換使用。術語「麥芽汁」表示麥芽，例如碾磨麥芽或綠色麥芽或者碾磨的綠色麥芽的液體提取物。在大麥釀造中，麥芽汁還可以通過將未發芽大麥的提取物與水解大麥成分的酶混合物一起溫育而製備。除所述麥芽或源自大麥的提取物外，還可以由麥芽和額外的成分，例如部分轉化為可發酵糖的其它含澱粉物質製備所述液體提取物。麥芽汁通常通過糖化，隨後任選的「噴射提取(sparging)，，(即在用熱水糖化後從用過的穀粒提取殘留糖和其它化合物的過程)而獲得。噴射提取通常在濾桶、麥芽漿過濾器或可以從用過的穀粒分離提取水的另一種設備內進行。糖化後獲得的麥芽汁通常被稱為「第一麥芽汁」，而噴射提取後獲得的麥芽汁通常被稱為「第二麥芽汁」。如非特別指明，術語麥芽汁可以是第一麥芽汁、第二麥芽汁或者二者的組合。在啤酒生產過程中，麥芽汁通常與酒花一起煮沸。沒有與酒花一起煮沸的麥芽汁還可以稱為「甜麥芽汁」，而與酒花一起煮沸的麥芽汁可被稱為「煮沸的麥芽汁」。大麥植物大麥是一類植物。「野生大麥」(Hordeum vulgare ssp. Spontaneum)被認為是當今栽培大麥的祖先。認為大麥從野生態至栽培態的轉變與多個基因座的等位基因頻率的重要變化同時發生。農場主積極選擇稀少的等位基因和新突變事件，並很快在稱作「大麥當地品種」的馴化植物群體中確立新特徵。與野生大麥相比，這些大麥在遺傳上與現代栽培品種更密切相關。直至十九世紀晚期，大麥當地品種才作為近交系和雜種分離子的高度異源混合物出現，其包括由較早世代的隨機雜交而來的少數植物。在現代農業中，大多數當地品種已經被純系栽培品種取代。剩餘當地品種的特徵在於中等水平或高水平的遺傳多樣性。最初， 「現代大麥」栽培品種代表了自當地品種的選擇。後來，這些栽培品種來源於確定的純系，例如不同地理來源的純系之間連續多輪的雜交。最後，導致在許多，也可能是所有現代農作物的遺傳基礎顯著縮小。與當地品種相比，現代大麥栽培品種有多個改良的性質(Nevo，1992 ； von Bothmer等人，1992)，例如但不限於以下(i)隱藏和裸露的麥粒；(ii)種子休眠；(iii)抗病性；(iv)環境耐受性(例如對乾旱或土壤pH的耐受性)；(ν)賴氨酸和其它胺基酸的比例；(Vi)蛋白含量；(vii)氮含量；(viii)碳水化合物組成；(ix)大麥醇溶蛋白的含量和組成；(χ) (1-3，1-4)_β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖的含量；(xi)產率(xii)麥稈硬度；(xiii)株高。在本發明中，術語「大麥植物」包括任何大麥植物。因此，本發明涉及包含導致 L0X-1活性功能完全喪失的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失的第二突變的任何大麥植物。因此，本發明涉及包含導致功能性L0X-1酶完全喪失的第一突變和導致功能性 L0X-2酶完全喪失的第二突變的任何大麥植物。然而，優選用於本發明的大麥植物是現代大麥栽培品種或純系。本發明使用的大麥栽培品種可以是，例如選自 Sebastian、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、 Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、 Ariel、Lenka> Maresi> Steffi、Gimpel> Cheri> Krona> Camargue> Chariot、Derkado> Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、K0U A、Swan Hals>Kanto Nakate GolcUHakata No. 2、 Kirin-choku No. 1、Kanto late Variety Gold、Fuji Ni jo、New Golden、Satukio Ni jo、 Seijo No. 17、Akagi Ni jo、Azuma Golden、Amagi Ni jpo、Nishino Gold、Misato golden、 Haruna Ni jo、Scarlett 禾口 Jersey 組成的組，優選來自 Haruna Ni jo、Sebastian、Celeste、Lux、Prestige、SalooruNeruda 禾口 Power 組成的組，優選來自 Harrington、Klages、Manley、 Schooner、Stirling、Clipper、Frankl in、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、 Gimpe1、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A> Swan Hals>Kanto Nakate GolcUHakata No. 2、Kirin_choku No. 1、Kanto late Variety GolcUFuji Ni jo、New Golden、Satukio Ni jo、Seijo No. 17、Akagi Ni jo、Azuma Golden、 Amagi Ni jpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Ni jo、Scarlett 禾口 Jersey 組成的組，優選來自 Haruna Ni jo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power > Quench、NFC Tipple、Barke> Class 禾口 Vintage 組成的組。因此，在本發明的一個實施方式中，所述大麥植物是包含導致LOX-I活性功能完全喪失(例如功能性LOX-I酶完全喪失)的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變的當代大麥栽培品種(優選選自上文描述的大麥栽培品種組的栽培品種)。因此，在該實施方式中，優選所述大麥植物不是大麥當地品種。所述大麥植物可以是任何適合的形式。例如，本發明的大麥植物可以是能活的大麥植物、乾燥的植物、均質化的植物或者經碾磨的大麥粒。所述植物可以是成熟的植物、胚、 萌芽的麥粒、發芽的麥粒或經碾磨的發芽麥粒等。大麥植物的部分可以是所述植物的任何合適的部分，例如麥粒、胚、葉、莖、根、花或其小部分(fraction)。所述小部分可以是，例如麥粒、胚、葉、莖、根或花的部分。大麥植物的部分還可以是勻漿的小部分或者經碾磨的大麥植物或麥粒的小部分。在本發明的一個實施方式中，大麥植物的部分可以是所述大麥植物的細胞，優選可以在體外組織培養物中繁殖的活細胞。特別地，在一個實施方式中，所述細胞可以是不能成熟為完整大麥植物的細胞，即不是生殖物質的細胞。LOX活性功能的喪失本發明涉及具有第一突變和第二突變的大麥植物或其部分或其植物產品，其中所述第一突變導致LOX-I活性功能完全喪失，所述第二突變導致L0X-2活性功能完全喪失。因此，例如，第一突變導致功能性LOX-I酶完全喪失，第二突變導致功能性L0X-2酶完全喪失。LOX-I活性功能完全喪失(例如功能性LOX-I酶完全喪失)和L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)可獨立地基於不同的機制。例如，L0X-1活性和 L0X-2活性中的一個或兩個的功能完全喪失可以由大麥植物中的異常蛋白，即異常L0X-1 和/或L0X-2蛋白引起，例如由沒有可檢測到的9-HP0DE形成活性的突變L0X-1蛋白(例如按照實施例4中的描述進行測定)引起，和/或由沒有可檢測到的13-HP0DE形成活性的突變L0X-2蛋白(例如按照實施例4中的描述進行測定)引起。L0X-1活性和L0X-2活性中的一個或兩個的功能完全喪失可以由L0X-1蛋白和/ 或L0X-2蛋白的缺乏引起。明顯地，L0X-1蛋白的缺乏將導致功能性L0X-1酶喪失，而L0X-2 蛋白的缺乏將導致功能性L0X-2酶完全喪失。因此，所述大麥植物可優選不包含，或僅包含非常少的L0X-1和/或L0X-2蛋白，更優選其中沒有可檢測到的L0X-1和/或L0X-2蛋白。 L0X-1和/或L0X-2蛋白可以由本領域技術人員已知的任何合適的方式進行檢測。然而， 優選通過其中利用L0X-1和L0X-2的特異性抗體(例如L0X-1和L0X-2的多克隆抗體)檢測L0X-1蛋白的技術對所述蛋白進行檢測。所述技術可以是，例如Western印跡或ELISA。 所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。然而，優選所述抗體為分別識別L0X-1和L0X-2蛋白中的數個不同表位的多克隆抗體。還可以間接檢測L0X-1和/或L0X-2蛋白，例如通過測定L0X-1活性的方法，或者通過測定L0X-2活性的方法。在本發明的一個優選實施方式中，利用國際專利申請WO 2005/087934的實施例4中列出的方法檢測L0X-1蛋白。可以利用與L0X-2結合的抗體以類似的方式檢測L0X-2蛋白。L0X-1活性和L0X-2活性中的一個或兩個的功能完全喪失還可以是沒有或幾乎沒有表達L0X-1轉錄本和/或L0X-2轉錄本的結果，優選是沒有表達L0X-1轉錄本和/或 L0X-2轉錄本。本領域技術人員理解L0X-1或L0X-2轉錄本的缺失也將分別導致L0X-1或 L0X-2翻譯蛋白的缺失。或者，L0X-1活性和L0X-2活性中的一個或兩個的功能完全喪失 (例如功能性L0X-1和L0X-2酶完全喪失)也可以是表達異常的L0X-1轉錄本和/或異常的L0X-2轉錄本的結果。異常的L0X-1和/或L0X-2轉錄本可能是由轉錄本的異常剪接導致的，例如由於剪接位點的突變。因此，本發明的大麥植物可以具有位於剪接位點中的突變，例如位於5'剪接位點或3'剪接位點中，例如在內含子最5'端的一個或兩個核苷酸中，或者在內含子最3'端的核苷酸之一中。L0X-1轉錄本具有異常剪接的突變的實例為 W02005/087934中描述的突變體A618。編碼L0X-1或L0X-2的轉錄本的表達可以通過，例如Northern印跡或RT-PCR試驗檢測。本發明的大麥植物功能性L0X-1和L0X-2酶的完全喪失是由突變引起的。因此， 本發明的大麥植物通常在L0X-1基因中具有突變。所述突變可以在調節區內，例如在啟動子或內含子內，或者所述突變可以在編碼區內。類似地，本發明的大麥植物通常在L0X-2基因中具有突變。所述突變可以在調節區內，例如在啟動子或內含子內，或者所述突變可以在編碼區內。因此，還可以通過鑑定L0X-1編碼基因中或者L0X-2編碼基因中的突變而檢測功能性L0X-1和/或L0X-2酶完全喪失的原因。L0X-1編碼基因中的突變可以通過，例如對所述基因進行測序而檢測。優選地，在鑑定所述突變後，通過測定L0X-1和/或L0X-2活性而驗證功能的完全喪失。術語「L0X-1 蛋白」是指涵蓋 WO 2005/087934 的 SEQ ID NO :3 或 W02005/087934 的SEQ ID NO :7列出的大麥全長L0X-1蛋白或其功能同源物。L0X-1的活性位點位於所述酶的C末端部分。特別地，認為跨越胺基酸殘基520-862的區域或其部分與L0X-1活性有關。因此，在一個實施方式中，L0X-1無效大麥優選包含編碼缺失L0X-1胺基酸520-862中的部分或全部胺基酸的突變形式L0X-1的基因。所述突變L0X-1也可以缺失存在於野生型 L0X-1中的其它胺基酸殘基。因此，本發明的雙無效LOX大麥可以包含非功能性的截短形式的L0X-1，例如N-末端或C-末端被截短的形式。優選地，所述截短形式包含不超過800個，更優選不超過750 個，甚至更優選不超過700個，還更優選不超過690個，甚至更優選不超過680個，還更優選不超過670個L0X-1的連續胺基酸，例如不超過650個，如不超過600個，例如不超過550 個，如不超過500個，例如不超過450個，如不超過425個，例如不超過399個W02005/087934 的SEQ ID NO :3的L0X-1的連續胺基酸。優選地，所述截短形式僅包含L0X-1的N末端片段，優選最多800個，更優選最多750個，甚至更優選最多700個，還更優選最多690個，甚至更優選最多680個，還更優選最多670個，甚至更優選最多665個WO 2005/087934的SEQ ID NO 3的N-末端胺基酸，如包含不超過665個，例如不超過650個，如不超過600個，例如最多550個，如最多500個，例如最多450個，如最多425，例如最多399個WO 2005/087934的SEQ ID NO 3的N-末端胺基酸。在一個非常優選的實施方式中，所述截短形式可以由WO 2005/087934的SEQ ID NO 3的胺基酸1-665組成。在本發明的一個優選實施方式中，本發明的大麥植物包含被轉錄成mRNA的L0X-1 編碼基因，其中所述mRNA在野生型L0X-1 mRNA的終止密碼子的上遊包含無義密碼子或者終止密碼子。這種無義密碼子在本文中被命名為提前終止的無義密碼子。優選地，所述植物的所有轉錄成mRNA的L0X-1編碼基因都包含提前終止的無義密碼子或終止密碼子。所述無義密碼子或終止密碼子優選位於起始密碼子下遊的最多800個，更優選最多750個，甚至更優選最多700個，還更優選最多690個，甚至更優選最多680個，還更優選最多670個，甚至更優選最多665個密碼子處。編碼L0X-1的野生型基因組DNA的序列示於WO 2005/087934 的 SEQ ID NO 1 或者 W02005/087934 的 SEQ ID NO :5。在一個優選的實施方式中，本發明的大麥植物包含編碼L0X-1的基因，其中由所述基因轉錄的前mRNA包含與WO 2005/087934的SEQ ID NO 2對應的序列。在本發明的非常優選的實施方式中，本發明的雙無效LOX大麥植物的突變L0X-1 的編碼基因包含無義突變，所述突變對應於WO 2005/087934的SEQ ID NO=I的第3574位的G —A取代。術語「L0X-2蛋白」表示涵蓋本申請SEQ ID NO :5列出的大麥全長L0X-2蛋白或其功能同源物。L0X-2的活性位點位於L0X-2的C末端部分。特別地，認為跨越胺基酸殘基 515-717的區域或其部分與L0X-2的活性有關。根據大豆L0X-1晶體結構的檢測，認為胺基酸殘基515-525和707-717代表了大麥L0X-2酶的活性位點裂隙的序列延伸段。所翻譯的突變L0X-2蛋白，即大麥雙無效LOX突變體A689的C-末端截短形式，最多包含684個殘基，並且因此缺失活性位點裂隙的第二序列延伸段，從而導致其失活。根據本發明的一個實施方式，本發明的雙無效LOX大麥優選包含編碼L0X-2的突變形式的基因，其中所述突變形式缺失L0X-2的胺基酸515-717中的一些或者全部胺基酸，優選缺失胺基酸707-717中的一些或全部胺基酸，甚至更優選缺失胺基酸707-717中的全部胺基酸。所述突變L0X-2還可以缺乏野生型L0X-2中存在的其它胺基酸殘基。因此，雙無效LOX大麥可包含非功能性的截短形式的L0X-2，例如N-末端或C-末端被截短的形式。優選地，所述截短形式包含不超過800個，更優選不超過750個，甚至更優選不超過725，還更優選不超過700個，甚至更優選不超過690個，還更優選不超過684 個本申請的SEQ ID NO :5的L0X-2的連續胺基酸。優選地，所述截短形式僅包含L0X-2的 N-末端片段。因此，優選所述截短形式包含最多800個，更優選最多750個，甚至更優選最多725個，還更優選最多700個，甚至更優選最多690個，還更優選最多684個本申請的SEQ ID NO: 5的N-末端胺基酸。在一個非常優選的實施方式中，所述截短形式可以由本申請的SEQ ID NO 5的胺基酸1-684組成。在本發明的優選實施方式中，所述大麥植物包含被轉錄成L0X-2的mRNA的基因， 其中所述mRNA在野生型L0X-2 mRNA的終止密碼子的上遊包含無義密碼子或者終止密碼子。這種無義密碼子在本文中被命名為提前終止的無義密碼子。優選地，所述植物的轉錄成編碼L0X-2的mRNA的所有基因都包含提前終止的無義密碼子或終止密碼子。所述無義密碼子或終止密碼子優選位於起始密碼子下遊的最多800個，更優選最多750個，甚至更優選最多725個，還更優選最多700個，甚至更優選最多690個，還更優選最多684個密碼子處。編碼L0X-2的野生型基因組DNA的序列示於本申請的SEQ ID NO :1。在本發明的非常優選的實施方式中，所述雙無效LOX大麥植物的突變L0X-2的編碼基因包含無義突變，所述突變對應於SEQ ID NO 1的第沈89位的G — A取代。本發明的大麥植物可以由本領域技術人員熟知的任何合適的方法製備，優選通過下文「雙無效LOX大麥的製備」部分列出的方法之一製備。在本發明的一個實施方式中，優選本發明的雙無效LOX大麥植物具有類似於野生型大麥的植物生長生理學和穀粒發育。因此，優選L0X-1無效大麥植物在株高、每株的分櫱數、開始開花和/或每穗的穀粒數方面類似於野生型大麥。此外，優選本發明的雙無效LOX大麥植物在株高、抽穗期、抗病性、抗倒伏、穗破損、成熟時間和產量方面類似於野生型大麥，特別是類似於cv. Barke。在本發明中，在表述數目的情況下，將「類似」理解為相同士 10%。這些參數可以按照下文實施例5的描述進行測定。在本發明的非常優選的實施方式中，所述大麥植物是已在2008年12月4日將其種子以「大麥，Hordeum vulgare L. ；A689 系(Barley, Hordeum vulgare L. ；Line A689)，， 的名稱保藏在美國標準培養物保藏中心(ATCC，美國馬納薩斯(VA 20110)大學街10801 號專利保藏處，保藏編號PTA-9640)的大麥植物。因此，本發明的大麥植物可以大麥系 A689 (ATCC專利保藏名稱PTA-9640)，或其任何子代大麥植物。製備大麥突變體本發明的大麥植物可以通過本領域技術人員已知的任何合適的方法製備。優選地，本發明的大麥植物通過包括以下步驟的方法製備誘變大麥植物或其部分(例如大麥粒)，然後篩選和選擇特徵在於L0X-1活性功能的完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)和L0X-2活性功能的完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的大麥植物。在一個優選的實施方式中，所述大麥植物可以通過包括誘變大麥植物或其部分(例如大麥粒)的方法而製備，其中所述大麥植物已經具有引起功能性L0X-1酶完全喪失的突變。此類大麥植物描述在，例如國際專利申請W02005/087934中。在一個感興趣的方面，本發明涉及新的且非常有效的篩選方法，其可以鑑定具有引起L0X-2活性完全喪失的突變的大麥植物。所述新的可重複的篩選方法可以鑑定沒有 L0X-2活性或者L0X-2活性非常低的大麥植物。這種新的篩選方法包括使用萌芽胚作為起始材料。有趣的是，根據多達21，000個成熟胚的篩選(其沒有發現單個L0X-2無效大麥突變體)，本發明人發現使用成熟胚作為篩選L0X-2活性的起始材料較不優選。因此，所述新篩選方法的一個重要特徵涉及使用萌芽胚作為檢測L0X-2活性的起始材料。因此，本發明的目標是提供製備雙無效LOX大麥植物的方法，其包括以下步驟(i)提供L0X-1活性功能完全喪失，例如功能性L0X-1酶完全喪失的大麥植物或其部分；和(ii)誘變所述大麥植物，和/或來自所述大麥植物的大麥細胞，和/或大麥組織， 和/或大麥粒，和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和
(iii)將所述誘變大麥植物、麥粒和/或胚培育至少2代，由此獲得Mx代的大麥植物，其中X為彡2的整數；和(iv)獲得所述Mx大麥植物的胚；和(ν)使所述胚萌芽；和(vi)測定所述萌芽胚或其部分中的L0X-1和L0X-2活性；和(vii)選擇所述萌芽胚中L0X-1活性和L0X-2活性完全喪失的植物；和(viii)分析L0X-1基因和L0X-2基因中的突變；禾口(ix)選擇在L0X-1基因和L0X-2基因中具有突變的植物；由此獲得在L0X-1和L0X-2基因中具有引起L0X-1活性完全喪失和L0X-2活性完全喪失的突變的大麥植物。上述L0X-1活性完全喪失的大麥植物可以是，例如W02005/087934中描述的L0X-1 活性完全喪失的任意大麥植物，優選D112突變體，或其子代植物。上述列表中的步驟(ii)可以涉及誘變活的材料，其選自大麥植物、大麥細胞、大麥組織、大麥粒和大麥胚組成的組，優選選自大麥植物、大麥粒和大麥胚組成的組，更優選大麥粒。可以通過任何適合的方法進行誘變。在一個實施方式中，通過將誘變劑和大麥植物或其部分一起溫育，例如和大麥粒或來自大麥的單個細胞一起溫育而進行誘變。這種誘變劑是本領域技術人員已知的，包括但不限於疊氮化鈉(NaN3)、甲磺酸乙酯(EMS)、疊氮丙三醇仏6，3-疊氮-1，2-丙二醇)、甲基亞硝基脲(MNU)和馬來醯胼(MH)組成的組。在另一個實施方式中，通過照射，例如通過紫外線照射大麥植物或其部分，例如麥粒來進行誘變。在本發明的優選實施方式中，依照下文「化學誘變」部分中列出的任何方法進行誘變。合適的誘變方案的非限制實例公開在實施例2中。優選以以下方式進行誘變，即在篩選M3代的大麥時，期望突變體的預期頻率達到每10，000穀粒最少0. 5個，例如0. 5-5個的範圍，例如0. 9-2. 3個的範圍。在優選的實施方式中，對大麥粒進行誘變。用於誘變的麥粒命名為MO代(另參見圖1)。可以在來自萌芽大麥胚的樣本中，優選在來自萌芽大麥胚的液體提取物中測定 LOX活性。所述樣本，例如所述提取物可以由所述萌芽胚的任何合適部分製備。通常，在製備所述樣本的提取物和測定L0X-2活性前，必須利用任何合適的方法對大麥樣本進行勻質。特別地，優選蛋白提取物由萌芽胚或其部分製備，並且利用所述蛋白提取物測定LOX活性。可以利用，例如機械力，例如通過搖動或攪拌，如通過在存在珠(例如玻璃珠或沙珠) 的情況下振蕩而進行勻質。在優選的實施方式中，所述萌芽胚為Mx代的，其中χ是> 2整數，優選χ是2-10 的整數，更優選是3-8的整數。在非常優選的實施方式中，在M3代的萌芽胚中或者在源自此胚的樣本中測定LOX活性。在該實施方式中，優選培育MO代的誘變大麥粒以獲得大麥植物，並將所述大麥植物雜交以得到Ml代麥粒。重複該過程直至獲得M3代麥粒(另參見圖 1)。可以利用任何合適的試驗進行LOX活性測定，優選使用下文所列的方法之一。特別地，優選所述試驗產生關於通過L0X-1和L0X-2的雙加氧作用將亞油酸轉化成9-HP0DE 和13-HP0DE的數據。因此，所述試驗通常包括以下步驟
(i)提供由萌芽大麥胚或其部分製備的蛋白提取物；和(ii)提供亞油酸；和(iii)將所述蛋白提取物和所述亞油酸一起溫育；和(iv)測定亞油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的雙加氧作用。所述方法的步驟(iv)優選包括測定所述萌芽胚中，優選由所述萌芽胚製備的蛋白提取物中的9-HP0DE和13-HP0DE水平。所述步驟可以包括直接或間接測定9-HP0DE和 13-HP0DE的水平。可以測定所有HPODE的總水平，在此情況下優選為了驗證而進行9-HP0DE 和13-HP0DE的專門測定。一個方法可以是，例如其中使來自萌芽胚的蛋白提取物與作為底物的亞油酸一起溫育用以形成9-HP0DE和13-HP0DE的方法。然後可以通過多種方法檢測所述HP0DE。一個方法可以包括產生可檢測到的化合物，例如染料。例如，所述方法可以是在血紅素存在下由所形成的HPODE催化的3- 二甲基氨基苯甲酸和3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙的氧化偶聯，以形成可以利用分光光度計在A595測定的吲達胺染料。此方法的實例描述在下文的實施例1和2中。利用該實驗，認為小於0. 2A595單位的吸光讀數表示不存在 L0X-1且不存在L0X-2活性。然而，用於測定L0X-1和L0X-2活性的更精確的方法是使來自萌芽胚的蛋白提取物和亞油酸一起溫育，然後測定9-HP0DE和13-HP0DE的含量。9-HP0DE 和13-HP0DE的含量可以通過，例如利用基於HPLC的分析而測定。可以直接或間接測定亞油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的雙加氧作用。本發明可以使用任何合適的測定方法。在本發明的一個實施方式中，檢測到亞油酸過氧化氫物。例如， 可以通過例如色譜法，如實施例4描述的HPLC直接測定9-HP0DE和13-HP0DE。本發明公開了用於從萌芽胚提取蛋白的方法的某些方面的顯著重要性。因此，優選利用酸性緩衝液，優選PH為2-6的範圍，更優選pH為3-5的範圍，甚至更優選pH為3. 5-5 的範圍，還更優選PH為4-5的範圍，甚至更優選pH為4. 5的酸性緩衝液提取所述蛋白。用於提取的緩衝液優選基於有機酸，更優選乳酸緩衝液。最優選地，利用IOOmM乳酸緩衝液 (pH4. 5)製備蛋白提取物。本發明的某些實施方式公開了用於檢測L0X-1無效和L0X-2無效植物的方法，所述方法包括9-HP0DE和13-HP0DE與染料(例如3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙)的反應。優選地，在加入亞油酸之後將所述染料(例如3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙)加入到蛋白提取物中。優選地，在使所述蛋白提取物與亞油酸接觸至少1分鐘，更優選至少5分鐘，甚至更優選至少10分鐘，例如1-60分鐘的範圍，例如5-30分鐘的範圍，例如10-20分鐘的範圍後加入所述染料。優選用於選擇本發明的大麥植物的方法詳述在下文實施例2中。所述選擇方法可經調整用於基於微滴定板的分析程序或允許快速篩選許多樣本的其它已知的高通量重複測定方式。優選分析至少5000株，例如至少7500株，例如至少 10，000株，例如至少15，000，例如至少20，000，例如至少25，000誘變的大麥植物的L0X-1 活性和L0X-2活性。可以通過數個不同的方法測定L0X-1編碼基因中的突變。例如，可以對L0X-1 基因進行完全或部分地測序，並且將其序列與WO 2005/087934的SEQID NO :1或者WO 2005/087934的SEQ ID NO 5比較。如果尋找特異突變，可以採用SNP分析。本領域技術人員將能夠設計可用於檢測給定的特異突變的引物，例如用於檢測在L0X-1的編碼序列內產生提前終止密碼子的突變(例如上文描述的任意提前終止密碼子)的引物。如何進行SNP 分析的一個實例描述在下文的實施例10中，其中的引物可用於檢測在L0X-1基因的第3474 位核苷酸的G — A突變。可以通過數個不同的方法測定L0X-2編碼基因中的突變。例如，可以對L0X-2基因進行完全或部分地測序，並且序列與本申請的SEQ ID NO :1比較。如果尋找特定突變，可以採用SNP分析。本領域技術人員將能夠設計可用於檢測給定的特定突變的引物，例如用於檢測在L0X-2的編碼序列內產生提前終止密碼子的突變(例如上文描述的任意提前終止密碼子)的引物。如何進行SNP分析的一個實例描述在下文的實施例10中，其中的引物可用於檢測在L0X-2基因的第沈89位核苷酸的G — A突變。如上文該部分詳述的雙無效LOX大麥植物的製備方法的步驟(viii)和(ix)可以在步驟(vi)和(vii)之前進行，在這種情況下，所述方法將包括順序依次為⑴、(ii)、 (iii)、(iv)、(V)、(Viii)、(ix)、(Vi)和(vii)的步驟，這種方法也包含在本發明的範圍之內。特別地，當尋找特異突變時，例如在已經鑑定的雙無效LOX大麥植物的子代植物中尋找特異突變時就是這種情況。一旦鑑定出在L0X-1基因中包含特定突變且在L0X-2基因中包含特定突變(例如上述任意突變)的雙無效LOX大麥植物，即可以通過傳統的育種方法，例如通過本領域技術人員熟知的那些方法產生具有相同突變的其它大麥植物。例如，所述雙無效LOX大麥植物可以與另一個大麥栽培品種回交。在選擇L0X-1和L0X-2功能完全喪失的有用大麥植物後，可以任選進行一個或多個額外的篩選。例如，可以進一步繁殖所選擇的突變體，並且可以檢測新一代的植物是否完全喪失功能性L0X-1和L0X-2酶。在選擇有用的大麥植物後，可以對所述大麥植物進行育種，例如進行傳統育種。育種方法描述在下文的「植物育種」部分。植物產品本發明涉及由雙無效LOX大麥植物或其部分製備的，具有低T2N潛能水平的飲料或其它植物產品。因此，本發明涉及植物產品，所述植物產品可以是包含上述大麥植物或其部分的組合物，或者由所述大麥植物或其部分製備的組合物，例如由所述大麥植物或其部分製備的植物產品。由於所述大麥植物缺乏L0X-1和L0X-2活性，所述組合物通常包含非常低水平的T2N潛能。下文描述了包含或由具有導致L0X-1活性功能完全喪失(例如功能性L0X-1 酶完全喪失)的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變的大麥植物的有用組合物的實例。與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的類似組合物相比，優選所述組合物包含(i)小於60%、甚至更優選小於50%、還更優選小於40%，例如小於30%、優選小於20%、更優選小於10%的游離T2N ；和/或(ii)小於60%、甚至更優選小於50%、還更優選小於40%，例如小於30%、優選小於25%的T2N潛能。根據組合物的類型，T2N的具體減少可以不同。上述T2N的減少與組合物顯著相關，其中所述組合物選自麥芽、麥芽汁和老化飲料(aged beverage)組成的組。此外，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體D112製備的類似組合物相比，優選所述組合物包含⑴小於80%、優選小於70%、甚至更優選小於60%，例如小於50%的游離T2N ； 和/或(ii)小於80%、優選小於70%、甚至更優選小於60% ；例如小於50%的T2N潛能。本發明一方面涉及具有導致L0X-1活性功能完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變的大麥粒。本發明還涉及包含所述麥粒的組合物和由所述麥粒製備的組合物，以及由所述麥粒製備的植物產品。 已經有描述稱通過浸泡工序(其中可以對大麥進行高溫和/或乳酸處理)，可降低大麥粒中脂加氧酶的活性。這種處理可具有其它的不利作用，例如降低期望的酶活性，例如植酸酶活性。此外，這種處理僅從進行熱處理的時間點開始降低脂加氧酶活性，因此其不影響脂加氧酶產物在此前的積累。因此，在一個實施方式中，用於製備本發明的植物產品的方法不在至少70°C的溫度下浸泡大麥粒。還優選用於製備本發明的植物產品的方法不在至少57°C的溫度下在乳酸存在下浸泡大麥粒。一方面，本發明涉及通過發芽(malting)由雙無效LOX麥粒製備的麥芽組合物。術語「發芽」應該理解為浸泡的大麥粒在受控制的環境條件下發生的萌芽(例如圖3的步驟 2和3所例示的)。與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物優選包含小於30%，更優選小於20%，甚至更優選小於10%的游離T2N。更優選地，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的L0X-1無效大麥突變體Dl 12製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物包含小於60%，更優選小於50%的游離T2N。還優選與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物包含小於60 %，優選小於50 %，更優選小於40 %，甚至更優選小於30 %，更優選小於20 %，甚至更優選小於10%的T2N潛能。更優選地，與以相同方式由W02005/087934中描述的L0X-1 無效大麥突變體D112製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物包含小於60%，更優選50% 的T2N潛能。麥粒發芽是受控的浸泡和萌芽，隨後對大麥穀粒進行乾燥，優選烘乾(kiln drying)大麥穀粒的過程。在乾燥前，浸泡和萌芽的大麥穀粒被稱為「綠色麥芽」，其也可以代表本發明的植物產品。這一作業順序對於引起穀粒改變的許多酶的合成都很重要，而穀粒改變是主要解聚死胚乳細胞的細胞壁以動員麥粒營養和激活其它解聚酶的過程。在隨後的乾燥過程中，由於化學褐色氧化反應而產生風味和顏色。雖然麥芽的主要用途用於飲料生產，但是也可將其用在其它工業工藝中，例如作為烘烤業的酶源，或者作為食品工業的調味劑和著色劑，例如麥芽或麥芽粉，或間接作為麥芽糖漿等。一方面，本發明涉及產生所述麥芽組合物的方法。所述方法優選包括以下步驟(i)提供雙無效LOX大麥粒；(ii)浸泡所述麥粒；(iii)在預定的條件下使浸泡的麥粒萌芽；
(iv)乾燥所述萌芽的麥粒；從而產生L0X-1活性和L0X-2活性完全喪失的麥芽組合物。例如可以由Briggs 等人(1981)和Hough等人(198 描述的任意方法產生所述麥芽。然而，本發明還可以使用適合產生麥芽的任何其它方法，例如用於產生特色麥芽的方法，包括但不限於焙燒 (roasting)麥芽的方法。非限制實例描述在實施例6和8中。可以通過，例如碾磨，對麥芽進行進一步加工。因此，本發明的植物產品可以是任何種類的麥芽，例如未加工的麥芽，或者經碾磨的麥芽，或者其粉末。經碾磨的麥芽和其粉末包含麥芽的化學成分，和缺乏再萌芽能力的死細胞。另一方面，本發明的植物產品可以包含糖漿，例如大麥糖漿或大麥麥芽糖漿，乃至由其組成。所述植物產品還可以是大麥或麥芽的提取物。另一方面，本發明涉及植物產品的類型，其是由源自雙無效LOX麥粒的麥芽組合物製備的麥芽汁組合物。所述麥芽可以僅由雙無效LOX麥粒製備或由還包含其它麥粒的混合物製備。本發明還涉及利用(單獨或混合有其它成分)的雙無效LOX大麥或其部分製備的麥芽汁組合物。與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物優選包含小於30 %，更優選小於20 %，甚至更優選小於10 %的游離T2N。更優選地，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體Dl 12製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物包含小於60 %，更優選小於50 %的游離T2N。還優選與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物優選包含小於40%，更優選小於30%，甚至更優選小於25%的T2N潛能。更優選地，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體Dl 12製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物包含小於60 %，更優選小於50 %的T2N潛能。所述麥芽汁可以為第一麥芽汁、和/或第二麥芽汁、和/或進一步的麥芽汁。所述麥芽汁組合物可以為甜麥芽汁、煮沸麥芽汁或其混合物。所述麥芽汁組合物還可以是大麥麥芽汁。麥芽汁組合物通常包含高含量的氨基氮和可發酵的碳水化合物，後者主要是麥芽糖。在圖3中，步驟4-6例示了由麥芽製備麥芽汁的通用方法。通常，通過合併並溫育麥芽汁和水，即糖化工藝製備麥芽汁。在糖化過程中，可以向所述麥芽/液體組合物補充額外的富含碳水化合物的輔助組分，例如經碾磨的麥芽、玉米或水稻輔料。未發芽的穀類輔料通常含有非常少或者不含活性酶，這使得補充麥芽或外源酶以提供糖轉化所必需的酶至關重要。通常，通過碾磨麥芽從而使水可以在糖化階段進入穀類顆粒，由此啟動麥芽汁生產。所述糖化基本上是發芽過程的延續，並且伴有底物的酶分解。在糖化過程中，碾磨麥芽與液體部分，例如水一起溫育。溫育溫度通常保持恆定(恆溫糖化)或者逐漸升高。在任何一種情況下，在發芽和糖化中產生的可溶物質均被釋放至所述液體部分中。隨後的過濾將麥芽汁和殘留的固體顆粒分離，後者還被稱為「用過的穀粒」。所述麥芽汁還可以被稱為 「第一麥芽汁」。在噴射提取和過濾後，可以獲得「第二麥芽汁」。通過重複所述方法可以製備進一步的麥芽汁。Briggs等人(見上文)和Hough等人(見上文)描述了適合製備麥芽汁的方法的非限制性實例。已經描述了通過酶的熱處理可以降低脂加氧酶活性。已經描述了可以對麥芽汁進行熱處理以降低脂加氧酶活性和/或在高溫下進行糖化。然而，除了降低脂加氧酶活性外， 熱處理還具有其它不利影響，例如降低其它酶活性。此外，熱處理僅從進行熱處理的時間點開始降低脂加氧酶活性，因此不影響脂加氧酶產物在此前的積累。因此，在一個實施方式中，利用以下方法製備本發明的麥芽汁，其中初始糖化溫度不超過70°C，優選不超過69°C，因此，例如初始糖化溫度可以在50-69°C的範圍，例如在55-69°C的範圍，例如在55-65°C的範圍。還優選在糖化過程中，本發明的麥芽汁沒有在 70°C或更高溫度下持續大於25分鐘，優選不大於20分鐘，更優選不大於15分鐘。如果糖化溫度過高，將影響麥芽中的酶活性並可以降低，乃至消除期望的酶活性，從而將導致麥芽汁質量改變。可以將第一麥芽汁、第二麥芽汁和進一步的麥芽汁合併，隨後將其煮沸。未煮沸的麥芽汁，無論是純的第一麥芽汁還是合併的麥芽汁，都被稱為「甜麥芽汁」，而煮沸之後，可將其稱為「煮沸的麥芽汁」。如果麥芽汁將用於生產啤酒，則通常在煮沸前加入酒花。還可以通過將雙無效LOX大麥植物或其部分(例如未發芽的雙無效LOX麥粒或其部分，特別是經碾磨的未發芽雙無效LOX麥粒或其部分)和一種或多種合適的酶(例如酶組合物或者酶混合組合物，如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro (Novozymes)) 一起溫育，而製備麥芽汁組合物。用於從由此製備的麥芽汁生產飲料的方法也可以被稱為「大麥釀造」， 而其麥芽汁組合物被稱為「大麥麥芽汁」或「大麥釀造的」麥芽汁。還可以利用麥芽和未發芽大麥植物或其部分，或者僅利用未發芽的大麥製備麥芽汁組合物，任選在所述製備過程中加入一種或多種合適的酶，特別是澱粉酶、葡聚糖酶[優選(1-4)-和/或(1-3，1-4) - β -葡聚糖酶]，和/或木聚糖酶(例如阿拉伯木聚糖酶)，和/或蛋白酶，或者包含一種或多種上述酶的酶混合物，例如在所述製備過程中加入酶混合物Ondea Pro (Novozymes)。在本發明實施方式的一個方面，本發明的麥芽汁組合物是大麥麥芽汁，例如煮沸的大麥麥芽汁，即通過將未發芽(並優選經過碾磨)的雙無效LOX麥粒和水一起溫育來製備的麥芽汁，優選通過糖化和噴射提取製備的麥芽汁。這種大麥麥芽汁的特徵在於T2N和 T2N潛能的水平極低。因此，與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv.Power)製備的大麥麥芽汁組合物相比，所述大麥麥芽汁優選包含小於50 %，更優選小於40 %，甚至更優選小於30%的游離T2N。更優選地，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體Dl 12 製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物包含小於70%，更優選小於60%的游離T2N。 此外，當所述麥芽汁被調整至13-16° ρ的範圍，優選14-15° ρ的範圍，更優選至14. 5° ρ 時，優選所述大麥麥芽汁包含最多0. 15ppb游離T2N。此外還優選與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的大麥麥芽汁組合物相比，所述大麥麥芽汁優選包含小於 50%，更優選小於40%，甚至更優選小於30%的T2N潛能。還優選與以相同方式由野生型大麥植物(優選cv. Power)製備的大麥麥芽汁組合物相比，所述大麥麥芽汁優選包含小於 50 %，更優選小於40 %，甚至更優選小於30 %的T2N前體。本發明還涉及植物產品，其可以是包含雙無效LOX大麥植物或其部分的食物組合物、飼料組合物以及香料組合物(fragrance raw material composition)。食物組合物可以是，例如但不限於發芽或未發芽的大麥粒、大麥粗粉、麵包、粥、包含大麥的穀類混合物、 保健品如包含大麥的飲料、大麥糖漿，以及薄片狀、碾碎的或擠出的大麥組合物。飼料組合物包括例如，包含大麥粒和/或粗粉的組合物。下文將對香料組合物進行描述。
本發明還涉及本發明組合物的混合物。例如，本發明一方面涉及通過以下物質的混合物製備的組合物(i)包含大麥植物或其部分的組合物，其中所述大麥植物或其部分包含導致 L0X-1活性功能完全喪失(例如功能性L0X-1酶完全喪失)的第一突變和導致L0X-2活性功能完全喪失(例如功能性L0X-2酶完全喪失)的第二突變；和(ii)由雙無效LOX麥粒製備的麥芽組合物。在優選的方面，本發明涉及飲料，更優選涉及麥芽飲料，甚至更優選涉及發酵飲料，例如發酵麥芽飲料，優選醇飲料，例如具有穩定的感官品質的啤酒，其中所述飲料是使用雙無效LOX大麥或其部分製備的。由此，在本發明的一個優選的實施方式中，優選通過發酵雙無效LOX大麥或其部分或其提取物，例如通過發酵來自雙無效LOX麥芽的麥芽汁(單獨或與其它成分組合)而製備所述飲料。然而，在本發明的其它實施方式中，所述飲料為未發酵的飲料，例如麥芽汁，優選由雙無效LOX麥芽製備的麥芽汁。所述飲料可以由未發芽大麥植物或其部分製備，這也包括在本發明中。所述飲料可以是無醇飲料，例如無醇啤酒或其它種類的無醇飲料，例如無醇麥芽飲料，例如無酒精麥芽飲料(maltina)。然而，優選所述飲料由用雙無效LOX大麥粒製備的麥芽組合物製備。更優選地，所述飲料是啤酒，其可以是本領域技術人員已知的任何種類的啤酒。在一個實施方式中，所述啤酒是，例如儲藏啤酒。優選使用包含萌芽的雙無效LOX大麥的麥芽組合物釀造啤酒，更優選所述啤酒是利用僅由萌芽的雙無效LOX大麥製備的麥芽組合物釀造的。然而，所述麥芽組合物還可以包含其它成分，例如其它萌芽或未萌芽的穀類，例如野生型大麥、L0X-1無效大麥、小麥和/或黑麥，或者包含糖的未萌芽原料或源自發芽或未發芽原料的組合物，包括糖漿組合物。然而，優選地，用於製備所述啤酒的所有大麥，例如所有發芽和/或未發芽的大麥和/或萌芽和/或未萌芽大麥優選是雙無效LOX大麥。在優選的實施方式中，本發明的飲料是優選地通過發芽和任選噴射提取而由用烘乾麥芽製備的麥芽汁生產的啤酒。這種啤酒在本文中也被稱作「發芽的」。然而，本發明的飲料還可以由大麥麥芽汁製備。這種啤酒還被稱為「大麥啤酒」。在優選的實施方式中，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料的T2N潛能相比，本發明的飲料包含小於50%，優選小於40%，更優選小於35%，例如小於 30%的T2N潛能。還優選與以相同方式由L0X-1無效大麥突變體(優選WO 2005/087934中描述的大麥突變體DlU)製備的飲料相比，本發明的飲料包含小於70%，優選小於60%，例如小於50%的T2N潛能。還優選，如果飲料所基於的原始提取物的。ρ被調整至10-12° ρ 的範圍，更優選11° P，則本發明的飲料包含最多2ppb，更優選最多1. 5ppb，例如最多Ippb 的T2N潛能。在優選的實施方式中，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料的T2N前體相比，本發明的飲料包含小於50%，優選小於40%，更優選小於35%，例如小於 30%的T2N前體。還優選與以相同方式由W02005/087934中描述的大麥突變體Dl 12製備的飲料相比，本發明的飲料包含小於70 %，優選小於60 %，例如小於50 %的T2N前體。還優選，如果飲料所基於的原始提取物中的。P被調整至10-12° ρ的範圍，更優選11° p，則本發明的飲料包含最多2ppb，更優選最多1. 5ppb，例如最多Ippb的T2N前體。在本發明的一個具體的實施方式中，所述飲料為大麥啤酒，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的大麥啤酒的T2N潛能相比，其包含小於50 %，優選小於 40%，更優選小於35%的T2N潛能。在該實施方式中，還優選與以相同方式由野生型大麥 (優選cv. Power)製備的大麥啤酒的T2N前體相比，所述大麥啤酒包含小於50%，優選小於 40%，更優選小於35%的T2N前體。在該實施方式中，還優選本發明的大麥啤酒包含最多 2ppb，更優選最多1.5ppb，甚至更優選最多1.2ppb T2N潛能。在該實施方式中，還優選，如果飲料所基於的原始提取物中的。P被調整至10-12° ρ的範圍，更優選11° P，則本發明的大麥啤酒包含最多2ppb，更優選最多1. 5ppb，甚至更優選最多1. 2ppb T2N前體。在本發明的另一個具體的實施方式中，所述飲料是由麥芽製備的啤酒，其中與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的啤酒的T2N潛能相比，所述啤酒包含小於 50%，優選小於40%，更優選小於30%的T2N潛能。在該實施方式中，還優選與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的啤酒的T2N前體相比，所述啤酒包含小於50%，優選小於40%，更優選小於30%的T2N前體。在該實施方式中，還優選本發明的啤酒包含最多 2ppb，更優選最多1.5ppb，甚至更優選最多Ippb T2N潛能。在該實施方式中，還優選，如果飲料所基於的原始提取物中的。P被調整至10-12° ρ的範圍，更優選11° P，則本發明的啤酒包含最多2ppb，更優選最多1. 5ppb，甚至更優選最多Ippb T2N前體。「感官品質」表示吸引人嗅覺和味覺的性質。通過例如經過培訓的專家品嘗小組對這些品質進行分析。優選地，所述品嘗小組經過專門培訓以識別醛異味，例如T2N。通常， 所述品嘗小組由3-30位成員組成，例如5-15位，優選8-12位成員組成。所述品嘗小組可以評價各種風味的存在，例如紙樣、氧化、老化和麵包樣(bready)異味。與本發明有關，優選特別降低了紙樣和/或老化異味。測定飲料的「感官品質」的方法描述在國際專利申請 W02005/087934的實施例6中。測定飲料的「感官品質」的另一個優選方法描述在下文的實施例8和9中。在優選的實施方式中，穩定的感官品質至少部分是低水平的T2N或T2N潛能的結果。優選地，本發明的飲料的特徵在於，與以相同方式由包含L0X-1和L0X-2活性的大麥植物製備的類似飲料相比，在15-25°C的範圍，例如約20°C儲藏至少10個月後的紙樣味道較低。優選地，通過經過培訓的品嘗小組評價，所述紙樣味道小於90%，更優選小於 80%，例如小於70%。還優選與由野生型大麥製備的類似飲料相比，本發明的飲料在提高的溫度下儲藏後的紙樣味道較低。當如上文所述，由受過培訓的專家品嘗小組確定「紙樣味道」性質並以 0-5分(0為無，5為極大)等級進行評分時，優選本發明的飲料具有一個或多個，優選至少兩個，例如至少三個，例如以下所有對紙味道的分值(i)在37°C溫育1周後，紙樣分值比以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料的紙樣味道分值低至少0. 5，優選低至少0. 7，更優選低至少1. 0 ；(ii)在37°C溫育2周後，紙樣分值比以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料的紙樣味道分值低至少0. 5，優選低至少0. 7，更優選低至少1. 0 ；(iii)在37°C溫育3周後，紙樣分值比以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power) 製備的飲料的紙樣味道分值低至少0. 5，優選低至少0. 7，例如低至少1. 0 ；
(iv)在37°C溫育1周後，紙樣分值是以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料的紙樣味道分值的最多90%，優選最多80%，更優選最多70% ；甚至更優選最多60%，還更優選最多50% ；(ν)在37°C溫育2周後，紙樣分值是以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料的紙樣味道分值的最多90%，優選最多80%，更優選最多70% ；甚至更優選最多 60% ；(vi)在37°C溫育3周後，紙樣分值是以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料的紙樣味道分值的最多90%，優選最多80%。當飲料甚至在儲藏後也包含非常低水平的T2N時，所述飲料被稱為具有「穩定的感官品質」。因此，本發明的目的是提供利用雙無效LOX大麥植物製造的飲料(例如具有穩定的感官品質的啤酒)。在儲藏至少1周，優選至少2周，更優選至少3周，甚至更優選至少 4周，例如1-3個月，例如3-6個月，例如6-12個月，例如大於1年後，與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的飲料相比，這種飲料優選包含非常低水平的T2N潛能，優選小於50 %，優選小於40 %，更優選小於35 %，例如小於30 %，如小於20 %，例如小於10 %的 T2N潛能。此外，還優選在30_40°C的範圍，優選37°C的溫度下儲藏至少1周，優選至少2周， 更優選至少3周，甚至更優選至少4周後，例如在20-30°C的溫度範圍下儲藏1-3個月，例如 3-6個月，例如6-12個月，例如大於1年後，與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power) 製備的飲料相比，本發明的飲料包含非常低水平的T2N，優選小於50 %，優選小於40 %，更優選小於35%，甚至更優選小於30%，例如小於25%的游離T2N。特別地，優選在37°C儲藏2周後，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料相比，優選本發明的飲料包含非常低水平的T2N，優選小於50 %，優選小於40 %， 更優選小於35%的游離T2N。還優選在37°C儲藏2周後，本發明的飲料包含小於50ppt，甚至更優選小於40ppt，甚至更優選小於30ppt游離T2N。優選地，所述儲藏在存在的亞硫酸鹽水平不超過IOppm的情況下進行，優選I-IOppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選l_8ppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選2-6ppm範圍的亞硫酸鹽水平，還更優選3-5ppm範圍的亞硫酸鹽水平，例如4ppm亞硫酸鹽。還優選在37°C存在2周後，與以相同方式由L0X-1無效大麥(優選W02005/087934 中描述的大麥突變體DlU)製備的飲料相比，本發明的飲料包含小於80%，優選小於75%， 例如小於60%的游離T2N。優選地，所述儲藏在存在的亞硫酸鹽水平不超過IOppm的情況下進行，優選I-IOppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選I-Sppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選 2-6ppm範圍的亞硫酸鹽水平，還更優選2-4ppm範圍的亞硫酸鹽水平。還特別優選在37°C儲藏8周後，與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的飲料相比，本發明的飲料(例如啤酒，例如大麥啤酒)包含非常低水平的T2N，優選小於50 %，優選小於40 %，更優選小於35 %，甚至更優選小於30 %，還更優選小於25 %的游離T2N。還優選在37°C儲藏8周後，所述飲料(例如啤酒，例如大麥啤酒)包含最多50ppt， 甚至更優選最多40ppt，還更優選最多30ppt，甚至更優選最多20ppt游離T2N。優選地，所述儲藏在存在的亞硫酸鹽水平不超過IOppm的情況下進行，優選I-IOppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選I-Sppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選l-6ppm範圍的亞硫酸鹽水平，還更優選2-4ppm範圍的亞硫酸鹽水平，例如3ppm亞硫酸鹽。還優選在37°C儲藏8周後，與以相同方式由L0X-1無效大麥(優選W02005/087934 中描述的大麥突變體DlU)製備的飲料相比，本發明的飲料包含小於70%，優選小於60%， 甚至更優選小於的游離T2N。優選地，所述儲藏在存在的亞硫酸鹽水平不超過IOppm 的情況下進行，優選I-IOppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選I-Sppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選2-6ppm範圍的亞硫酸鹽水平，還更優選2-4ppm範圍的亞硫酸鹽水平。此外，本發明的目的還在於提供利用雙無效LOX大麥植物製造的飲料(例如啤酒)，其在30-40°C的範圍，優選37°C的溫度下儲藏至少1周，優選至少2周，更優選至少3 周，甚至更優選至少4周後，例如在20-30°C的溫度下儲藏1-3個月，例如3-6個月，例如 6-12個月，例如大於1年後，與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體Dl 12製備的飲料相比，所述飲料包含小於70 %，優選小於60 %，例如小於50 %的T2N和/或T2N潛能，更優選小於70%，優選小於60%，例如小於50%的游離T2N。特別地，優選在37°C儲藏8周後，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料相比，本發明的飲料(例如啤酒，如大麥啤酒)包含非常低水平的T2N，優選小於 70%，優選小於60%，更優選小於55%，甚至更優選小於52%的游離T2N。優選地，所述儲藏在存在的亞硫酸鹽水平不超過IOppm的情況下進行，優選I-IOppm範圍的亞硫酸鹽水平， 更優選I-Sppm範圍的亞硫酸鹽水平，更優選l-6ppm範圍的亞硫酸鹽水平，還更優選2-4ppm 範圍的亞硫酸鹽水平，例如3ppm亞硫酸鹽。優選地，本發明的飲料還包含I-IOppm(百萬分之一份數)亞硫酸鹽，更優選 2_8ppm，更優選3-7ppm，還更優選4_6ppm範圍的亞硫酸鹽。在15_40°C，優選30-37°C，更優選37 °C的溫度下儲藏至少1周，優選至少2周，更優選至少3周，甚至更優選至少4周， 例如1-3個月，例如3-6個月，例如6-12個月，例如大於1年後，本發明的飲料優選包含最多0. 07，優選最多0. 06，更優選最多0. 05，甚至更優選最多0. 04，例如最多0. 03ppb (十億分之一份數)游離T2N。在本發明的一個優選實施方式中，在存在4-6ppm亞硫酸鹽的情況下，在37°C儲藏4周後本發明的飲料包含最多0. 03ppb，優選最多0. 025ppb，更優選最多 0. 02ppb (十億分之一份數)游離T2N。與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的類似飲料相比，本發明的具有穩定感官品質的飲料優選包含非常低水平的T2N潛能，優選小於40%，更優選小於30%， 甚至更優選小於25%的T2N潛能。在一個實施方式中，本發明涉及具有低水平的某些三羥基十八碳烯酸(也被稱為 THA)的飲料(例如啤酒)，特別是具有低9，12，13-THA和9，10，13-THA水平的飲料。THA的特徵在於苦味(Baur and Grosch, 1977 ；Baur等人，1977)，並且因此被認為是不期望的。因此，期望9，12，13-THA和9，10，13-THA水平儘可能低，優選低於1. 3ppm，例如低於lppm。然而，源自麥芽的飲料(例如啤酒)中9，12，13-THA和9，10，13-THA的總濃度還依賴於用於製備所述特定飲料的麥芽量。因此，通常高濃度啤酒將包含比淡啤酒多的9，12， 13-THA和9，10，13-THA，從而使高濃度啤酒中能接受整體水平更高的9，12，13-THA和9，10， 13-THA。因此，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料相比，優選本發明的飲料包含較低水平的9，12，13-THA和9，10，13-THA。特別地，與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的飲料中的水平相比，本發明的飲料中9，12，13THA的水平優選最多為50%，優選最多為40%，更優選最多為30%。還優選與以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)製備的飲料中的水平相比，本發明的飲料中9，10，13THA的水平優選最多為 70%，優選最多為60%。可通過使用雙無效LOX大麥製備此類飲料。在本發明的一個實施方式中，所述飲料具有改良的泡沫性質。當所述飲料是啤酒時，這具有特別重大的意義。因此，本發明的目的是提供具有優異泡沫性質的飲料，例如啤酒。優選地，與以相同方式由野生型大麥(優選cv.Power)製備的飲料相比，本發明的啤酒在60-80分鐘內多產生至少多出10 %，優選至少多出20 %，還更優選至少多出25 %的泡沫。 按照下文實施例9的描述測定所述泡沫的產生。本發明還涉及生產所述飲料的方法。所述方法優選包括以下步驟(i)提供包含萌芽的雙無效LOX麥粒的麥芽組合物；(ii)將所述麥芽組合物加工成飲料；由此獲得感官品質更穩定的飲料。在一個優選的實施方式中，所述飲料是啤酒。在這種情況下，所述加工步驟優選包括例如通過上文描述的任何方法由所述麥芽組合物製備麥芽汁，並發酵所述麥芽汁。一般來說，可以用發芽和/或未發芽的大麥穀粒製造醇飲料，例如啤酒。除了酒花和酵母外，麥芽也促成了啤酒的風味和顏色。此外，麥芽還充當了可發酵糖和酶的來源。啤酒生產的一般工藝的示意圖示於圖3，而適合發芽和釀酒的方法的實例詳細描述可見於，例如Briggs等人(1981)和Hough等人(198 的文獻。可獲得多種用於分析大麥、麥芽和啤酒產物的定時更新的方法，所述方法包括，例如但不限於American Association of Cereal Chemists(1995), American Society of Brewing Chemists(1992), European Brewery Convention (1998)和Institute of Brewing(1997)。已經認識到特定的釀酒廠使用了許多帶有顯著差異的具體工序，這些差異與當地消費者的喜好有關。本發明可以使用任何此類製造啤酒的方法。非限制實例描述在實施例8和9中。可以通過例如上文描述的任何方法獲取上述飲料，例如啤酒、麥芽飲料或非發酵麥芽汁的麥芽組合物。可以按照上文描述由所述麥芽組合物製備麥芽汁。從麥芽汁生產啤酒的第一步優選包括煮沸所述麥芽汁。在煮沸期間，可以添加其它組分，例如產生典型的苦啤酒和芳香啤酒特徵的酒花。煮沸麥芽汁還會導致主要在後續的麥芽汁冷卻階段沉澱的多酚和變性蛋白質之間的聚集。冷卻後，麥芽汁被轉移到含酵母的發酵罐中。優選地，所述酵母是啤酒酵母，卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。 可以將麥芽汁發酵任何適當時間，通常在1-100天的範圍。在持續數天的發酵過程中，糖被轉化成醇和C02，同時伴隨產生一些風味物質。隨後可以對啤酒進行進一步加工，例如冷藏啤酒。也可以過濾和/或儲藏啤酒，儲藏是產生令人愉快的芳香以及較少酵母(yeasty)味的過程。也可以加入添加劑。此外，還可以加入C02。最後可以在封裝(例如裝瓶或裝罐)前，對啤酒進行巴氏滅菌和/或過濾。除了在啤酒生產領域的進展，這還將有益於降低啤酒中的T2N和T2N潛能。因此， 還需要使成品啤酒具有較少異味的新原料，特別是大麥和麥芽。因此，本發明的目的是提供此類大麥植物和麥芽。有很多方法都可用於確定大麥植物產品或植物產品是否由L0X-1和L0X-2基因具有引起功能性L0X-1酶完全喪失和功能性L0X-2酶完全喪失的突變的大麥植物製備。植物產品通常會包含至少一些來自用於生產該植物產品的植物的基因組DNA。因此，麥芽將包含大量的基因組DNA，但即便是大麥或麥芽提取物(例如麥芽汁)也可以包含來自所述大麥或麥芽的基因組DNA或其片段。此外，基於大麥的飲料，例如啤酒也可包含來自所述植物的基因組DNA或其片段。通過分析植物產品中的DNA，可以確定用於製備植物產品的植物的 L0X-1和L0X-2基因是否具有引起功能性L0X-1酶完全喪失和功能性L0X-2酶完全喪失的突變。所述突變可以是，例如上文在「L0X活性功能的喪失」部分描述的L0X-1和L0X-2基因的任何突變。可以通過任何可用的方法，例如通過測序或者通過基於擴增的方法(包括基於PCR的方法)分析所述基因組DNA。如果認為L0X-1基因和/或L0X-2基因具有特定突變，則可以採用多態性分析，例如SNP分析。可以按照下文實施例10的描述進行此類分析。本領域技術人員能夠對這些實施例中描述的具體SNP分析進行適應性改進以用於其它突變或者其它起始材料。如果上述植物產品僅由L0X-1和L0X-2基因具有引起功能性L0X-1酶完全喪失和功能性L0X-2酶完全喪失的突變的大麥植物製備，則大麥LOX-ImRNA和L0X-2 mRNA和/或 L0X-1蛋白和L0X-2蛋白的存在與否也可以作為表明所述植物產品是否由雙無效LOX大麥製備的指標。因此，可以利用Western印跡分析，或者其它蛋白分析，或者利用RT-PCR，或者利用Northern印跡分析，或者利用其它mRNA分析完成植物產品的產品檢測。當所述植物產品為麥芽時，此類分析特別有用。化學誘變為了產生本發明的雙無效LOX大麥植物，即包含導致功能性L0X-1酶完全喪失的第一突變和導致功能性L0X-2酶完全喪失的第二突變的植物，可以通過任何合適的誘變方法，例如通過使用大麥粒的化學誘變製備非常大量的大麥突變體。已知該方法隨機引入突變。可以利用任何化學誘變物質進行大麥的誘變。然而，優選利用Na隊處理穀粒，使存活的穀粒萌芽，然後分析子代植物。由誘變的穀粒長成的植物世代(稱為M0)包含任何給定突變的雜合嵌合體。在自花傳粉之後收集的子代植物稱為Ml代，在Ml代中，給定突變分離至相應的雜合子和純合子中(參見圖1)。 利用NaN3處理麥粒不等同於處理單個細胞，原因是處理之後的穀粒可包含一些未突變的細胞和多種具有DNA突變的細胞。由於在不產生種系的細胞譜系中的突變會丟失， 因此，目標就是將誘變劑靶向發育為生殖組織的少數細胞，這有助於Ml代的產生。為了評價整體突變效率，可計數MO和Ml代中的白化(albino)嵌合體和白化植物。由作為存活植物的函數的計分突變體數量(scoring mutant number)得出對突變效率的估計，而作為已處理種子的函數的計分突變體數量測定了突變效率和穀粒死亡二者的組合。值得注意的是，在基因表達的幾乎每個步驟，細胞都具有可緩和損害突變影響的質量保證機制。真核生物中的一個經過深入研究的實例是無義介導的mRNA降解(稱為NMD)，其阻止合成潛在有害的提前截短蛋白(Maquat and Carmichael，2001 Ju等人， 2007)。在NMD中，通過末位密碼子相對於下遊脫穩定元件的位置將其鑑定為翻譯提前終止密碼子。產生翻譯提前終止(無義)密碼子(PTC)的突變有時提高了選擇性剪接轉錄本的水平，由此跳過有害突變，從而潛在地挽救了蛋白的功能(Mendell and Dietz，2001)。植物育種
在一個實施方式中，本發明的目的是提供包含雙無效LOX特徵的在農業上有用的大麥植物。農作物發育常為始於引入新特徵的長期且困難的過程。然而，從植物育種家的觀點看，這一步驟幾乎總是產生與現在的市場品種相比，農業性狀總體譜圖不甚理想的植物。除了雙無效LOX特性之外，在產生商業發芽大麥品種的領域還要考慮其它因素， 例如麥粒產量、大小以及與發芽性能或釀造性能相關的其它參數。因為已經顯示許多(即便不是所有)相關特性都處於遺傳控制之下，本發明還提供了現代的純合且高產量的發芽栽培品種，其可以通過與本申請公開的雙無效LOX大麥植物雜交而製備。這種大麥植物的麥粒提供了產生T2N潛能的能力低的新原料，即與以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥無效L0X-1突變體D112產生的麥芽相比，由這種麥粒產生的麥芽優選具有小於50% 的T2N潛能。專業大麥育種者將能夠選擇並開發大麥植物，該大麥植物在與雙無效LOX大麥雜交後將產生更好的栽培品種。或者，大麥育種者可以利用本發明的植物用於進一步的誘變，以產生源自雙無效LOX大麥的新栽培品種。確保在子代中維持雙無效LOX特徵的一個方法涉及L0X-1基因和L0X-2基因的 SNP分析。優選地，還對L0X-1和L0X-2活性進行測定。可以將本發明的大麥植物引入到任何合適的育種方案中。本發明的另一個目的是提供包含雙無效LOX特徵的在農藝上優良的大麥植物。因此，本發明還涉及通過使第一親本大麥植物與第二親本大麥植物雜交而產生新的雙無效 LOX大麥植物的方法，其中所述第一植物或第二植物是雙無效LOX大麥。此外，第一親本大麥植物和第二親本大麥植物均可來自雙無效LOX大麥品種。因此，利用雙無效LOX大麥品種的任何此類方法都是本發明的一部分自花授粉、回交和群體雜交等。利用雙無效LOX大麥品種作為親本產生的所有植物都在本發明的範圍內，包括由源自雙無效LOX大麥品種的品種形成的那些植物。在將外源DNA引入至雙無效LOX植物或植物組織並在其中表達的情況下，雙無效LOX大麥還可以用於遺傳轉化。本發明可以使用回交方法以將突變大麥植物的雙無效LOX特徵引入至另一個栽培品種中，例如都是當代高產發芽大麥栽培品種的cv. karlett或cv. Jersey中。在標準的回交操作中，將原始目標品種(即輪迴親本植物)與攜帶有待轉移目標突變LOX基因的第二品種(非輪迴親本植物)雜交。隨後，將這次雜交產生的雙無效LOX子代植物與輪迴親本雜交，重複這一過程直至獲得這樣的大麥植物，即其中除了非輪迴親本植物的雙無效LOX 特徵外，輪迴親本特有幾乎所有特徵都在所產生的植物中被恢復。最後，將最後產生的回交植物自交以產生純的雙無效LOX育種子代植物。加快植物育種過程的方法包括通過應用組織培養和再生技術對所產生的突變體進行初始增殖。因此，本發明另一個方面提供了生長和分化後產生具有雙無效LOX特徵的大麥植物的細胞。例如，育種可以包括傳統雜交、製備源自可育花葯的植物或利用小孢子培養。LOX通路產物在多種實施方式中，本發明涉及包含低水平的T2N潛能的大麥植物和其產品。LOX 酶催化帶有順式-1，順式-4戊二烯系統的多不飽和脂肪酸的二加氧作用。在大麥中，C18多不飽和脂肪酸亞油酸(18:2Δ9』12)和α-亞麻酸(18:3Δ9』12』15)是主要的LOX底物。通過在醯基鏈的C-9位(多由L0X-1催化)或C-13位(多由L0X-2催化)加入分子氧而啟動脂肪酸代謝的脂加氧酶通路，產生相應的9-HP0DE和13-HP0DE[當底物為α -亞麻酸時產物是9-氫過氧化十八碳三烯酸和13-氫過氧化十八碳三烯酸(HPOTE)，但HPOTE不發揮Τ2Ν 前體的功能]。在LOX通路的氫過氧化物裂解酶支路中，9-HP0DE和13-HP0DE可以被裂解成短鏈含氧酸和醛(參見圖2、。特別地，9-HP0DE可以被裂解成被轉化成T2N的順式-壬烯醛，而13-HP0DE是2-E-己烯醛的前體。因此，預期作為L0X-2催化的亞油酸的二加氧作用的主要產物13-HP0DE不是導致形成陳舊味T2N的通路的上遊成分。認為本發明涵蓋了影響L0X-1和L0X-2催化作用的下遊代謝物的產生，其不作為 L0X-1或L0X-2催化反應的直接產物而產生，但是隨後的系列反應的結果。這些反應包括自然發生的、因素誘導的或者酶催化的異構化和轉化。因此，可能通過調節該通路中其它成分 (例如氫過氧化物裂解酶HPL)的表達而影響這些下遊代謝物的產生。T2N 潛能本發明的重要目的是降低或消除T2N潛能。因此，本發明的目的是減少T2N前體和醛加合物的形成。雖然與啤酒老化有關的數個化學反應仍不清楚，由T2N潛能產生游離 T2N被認為是啤酒產品中形成陳舊風味的主要原因(Kuroda等人，見上文)。因此，本發明的目的是提供具有低水平的T2N潛能的飲料和具有低水平的T2N前體的飲料。多數T2N潛能由麥芽汁轉移至成品啤酒，在成品啤酒中可以釋放出遊離 T2N(Li6geoiS等人，200 ，並且酸度和溫度都是該過程中的重要因素。根據本發明，T2N潛能的定義如上文在定義部分中的描述。也可以使用其它測定T2N潛能的水平的方法。為了避免混淆，在本申請中「T2N潛能」的含義如上文在定義部分中的描述。具有釋放T2N或者轉化成T2N的能力的化學物質在本文中被稱為「T2N前體」，並且通過除測定T2N潛能的方法外的其它方法確定或測定的T2N前體被稱為「T2N前體」。特別可以通過首先處理樣本從而使具有釋放T2N或轉化成T2N能力的基本上所有(優選所有)或其化學物質都實際上確實分別釋放T2N和/或轉化成T2N。此後，測定T2N的水平。本發明的大麥粒不含L0X-1和L0X-2活性。有趣地，這種大麥粒包含非常少的T2N 潛能。因此，利用雙無效LOX大麥粒產生的啤酒將不僅具有非常低水平的T2N，還具有非常低水平的T2N潛能。雙無效LOX大麥粒在本發明的範圍內，其中所述雙無效LOX大麥粒其產生的啤酒產品包含非常低水平的T2N潛能，優選為以相同方式由野生型大麥(優選 cv. Power)生產的類似啤酒產品的T2N潛能的水平的小於40%，更優選小於30%，甚至更優選小於25%。因此，所述啤酒產品包含的T2N潛能為以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體Dl 12生產的類似啤酒產品的T2N潛能的小於60%，更優選小於50%。並且，還優選源自雙無效LOX大麥粒的植物產品具有非常低的T2N前體水平。由雙無效LOX大麥粒製備的植物產品在本發明的範圍內，其中所述植物產品包含的T2N前體的水平為以相同方式由野生型大麥(優選cv. Power)生產的類似植物產品的T2N前體的水平的小於40%，更優選小於30%，甚至更優選小於25%。因此，所述植物產品包含的T2N前體為以相同方式由WO 2005/087934中描述的大麥突變體D112生產的類似植物產品的T2N 前體的小於60 %，更優選小於50 %。注意到在微發芽原料的樣本中或在來自發芽原料的產品中測定的T2N值常高於來自較大規模生產的原材料，例如30-kg規模的實驗性發芽樣本。然而，大規模和小規模試驗之間，T2N潛能相對試驗值通常是相似的。類似地，還注意到在微發芽原料的樣本中和在來自發芽原料的產品中測定的T2N 潛能(和T2N前體)常常高於來自較大規模生產的原材料，例如30-kg規模的實驗性發芽樣本。然而，大規模和小規模試驗之間，T2N潛能相對試驗值通常是相似的。
實施例本文的實施例例示說明了本發明的優選實施方式，並且不應認為這些實施例是對本發明的限制。除非另有說明，否則用於操作核酸和細菌的基本分子生物學技術均按照Sambrook and Russel (2001)中的描述進行。實施例1在突變的L0X-1無效群(M3代)的突變的成熟胚中選擇低L0X-2活性L0X-1和L0X-2兩者均在成熟的大麥胚(L0X-1是主要的酶)中合成，也在萌芽胚 (兩個酶水平相等)中合成。為了測定數千樣本中的LOX活性，利用大麥胚的提取物的試驗將是最便利的。並且在用於L0X-2水平的試驗中，篩選誘變的L0X-1無效大麥的麥粒將非常有利(參見WO 2005/087934)從無效L0X-1突變體Dl 12 (描述在W02005/0879;34中，ATCC的保藏號是PTA-5487) 的大麥植物收集麥粒，並與誘變劑NaR溫育以在大麥基因組DNA中誘導點突變。按照 Kleinhofs等人(見上文)提供的建議進行試驗設定。接著，在田間土地繁殖Ml代的突變穀粒經歷隨後兩代，最後產生用於篩選目的的高比例的M3代純合植物(過程概述參見圖1)。預期M3代的突變穀粒含基因突變的頻率為 0. 9-2. 3/10，000個穀粒(Kleinhofs等人，參見上文)。通過常規的L0X-1實驗測定，發現無效L0X-1突變體的成熟胚中L0X-2活性低。在此，同時將反應混合物的儲備溶液和提取物合併(按照W02005/087934中的描述)。在該申請中詳述了提高實驗靈敏度的方法，其中同時改變了酶提取條件以及反應混合物儲備溶液的混合。對於LOX提取，本發明人驚喜地發現利用100-mM乳酸緩衝液(pH 4.5)致使 HPODE-消耗活性的背景水平顯著降低，使HPODE積累在試驗緩衝液中。此外，本發明人還發現，通過在加入剩餘試驗反應物之前，允許所形成的小部分HPODE通過對與L0X-2結合的鐵原子的— Fe+++氧化而活化L0X-2，最終形成藍色吲達胺染料，可進一步改良所述試驗。簡而言之，利用200 μ 1提取緩衝液(IOOmM乳酸，pH 4. 5)從所分離的成熟胚中提取L0X-2酶。提取在96孔板中進行，其中每1.2-ml孔含圓形的5-mm玻璃珠。將平板在冰上孵育10分鐘，然後轉移至MM 300試驗室磨(Retsch)，經電子調整而以27^(^1的頻率震蕩；35秒。隨後，將平板在Allegra 6R離心機(Beckman-Coulter)中以4，OOOrpm在 4°C離心10分鐘以沉澱不溶物質，並隨後至進一步加工前保持在冰上最多2小時。將96 孑L板轉移至 Biomek 2000Laboratory Automation Workstation(Beckman-Coulter)以進一步吹吸。最初，將96X40 μ 1胚提取物轉移至標準的96-孔微孔平板(Nunc)，隨後加入 90 μ 1試劑A[12. 5mM 3-( 二甲基氨基)苯甲酸，0. 625mM亞油酸]，其中所述試劑A通過首先混合155 μ 1亞油酸(相當於13%ig游離酸，Sigma, L-1376)和257 μ 1吐溫-20，然後加入H2O至體積為5ml，隨後加入600 μ 1 IM NaOH而製成。利用H2O將澄清的溶液調整至 20ml。在加入90μ 1試劑B(0. 25mM 3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙，0. 125mg/ml血紅蛋白) 前溫育混合物10分鐘。在進一步溫育5分鐘後，利用Flourostar Galaxy分光光度計(BMG Labtechnologies)測定96孔平板各孔的A595，顏色形成反映存在由L0X-2催化的二加氧作用產生的HPODE (因此，活性表示為A595單位)。利用以上描述的方法，分析總共21，000個大麥突變系的L0X-2活性，並基於低 L0X-2活性選擇其中的1，550個突變系。將這些突變系進一步在田間繁殖，隨後在成熟穀粒中測定L0X-2活性。然而，發現沒有一個突變系將低L0X-2特徵轉移至下一代。實施例2在萌芽大麥胚中選擇低L0X-2活性改良的篩詵材料根據Kleinhofs等人(參見上文)提供的詳述，將從通過雜交(無效L0X-1突變體D112X Jersey) XSebastian產生的L0X-1無效系Ca211901的大麥植物收集的麥粒與誘變劑Na隊一起溫育。選擇該方法的原因是已知其在大麥基因組DNA中誘導點突變，最終導致誘變DNA編碼的蛋白的胺基酸殘基取代或截短。在本申請的誘變試驗中，選擇在田間土地繁殖Ml代的突變穀粒經歷隨後兩代，最後產生用於篩選目的的高比例純合植物(參見圖1)。儘管沒有篩選M2代穀粒，主要原因是預期這些穀粒包含有相對高比例的雜合點突變，但使用M3代的突變穀粒作為篩選材料，其中預期每10，000個穀粒具有 0. 9-2. 3個突變(Kleinhofs等人，參見上文)。意外地，本發明人發現，與分析成熟胚的提取物(如上文實施例1所述)相比，萌芽胚的分析產生試驗結果明顯改進。因此，建立高通量篩選方法以測定包括子葉盤組織在內的萌芽胚中的L0X-2活性。從35，125個大麥穗的成熟麥粒分離兩個胚(無效L0X-1突變體Dl 12的M4代的 20，977個系，和L0X-1無效系Ca21190系的M3代的14，148個系)，並轉移至96孔儲藏板 (ABgene)。在向各個孔中加入20 μ 1水後開始胚萌芽，其中用溼的Kimnett薄紙和塑料蓋覆蓋所述孔。將平板在塑料箱中於20°C溫育48小時。溫育後，提取L0X-2酶；首先向各孔中加入5-mm玻璃珠和200 μ 1提取緩衝液(IOOmM乳酸緩衝液，ρΗ 4. 5)，然後在匪300 實驗室磨(Retsch)中以278^-1的頻率研磨35秒。隨後，將平板在Allegra 6R離心機 (Beckman-Coulter)中在4°C以4，OOOrpm離心10分鐘，以沉澱不溶物質。基本按照用於成熟胚提取物的L0X-2活性分析(實施例1)的描述測定L0X-2活性，區別僅在於每個試驗僅使用30 μ 1提取物而非40 μ 1。潛在突變體的鑑定如上文所述，分析上述35，125個大麥系的各兩個穀粒的L0X-2 活性，目的在於鑑定當與L0X-1無效和野生型穀粒相比時，所述活性高度降低的穀粒。在 Ca211901系的M3代中，共鑑定出7個潛在原始突變體。在溫室中進一步繁殖這些突變體， 收穫，並再選擇與非常低的LOX活性相關的特徵。最後，Ca211901系的僅一個突變體(命名為突變體A689，在本文中還被稱為雙無效LOX突變體A689)顯示基本沒有L0X-2活性。利用LOX活性幾乎完全由L0X-2產生的萌芽胚的提取物進行總LOX活性的詳細測定(khmitt and van Mechelen, 1997)。對於突變體A689的M3穀粒的萌芽胚，由LOX比色試驗測定的總LOX活性(實施例1，表1)為0. 163士5. 5% A595U/萌芽胚，而對於LOX-1無效母本品種Ca211901則為1. 2M士3. 8% A595U/萌芽胚(無效L0X-1原始突變體D112的相應值為1.215士6. O^A595U/ 萌芽胚)。實施例3大麥突變體A689進行分析以確定M4和M5代的L0X-2無效植物在相應的突變表型方面是否為純合的。這種類型的分析會有助於確定所述突變在遺傳上是隱性的，還是顯性的。因此，如果M3 代植物對於顯性突變是雜合的，則隨後世代的個體將出現表型分離。測定突變體A689的M3、M4和M5代的大麥胚中的總LOX活性，並將活性與母本系 Ca211901的胚的進行比較，還與無效L0X-1突變體D112的進行比較。LOX活性的測定如按照本申請實施例1的描述。在所有試驗中，對照樣本均包括來自母本系的萌芽胚的標準提取物，和來自無效L0X-1突變系Ca211901和突變體D112的胚的熱失活標準提取物。對於突變體A689的M4代穀粒的胚，平均總LOX活性為0. 151 士 2.6% A595U (η = Μ)，並且對於突變體Α689的Μ5代的萌芽胚的平均總LOX活性為0. 16士2. 3% A595U (n = 90)。出於比較，L0X-1無效系Ca211901和突變體Dl 12的萌芽胚分別產生1. 210士3. 0% A595U (n = 90， Μ4代)和1. 199 士 4. 6% A595U (n = 90，Μ5代)。結果總結在表1和圖4A-C中。總之，試驗數據證明突變體D112的Μ4和Μ5代穀粒在表明非常低的總LOX活性的遺傳特徵方面是純合的，其反映了雙無效LOX表型。表1.由原始突變體(Μ3代)和子代(Μ4和Μ5代)的萌芽大麥胚製備的提取物中的總LOX活性(平均)。
權利要求
1.由大麥植物或其部分製備的飲料，其中所述飲料包含非常低水平的T2N潛能，並且其中所述大麥植物或其部分包含導致功能性脂加氧酶(LOX)-I酶完全喪失的第一突變和導致功能性L0X-2酶完全喪失的第二突變。
2.如權利要求1所述的飲料，其中所述飲料為麥芽飲料。
3.如權利要求1和2中任一項所述的飲料，其中所述飲料是發酵的麥芽飲料。
4.如前述任一項權利要求所述的飲料，其中所述飲料是啤酒。
5.如權利要求1和4中任一項所述的飲料，其中所述飲料是大麥啤酒。
6.如前述權利要求1-3中任一項所述的飲料，其中所述飲料是無醇麥芽飲料。
7.如前述任一項權利要求所述的飲料，其中與以相同方式由大麥cv.Power製備的飲料的T2N潛能相比，所述飲料包含小於50%，優選小於40%，更優選小於35%的T2N潛能。
8.如前述任一項權利要求所述的飲料，其中與以相同方式由L0X-1無效大麥突變體製備的飲料相比，所述飲料包含小於70%，優選小於60%的T2N潛能。
9.如前述任一項權利要求所述的飲料，其中在37°C儲藏8周後，與以相同方式由大麥 cv. Power製備的飲料相比，所述飲料包含小於50 %，優選小於40 %，更 優選小於35 %，甚至更優選小於30%，還更優選小於25%的游離T2N。
10.前述任一項權利要求所述的飲料，其中在存在2-4ppm亞硫酸鹽的情況下在37°C儲藏2周後，與以相同方式由大麥cv. Power製備的飲料相比，所述飲料包含小於50 %，優選小於40%，更優選小於35%的游離T2N。
11.前述任一項權利要求所述的飲料，其中在37°C儲藏8周後，與以相同方式由L0X-1 無效大麥製備的飲料相比，所述飲料包含小於70 %，優選小於60 %，甚至更優選小於55 % 的游離T2N。
12.前述任一項權利要求所述的飲料，其中在37°C儲藏2周後，與以相同方式由L0X-1 無效大麥製備的飲料相比，所述飲料包含小於80%，優選小於75%的游離T2N。
13.前述任一項權利要求所述的飲料，其中當由受過訓練的專家品嘗小組進行評價並且以0-5分的等級，其中0為不存在，5為極大進行打分時，在37°C儲藏2周後，所述飲料的紙樣味道的分值比與以相同方式由cv. Power製備的飲料的紙樣味道的分值低至少0. 5，優選低至少0. 7，更優選低至少1. 0。
14.如權利要求9-13中任一項所述的飲料，其中所述儲藏是在2-6ppm亞硫酸鹽的存在下進行。
15.大麥植物或其部分，其包含導致功能性L0X-1酶完全喪失的第一突變和導致功能性L0X-2酶完全喪失的第二突變。
16.如權利要求15所述的大麥植物或其部分，其中在所述植物的所述L0X-1編碼基因中包含提前終止密碼子。
17.如權利要求15-16中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述植物的L0X-1編碼基因包含位於起始密碼子下遊最多705個密碼子，優選最多665個密碼子處的提前終止密碼子。
18.如權利要求16所述的大麥植物或其部分，其中所述植物的所述L0X-1編碼基因包含無義密碼子，所述密碼子對應於WO 2005/087934的SEQ ID NO 2的第3572-3574位鹼基。
19.如權利要求15-18中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述植物的所述L0X-2 編碼基因包含提前終止密碼子。
20.如權利要求15-19中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述植物的所述L0X-2 編碼基因包含位於起始密碼子下遊最多707個密碼子，優選最多684個密碼子處的提前終止密碼子。
21.如權利要求20所述的大麥植物或其部分，其中所述植物的所述L0X-2編碼基因包含位於SEQ ID NO 1的第沈89位核苷酸的突變，導致形成終止密碼子。
22.如權利要求15-21中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述植物選自保藏在 ATCC、保藏編號為PTA-9640且命名為〃大麥，Hordeum vulgare L.系A689"的植物及其子代植物組成的組。
23.如權利要求15-22中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述大麥植物的所述部分是麥粒。
24.如權利要求15-23中任一項所述的大麥植物或其部分，其中所述植物由包含以下步驟的方法生產，或者所述植物是由包含以下步驟的方法生產的植物的子代(i)提供L0X-1活性完全喪失的大麥植物或其部分；和( )誘變所述大麥植物，和/或來自所述大麥植物的大麥細胞，和/或大麥組織，和/ 或大麥粒，和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和(iii)將所述誘變大麥植物、麥粒和/或胚培育至少2代，由此獲得Mx代的大麥植物， 其中χ為彡2的整數；和(iv)獲得所述Mx大麥植物的胚；和(ν)使所述胚萌芽；(vi)測定所述萌芽胚或其部分中的L0X-1和L0X-2活性；和(vii)選擇所述萌芽胚中L0X-1活性和L0X-2活性完全喪失的植物；和(viii)測定L0X-1編碼基因和L0X-2編碼基因中是否存在突變；和(ix)選擇在L0X-1編碼基因和L0X-2編碼基因中具有突變的植物；由此獲得在L0X-1編碼基因和L0X-2編碼基因中具有引起L0X-1活性完全喪失和 L0X-2活性完全喪失的突變的大麥植物。
25.如權利要求1-14中任一項所述的飲料，其中所述飲料是由權利要求15-24中任一項所述的大麥植物或其部分製備的。
26.組合物，其包含權利要求15-24中任一項所述的大麥植物或其部分。
27.包含經加工的大麥植物或其部分的植物產品，其中所述大麥植物是權利要求 15-24中任一項所述的大麥植物。
28.如權利要求27所述的植物產品，其中所述植物產品是包含經加工的大麥植物或其部分的麥芽組合物，其中所述大麥植物是權利要求15-24中任一項所述的大麥植物。
29.如權利要求觀所述的麥芽組合物，其中所述大麥植物的所述部分是麥粒。
30.如權利要求觀-29中任一項所述的麥芽組合物，其中與以相同方式由大麥突變體 D112製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物包含最多60%的游離T2N，所述大麥突變體 D112在美國標準培養物保藏中心(ATCC)的保藏編號為PTA-5487。
31.如權利要求20-22中任一項所述的麥芽組合物，其中與以相同方式由cv.Power製備的麥芽組合物相比，所述麥芽組合物包含小於30 %，更優選小於20 %，甚至更優選小於 10%的游離T2N。
32.如權利要求27所述的植物產品，其中所述植物產品是利用權利要求15-24中任一項所述的大麥植物或其部分製備的麥芽汁組合物，或者是利用由所述大麥植物或其部分製備的麥芽組合物製備的麥芽汁組合物，或其混合物。
33.如權利要求32所述的麥芽汁組合物，其中所述植物的所述部分是麥粒。
34.如權利要求32和33中任一項所述的麥芽汁組合物，其中所述麥芽汁組合物是大麥麥芽汁。
35.如權利要求32-34中任一項所述的麥芽汁組合物，其中與以相同方式由野生型大麥製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物包含小於50 %，更優選小於40 %，甚至更優選小於30%的游離T2N。
36.如權利要求32-35中任一項所述的麥芽汁組合物，其中與以相同方式由野生型大麥製備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物包含小於50 %，更優選小於40 %，甚至更優選小於30%的T2N潛能。
37.如權利要求32-36中任一項所述的麥芽汁組合物，其中所述麥芽組合物是權利要求觀-31中任一項所述的麥芽組合物。
38.如權利要求32-37中任一項所述的麥芽汁組合物，其中所述麥芽汁組合物是利用在不超過70°C，優選不超過69°C的溫度下的糖化產生的。
39.如權利要求32-38中任一項所述的麥芽汁組合物，其中所述麥芽汁組合物是通過其中糖化過程中的溫度不高於70°C，持續不超過25分鐘的方法產生的。
40.如權利要求27所述的植物產品，其中所述植物產品是由以下的混合物製備的組合物(i)包含權利要求15-24中任一項所述的大麥植物或其部分的組合物；和( )權利要求觀-31中任一項所述的麥芽組合物。
41.如權利要求27所述的植物產品，其中所述植物產品是由權利要求40所述的組合物製備的麥芽汁組合物或飲料。
42.如權利要求1-14中任一項所述的飲料，其中所述飲料是由權利要求觀-31中任一項所述的麥芽組合物或者權利要求32-39中任一項所述的麥芽汁組合物製備的。
43.如權利要求27所述的植物產品，其中所述植物產品選自大麥糖漿、麥芽糖漿、大麥提取物和麥芽提取物組成的組。
44.生產T2N潛能水平非常低的飲料的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)製備包含權利要求15-24中任一項所述的大麥植物或其部分的組合物；和( )將(i)的所述組合物加工成飲料；由此獲得T2N潛能水平非常低的飲料。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述T2N潛能水平非常低是指該潛能是以相同方式由大麥cv. Power製備的飲料的T2N潛能的至多50%，優選至多40%，更優選至多35%。
46.如權利要求42-43中任一項所述的方法，其中T2N潛能水平非常低是指該潛能與以相同方式由L0X-1無效大麥突變體製備的飲料相比，該潛能小於70%，優選小於60%。
47.如權利要求44-46中任一項所述的方法，其中步驟(i)包括由所述大麥植物或其部分的麥粒製備麥芽組合物。
48.如權利要求44-47中任一項所述的方法，其中將所述組合物加工成飲料包括糖化步驟，從而產生麥芽汁組合物。
49.如權利要求44-48中任一項所述的方法，其中將所述組合物加工成飲料包括糖化步驟和噴射提取步驟，從而產生麥芽汁組合物。
50.如權利要求48和49中任一項所述的方法，其中所述糖化步驟包括糖化經碾磨的麥芽，或糖化經碾磨的大麥，或糖化經碾磨的麥芽和大麥的混合物。
51.如權利要求48-50中任一項所述的方法，其中將所述組合物加工成飲料包括發酵所述麥芽汁。
52.生產包含非常低水平的游離T2N的麥芽組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)提供權利要求23所述的麥粒； ( )浸泡所述麥粒；(iii)在預定條件下萌芽所述經浸泡的麥粒；(iv)用熱處理所述萌芽的麥粒；由此產生包含非常低水平的游離T2N的麥芽組合物。
53.如權利要求52所述的方法，其中與以相同方式由大麥突變體D112製備的麥芽組合物中的游離T2N相比，所述非常低水平的游離T2N為最多50% T2N，其中所述大麥突變體 Dl 12的ATCC保藏編號為PTA-5487。
54.製備大麥植物的方法，其中所述大麥植物包含導致功能性L0X-1酶完全喪失的第一突變和導致功能性L0X-2酶完全喪失的第二突變，所述方法包括以下步驟(i)提供功能性L0X-1完全喪失的大麥植物或其部分；和( )誘變所述大麥植物，和/或來自所述大麥植物的大麥細胞，和/或大麥組織，和/ 或大麥粒，和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和(iii)將所述誘變的大麥植物、麥粒和/或胚培育至少2代，由此獲得Mx代的大麥植物，其中χ為彡2的整數；和(iv)獲得所述Mx大麥植物的胚；和 (ν)使所述胚萌芽；(vi)測定所述萌芽胚或其部分中的L0X-1和L0X-2活性；和(vii)選擇所述萌芽胚中L0X-1活性和L0X-2活性完全喪失的植物；(viii)測定L0X-1編碼基因和L0X-2編碼基因中是否存在突變；和(ix)選擇在L0X-1編碼基因和L0X-2編碼基因中具有突變的植物；由此獲得包含導致功能性L0X-1酶完全喪失的第一突變和導致功能性L0X-2酶完全喪失的第二突變的大麥植物。
全文摘要
本發明提供了功能性脂加氧酶(LOX)-1和LOX-2完全喪失的大麥和由其生產的植物產品，例如利用脂肪酸雙加氧酶LOX-1和LOX-2的合成具有缺陷的大麥粒製備的麥芽。所述酶的主要活性分別涉及將亞油酸轉化為9-氫過氧化十八碳二烯酸和13-氫過氧化十八碳二烯酸的雙加氧作用。9-氫過氧化十八碳二烯酸代表了LOX通路代謝物，其可通過進一步酶促或自發反應導致反式-2-壬烯醛(T2N)的出現。本發明能夠使釀酒者生產出即使在長期飲料儲藏後，T2N特異性的陳腐異味水平仍不顯著的啤酒。
文檔編號A01H5/10GK102333440SQ200980157631
公開日2012年1月25日 申請日期2009年12月28日 優先權日2008年12月30日
發明者伯吉特·斯卡德豪奇, 克勞斯·布雷達姆, 奧利·奧爾森, 索倫·克努森, 芬恩·洛克, 萊恩·M·貝克 申請人:嘉士伯釀酒有限公司, 海尼肯供應鏈股份有限公司