用於進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法

2023-05-31 05:40:16

專利名稱：用於進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法
技術領域：
本發明涉及一種直接使用生物樣品進行涉及核酸分子的直接酶反 應的方法及其試劑盒。
背景技術：
自從Watson和Crick闡明DNA的雙螺旋結構以來，核酸分子已變 成分子生物學中最重要的對象和目標。另外，已廣泛開發和研究了使 用核酸分子作為底物或模板的酶，且已經提出了包括克隆和誘變的多 種操作核酸分子的技術。Mullis等人(1 3)已在二十世紀八十年代末開發了聚合酶鏈式反應 (PCR),其在分子生物學中邁出了巨大一步。此外，已報導了如連接酶 鏈反應(LCR)、分枝DNA技術(bDNA)、轉錄介導的擴增(TMA)、雜交 保護分析(HPA)、雜交捕獲系統、鏈置換擴增(SDA)、環狀探針技術 (CPT)、實時PCR、侵染才企測和環介導等溫擴增(LAMP)的多種核酸操 作技術，以滿足如基因工程、蛋白質工程、診斷學和治療學的研究和 工業領域中的多種需要。同樣地，核酸分子被廣泛地應用到多種領域中，它們的應用不可 缺少地伴隨有預純化(分離)方法。換句話說，因為含有核酸分子的生物 樣品很可能含有酶反應特別是酶的抑制劑，所以在應用之前需要將核 酸分子與抑制劑分離。例如，因為生物樣品中存在的各種物質抑制PCR 過程，從而不能得到所需結果，所以PCR方法通常使用從生物樣品中 純化的核酸分子作為模板。為了從生物樣品中分離或純化核酸分子，通常採用酚-氯仿抽提、 離子交換層析或使用玻璃珠的方法。然而，這些被認為煩瑣的方法是 耗時和耗成本的方法。此外，眾所周知酚對人類和環境是十分有毒的。 因此，如果可以將生物樣品直接進行涉及核酸的酶反應，那麼可以具 有多種優點。將血液樣品用擴增發應，尤其是PCR進行分析。然而，因為在血 液樣品中存在多種聚合酶的酶抑制劑，所以血液樣品在直接進行擴增 反應中具有固有局限性。其固有的抑制劑包括血紅蛋白(4)、免疫球蛋 白G(IgG)(5)、鹽(例如，K+和Na+)、膽鹽以及血細胞中的脫氧核糖核 酸酶和蛋白酶。另外，如EDTA、肝素和檸檬酸鈉的抗凝劑對擴增反應， 特別是PCR呈現出強的抑制活性。不經過核酸純化的直接擴增反應是可行的，可以克服與核酸純化 相關的許多缺點，其包括(i)傳染研究者；(ii)核酸樣品間的交叉汙染； (iii)核酸損失，尤其是在存在痕量樣品時；(iv)損摔毛時間和成本；以及(v) 難以自動操作。與此相關，已進行許多研究以提出用於進行直接酶反 應的方法。例如，Mercier等人(6), Panaccio等人(7)和McCusker等人(8)已 報導了直接使用血液樣品的PCR法。另外，Panaccio等人(9)已經提出 了使用血液樣品的直接PCR法。然而，所述方法的缺點在於血液樣品 與甲醯胺混合併使混合物進行預反應(9,10)。 Burckhardt公開了改變 PCR反應中的陽離子濃度以使用高達80 % (v/v)的血液樣品進行直接 PCR(ll)。根據Burckhardt的方法，PCR反應的配方和組成根據血液樣 品的量而改變，且在擴增反應之前將血液樣品預熱。雖然前述報導描述了使用血液樣品進行直接PCR的可能性，但是 需要解決如需要單鏈DNA結合蛋白(T4基因32蛋白(gp32) ) (12)或特 殊的預處理的不方便性(8,13)。最近，包括Makowski等人(14)、 Kreader(12)和Satoh等人(15)的一 些研究者也已報導了直接PCR反應。Al-Soud等人已研究將從細菌中分離的DNA樣品與不同量的如血 液、糞便以及乾酪和肉的懸浮液的生物樣品混合，然後使用各種熱穩 定的DNA聚合酶和PCR促進劑進行PCR擴增。結果，他們發現牛血 清白蛋白(BSA)、甜菜鹼和gp32可以防止血液樣品抑制PCR反應。然 而，他們的試驗使用與如血液的生物樣品人工混合的DNA樣品而不是 生物樣品本身，其不能反映直接擴增反應的真實條件。而且，他們使 用相對高含量的DNA樣品(l ng/25 pl反應物)，從而他們不能評價是否 能使用這種PCR促進劑進行痕量DNA樣品擴增。Nishimura等人已提出在高於8.9的pH範圍內進行PCR可以有效 地克服血液對PCR的抑制作用(美國專利號5,935,825)。另外，他們已 提出了高水平的多胺使用糞便的直接PCR反應成為可能(美國專利號 6,413,747)。然而，因為這些方法採用較高的pH,所以，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems^^司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science7>司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen^^司)的化學修 飾DNA聚合酶熱啟動PCR在這些條件下不能進行，且多種DNA聚合 酶不能用於這些PCR反應中。
另外，Kato等人已提出了使用多胺進行低拷貝DNA分子直接擴增 反應(美國專利號6，413，747)。然而，他們沒有直4妄-使用血液樣品。他 們而是使用間接收集的添加有人免疫缺陷病毒型1型(HIV-1) DNA分 子的白細胞，其不含如血紅蛋白的PCR抑制劑。因此，他們給出的防 止血液樣品抑制PCR活性的結果是不合理的。因此，現有技術中迫切需要開發一種新的不經過核酸純化的直接 酶反應(尤其是擴增反應)。整個申請中參考多個專利和出版物，且引文列於括號中。為了更 充分地描述本發明和本發明所述技術領域的情況，在此將這些專利和 出版物的內容全部引入本申請中作為參考。發明內容在這種背景下，本發明人已進行深入研究，以開發用於直接使用 生物樣品進行涉及核酸分子的直接酶反應的新方法，結果發現，包含 在反應混合物中的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物使生物樣 品中含有的核酸分子不經過預純化而直接酶反應是可行的。因此，本發明的一個目的是提供一種用於進行涉及核酸分子和直 接使用生物樣品的的直接酶反應的方法。本發明的另 一個目的是提供一種用於進行涉及核酸分子和直接使 用生物樣品的直接酶反應的試劑盒。本發明的又一個目的是提供一種防止生物樣品抑制涉及核酸分子 的酶反應的方法。
本發明的再一個目的是提供兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化 合物用於製備用於涉及核酸分子的直接酶反應的反應混合物的用途。結合附屬權利要求和附圖，通過下面的詳細描述，本發明的其它 目的和優點將變得顯而易見。


圖1示出使用引物對GH20/GH21的(3-珠蛋白基因(408 bp)的直接 PCR(聚合酶鏈式反應)結果。泳道1-9對應於Tris緩衝液(pH分別為8.3 、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2),泳道10-20對應於Tricine 緩衝液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9 和9.0)，泳道21-29對應於Bicine緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、8.4、 8.5、 8.6、 8.7和8.8),且泳道30-40對應於HEPES緩沖液(pH分 別為8.0、 8丄8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)。 L表示 範圍為100 1500bp的100bp梯度。圖2示出使用引物對GH20/KM38的(3-珠蛋白基因(325bp)的直接 PCR(聚合酶鏈式反應)結果。泳道1-9對應於Tricine緩沖液(pH分別為 8.0、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0),且泳道10-19對應於 Tris緩衝液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0、 9.2和 9.5)。 L表示範圍為100 1500bp的100bp梯度。圖3示出p53基因的直接PCR結果。泳道1-9表示使用Tris緩沖 液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2)的結果， 泳道10-20表示使用Tricine緩衝液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8,4、8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)的結果，泳道21-29表示使用Bicine緩
衝液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7和8.8)的結果， 且泳道30-40表示使用HEPES緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)的結果。L表示範圍為100 1500bp 的100bp梯度。圖4表示多種非還原性碳水化合物防止血液樣品抑制擴增反應的 可能性的分析結果葡萄糖(板A，泳道3-6)，蔗糖(板A，泳道7-10)， 乳糖(板A,泳道11-14),松三糖(板A，泳道15-18)，水蘇糖(板A,泳 道19-22),海藻糖(板B,泳道3-6),蜜三糖(板B,泳道7-10)，山梨糖 醇(板B,泳道11-14),甘露醇(板B,泳道15-18),聚乙烯吡咯烷酮(板 B,泳道19-22)。在板A和B中，泳道1對應於不添加非還原性碳水 化合物，且泳道2對應於使用2 ng人基因組DNA代替血液的結果。圖5示出使用蜜三糖或海藻糖作為用於防止血液抑制擴增反應的 試劑的直接PCR結果。使用Tris緩沖液(pH 8.3)(泳道l-12)或Tricine 緩衝液(pH8.3)(泳道13_24)。蜜三糖最終濃度(。/。(w/v))為0 (泳道1和 13)、 1.4 (泳道2和14)、 2.8 (泳道3和15)、 4.2 (泳道4和16)、 5.6 (泳 道5和17)和7.0 (泳道6和18)。使用的海藻糖的最終濃度(。/。(w/v))為 1.5 (泳道8和20)、 3.0 (泳道9和21)、 4.5 (泳道10和22)、 6.0 (泳道11 和23)和7.5 (泳道12和24)。圖6示出使用海藻糖作為阻止血液對擴增反應的抑制作用的試劑 的直接PCR結果。使用Tricine緩沖液(pH8.3)和2.0單位AmpliTaq DNA 聚合酶。在泳道1-8中使用的海藻糖的最終濃度分別為0、 2.4、 4.8、 6、 12、 18、 24和30。/。(w/v)。
圖7表示海藻糖根據pH對直接擴增反應的影響的分析結果。泳道l-9對應於Tris緩衝液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2)，且泳道10-20對應於Tricine緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9禾口 9.0)。 <吏用1單4立AmpliTaq DNA聚合酶。板A表示0。/。海藻糖，且板B表示3。/。(W/V)海藻糖。圖8示出使用CHAPS擴增p53基因的直接PCR結果。使用Tricine 緩沖液(pH 8.3)(泳道l-9)或Tricine緩沖液(pH 8.7)(泳道10-15)。使用 包含0.4mM三亞乙基四胺(泳道2)或2.4。/。海藻糖(泳道3-15)的共50jil 的PCR反應物。CHAPS的濃度為0 mM (泳道1 、 2和3)、 0.3 mM (泳 道4和10)、 0.6 mM (泳道5和11)、 1.25 mM (泳道6和12)、 2.5 mM (泳 道7和13)、 5 mM (泳道8和14)以及10 mM (泳道9和15)。圖9示出使用多胺、亞精胺(板A)和三亞乙基四胺(板B)擴增p53 基因的直接PCR結果。直接使用l)il肝素處理的血液。泳道l-6對應 於Tris緩衝液(pH 8.3),泳道7-12對應於Tricine緩衝液(pH 8.3),泳道 13-18對應於Tris緩沖液(pH 8.7)，且泳道19-24對應於Tricine緩衝液 (pH 8.7)。亞精胺或三亞乙基四胺最終濃度為0 mM (泳道1、 7、 13和 19)、 0.25mM(泳道2、 8、 14和20)、 0,5mM(泳道3、 9、 15和21)、 1.0mM(泳道4、 10、 16和22)、 2.0mM(泳道5、 11、 17和23)、 4 mM (泳道6、 12、 18和24)。圖10示出使用包含不同濃度的亞精胺(泳道1-6和13-18)或三亞乙 基四胺(泳道7-12和19-24)的Tricine緩沖液(泳道1-12 pH 8.3，泳道 13-24 pH8.7)的直接PCR結果。直接使用2|_11肝素處理的血液。亞精胺 或三亞乙基四胺最終濃度為0 mM (泳道1 、 7、 13和19)、 0.25 mM (泳 道2、 8、 14和20)、 0.5mM氷道3、 9、 15和21)、 1.0mM(泳道4、
10、 16和22)、 2.0mM(泳道5、 11、 17和23)、 4mM(泳道6、 12、 18和24)。圖11示出使用不同濃度的BSA(牛血清白蛋白)擴增p53基因的直 接PCR結果。泳道1-6對應於Tris緩衝液(pH 8.3)、泳道7-12對應於 Tricine緩沖液(pH 8.3),泳道13-18對應於Tris緩衝液(pH 8.7)、且泳道 19-24對應於Tricine緩沖液(pH 8.7)。 BSA的最終濃度為0 mg/ml (泳道 1、 7、 13和19)、 0.62 mg/ml (泳道2、 8、 14和20)、 1.25 mg/ml (泳道 3、 9、 15和21)、 2.5mg/ml(泳道4、 10、 16和22)、 5mg/ml(泳道5、11、 17和23)、 10mg/ml(泳道6、 12、 18和24)。圖12表示使用不同的模板擴增p53基因的PCR結果。泳道1-6對 應於人基因組DNA(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10ng)，泳道7-12 對應於肝素處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20 jil)，泳道 13-18對應於EDTA處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20)dl)， 且泳道19-24對應於檸檬酸鈉處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20 nl)。使用Tricine緩衝液(pH 8.7)。圖13表示使用不同的模板擴增p53基因的PCR結果。泳道l-6對 應於人基因組DNA(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10ng),泳道7-12 對應於肝素處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和lOpl),泳道 13-18對應於EDTA處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10 (il)， 且泳道19-24對應於檸檬酸鈉處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10^1)。 PCR反應物包含Tricine緩沖液(pH 8.7)、 2.4 % (w/v)海藻 糖和4 mg/ml BSA。
圖14示出使用甜菜鹼在本發明所提供的條件下擴增人成視網膜細胞瘤基因(板A和B， 180bp)或載脂蛋白E基因(板C和D, 268bp)的直 接PCR結果。使用20ng人基因組DNA(板A和C)或l^d肝素處理的 血液(板B和D)作為模板。泳道1-5中的甜菜鹼的最終濃度分別為0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0禾口2.5M。圖15示出以不同拷貝數和不同血液樣品的量來擴增HIV-1(人免疫 缺陷病毒-1)的核苷酸序列的直接PCR結果。PCR反應物包含Tricine 緩衝液(pH8.3)、 2.8 % (w/v)海藻糖和4 mg/ml BSA。泳道1-6對應於 分別包含0、 10、 20、 30、 40和50拷貝HIV-1質粒的1 pl肝素處理 的血液，且泳道7-13對應於分別包含在0、 1、 2、 3、 4、 5和6 |il肝 素處理的血液樣品中的20拷貝HIV-1質粒。4吏用引物對SK145和 SK431以產生142 bp的擴增子。圖16示出以不同拷貝數和不同血液樣品的量來擴增HIV-l(人免疫 缺陷病毒-l)的核苷酸序列的直接PCR結果。PCR反應物包含Tricine 緩衝液(pH8.3)、 2.8 % (w/v)海藻糖和4 mg/ml BSA。泳道l-6對應於 分別包含0、 10、 20、 30、 40和50拷貝HIV-1質粒的1 pl肝素處理 的血液，且泳道7-13對應於分別包含在0、 1、 2、 3、 4、 5和6 (il肝 素處理的血液樣品中的20拷貝HIV-1質粒J吏用引物對SK38和SK39 以產生115 bp的擴增子。圖17示出使用多種熱穩定的DNA聚合酶的p53基因的擴增結果。 泳道1-5對應於PfU DNA聚合酶，泳道6-10對應於Pwo DNA聚合酶， 且泳道11-15對應於Tth DNA聚合酶。泳道1、 6和11對應於Tris 緩衝液(pH 8.3)，泳道2、 7和12對應於Tris緩衝液(pH 8.7)， 泳道3、 8和13對應於Tricine緩衝液(pH8.3),且泳道4、9和14對應於Tricine
緩衝液(pH 8.7),其全部包含2.4。/。的海藻糖。泳道5、 10和15各自4吏 用商業製造商提供的反應混合物。圖18示出擴增在細胞培養基中的p53基因的PCR結果。使用包 含2.4%的海藻糖的Tricine緩衝液(pH 8.7)。使用10 ng人基因組DNA 作為模板。泳道l-6分別表示2、 5、 10、 15和20 (il的細胞培養基(包 含10%FBS的DMEM)。圖19示出使用唾液(板A)或血液(板B)通過AmpFLSTR Identifier 試劑盒(Applied Biosystems公司)獲得的分析結果中的藍染 結果。使用的反應混合物包含海藻糖作為用於防止生物樣品抑制擴增 反應的試劑。圖20示出直接使用hepG2-SK細胞擴增(3-肌動蛋白基因(264 bp) 的RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應)結果。泳道1和2分別表示人基因 組DNA和總cDNA的RT-PCR結果。泳道3-4對應於直4妻<吏用1 x 103 個細胞的RT-PCR結果，且泳道5-6對應於直接使用1 x 104個細胞的 結果。泳道3和5為不使用逆轉錄酶的結果(RT-陰性)；泳道4和6為 使用逆轉錄酶的結果(RT-陽性)。圖21表示使用從牛肉組織得到的溶解產物樣品的直接PCR & RFLP(限制性片段長度多態性)分析的結果。泳道1-2對應於分離的 DNA,泳道3-4對應於1 mg肉溶解產物，且泳道5-6對應於10 mg肉 溶解產物衝莫板。泳道2、 4和6表示對擴增子的MspAlI處理的結果。圖22A示出直接使用含有弗氏志賀菌(幼&e他i7e;me/7)的糞便樣品 擴增virA基因的直接PCR結果。泳道1-8表示Tris緩衝液(pH 8.3),
且泳道9_16表示含有2.4 % (w/v)海藻糖的Tricine緩衝液(pH 8J)。弗 氏志賀菌的滴度調整到128,000 CFU (泳道1和9)、 6,400 CFU (泳道2 和10)、 320 CFU (泳道3和11)、 16 CFU (泳道4和12)、 8 CFU (泳道5 和13)、 4CFU (泳道6和14)、 2 CFU (泳道7和15)以及1 CFU (泳道8 和16)。
圖22B表示實時PCR的結果。上面的小圖表示標準曲線，且下面 的小圖表示來自SYBR Green I試驗的熔解曲線分析，其表示刺入糞便 中的弗氏志賀菌的virA基因檢測。
圖23示出使用包括20 ng分離的DNA(泳道1)、 0.4 mg(泳道2)和 0.1 mg(泳道3)凍乾粉末、各1 (id來自水稻葉的0.04 mg/)al的葉懸浮液(泳 道4)和0.1 mg/pl的葉懸浮液(泳道5)的多種植物樣品來擴增水稻(3-肌 動蛋白基因的直接PCR結果。板A表示含2.4%海藻糖的Tricine緩沖 液(pH 8.3)，且板B表示Tris緩沖液(pH 8.3)。
圖24示出直接使用從組織微陣列(ISU Abxis公司)中提取的組織點 來擴增表皮生長因子受體(EGFR)基因的直接PCR結果。泳道1-4分別 對應於EGFR基因的外顯子18、 19、 20和21。使用包含2.4%海藻糖 的Tricine緩沖液(pH 8.3)。
圖25表示在ABI 3100基因分析儀上分析的SNaPshot ddNTP引物 延伸(Primer-Extension)試驗的電泳圖，其用於SNP(單核苷酸多態性)基 因分型，以檢測EGFR基因的啟動子區域的多態性(上面的圖，TT純合 子；中部的圖GT雜合子；以及底部的圖，GG純合子)。 圖26A和26B表示由螢光染料終止循環測序法得到的測序數據。 在循環測序之前，用NucleoSpin Extract II將直接PCR產物進行PCR 產物純化(圖26A)或不經過純化(圖26B)。
具體實施方式
在本發明的 一 個技術方案中，提供一種用於進行涉及核酸分子的 直接酶反應的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩 性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物中進行酶反應， 該兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物用於防止生物樣品抑制酶 反應，其中在酶反應之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b) 從酶反應中得到產物。在本發明的另 一個技術方案中，提供一種用於進行涉及核酸分子 的直接酶反應並直接使用生物樣品的試劑盒，其包括用於酶反應的反 應混合物，該反應混合物包含用以防止生物樣品抑制酶反應的兩性離 子緩衝液和/或非還原性碳水化合物，而存在於生物樣品中的核酸分子 在酶反應之前不需要純化。本發明人已進行深入研究，以開發用於直接使用生物樣品進行涉 及核酸分子的直接酶反應的新方法，結果發現，包含在反應混合物中 的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物使生物樣品中含有的核酸 分子不經過預純化而直接酶反應是可行的。使用生物樣品的直接酶反應的成功取決於如何防止生物樣品抑制 酶反應。本發明中使用的術語"直接酶反應"指直接使用生物樣品而 不需要用於分離或純化生物樣品中包含的特定生物物質的預處理的由 酶催化的反應。
如體液(例如，血液、唾液和淋巴液)的生物樣品和細胞培養物通常 含有酶反應特別是本身是酶的固有抑制劑。本發明完全保證克服與存 在於生物樣品中的酶抑制劑有關的缺陷，從而可以使用生物樣品以較 高的效率和適用性成功地進行直接酶反應。本發明中的術語"涉及核酸分子的酶反應"指使用核酸分子作為 底物、模板或引物的由酶催化的反應。涉及核酸分子的酶反應引起核 酸分子的改變。本發明中的術語"核酸"指單鏈或雙鏈形式的脫氧核 糖核酸或核糖核酸聚合物。本發明可以以較高的效率和適用性使用生物樣品來進行直接酶反 應，其不需要任何預處理以分離或純化生物樣品中存在的核酸分子。本發明可以應用到多種涉及核酸(NA)的酶反應。優選將本發明應 用到擴增反應、逆轉錄、DNA連接、核酸酶介導的反應、DNA曱基化、 拓樸異構酶介導的反應或端粒酶介導的反應。使用的術語"擴增反應"指用於擴增核酸分子的反應。本領域中已 提出了多種擴增反應，其包括但不限於聚合酶鏈式反應(下文稱為 PCR)(美國專利號4,683,195、 4,683,202和4,800,159)、逆轉錄聚合酶鏈 式反應(下文稱為RT-PCR) (Sambrook， J.等人，Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第 3 Zf反.Cold Spring Harbor Press (2001)), the methods of Miller, H. I. (WO 89/06700)以及Davey, C.等人(EP 329,822)、連接酶鏈反應(LCR)(17, 18)、缺口-LCR (WO 90/01069)、修 復鏈反應(EP 439,182)、轉錄介導的擴增(TMA) (19) (WO 88/10315)、 自主序列複製(20) (WO 90/06"5)、目標多核苷酸序列的選擇性擴增(美 國專利號6,410,276)、共有序列引物聚合酶鏈反應(CP-PCR)(美國專利
號4,437,975)、隨機引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)(美國專利號5,413，卯9 和5,861,245)、基於核酸序列的擴增(NASBA)(美國專利號5,130,238、 5,409,818、 5,554,517和6,063,603)、鏈置換擴增(21, 22)和環介導等溫 擴增(LAMP)(23)。可以1"吏用美國專利號5,242,794、 5,494,810、 4,988,617 以及美國序列號09/854,317中所描述的其它擴增方法。本發明中使用的術語"逆轉錄"指以RNA為模板合成DNA的反 應。例如，RT-PCR涉及逆轉錄。術語"DNA連接"意指在兩個DNA 分子之間形成共價連接的反應。例如，LCR中涉及DNA連接。本發明中使用的術語"核酸酶介導的反應"指由核酸酶催化的切 斷核酸分子間的磷酸二酯鍵的反應。本領域的技術人員已知多種核酸 酶。例如，核酸酶包括但不限於內切核酸酶(例如，FEN-1內切核酸酶、 限制性內切酶、DNase I、 DNase II和RNase I)和外切核酸酶(蛇毒磷酸 二酯酶和脾磷酸二酯酶)。例如，FEN-I內切核酸酶在侵染檢測中起關 鍵作用。本發明使用的術語"DNA曱基化"指在DNA鹼基的特定位置引 起曱基化的反應。本發明中使用的術語"拓樸異構酶介導的反應"指 由拓樸異構酶(例如，I或II型拓樸異構酶)催化的將共價閉合環狀DNA 的一種拓樸異構體轉變成另一種的反應。術語"端粒酶介導的反應" 指由端粒酶催化的在端粒產生一條鏈的重複單元的反應。根據優選的實施方式，所述酶反應為擴增反應。完成本方法以擴兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物來進行。本發 明的直接擴增優選包括如下步驟(i)獲得包括目標核酸分子的生物樣 品；(ii)將上述生物樣品接觸用於擴增反應的包含酶以及用以防止生物樣品抑制擴增反應的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物中；以及(iii)擴增目標核酸分子。本發明中使用的術語"直接擴增"指直接使用生物樣品而不需要 用於分離或純化生物樣品中包含的核酸分子的預處理的擴增反應。包含於反應混合物中的酶包括但不限於用於基於PCR擴增的熱穩 定的DNA聚合酶、用於LCR的熱穩定的連接酶以及用於NASBA和 TMA的逆轉錄酶、RNase H和RNA聚合酶。根據本發明更優選的實施方式，所述酶反應為基於PCR的擴增。PCR是用於核酸擴增的最重要的方法之一，已經開發其多種變形 和應用。例如，為了提高PCR的特異性或靈敏度，通過修改傳統PCR 方法已開發了遞減PCR(24)、熱啟動PCR(25，26)、巢式PCR(2)和加強 PCR(27)。另外，為了特定應用已經提出了實時PCR、差異顯示PCR (DD-PCR)、 cDNA末端快速擴增(RACE)、多重PCR、反向聚合酶鏈反 應(IPCR)、載體PCR(Vectorette PCR)、熱不對稱交錯PCR (TAIL-PCR) 和多重PCR。 PCR的具體內容可以參考McPherson， M.丄，和Moller, S. G PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N. Y. (2000),其全部內容引入此處作為參考。雖然已經報導了多種基於PCR的擴增方法，但是其遵循共同的步 驟如熱循環並使用熱穩定的DNA聚合酶。根據基於PCR的擴增完成本發明，其可以包括如下步驟(i)獲得 包括目標核酸分子的生物樣品；(ii)將上述生物樣品接觸用於PCR的包 含熱穩定的DNA聚合酶以及用以防止生物樣品抑制擴增反應的兩性
離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物中；以及(iii)擴增目 標核酸分子。包含在PCR反應物中的熱穩定的DNA聚合酶可以是從嗜熱性真 細菌或古細菌，例如水生嗜熱菌(r力e/7770s a 朋f/'c"^、 r tf e/777opA 7/cs、77 e/mo/ /^S77 a ac/Jo/ 力/Aw和5W^ /o&" s/ ec中分離的 一種。所述熱穩 定的DNA聚合酶優選為Tag DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfo DNA 聚合酶、PwoDNA聚合酶以及在室溫下無活性的修飾的熱穩定的DNA聚合酶。在室溫下無活性的修飾的熱穩定的DNA聚合酶包括化學修飾的 熱穩定的DNA聚合酶和抗體結合的熱穩定的DNA聚合酶。本發明中 使用的術語"化學地修飾(或化學修飾)的熱穩定的DNA聚合酶，，指經 過化學修飾以在室溫下無活性的熱穩定的DNA聚合酶，其已開發用於 熱啟動PCR。化學修飾的熱穩定的DNA聚合酶在起始再生(regeneration) 步驟(例如，在95。C下加熱10分鐘)中再生然後進行PCR。市售的化學 修飾的熱穩定的DNA聚合酶的非限制性例子包括AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(Applied Biosystem公司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science公司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen公司)。抗體結 合的熱穩定的DNA聚合酶由於結合的抗體而在室溫下無活性，而在高 溫下抗體變性時變得有活性。
在進行擴增反應時，優選在反應容器中提供過量的用於這種反應 的成分。所指的擴增反應的成分的過量是指各成分的量使得完成所述 擴增的能力基本不受所述成分的濃度的限制。需要向反應混合物中提供充足量的如Mg2+的輔因子以及dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP,以達到所需的擴增程度。種出版物中，如Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)以及McPherson， M丄，和Moller, S. G. PCR, BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N. Y. (2000),在此包含其全部技術內容作為參考。除了直接使用生物樣品代替分離的 核酸模板，並在反應混合物中使用兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水 化合物之外，可以根據本領域技術人員已知的一般用於PCR的方法和 條件進行本發明的直接PCR。根據優選的實施方式，根據RT-PCR進行本發明。令人驚訝地， 本發明使得無需RNA分離的直接RT-PCR是可行的。本發明的直接 RT-PCR在擴增步驟之前包括用於從mRNA製備cDNA的反轉錄步驟， 其詳糹田內容參考Joseph Sambroo—k等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);以及Noonan，K.F等人(28)。為進行反轉錄，使用可與mRNA 的poly A尾巴雜交的寡核苷酸dT引物。可以用逆轉錄酶進行反轉錄， 例如，來自MMLV(莫洛尼鼠類白血病毒)、AMV(禽類成髓胞瘤病 毒)或HIV (人免疫缺陷病毒)。 根據優選的實施方式，將本發明應用於熱啟動PCR。已開發熱啟動PCR以提高PCR的靈敏度和特異性(25)。用於傳染病或法醫學的擴 增反應通常使用低拷貝數的核酸樣品。尤其是，為診斷如與HIV和HBV 相關的疾病的傳染病，病毒感染的早期檢測很重要。換句話說，為得 到準確可靠的診斷結果，必須擴增以低拷貝數存在的病毒的核酸分子。 根據本發明，可以直接使用生物樣品通過熱啟動PCR來擴增低拷貝數 的核酸分子。本發明中的這種成果歸因於使用用以防止生物樣品抑制 酶反應的兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物。所述兩性離子緩 衝液和/或非還原性碳水化合物可以在比前面報導的pH (例如，pH 9.0) 相對低的pH(例如，pH 8.3)下發揮這種作用，/人而可以-使用生物樣品在 本發明提供的條件下通過化學修飾的聚合酶來成功地完成熱啟動 PCR。另外，本發明可以應用到在室溫下使用如葡聚糖硫酸酯(美國專利 號6，667,165)或適體(29，30)的聚合酶抑制劑的其它熱啟動PCR變形中。在此處包含其內容作為參考D'Aquila, R. T.等人(25、 26、 31、 32) 中描述了用於熱啟動PCR的一般方法和條件。除了直接使用生物樣品 代替分離的核酸，並在反應混合物中使用兩性離子緩沖液和/或非還原 性碳水化合物之外，可以根據本領域技術人員已知的一^殳用於熱啟動 PCR的方法和條件進行本發明的直接熱啟動PCR。本發明中使用的生物樣品不限於但優選包括病毒、細菌、組織、 糹田月包、血液、'淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞i"更、目艮內液、精液、 腦提取物、脊髓液、關節液、胸液(thymic fluid)、腹水、羊水和細胞組 織液，更優選為病毒、糹田菌、組織、細胞、血液、唾液、奶、尿和糞
便，仍更優選為病毒、細菌、組織、細胞和血液，且最優選為血液。 作為生物樣品，血液可以是全血、血漿或血清，優選為全血樣品。優選的是，在加入混合物之前，用如肝素、EDTA(乙二胺四乙酸)和檸檬酸鈉的抗凝劑預處理全血。然而，抗凝劑很可能抑制酶反應，尤其是PCR活性，從而它們在確定向PCR反應物中加入血液的量中變 成限制性因素。本發明使用兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物 可以克服來自抗凝劑的這種缺點，從而可以在直接擴增中使用較大量 的血液，例如，如實施例in所示，相對於反應混合物總體積高達10%(v/v)。本發明最主要的特徵在於使用作為用於防止生物樣品抑制酶反應 的試劑的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物。生物樣品中存在的多種物質(例如，血紅蛋白、免疫球蛋白G、無機鹽、膽鹽、脫氧核 糖核酸酶和蛋白酶)抑制反應涉及的酶的活性。本發明人發現，兩性離抑制反應中的酶的物質的障礙。本發明的這種巨大的效果可以在兩性 離子緩沖液或非還原性碳水化合物的單獨幫助下實現。優選地，本發 明使用兩性離子緩衝液和非還原性碳水化合物。本發明中使用的術語"兩性離子緩沖液"指包含在同一分子中具 有酸性和鹼性基團的化合物的緩衝液。在中性pH下，多數兩性離子緩 衝液同時具有負電荷的陰離子和正電荷的陽離子。兩性離子緩沖液有 時被稱為"Good"緩沖液(33)。在本發明中可以使用本領域技術人員 已知的任何兩性離子緩沖液，其優選包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌。秦 乙烷磺酸)、Tricine (N-三(羥曱基)曱基甘氨酸)、Bicine (N,N-雙(2-羥乙
基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基)曱基J-氨基丙烷磺酸)、ACE(N-O乙 醯胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA (N-(2-乙醯胺)-亞氨基二乙酸)、MES (2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺酸)、MOPSO(3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺 酸)、PIPES 4-雙(2-乙烷磺酸))和CAPS (N-環己基-3_氨基丙烷磺酸)，更優選HEPES、 Tricine和Bicine，且最優選Tricine。本發明中使用的兩性離子緩衝液的濃度沒有特別限制，優選為 5 60mM，更優選為10 60mM,且最優選為10 50 mM。才艮據如使用 的酶的類型的多個反應條件的改變通過兩性離子緩衝液調整的反應混 合物的pH,優選在6.8 9.5、更優選在7.5 9.0、且最優選在8.0~8.7的範圍內。直接酶反應。本發明中使用的術語"非還原性碳水化合物"指具有不少於兩個 羥基且不具有還原能力的碳水化合物。非還原性碳水化合物包括多元 醇(多羥基化合物)及其衍生物。多元醇的代表性例子包括乙二醇、聚乙 二醇(例如，聚乙二醇)和聚甘油。另外，非還原性碳水化合物的代表性 例子包括碳的非還原性水合物，所謂的非還原性糖或糖類，及其衍生 物。非還原性糖的例子包括但不限於如蔗糖、海藻糖和異麥芽酮糖醇的二糖；如蜜三糖和松三糖的三糖；如水蘇糖的四糖。非還原性糖衍生物包括但不限於糖醇(醛糖或酮糖的氬化形式)，如山梨糖醇、甘露醇、赤蘚糖醇和木糖醇(衍生自單糖)、乳糖醇和麥芽糖醇(衍生自二糖)；如 葡萄糖酸、葡萄糖酸y-內酯的醛糖酸及其內酯；如瑞巴瑞克酸(ribaraic
acid)、阿拉伯酸(arabinaricacid)和半乳糖二酸的糖二酸及其內酉旨；如葡 萄糖醛酸、半乳糖醛酸(galaccuronicacid)和甘露糖醛酸的糖醛酸；如海 藻糖八乙酸酯、蔗糖八乙酸酯和纖維二糖八乙酸酯的酯衍生物(優選 C廣C4脂肪酸酯衍生物)；其中羥基轉變成醚的醚衍生物(優選C廣C4烷基 醚衍生物)。可以^吏用非還原性;友水化合物的D和L形式。
三糖、四糖和衍生自單糖的糖醇，更優選非還原性二糖和衍生自單糖 的糖醇，且最優選山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖和蔗糖。
本發明中使用的非還原性碳水化合物的量沒有特別限制，基於反 應混合物的總重，優選為至少1.5 % (w/v)，更優選為至少2 % (w/v)， 且最優選為2-30 % (w/v)。
根據優選的實施方式，本發明應用到核酸酶介導的反應。更優選 地，本發明按照侵染檢測(34-36)(美國專利號5,846,717, 6,090，543， 6,001,567， 5,985,557和5，994，069)進行。在直接使用生物樣品的直接侵 染檢測中，兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物防止生物樣品抑 制酶反應，如FEN-1內切核酸酶介導的反應。4曼染一企測通過{吏用用於 切斷由重疊寡核苷酸探針雜交形成的複合體的如FEN-1內切核酸酶的 結構特異性酶而一企測特定DNA和RNA序列。不經過溫度循環，升高 的溫度和其中一種探針過量使多數探針被切斷用於存在的各自的目標 序列。這些切斷的探針然後促進次級標記探針的切斷。次級探針寡核 苷酸可以用通過第二染料或其它半淬滅劑淬滅的螢光染料進行5'-端標 記。切斷時，在反應過程中可以使用標準螢光板分析儀或收集螢光數 據的裝置檢測去淬滅的染料標記的產物。侵染檢測在未擴增的基因組
DNA中4企測特定突變和SNP(單核苷酸多態性)。侵染4企測可以結合多 重PCR以廣泛地進行基因組相關的研究。本發明中使用的反應混合物可以進一步包含兩性離子表面活性 劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。這些添加劑同樣能夠防止生物樣 品抑制酶反應。然而，為進行直接酶反應，在本發明中不是必須使用 這些添加劑。本發明中使用的兩性離子表面活性劑的例子包括但不限 於正辛基-N,N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正癸基-N,N-二甲基-3-氨基溶 -1-丙磺酸鹽、正十二烷基-N, N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正十四烷基-N, N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正十六烷基-N，N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、 CHAPS (3-[(3-膽醯胺丙基)二曱基氨基]-l-丙磺酸鹽)和zwittergent (N-烷基-N,N-二曱基-3-氨基-l-丙碌酸鹽)，優選CHAPS和zwittergent,更 優選CHAPS。本發明中使用的多胺優選包括但不限於精胺、腐胺、亞 精胺和三亞乙基四胺，更優選亞精胺和三亞乙基四胺，且最優選三亞 乙基四胺。當將本發明應用到直接擴增生物樣品、尤其是血液中的低拷貝數 的核酸分子時，其優點變得最突出。所指的作為模板的核酸分子的術 語"低拷貝數"指1 1000拷貝的目標核酸分子。以前沒有報導過使用具 有低拷貝數的核酸分子的生物樣品的直接擴增。令人吃驚地，如實施 例V中所示，本發明可以使用血液樣品直接擴增低拷貝數(例如，50(il 總反應物中10拷貝HIV-1核酸)的HIV-1核酸分子。本發明的目的在於一種通過克服來自生物樣品中存在的酶抑制劑 的障礙而可以實現直接酶反應(優選擴增，更優選基於PCR的擴增)的 新方法。據我所知，與如Nishimura等人(美國專利號5,935,825和
6,413,747)和Al-Soud等人(16, 37)的方法的目前已報導的其它直接擴增 方法相比，本發明的效果最好。更具體而言，Nishimura等人的方法存在嚴重的問題用於熱啟動 PCR的化學修飾的聚合酶，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems 7>司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science 司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen公司)在Nishimura等人提供的條 件下不起作用。另外，Al-Soud等人的嘗試對於低拷貝數的DNA模板 不能獲得擴增結果。與這些常規的技術相比，本發明在幾乎全部擴增 反應中呈現出改進的性能。Nishimura等人的方法使用三(羥氨基)曱烷(Tris)反應緩沖液(IO mMTris-HCl，在25°C下高於pH 8.9, 50 mM KC1),其提供了一種通過 將pH調整到高於通常PCR反應緩衝液的pH以抵抗PCR抑制的策略。 與此相反，本發明通過使用兩性離子緩衝液(或Good緩衝液，25。C下PCR抑制。如下文實施例中所述，本發明用於擴增血液中的目標核酸 分子的PCR反應對PCR抑制呈現出十分優異的防止作用，即使在比使 用Tris緩衝液的方法的pH更低的pH下。此外，Nishimura等人已經報導了通過僅使用Taq DNA聚合酶而 獲得的結果。關於Shimadzu公司的AmpdirectTM的報導提出在使用血 液的直接擴增中通過使用PfUDNA聚合酶沒有成功。相反，本發明的 直接擴增能夠使用包括Tth DNA聚合酶、PfU DNA聚合酶和Pwo DNA 聚合酶以及TaqDNA聚合酶的多種熱穩定的聚合酶進行。
最廣泛使用AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)用於基因4全測或鑑定。當將血液樣品直^t妄應用到該試劑盒時，不 產生擴增產物。然而，如實施例IX中所示，當將兩性離子緩沖液和/ 或非還原性碳水化合物加入到反應混合物中時，該試劑盒產生所需的 分析結果。另外，才艮據本發明，在Guthrie卡片、FTA卡片或濾紙上的 血跡可以直接用作用於直接基因檢測模板。本發明的目的還在於用於進行直接酶反應的試劑盒。用於進行直 接酶反應的本試劑盒可以選擇性地用於進行酶反應所需的包括如酶、 底物和輔因子的其它成分。其中，製成本發明的試劑盒以用於擴增DNA 分子，其可以選擇性地包括進行PCR所需的試劑，如DNA聚合酶、 輔因子和脫氧核糖核酸-5-三磷酸酯。本試劑盒還可選擇性地包括多核 苦酸分子、逆轉錄酶、各種緩沖液和試劑以及抑制DNA聚合酶活性的 抗體。本試劑盒還可以包括用於進行陽性或陰性對照反應所需的試劑。 在特定反應中使用的試劑的最佳量已通過受益於本公開內容的技術人 員測定。本試劑盒一般適於被包括在單獨的包裝中或上述組成的分裝 部分中。在本發明的另 一個技術方案中，提供一種用於防止生物樣品抑制 涉及核酸分子的酶反應的方法，其包括將生物樣品接觸包含兩性離子 緩沖液和/或非還原性石友水化合物的用於酶反應的反應混合物中，其中 存在於生物樣品中的核酸分子在酶反應之前不經過純化。在本發明的又一個技術方案中，提供兩性離子緩沖液和/或非還原 性碳水化合物用於製造用於涉及核酸分子的直接酶反應的反應混合物 的用途。
既然本發明的這些技術方案遵循上述本發明的方法的原理，那麼 省略它們間的共同說明，以避免過分冗成而導致本說明複雜。被認為煩瑣的核酸純化(分離)是耗時和耗成分的方法，其通常使用如酚的有毒材料。所述方法會引起一些問題(i)傳染研究者；(ii)核酸 樣品間的交叉汙染；(iii)核酸損失，尤其是在存在痕量樣品時。因此， 急需開發不經過核酸純化的直接酶反應(尤其是，擴增反應)。另外，在 使用許多樣品的對比試驗中，由於純化效率的不同而使得核酸純化很 可能產生人為誤差。因此可以理解，使用生物樣品而不經過核酸純化 可以消除這種人為誤差。根據本發明，由於樣品製備簡單，已經可以實現酶反應，尤其是 擴增反應的自動操作。且可以對痕量的樣品進行酶操作。除此之外， 由於其時效本發明可以處理緊急的情況，快速產生擴增結果，且由於 其不需要用於核酸純化的設備和試劑而可以以簡單的方式進行戶外分析。下面具體的實施例意在說明本發明，且其不解釋為限制如附屬權 利要求所限定的本發明的範圍。實施例除非另外特別指出，下文給出了的固體混合物中的固體、液體中 的液體以及液體中的固體的百分比分別為w/w、 v/v和w/v。實施例I:使用血液樣品的核酸擴增(使用多種類型的緩衝液)
使用Taq DNA聚合酶的PCR反應通常使用10x濃縮的PCR緩沖 液(包含100 mM Tris-HCl、 500 mM KC1和15 mM MgCl2)，其通過Tris 的緩衝力調節的pH主要為8.3,且可以升高到9.0。為了證明Good緩衝液有助於防止血液樣品抑制PCR活性，製備 包含100 mM IC沖液(Tris或如Tricine、 HEPES和Bicine的Good)、 500 mM KC1和15 mM MgCl2的10x濃縮的PCR緩衝液，直接使用血液樣 品進行PCR反應。調節Tris緩衝液的pH從8.3~9.0(增加0.1), Tricine 緩衝液和HEPES緩沖液的pH從8.0 9.0(增加0.1)，且Bicine緩衝液的 pH從8.0 8.8(增加0.1)。所述緩衝液的pH在25。C下測定。使用總體積為50^1的PCR反應混合物進行PCR反應，該PCR反 應混合物包含5 |il的10x濃縮的PCR緩沖液、0.2 mM dNTPs混合物 以及0.4 [iM的人卩-珠蛋白(3)的引物GH20 (正義引物 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-S') 和 GH21( 反義引物 5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-S')。 AmpliTaq DNA聚合酶(5單 位/|11, Applied Biosystems公司)和1 jil肝素預處理的血液樣品用於直 接PCR。 PCR反應在如下溫度條件下進行94。C下10分鐘，接著40 個循環，每個循環為94。C下30秒、55。C下30秒、72。C下1分鐘；然 後在72。C下最後延伸7分鐘。在94。C下進行10分鐘起始變性步驟， 以破碎細胞並使血液樣品中存在的如蛋白酶和脫氧核糖核酸酶的PCR 抑制劑變性。通過包含0.5嗎/ml的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳， 接著UV照射來分析擴增的產物。圖1示出使用引物對GH20/GH21的408 bp的f3-珠蛋白基因的擴 增結果。雖然只有在Tris緩衝液的pH變得不低於8.5(泳道3-9)時其才 產生PCR產物，而Good緩衝液甚至在更低的pH下，即，Tricine緩 衝液為pH8.3(泳道12), Bicine緩沖液為pH8.1(泳道22)，且HEPES 11 衝液為pH8.0(泳道30)產生PCR產物。因此，可以看出Good緩沖液成功地防止血液才羊品承卩制PCR活性。圖 2表示 <吏用引物對GH20/KM38 (KM38 引物，5'-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3')的325bp的(3-J朱蛋白基因的擴增 結果。PCR條件與用於引物對GH20/GH21的條件相同。與圖1的結果 相似，顯示使用pH低於8.5的Tris緩衝液的擴增反應受血液樣品抑制； 然而，Good緩沖液，pH8.3的Tricine緩衝液可以使用血液樣品進行直 接PCR擴增。使用正義引物(E6f, 5'- TGTTCACTTGTGCCCTGACT-3')和反義引 物(E6r， 5'- GGAGGGCCACTGACAACCA-3')擴增p53基因以得到 489bp的產物。50 (nl PCR混合物包含0.2 mM dNTPs混合物、0.4 引 物、0.4 |il AmpliTaqDNA聚合酶和1 (il肝素預處理的血液樣品。PCR 反應在如下溫度條件下進行94。C下10分鐘，接著40個循環，每個 循環為94。C下30秒、56。C下30秒、72。C下l分鐘；然後在72。C下最 後延伸7分鐘。擴增的產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳分辨。如圖3所 示，使用Tris緩衝液的擴增從pH8.8開始產生微弱的條帶，而在pH9.0 和9.2產生強的條帶。而Tricine、 Bicine和HEPES緩沖液在更低的pH 下產生PCR擴增條帶。如圖1和3中所示，HEPES緩衝液在寬的pH範圍內產生更好的 結果。其原因在於，由於HEPES的緩沖區域(pH6.8-8.2),所以如dNTPs 和引物的PCR反應物加入pH高於8.3的HEPES緩衝液中引起PCR反 應混合物中pH迅速降至8.3左右，其有助於在不同的pH下得到相似 的PCR結果。
為成功地進行直接擴增需阻斷血液中存在的PCR抑制劑的活性。 本發明人認為血液中代表性的抑制劑，血紅蛋白的活性可以通過在？ 1起變性的pH和溫度條件下血紅蛋白的分子間結合而被阻斷。我們採納了這種理由以選取用於進行有前途的直接擴增的 一類合適的緩衝液。Nishimura等人已經報導較高的pH有助於使用血液樣品進行直接 PCR擴增。然而，儘管由於與其它Good緩衝液相比Tricine緩衝液隨 溫度而呈現出較大的pH變化(根據默克索引，Tricine: ApKa廠C-0.021, Bicine: ApKa廠C-0.018, HEPES: ApKaTC-0.014)的事實，但是由於Tricine 緩衝液在較低pH下由血液樣品產生擴增子，所以應該理解，使用Good 緩衝液的優異的結果並不是由於PCR混合物較高的pH值。已知Tris 緩衝液的pH在5 25。C降低0.03,在25 37。C降低0.025 (根據Sigma 公司的出版物)。我們利用包括兩性緩衝液、無反應性和低離子強度的Good緩衝液 的一些性質而不是其pH範圍。與Tris緩沖液不同，Good緩沖液具有 正電荷和負電荷，從而其能夠與具有正電荷或負電荷的生物分子結合。 另外，我們認為由於其低離子強度，所以Good緩沖液可以提高蛋白質 的熱變性。pl左右的pH引起蛋白質沉澱，且在低離子強度下促進沉澱。 這些事實使我們認為包含Good緩衝液的PCR反應變得具有低離子強 度，且在溫度升高時其pH變得在PCR抑制蛋白的pl左右，從而引起 血液樣品中的蛋白質的凝集，以阻斷PCR抑制劑的活性。實施例II:使用血液樣品的核酸擴增(使用多種類型的添加劑)
為測定添加劑對使用血液樣品的直接擴增的影響，使用非還原性 碳水化合物、表面活性劑或用於通常PCR方法的其它已知常規添加劑(例如，多胺、BSA和甜菜鹼)進行PCR擴增。 實施例II-1: 一一還原性碳水化合物的影響為了說明非還原性碳水化合物及其衍生物對直接擴增的積極影 響，進行使用包含在血液樣品中的未分離的DNA作為模板的PCR來 擴增p53。除了使用Tricine緩沖液(pH8.3)之外，使用的引物和條件與 實施例I中的相同。如圖4中所示，使用葡萄糖(板A，泳道3-6分別為0.18、 0.38、 0.75和.5 % (w/v))的PCR擴增不產生擴增子。與此相似，乳糖(板A,泳 道11-14分別為0.18、 0.38、 0.75和1,5 % (w/v))在較高濃度下同樣不 能擴增p53，而其較低濃度時呈現出微弱的產物條帶。與對照條帶相比 (板A和B,泳道l),應該理解，低濃度的乳糖對使用血液的直接擴增 的成功沒有幫助，其甚至在較高濃度時抑制PCR活性。這些結果使我 們推出還原性碳水化合物不能使使用包含擴增抑制劑的生物樣品直接 擴增。作為非還原性糖的例子，測試蔗糖(圖4,板A,泳道7-10分別為 1.25、 2.5、 5和10%(w/v))、海藻糖(圖4,板B，泳道3-6分別為0.94、 1.8、 3,8和7.5 % (w/v))和蜜三糖(圖4，板B,泳道7-10分別為0.87、 1.8、 3.5和7 % (w/v)),以證明其防止血液樣品抑制擴增反應的能力。 所述還原性糖在其濃度提高時呈現出增強的防止能力。另外，發現其 它非還原性糖，如松三糖(圖4,板A，泳道15-18分別為0.6、 1.25、2.5和5% (w/v))和水蘇糖(圖4,板A，泳道19-22分別為0.6、 1.25、2.5和5% (w/v》同樣防止血液樣品抑制擴增反應。在不具有還原本領的糖醇(糖醇)，包括山梨糖醇(圖4，板B,泳道 11-14分別為1.25、 2.5、 5和10% (w/v))和甘露醇(圖4,板B,泳道15-18 分別為0.6、 1.25、 2.5和5% (w/v))中同樣觀察到使用血液樣品的直接擴增的完成。同時，不在本發明中描述的非還原性碳水化合物的範圍內的聚乙 烯吡咯烷酮(圖4，板B,泳道19-22分別為0.25、 0.5、 1和2 % (w/v)) 不能使用血液樣品進行直接擴增。因此，這些結果證明，所述非還原性碳水化合物用作進行使用包 含抑制擴增的抑制劑的生物樣品的直接擴增的優異試劑。實施例II-2:海藻糖和蜜三糖的影響的詳細評《介為了更詳細地測定海藻糖(作為二糖的代表性例子)和蜜三糖(作為 三糖的代表性例子)對直接擴增的影響，進行使用包含在血液樣品中的 未分離的DNA作為模板的PCR來擴增p53。除了使用Tris緩沖液(pH 8.3)或Tricine緩沖液(pH 8.3)，以及2.5 pl的肝素預處理的血液樣品使 用相對於PCR反應物總體積的(5 % (v/v)之外，使用的引物和條件與實 施例I中的相同。如圖5中所示，使用5%血液樣品和2.0單位TaqDNA聚合酶且不 使用非還原性碳水化合物的常規PCR反應受血液樣品抑制。而使用Tris 緩衝液，7%的蜜三糖呈現十分微弱的條帶(泳道6)，且在其濃度提高時 海藻糖呈現更明顯的條帶(泳道8-12)。與此不同，Tricine緩衝液中的蜜
三糖和海藻糖在其相對高的濃度呈現明顯的擴增條帶(泳道6-18和22-24)。此外，如圖6中所示，通過使用其提高的濃度(0-30。/。(w/v))證明 海藻糖的作用。通過增加其濃度，發現海藻糖的這種作用更加清楚地呈現。因此，可以證明非還原性石友水化合物可以完全避免血液樣品中包 含的抑制劑的作用，從而實現使用生物樣品的直接擴增。為了測定緩衝液(pH和類型)與非還原性碳水化合物的組合效果， 使用存在或缺失海藻糖的Tris緩沖液(pH 8.3-9.0和9.2)或Tricine緩衝 液(pH 8.0-9.0)直接擴增p53。車輛使用1.0單位Taq DNA聚合酶之夕卜， 使用的引物和條件與上述的相同。不使用添加劑的情況下，對於Tris 緩衝液只有在十分高的pH(例如，高於pH9.0)下觀察到PCR擴增產物， 而對於Tricine緩沖液(圖8，板A)在相對較低的pH(例如，高於8.6)觀 察到PCR擴增產物。在向PCR反應物中加入3 % (w/v)海藻糖的情況 下，產生擴增產物的pH變得更低對於Tris緩衝液約pH8.5，而對於 Tricine緩衝液約pH 8.2(圖8，板B)。因此，可以理解，非還原性碳水化合物結合合適的緩沖液類型和 pH可以具有更大的防止生物樣品抑制擴增反應的能力。實施例II-3:表面活性劑的作用我們觀'j試如CHAPS (3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸鹽) 的兩性離子表面活性劑是否可以改進使用血液樣品的直接擴增。以與 實施例I中所述的相同方法進行PCR反應以擴增p53。如圖8中所示，Tricine緩衝液(pH 8.3或8.7)中的CHAPS以濃度依賴的方式促進使用 生物樣品的直接擴增。實施例II-4:多胺的作用已報導作為多胺的代表性例子的亞精胺可以提高PCR擴增的效 率。Kato等人提出高濃度的多胺可以避免包含在血液、尿和糞便中的 PCR抑制劑的作用(美國專利號6,413,747)。進行擴增p53的PCR反應以比較多胺在Tris緩衝液和Good緩衝 液中的作用。使用濃度變化的亞精胺或三亞乙基四胺和2% (v/v)的肝素 處理的血液。用於PCR反應的引物和條件與實施例I中所述的相同。如圖9中所示，全部濃度(甚至4 mM)的亞姊青胺和三亞乙基四胺在 pH 8.3的Tris緩衝液中不產生擴增子(泳道1-6),亞^青胺和三亞乙基四 胺在pH 8.7的Tris緩衝液中分別對應於其0.5 mM和1 mM的濃度呈 現增加的PCR產物(泳道13-18)。同時，難以評^介多胺在^f吏用pH 8.3 或pH 8.7的Tricine緩衝液的PCR中的作用。Tris緩衝液和Tricine緩 沖液中的更高濃度的多胺甚至抑制PCR活性。在使用4 % (v/v)的肝 素處理的血液的試驗中，如圖10中所示，在Tricine緩衝液中觀察到 多胺對使用血液樣品的PCR的正面作用。實施例II-5: BSA的作用Kreader(12)和Al-Soud等人(16， 37)提出高濃度的BSA可以防止 血液樣品抑制PCR。進行PCR反應擴增p53以檢測BSA在Tris緩衝 液和Good緩衝液中的這種作用，且使用2 % (v/v)的肝素處理的血液。 用於PCR反應的引物和條件與實施例I中所述的相同。
如圖11中所示，在pH 8.3或pH 8.7的Tris緩沖液中包含BSA 的PCR反應產生p53擴增子；在不使用BSA的情況下，沒有p53擴增 子(泳道1和13)。與此相反，在pH 8.3或pH 8.7的Tricine緩衝液中不 含或者含有BSA的擴增反應產生p53擴增子。尤其清楚地觀察到隨其 在pH8.3的Tricine緩沖液中的濃度提高BSA的作用變得更明顯。因此，應該認為，在將BSA進一步加入擴增反應物中時，使用 含有兩性離子緩沖液的本發明的緩衝系統的直接擴增可以更高效的進行。Al-Soud等人描述BSA的作用歸因於其保護DNA酶免受蛋白酶 的作用且防止血紅素基結合到Taq聚合酶上。然而，考慮到較高pH的 Tris緩沖液和pH 8.3的Tricine緩衝液可以使用血液樣品進行直接PCR， 所以BSA的作用應該是由於其阻止血紅素基的能力，而不是其保護免 受蛋白酶的能力。另外，可以認為在高溫度下的BSA的變性形式會容 易引起對PCR活性具有抑制作用的蛋白的凝集，從而降低了所述蛋白 質的抑制作用。實施例m:抗凝劑的作用的分析用於擴增的血液樣品通常通過用包括肝素、EDTA和檸檬酸鈉的 抗凝劑預處理而製備。然而，這些抗凝劑很可能抑制PCR活性，從而 它們在確定向PCR反應物中加入血液的量中變成限制性因素。進行4吏用Good緩沖液的PCR反應來擴增p53 ，以確定在我們的 直接擴增反應體系中的合適的血液量。用於PCR反應的引物和條件與 實施例I中描述的相同。
如圖12中所示，使用pH 8.7的Tricine緩沖液的直接PCR反應 適宜使用2.5 % (v/v)的肝素處理的血液和5 % (v/v) EDTA或4寧檬酸鈉 處理的血液。使用分離的人DNA (Promega公司)作為模板的PCR反應 而呈現出低特異性的結果，其中觀察到除了 p53條帶的其它幾條帶。 使用血液樣品本身作為模板可以使PCR反應在熱啟動PCR的條件下進 行，其中因為血液中的細胞在更高的溫度下破碎，所以目標DNA在第 一循環退火步驟開始與引物作用。在Tricine緩衝液(pH 8.7)中使用2.4%海藻糖和4 mg/ml BSA時，直接擴增反應對於高達5 % (v/v)的肝素或檸檬酸鈉處理的血液和10 % (v/v)的EDTA處理的血液產生擴增子。實施例IV:具有高GC含量的模板DNA的直接PCR已報導可以使用甜菜鹼,、氯化四曱基銨(TMAC)或二曱基亞碸 (DMSO) PCR擴增具有高GC含量的模板。為評價使用這種添加劑時用於具有高GC含量的模板或引物的直 接PCR是否成功，進行使用Tricine緩沖液(pH 8.7)和甜菜鹼的直接 PCR。用於成視網膜細胞瘤(RB)基因的擴增反應使用正義引物(E1 SD, 5'-CAGGACAGCGGCCCGGAG-B') 和反義 引 物 (I1SD, 5'-CTGCAGACGCTCCGCCGT-S')以獲得180 bp的擴增子，對於載脂 蛋白 E(apoE)基因，使用正義引物(apoE-f , 5'-GGCACGGCTGTCCAAGGA-3') 和反義引物(apoE-r , 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAG-3')以獲得268bp的擴增子。由於兩個 引物對具有高的GC含量，所以在普通PCR反應中它們不產生所需的 擴增子。使用總體積50 pl的反應混合物進行直接PCR反應，該反應混合物包含5 (il的10 x濃縮的PCR緩衝液、0.2 mM dNTPs混合物、0.4 |iiM 引物、2.0單位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosysterns 7>司)和1 pi 肝素處理的血液樣品。PCR反應在如下溫度條件下進行94。C下10分 鍾，接著40個循環，每個循環為94。C下30秒、6CTC下30秒、72。C下 1分鐘；然後在72。C下最後延伸7分鐘。將Tris緩衝液(pH 8.3)用於 人基因組DNA模板(Promega公司)和包含海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.7)用於肝素處理的血液模板。使用的甜菜鹼的濃度調節到0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0和2.5 M。如圖14中所示，使用Good緩衝液和高於l.OM的甜菜鹼的直接 PCR產生所需擴增子。因此，應該理解，在使用Good緩沖液和/或非 還原性碳水化合物時，用於擴增具有高GC含量的才莫板的直接擴增可 以在用於克服來自具有高GC含量的模板的問題的添加劑(例如，甜菜 鹼、TMAC和DMSO)的存在下成功地進行。實施例V:使用化學修飾的Taq聚合酶擴增低拷貝模板Nishimum等人已提出使用高於pH 9.0的Tris、 CHES或CAPSO 可以完成血液樣品的直接PCR。然而，如果PCR反應混合物的pH較 高，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems 乂>司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science公司)和HotStarTaq DNA聚合 酶(Qiagen公司)的用於熱啟動PCR的化學修飾的聚合酶不呈現或具有 較低的再生作用。
如上所述，因為Good緩沖液和/或非還原性碳水化合物即使在較 低pH下也可以阻斷生物樣品中存在的抑制劑的作用，所以使用這種化 學修飾的聚合酶的熱啟動PCR可以在本發明的條件下成功進行。
用於傳染病或法醫學的擴增反應通常使用低拷貝數的核酸樣品。 尤其是，對於傳染病如HIV和HBV相關疾病的i貪斷和病毒性感染的 早期檢測很重要。換句話說，必須擴增以低拷貝數存在的病毒核酸分 子，以得到準確可靠的診斷結果。根據本發明，可以使用化學修飾的 Taq聚合酶在採用Good緩衝液和非還原性碳水化合物的條件下擴增低 拷貝悽t的HIV-1。
Al-Soud等人(37)已使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶和高濃度的 BSA由血樣樣品中的產單核細胞李斯特菌(Listria monocytogenes)擴增 DNA分子。然而，他們沒有提供低拷貝DNA分子的擴增結果。雖然 Kato等人(美國專利號6,413,747)已提供了使用多胺的低拷貝DNA分子 的擴增結果，但是他們沒有直接使用血液樣品。他們而是間接地使用 添加有HIVDNA分子的白細胞樣品，其不含有包括血紅蛋白和免疫球 蛋白G的PCR抑制劑。
使用總體積50 (il的反應混合物進行低拷貝數的HIV-1的PCR反 應(26、 31、 38),該反應混合物包含Tricine緩衝液(pH 8.3)、 0.2 mM dNTPs混合物、0.5pM引物、2.5mMMgCl2、 2.5單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶或HotStarTaq DNA聚合酶和1 肝素處理的血液樣品。 使用2.4%的海藻糖和4 mg/ml的BSA作為添加劑。J吏用的引物對的 核苷酸序列為 SK145(5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT國3')和 SK431(5'-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT畫3'); 或者 SK38 (5'畫 ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3') 和 SK39 (5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3')。HIV-1DNA(HIV-1陽性對照DNA, Applied Biosystems公司)的拷貝數從0至50依次增加10。為了通過變化的血液量來檢測低拷貝DNA 的擴增，分別向0、 1、 2、 3、 4、 5和6 的肝素處理的血液中加入20 拷貝的HIV-1。使用引物對SK145和SK431的PCR反應在如下溫度條件下進行 95°。下15分鐘，接著45個循環，每個循環為94"C下30秒、6(TC下1 分鐘；然後在6(TC下最後延伸IO分鐘。擴增子的大小為142 bp。對於 引物對SK38的SK39，擴增在如下溫度條件下進行以產生115bp的擴 增子95。C下15分鐘，接著45個循環，每個循環為94。C下30秒、55°C 下1分鐘、72。C下1分鐘；然後在72。C下最後延伸7分鐘。如圖15中所示，使用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，通過根據本發 明的PCR可以明顯地檢測到存在於6 pl地肝素處理的血液中的10拷 貝和存在於高達6 % (v/v)的血液中的20拷貝。存在於高達8 12 % (v/v) 的血液中的20拷貝同樣產生擴增子。如圖16所示，使用HotStarTaq DNA聚合酶擴增呈現出與AmpliTaq Gold DNA聚合酶擴增相似的結 果。因此，可以認為，使用Good緩沖液和/或非還原性碳水化合物的 本發明能夠使用於熱啟動PCR的化學修飾的DNA聚合酶通過再生而 起作用，從而可以直接檢測存在於如血液的生物樣品中的低拷貝核酸分子。
實施例VI:對其它熱穩定的DNA聚合酶的試驗目前開發的熱穩定DNA聚合酶包括Pfu DNA聚合酶(Stratagene 公司)、具有高保真性的Pwo DNA聚合酶(Roche Applied Science公司) 和具有高反轉錄活性的Tth DNA聚合酶(Roche Applied Science公司) 以及Taq DNA聚合酶。我們測試使用多種熱穩定的DNA聚合酶的直 接擴增在本發明提供的條件下是否可以進行。為了對比，我們還使用 市售的反應混合物[用於Pfu DNA聚合酶的20 mM Tris (pH 8.8)、 10 mMKCl、 10mM(NH4)2SO4、 0.1% Triton X-100、 100昭/mlBSA和2 mM MgS04;用於Pwo DNA聚合酶的10 mM Tris (pH 8.85)、 25 mM KCl、 5 mM (NH4) 2S04和2 mM MgS04;以及用於Tth DNA聚合酶的 10mMTris(pH 8.9)、 100mMKCl、 50嗎/mlBSA、 0.05 % (w/v) Tween 20和1.5 mM MgCl2]。使用2.0單位的各自的聚合酶進行直接PCR以 擴增 p53 基因。使用的引物為正向引物，E8f (5'-GACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATG-3')和反向引物E-R2 (5'-CACAAACACGCACCTCAAAG-3')。產生的擴增子的大小為357 bp 。 PCR熱循環的條件與實施例I中的相同。如圖17所示，常失見反應混合物不產生擴增子(泳道5、 10和15), 而本發明的混合物(pH 8.3和8.7)產生可在瓊脂糖凝膠上檢測的擴增子。實施例VII:來自細胞培養物的擴增抑制動物細胞培養是分子生物學中經常進行的普通方法。細胞培養基 中存在的PCR抑制劑是使用培養細胞的直接擴增的巨大障礙。根據目
前開發的擴增，通過離心收集培養的細胞，然後進行DNA純化，接著進行PCR過程。為了驗證本擴增體系是否可以克服與細胞培養物相關的障礙，使用包含Tricine緩沖液(pH8.7)、 2.4%海藻糖、細胞培養基和10 ng作為 模板的人基因組DNA (Promega公司)的反應混合物進行直接PCR以擴 增p53基因。使用的細胞培養基為添加有10。/。的胎牛血清(FBS)、 100 嗎/ml青黴素和100嗎/ml鏈黴素的DMEM (Dulbecco's modified Eagle's 培養基)。用於PCR反應的引物和條件與實施例I中所述的相同。實施例vm: ^使用口腔上皮細胞的擴增使用細胞刷收集口腔上皮細胞、千燥並懸於500 pl TE(IO mM Tris 和O.lmM EDTA, pH 8.0)中。才艮據操作說明通過AmpFLSTR 1dentifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)使用2.5 (il細胞懸浮液進行 擴增。新鮮製備反應混合物(25 W)，使其包含含有2.4%的海藻糖和4 mg/ml BSA的Tricine緩沖液(pH 8.3)、 0.2 mM dNTP、2.5單位AmpliT叫 Gold DNA聚合酶和AmpFLSTR Identifiler引物對。使用ABI Prism基 因分析儀3.7 (Applied Biosystems公司)分析通過AmpFLSTR IdentifUer⑧試劑盒擴增的產物。圖19的板A表示由ABI Prism基因分析儀3.7獲得的通過 AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒擴增的口腔上皮細月包中的DNA分子的 分析結果中的藍染結果，其顯示本發明使用Good和/和非還原性碳水 化合物可以阻斷細胞懸浮液中包含的PCR抑制劑的作用，乂人而可以使 用細胞而不是純化的DNA樣品來進行成功的DNA指紋分析。另外， 顯著的是，根據本發明製備的反應混合物能夠使AmpliTaq Gold DNA 聚合酶在使用細胞懸浮液的擴增反應中具有活性。實施例IX:法醫學中的基因檢測在法醫學中，基因檢測變得突出且其相關技術發展迅速。然而， 法醫學中的基因;f企測通常會遇到如待分析樣品的各種類型和狀態的與 樣品相關的問題。換句話說，會使用如純淨的、分解的和汙染的樣品 或痕量的樣品的多種樣品進行基因擴增反應。除此之外，法醫學中的 基因檢測通常需要快速的結果。我們測試本發明是否可以滿足法醫學中的基因檢測的要求。使用 2.5 pl用TE緩沖液稀釋40 50倍的血液作為模板，且使用AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)進4亍DNA指紋分析。 照實施例VIII中所述進行擴增反應和分析。如圖19的板B所示，本發明使用Good緩衝液和/或非還原性碳水液而不是純化的DNA樣品成功地進行DNA指紋分析。另外，顯著的 是，根據本發明製備的反應混合物能夠使AmpliTaq Gold DNA聚合酶 在使用血液樣品的擴增反應中具有活性。實施例X:由培養細胞合成cDNA用磷酸緩沖鹽水(PBS)將培養細胞(hepG2-SK, 5 x 106個細胞)稀採 至l x 103—4個細胞/^1。將1^1稀釋後的細胞直接加入50^1的反應溶液 中使用對人(3-肌動蛋白mRNA特異性的引物進行RT-PCR。或者，為 使用分離的RNA進行常規RT-PCR，通過RNeasy Mini試劑盒(Qiagen
公司)從hepG2-SK細胞中純化總RNA，然後通過具有oligo(dT)18的 cDNA合成試劑盒由l昭純化的RNA合成cDNA 。為在RT-PCR中區分RNA來源的產物與DNA來源的產物，設計 引物使DNA來源的產物(370 bp)由於跨內含子而比RNA來源的產物 (264 bp)長107 bp。使用的引物序列為b-肌動蛋白-f (5'-CAA GAG ATG GCC ACG GCT GCT-3')和b-肌動蛋白-r (5'- TCC TTC TGC ATC CTG TCG GCA-3')。通過向RT反應產物中加入PCR反應試劑來進行 RT-PCR。使用包含50 mM Tricine (pH 8.7)、 80 mM KC1、 2.5 mM MgCl2、 250 jiM dNTPs混合物、5 mM DTT、 0.4 jiM b-肌動蛋白-r引物、20單位 RNase抑制劑(Promega公司)和4.5單位AMV逆轉錄酶(Roche Applied Science公司)的總體積25(il的RT反應混合物進行RT反應。向反應中 加入無RNase的水作為RT陰性對照。RT反應在60。C進行60分鐘， 接著95。C下IO分鐘以使逆轉錄酶失活。RT後，加入10 pmol的b-肌動蛋白-f引物和2單位的Taq DNA 聚合酶以進行後續PCR反應。在PCR反應中，使用10 ng人基因組 DNA(Promega公司)和由hepG2-SK合成的cDNA作為PCR對照。反 應在如下溫度條件下進行94。C下2分鐘，接著45個循環，每個循環 為94。C下30秒、65'C下30秒、72。C下30秒；然後在72。C下最後延 伸5分鐘。通過包含0.5 jag/ml的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，接 著UV照射來分析擴增的產物。
如圖20中所示，通過直接將培養細胞加入反應溶液中，在逆轉錄酶的存在下進行的RT-PCR中獲得對人(3-肌動蛋白mRNA特異的擴增產物。實施例VI:肉的RFLP分析將1 mg或10 mg牛肉樣品於56。C下在包含0.2 mg蛋白酶K (Sigma-Aldrich公司)、0.3 % SDS、 0.6 % Tween 20、 5 mM EDTA和400 mM NaCl的20 mM Tricine緩沖液(pH 8.0)中溫育2小時，接著在85。C 下溫育45分鐘，以獲得牛組織的溶解產物。將溶解產物直接進行PCR 以擴增牛MC1-R基因，並通過lU的MspAlI在37。C下消化45分鐘， 以分析RFLP(限制性片段長度多態性)。使用包含200 |iM dNTPs混合 物、0.2 jliM引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶以及10 mM Tricine (pH 8.3)、 50 mM KC1、 2.5 mM MgCl2和2.4 % (w/v)海藻糖的總 體積25 (il總體積的PCR反應混合物進行PCR反應。使用的引物的序 列為MClR-f(5'畫CAAGAACCGCAACCTGCACT-3')和 MClR-r(5'-TGATGAAGAGCAGGCTGGTG- 3' )。 PCR反應在如下溫度 條件下進行94。C下5分鐘，接著40個循環，每個循環為94"C下30 秒、62。C下30秒、72。C下l分鐘；然後在72。C下最後延伸10分鐘。如圖21中所示，在本發明提供的條件下直接使用牛組織溶解產物 的直接擴增明顯產生擴增子，且還獲得RFLP分析結果。實施例XII:糞便中引起食物中毒的微生物的檢測我們測定本發明是否可以克服糞便樣品對PCR的抑制。將作為引 起食物中毒的微生物的代表性例子弗氏志賀菌於37。C下在血液瓊脂平
板上溫育24小時。將產生的一個集落懸浮於0.2 ml的PBS中，然後鑑 定其集落形成單位(CFU)。用PBS將健康成人的糞便樣品稀釋10倍 (v/w)、渦旋並在4。C放置過夜以獲得上清夜。將1 jil的該上清液和7 pi 的包含具有確定的CFU的弗氏志賀菌的懸浮液混合以提供用於PCR 擴增的模板。使用包含200 dNTPs混合物、引物vir-f (正義引物，5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC-3 ')和vir-r (反以引物，5'-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3')各0.2 、 1單位的 AmpliTaq DNA聚合酶和含有2.4%海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.3)的 總體積20 (al的PCR反應混合物進行PCR反應，以擴增弟/^4 的 vir A基因。使用8 |il總計相當於總反應體積的5%的分別包含128,000 CFU、 6,400 CFU、 320 CFU、 16 CFU、 8 CFU、 4 CFU、 2 CFU和1 CFU 的糞便懸浮液。PCR反應在如下溫度條件下進行95。C下5分鐘，接 著40個循環，每個循環為95。C下40秒、55。C下40秒、72。C下40秒； 然後在72。C下最後延伸10分鐘。我們還評價本發明是否可以用於精確實時PCR(qPCR)試驗，以檢 測並量化人糞便樣品中相關的病原體並。用PBS將健康成人的糞便樣 品稀釋10倍(v/w)、渦旋並在4。C放置過夜以獲得上清液。將liil的該 上清液和7 的包含具有已知拷貝的弗氏志賀菌的懸浮液混合以提供 用於產生標準曲線的沖莫板。換句話說，使用8 (il總計相當於總反應體 積的5%的分別包含128,000 CFU、 6,400 CFU、320 CFU、 16 CFU、4 CFU 和2CFU的糞便懸浮液。在Mx3000P QPCR系統(Stratagene公司)上通過以下反應混合物 進行實時熱啟動PCR: 20 pl的反應混合物包含200 |aM dNTPs混合物、 引物vir-f和vir-r各0.2 pM、 1單位的HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen
公司)、包含2.4%的海藻糖的Tricine緩沖液(pH8.3) 、 lxSYBR Green95。C下15分鐘，4妄著50個循環，每個循環為94X:下30秒、60。C下 30秒、72。C下30秒(數據採集)。如圖22A中所示，在本發明提供的條件下直接PCR由甚至含有8 CFU病原體的糞便樣品產生擴增產物，而Tris緩衝液由含有128,000 CFU病原體的糞便樣品不產生擴增子。這些結果使我們推出Good緩 沖液和/或非還原性碳水化合物確保能克服來自糞便樣品的PCR抑制。糞便樣品直接獲得PCR產物，並根據實時SYBR GREEN定量PCR方法不需要對製造商提供的技術手冊進行下遊修改而以迅速的方式進行分析。實施例XIII:使用植物組織的基因擴增將凍幹的水稻(Qo/za幼f/'ra)葉子製成粉末樣品。將4~10 mg粉末樣 品懸浮於100 (^l的懸浮緩沖液(20 mM Tricine緩沖液，pH 8.0,包含 0.3% SDS 、 0.6% Tween 20、 5 mM EDTA和400 mM NaCl)中以得到水 稻葉子的懸浮液。將0.04 lmg的粉末或1 (il的樣品懸浮液直接進行 PCR以擴增(3-肌動蛋白基因。使用包含200 pM dNTPs混合物、0.2 (iM 引物和1.25單位ArapliTaq DNA聚合酶的總體積為25 的PCR反應 混合物進行PCR反應。緩衝體系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine 緩衝液(pH8.3)(圖23,板A)。為了對比，還使用Tris緩沖液(pH8.3)(圖 23,板B)。 使用的引物的核苷酸序列為正義引物 5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-S' 和 反 義 引 物5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3'。 PCR反應在如下溫度條件下進 行94。C下5分鐘，接著40個循環，每個循環為94。C下30秒、62。C 下30秒、72。C下1分鐘；然後在72。C下最後延伸10分鐘。在使用包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.3)的情況 下，使用任何^t板(純化的DNA、葉子粉末和葉子懸浮液)的全部反應 產生擴增子(圖23,板A)。與此相反，只有在使用純化的DNA作為模 板時Tris緩衝液才產生擴增子(圖23，板B)。因此，可以認為兩性離子緩沖液和/或非還原性石友水化合物同樣可 以使用植物組織進行直接擴增。實施例XIV:組織切片中的基因擴增在肺組織，特別是肺癌組織中，已對如gefitinib (Iressa)和elrotilib (tarceva) (39)的肺癌藥物的敏感性進行了深入研究，其注意力集中於表 皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子18、 19、 20和21的突變。為了驗 證使用組織切片的直接PCR的可能性，從組織微陣列(ISU Abxis公司) 上提取一點並直接進行PCR。使用的四對引物為用於擴增外顯子18 以 獲 得 425 bp 的 擴 增 子 的 E18F1， 5'-AATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTCCTG隱S' 和 E18R1, 5'-CCTCTCAATAACTTGGGAAAAACACTG-3';用於擴增外顯子19以 獲 得 446bp 的 擴 增 子 的 E19F1， 5'-AGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTG-S' 和 E19R1， 5'-ATGGGAGAGGCCAGTGCTGTCTCTAAG-S';用於擴增外顯子20 以獲得 385 bp 的擴增子的 E20F1, 5'-GCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGG-3' 和 E20R1, 5'-GCACACACATATCCCCATGGCAAACTC-3';以及用於擴增外顯子 21 以 獲得 386 bp 的 擴 增 子 的 E21F1, 5'-CGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAG-S' 和 E21R1, 5'-TCTGGAGAGCATCCTCCCCTGCATGTG-S'。將10 pi 30%的甘油滴加到組織微陣列的組織點中，1~2分鐘後， 通過連續吹打將組織點裂解。將裂解的組織點直接進行PCR擴增。 使用包含200 (iM dNTPs混合物、0.3 引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶的總體積25 pl的PCR反應混合物進行PCR反應。緩沖體 係為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tridne緩沖液(pH 8.3)。 PCR反應在 如下溫度條件下進行94。C下5分鐘，接著40個循環，每個循環為94 。C下30秒、62。C下30秒、72。C下1分鐘；然後在72。C下最後延伸10 分鐘。如圖24中所示，根據本發明組織切片可以不經過DNA純化而直接擴增。實施例XV: SNP基因分型SNP表示"單核苷酸多態性"。SNP為最常見的遺傳性變異，其 每100~300個鹼基發生一次。在過去幾年中已經開發了多種SNP基因 分型技術。然而，現有技術中需要快速、可靠和廉價的SNP基因分型方法。我們試驗本發明是否可以應用於SNP基因分型。為了 SNP基因分 型，設計引物以使擴增子(525 bp)在EGFR基因的啟動子區域包含 -216G/T多態性。使用的引物的序列為egfr-f
(5'隱GGCCCGCGCGAGCTAGACGT畫3') 和 egfr-r(5'匿CAGGTGGCCTGTCGTCCGGTCT-3')。將0.5 pl血液直接加入包含200 ^MdNTPs混合物、0.3 引物 和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶的總體為25|il的PCR反應混合 物中。緩沖體系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩衝液(pH 8.3)。 PCR反應在如下溫度條件下進行94。C下5分鐘，接著40個循環，每 個循環為94。C下30秒、6(TC下30秒、72。C下30秒；然後在72。C下 最後延伸10分鐘。然後通過用ExoSAP-IT (USB公司)或QIAquick PCR 純化試劑盒(Qiagen公司)的處理來純化PCR產物。然後使用純化的PCR 產物進行單鹼基延伸， 以用引物 egfr-sbe (5'-GCGCGGCCGCAGCAGCCTCC- 3')和SNaPshot試劑盒(Applied Biosystems公司)按照製造商的說明來基因分型-216G/T多態性，並對 基因分型評分。如圖25中所示，在本發明提供的條件下直接從血液得到PCR產 物，且其不需要對製造商提供的技術手冊進行下遊修改而用作的ABI PRISM SNaPshot ddNTP引物延伸試驗的模板，從而獲得精確的 SNP基因分型結果。實施例XVI:焚光染料鏈終止循環測序法DNA測序為測定DNA樣品中精確的核苷酸序列。用於測序的最 主要的方法為所謂的螢光雙脫氧法。我們試驗本發明是否可以應用到 自動螢光染料鏈終止循環測序法。為了自動循環測序，設計引物，使 擴增子(406 bp)包含人線粒體DNA中D-環區的HVI片段。使用的引物 的序列為L15996 (5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAG-S')和H16401 (5'-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3')。將的血液直接加入包含200 |iM dNTPs混合物、0.2 (iM引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶 (Applied Biosystems7^司)的總體為25jal的PCR反應混合物中。緩衝體 係為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8,3)。 PCR反應在 如下溫度條件下進行94。C下5分鐘，接著35個循環，每個循環為94 t下45秒、58。C下45秒、72。C下45秒；然後在72。C下最後延伸5分 鍾。然後將一半的PCR產物用NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel 公司)純化或通過用ExoSAP- IT (USB公司)處理，而剩餘的不純化。 然後按照製造商的說明，使用BigDye terminator v3.1循環測序反應 (Applied Biosystems公司)和用於延伸正向/反向鏈的L15996/H406引物 對純化或未純化的PCR產物進行測序。如圖26A-26B中所示，在通過本發明提供的條件下從血液中直接 得到PCR產物，且其不需要對製造商提供的技術手冊進行下遊修改而 用作BigDye terminator v3.1循環測序反應的衝莫^反，最終;彈到DNA測序 結果。雖然已經描述了本發明的優選實施方式，應該理解，在本發明的 實質內的變化和修改對於本領域的技術人員變得顯而易見，本發明的 範圍通過附屬權利要求和其等效物確定。參考文獻1. Saiki, R. K., Scharf， S., Faloona， F.， Mullis， K. B., Horn, G. T.， Erlich, H. A. & Arnheim, N. (1985) Science 230, 1350-1354, 2. Mullis, K. B. & Faloona, F. A. (1987) Methods Enzymol. 155， 335-350.3.3. Saiki, R. K" Gelfand, D. H.， Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R.， Horn G. T., Mullis， K. B. & Erlich, H. A. (1988) Science 239, 487-491.4. Akane, A.， Matsubara, K., Nakamura, H., Takahashi, S. & Kimura， K. (1994) J. Forensic Sci. 39， 362-372.5. Al Soud, W. A.， Jo腦on, L.丄& Radstrom, P. (2000) J. Clin. Microbiol. 38， 345-350.6. Mercier, B., Gaucher, C, Feugeas， O. & Mazurier， C (1990) Nucleic Acids Res. 18, 5908.7. Panaccio, M. & Lew, A. (1991) Nucleic Acids Res. 19， 1151.8. McCusker, J., Dawson, M. T., Noone， D.， Gannon, F. & Smith, T. (1992) Nucleic Acids Res. 20， 6747.9. Panaccio, M., Georgesz, M. & Lew, A. M. (1993) Biotechniques 14, 238-243.10. Sarkar, G., Kapelner, S. & Sommer， S. S. (1990) Nucleic Acids Res . 18 , 7465.11. Burckhardt， J. (1994) PCR Methods Appl. 3, 239-243.12. Kreader, C. A. (1996) Appl. Environ. Microbiol, 62, 1102- 1106.13. Cheyrou, A" Guyomarc'h, C， Jasserand, P. & Blouin, P.(1991) Nucleic Acids Res. 19， 4006.14. Makowski, G. S., Davis, E. L.， Aslanzadeh, J. & Hopfer, S.M. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3788-3789.
15. Satoh, Y., Takasaka, N., Hoshikawa, Y., Osaki, M., OhfUji, S., Ito, H., Kaibara, N., Kurata, T. & Sairenji, T.(1998) J, Clin. Microbiol, 36, 3423-3425.16. Abu Al-Soud， W. & Radstrom, P. (2000) J. Clin. Microbiol. 38, 4463-4470.17. Wu, D. Y. & Wallace, R. B. (1989) Genomics 4, 560-569. 18 ■ Barany, F. (1991) PCR Methods Appl.1,5-16.19. Kwoh, D. Y.， Davis, G. R.， Whitfield, K. M., Chappelle， H丄.， DiMichele, L. J. & Gingems, T. R. (1989) Proc. Natl, Acad, Sci. U. S. A 86, 1173-1177.20. Guatelli, J. C， Whitfield, K. M., Kwoh, D. Y.， Barringer, K. J"Richman D. D. & Gingeras, T. R. (19%) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 1874-1878.21. Walker, G. T., Little, M. C， Nadeau， J, G. & Shank, D. D.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 392-396.22. Walker, G. T.， Fraiser, M. S., Schram, J. L., Little, M. C， Nadeau, J. G. & Malinowski， D. P. (1992) Nucleic Acids Res. 20， 1691-1696.23. Notomi, T., Okayama, H.， Masubuchi, H., Yonekawa, T.， Watanabe， K.: Amino, N. & Hase, T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, E63.24. Don, R. H., Cox， P. T., Wainwright, B. J" Baker, K. & Mattick, J. S. (1991) Nucleic Acids Res. 19， 4008.25. D'Aquila, R. T.， Bechtel, L. J.， Videler, J. A.， Eron， J. J.， Gorczyca, P. & Kaplan, J. C, (1991) Nucleic Acids Res. 19, 3749.26. Chou, Q., Russell, M., Birch， D. E.， Raymond, J. & Bloch, W. (1992) Nucleic Acids Res. 20， 1717-1723,27. R腿o, G.， Fenton, W. & Kidd, K. K. (1989) Nucleic Acids Res. 17， 5407.28. Noonan, K. E. & Roninson, 1. B, (1988) Nucleic Acids Res. 16, 10366.29. Dang, C. & Jayasena, S. D. (1996) J. Mol. Biol. 264, 268- 278.30. Lin， Y. & Jayasena, S. D. (1997) J. Mol. Biol. 271, 100- 111.31. Kellogg, D. E., Rybalkin， I" Chen, S.， Mukhamedova, N.， Vlasik， T.， Siebert， P. D. & Chenchik， A. (1994) Biotechniques 16, 1134-1137.32. Birch, D. E. (1996) Nature 381, 445-446.33. Good, N. E., Winget， G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S. & Singh, R. M. (1966) Biochemistry 5， 467-477.34. Lyamichev, V., Mast, A. L， Hall, J. G., Prudent, J. R., Kaiser, M. W.， Takova, T., Kwiatkowski, R. W.， Sander, T. J., de Arruda, M.， Arco， D. A. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 292-296,35. Ryan, D., Nuccie, B. & Arvan， D. (1999) Mol. Diagn. 4, 135-144.36. Ohnishi, Y., Tanaka， T.， Ozaki, K., Yamada， R., Suzuki, H. & Nakamura, Y. (2001) J. Hum, Genet. 46， 471-477.37. Abu Al-Soud, W. & Radstrom, P. (1998) Appl . Environ. Microbiol. 64 3748-3753.38. Christopherson, C, Sninsky, J. & Kwok， S. (1997) Nucleic Acids Res. 25， 654-658.39. Qin， B. M.， Chen, X.， Zhu, J. D. & Pei, D. Q. (2005) Cell Res. 15, 212-217.
權利要求
1、一種用於進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物中進行酶反應，該兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物用於防止生物樣品抑制酶反應，其中在酶反應之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b)從酶反應中得到產物。
2、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述涉及核酸分子的酶反 應為擴增反應、逆轉錄、DNA連接、核酸酶介導的反應或DNA曱基化。
3、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物樣品為病毒、細 菌、組織、糹田胞、血液、淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞便、目艮 內液、精液、腦提取物、脊髓液、關節液、胸液、腹水、羊水或細胞組織液。
4、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述兩性離子緩沖液選自 包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌溱乙烷磺酸)、Tricine (N-三(鞋甲基)曱 基甘氨酸)、Bicine(N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基)曱基 -3-氨基丙烷磺酸)、ACE(N-(2-(乙醯胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA(N-(2-乙醯胺)-亞氨基二乙酸)、MES(2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺酸)的組。
5、 根據權利要求4所述的方法，其中，所述兩性離子緩衝液為 HEPES、 Tricine或Bicine。
6、 根據權利要求5所述的方法，其中，所述兩性離子緩衝液為Tricine。
7、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為乙二醇、聚乙二醇、聚甘油、非還原性二糖、三糖、四糖、糖醇、 醛糖酸或其內酯、糖二酸或其內酯或者糖醛酸。
8、 根據權利要求7所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為非還原性二糖、三糖、四糖或衍生自單糖的糖醇。
9、 根據權利要求8所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖或蔗糖。
10、 根據權利要求2所述的方法，其中，所述酶反應為擴增反應。
11、 根據權利要求IO所述的方法，其中，所述擴增反應為熱啟動 PCR(聚合酶鏈式反應)。
12、 根據權利要求10所述的方法，其中，所述擴增反應為 RT-PCR(逆轉錄聚合酶4連式反應)。
13、 根據權利要求2所述的方法，其中，所述酶反應為核酸酶介 導的反應。
14、 根據權利要求13所述的方法，其中，所述核酸酶介導的反應為侵染檢測。
15、 根據權利要求1所述的方法，其中，所述反應混合物進一步 包含兩性離子表面活性劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。
16、 根據權利要求3所述的方法，其中，所述生物樣品為血液。
17、 根據權利要求16所述的方法，其中，所述生物樣品為血液， 且存在於血液中的核酸分子具有低拷貝數。
18、 一種用於進行涉及核酸分子的直接酶反應並直4妄^使用生物樣 品的試劑盒，其包括用於酶反應的反應混合物，該反應混合物包含用 以防止生物樣品抑制酶反應的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合 物，而存在於生物樣品中的核酸分子在酶反應之前不需要純化。
19、 根據權利要求18所述的試劑盒，其中，所述涉及核酸分子的 酶反應為擴增反應、逆轉錄、DNA連接、核酸酶介導的反應或DNA曱基化。
20、 根據權利要求18所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為病毒、 細菌、組織、細月包、血液、淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞便、 眼內液、精液、腦提取物、脊髓液、關節液、胸液、腹水、羊水或細月包組織液。
21、 根據權利要求18所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩衝液 選自包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌。秦乙烷磺酸)、Tricine (N-三(羥曱基) 甲基甘氨酸)、Bicine (N,N-雙O羥乙基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基) 曱基-3-氨基丙烷磺酸)、ACE (N-(2-乙醯胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA (N-O乙醯胺)-亞氨基二乙酸)、MES (2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS O(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)J-羥基丙烷磺酸)的 組。
22、 根據權利要求21所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩衝液 為HEPES、 Tricine或Bicine。
23、 根據權利要求22所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩衝液 為Tricine。
24、 根據權利要求18所述的試劑盒，其中，非還原性碳水化合物 為乙二醇、聚乙二醇、聚甘油、非還原性二糖、三糖、四糖、糖醇、 醛糖酸或其內酯、糖二酸或其內酯或者糖醛酸。
25、 根據權利要求24所述的試劑盒，其中，所述非還原性碳水化 合物為非還原性二糖、三糖、四糖或衍生自單糖的糖醇。
26、 根據權利要求25所述的試劑盒，其中，所述非還原性碳水化 合物為山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖或蔗糖。
27、 根據權利要求19所述的試劑盒，其中，所述酶反應為擴增反應。
28、 根據權利要求27所述的試劑盒，其中，所述擴增反應為熱啟 動PCR(聚合酶鏈式反應)。
29、 根據權利要求27所述的試劑盒，其中，所述擴增反應為 RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應)。
30、 根據權利要求19所述的試劑盒，其中，所述酶反應為核酸酶 介導的反應。
31、 根據權利要求30所述的試劑盒，其中，所述核酸酶介導的反 應為侵染4企測。
32、 根據權利要求18所述的試劑盒，其中，所述酶反應混合物進 一步包含兩性離子表面活性劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。
33、 根據權利要求20所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為血液。
34、 根據權利要求33所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為血液， 且存在於血液中的核酸分子具有低拷貝數。
全文摘要
本發明涉及一種用於進行涉及核酸分子的直接酶反應的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物的反應混合物中進行酶反應，該兩性離子緩衝液和/或非還原性碳水化合物用於防止生物樣品抑制酶反應，其中在酶反應之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b)從酶反應中得到產物。
文檔編號C12Q1/68GK101128604SQ200680006345
公開日2008年2月20日 申請日期2006年2月8日 優先權日2005年2月28日
發明者李承寬, 梁寧根, 金聖旭, 金鐘烈 申請人:生物探索公司