糖蛋白Ⅵ特異的抗體以及生產這些抗體的方法

2023-05-29 23:45:41

專利名稱：糖蛋白Ⅵ特異的抗體以及生產這些抗體的方法
技術領域：
本發明涉及針對血小板膜糖蛋白VI(GPVI)產生的抗體、其片段或其天然存在的變體、產生抗GPVI抗體的方法以及這些抗體作為研究和免疫治療劑(特別是作為治療血栓形成和其他血管疾病的治療劑)的用途。
背景技術：
血小板是止血控制和傷口癒合所必需的小型無核血細胞。在正常條件下循環血小板是相當靜息的。然而，當血管被撕裂或損傷時，血小板與多種因子接觸，啟動引起凝血和血塊形成的複雜並互連的細胞程序，綜述於《Mechanisms of Platelet Activation and Control》，K.S.Authi，S.P.Watson和V.V.Kakar編輯，Plenum Press，1993。這些細胞程序的激活引起膜粘著特性的顯著提高、血小板聚集並釋放血管收縮和溶纖維蛋白因子。結果在創傷位點形成血塊，堵住血管壁的任何缺口並提供成纖維細胞侵入和修復的基質。
凝血過程的早期事件可以功能性地分為兩個基本部分粘著和活化。粘著是將血小板「粘」在受傷的管壁上的過程，而活化起始細胞內複雜的生理變化。總之，這兩個過程引起血小板聚集、凝塊形成，並最終形成成熟的血塊。儘管這些事件對於限制損傷位點的血液損失至關重要，但是血小板粘著和活化也可能促進疾病狀態的惡化。例如，血塊可能堵塞患病血管，引起缺血並導致重要組織如心和腦的損傷。血小板在止血和血栓形成中的雙重作用綜述於Ruggeri，Nature Medicine，81227-1234(2002)。
這些過程中的多數步驟依賴於胞外配體與嵌入血小板細胞膜中的特異性受體之間的相互作用。在體內，首先可見的血小板行為變化是上皮損傷引起血小板粘著於裸露的上皮。在裸露上皮暴露的小分子組分中，膠原認為是與血小板最具反應性的。膠原通過直接和間接途徑支持血小板粘著，並通過起始血小板聚集和產生凝塊形成所必需的促凝劑活性來活化血小板。Baumgartner，Thromb Haemost.371-16(1977)。
血小板和內皮下膜的最初接觸涉及血小板糖蛋白複合物GPIb-V-IX與裸露的內皮下膜結合的血管假性血友病因子(vWf)之間的相互作用。此相互作用似乎是可逆過程，而且對於穩定粘著而言是不夠的(如血小板沿血管壁的「滾動」所證明)。Ruggeri，Nature Medicine，81227-1234(2002)。儘管vWf相互作用並不完全固定循環血小板，但它對高血流量條件下的血小板粘著是必要的。接著，血小板與內皮下膜膠原通過糖蛋白GPIa-IIa(也稱為整合素α2β1)的不可逆結合穩定了vWf相互作用事件，將血小板牢固的錨定在血管壁上。與vWf不同，膠原粘著似乎是較慢的過程，且僅在低流量條件下或在血小板通過vWf相互作用已部分停止之後有效。此外，GPIa-IIa結合誘導血小板沿血管壁展平(伸展)。伸展促進與其他內皮下粘著因子(包括纖連蛋白、玻璃體連接蛋白和凝血酶敏感素)的結合。這些伸展後相互作用進一步穩定血小板對血管壁的粘著。
GPIa-IIa是含有α和β亞基的整合素。在其正常構象中，整合素對其天然配體具有低親和力，但可通過其他細胞受體產生的信號轉變成高親和力受體。Nieswandt B和Watson SP.Blood 102449-461(2003)。刺激GPIa-IIa和其他膠原受體誘導許多生理變化。其中包括引起血小板-血小板聚集的細胞表面粘著特性的改變和分泌多種生物活性化合物。這些化合物包括血管收縮劑、腎上腺素和前凝血因子，它們活化凝血酶並引起纖維蛋白原聚合為成熟血塊的纖維蛋白絲。此外，活化的血小板釋放ADP和血栓烷A2(TXA2)。這些強血栓形成因子擴增最初的活化信號，募集其他血小板進入活化態。
除了GPIa-IIa以外，在血小板細胞表面至少表達兩種其他膠原受體，即GPIV(CD36)和GPVI(綜述於Farndale RW等，J Thromb.Haemost2561-573，2004)。這些血小板膠原受體功能的線索來自對人患者變體的研究。人患者變體的研究提示GPVI在血小板-膠原相互作用中發揮主要作用，而GPIV的貢獻較小。這些研究還顯示相當多缺乏GPIa-IIa或GPVI的個體表現出比表達GPIa-IIa或GPVI的個體稍微延長的出血時間。此外，GPIa-IIa缺乏通常導致比缺乏GPVI的人更嚴重的出血障礙。儘管如此，這些患者很少像患伯-蘇症候群(由GPIb缺乏引起)或格蘭茨曼血小板無力症(由GPIIb-IIIa缺乏引起)的個體那樣表現嚴重的出血趨勢。
對人變體的觀察和最近的體外數據提示，三個膠原受體協調作用介導膠原-血小板相互作用。例如，在體外，現在可以用膠原受體位點特異性的抗體阻斷每種膠原受體的活性。每種抗體各自部分抑制血小板與膠原的粘著，抗體配對組合的抑制性明顯更強，特別是同時抑制GPIa-IIa和GPVI時。此外，這些研究證明GPIV、GPIa-IIa和GPVI通過兩條不同途徑促進血栓形成，在機制上可通過對二價金屬陽離子的需要進行區分。
生物化學和序列信息表明，GPIa-IIa是陽離子依賴性整合素類型的受體。相反，生物化學研究顯示GPIV和GPVI不需要二價金屬陽離子，因此是非整合素類型。就非整合素類別而言，對人受試者的觀察明確提示在初期粘著過程中，GPVI比GPIV更為重要。事實上，在通過螯合二價陽離子阻斷GPIa-IIa功能的體外實驗中，針對GPVI的抗體完全消除了膠原-血小板相互作用。Nakamura等J.Biol.Chem.2734338-4344，(1998)。
GPVI最初在約30年前通過等電聚焦和電泳鑑定。直到最近，其功能仍完全未知，只知道是還原條件下分子量約為62kDa的血小板糖蛋白。然而，約從1987年開始，Minoru Okuma博士及其同事檢查了若干患一種血小板減少性紫癜(出血/瘀傷症候群，其特徵在於血小板破壞加快和循環血小板數降低)的患者。Okuma博士的一些患者的血小板應答於多數激動劑(包括ADP、凝血酶、瑞斯託菌素和鈣離子載體(A23187))而正常聚集，但對膠原明顯無應答。此外，發現這些血小板62kDa糖蛋白的量減少或甚至完全缺失。Sugiyama等，Blood 691712-20(1987)；Moroi等，J.Clin.Invest.841440-45(1989)；Ryo等，Am.J.Hematol.3925-31(1992)和Aral等，Brit.J.Haematol.89124-130(1995)。
GPVI功能早期研究的關鍵試劑來自Okuma博士的一個血小板減少性紫癜患者。此患者表現為原因不明的大量出血，可通過輸入HLA匹配的血小板進行治療。接著對患者血的詳細檢查顯示完全缺失GPVI。最讓人吃驚的是，由於此患者完全缺失GPVI，她的免疫系統將輸入的血小板上的GPVI分子鑑定為外來抗原，並產生針對GPVI的多克隆抗體。Sugiyama等，Blood 691712-20(1987)。
天然存在的抗體由對單個抗原表位具有特異性的兩個相同的結合位點組成。通過共有柄或Fc結構域連接兩個抗原特異性部分，形成能與兩個相同的抗原分子結合的複合物。此外，抗體的二價特性與Fc結構域的聚集特性結合使許多特異性抗原分子交聯並聚集。Okuma博士發現來自患者血清的二價抗體與正常血小板混合時引起大量聚集的反應。相反，當通過酶去除連接的Fc結構域而使抗原特異性結構域表現為一價時，得到的Fab片段完全消除了正常血小板膠原誘導的聚集並抑制血小板-膠原粘著。
Okuma博士慷慨地將這種稀有的血清提供給科學界。不幸的是，來源非常有限，並且發現它的周圍環境事實上是不可重現的。儘管Okuma血清使對GPVI功能的研究成為可能並長期提供了鑑定蛋白質為GPVI的惟一方法，但是最近已發現C型凝集素驚厥素(convulxin)以高親和力與GPVI特異性結合，並可標記為探針用於鑑定GPVI蛋白。Francishetti等，Toxicon 351217-28(1997)；Polgaret等，J.Biol.Chem.272(24)13576-83(1997)；Jandrot-Perrus等，J.Biol.Chem.272(2)27035-41(1997)。驚厥素是來自熱帶響尾蛇Crotalus durissus terrificus的毒液組分。在其天然二價形式下，驚厥素是血小板聚集和前聚集及前凝血因子分泌的潛在誘導物。驚厥素的二價性質對其聚集效應是至關重要的。儘管該反應的生理學機制尚不清楚，單個驚厥素亞單位仍與GPVI結合，但是抑制而不是誘導聚集。已經提出，一價驚厥素阻斷膠原誘導信號傳入細胞內部。
最近測定了GPVI全序列。Clemetson等，J.Biol.Chem.27429019-24(1999)；WO 00/68377；Jandrot-Perrus等，Blood 961798-807(2000)；Ezumi等，Biochem Biophys Res Commun.27727-36(2000)。GPVI屬於免疫球蛋白超家族，並與Fc受體γ鏈(FcRγ)鏈非共價結合。Gibbins等，FEBS Lett.413255-259(1997)；Tsuji等，J.Biol.Chem.27223528-23531(1997)。目前認為與GPVI結合的膠原誘導FcRγ的酪氨酸磷酸化。其後磷酸化的FcRγ募集Syk激酶，最終引起胞內事件的級聯，包括磷酸激活Syk和磷脂酶C-γ2。這些事件最終引起胞內鈣水平升高並分泌前聚集和前凝血因子。因此，在人和小鼠血小板中，FcRγ鏈作為受體的信號轉導部分。Clemetson等，J.Biol.Chem.27429019-290(1999)；Jandrot-Perrus等，Blood 961798-1807(2000)；Gibbins等，FEBS Lett.413255-259(1997)；Tsuji等，J.Biol.Chem.27223528-23531(1997)。
GPVI缺乏的患者患有輕微出血素質，並且其血小板對膠原的應答很弱。Sugiyama等，Blood 691712-1720(1987)；Moroi等，J.Clin.Invest.841140-1445(1989)；Arai等，Br.J.Haemtol.89124-130(1995)。對GPVI缺陷型患者的血小板或用(得自患者血清的)抗GPVI Fab片段阻斷的血小板的研究清楚地證明了高和低剪切率下血小板與固定抗原間相互作用的缺乏和高剪切率下對固定vWf的粘著強度的降低。Goto等，Circulation106266-272(2002)。
用缺乏FcRγ鏈(也導致GPVI缺陷型表型)的敲除小鼠或GPVI衰竭的小鼠進行的研究也證實了這些觀察，但這些動物表現出稍微延長的尾出血時間。Nieswandt等，The EMBO Journal 202120-2130(2001)。GPVI缺陷型、FcRγ陽性小鼠顯示與野生型和GPVI雜合小鼠相似的出血時間。來自GPVI缺陷型小鼠的血小板不能應答於膠原和驚厥素而發生聚集，並顯示在流動條件下與固定膠原粘著的顯著降低，從而證實GPVI在膠原誘導的血小板功能和血栓形成中發揮重要作用。Kato等，Blood 1021701-1707(2003)。
現在已經接受GPVI為膠原誘導的血小板活化的主要受體，並且是信號轉導的關鍵渠道。Lchinohe等，J.Biol Chem.270(47)28029-28036(1995)；Tsuji等，J.Biol Chem.272(28)23528-31(1997)。相反，血小板中的另一主要膠原受體GPIa-IIa主要與得到穩定粘著和伸展、引起血栓生長的陽離子依賴性過程相關。Blood 102449-461(2003)。
不恰當的血小板聚集和血塊形成是一系列人類疾病(最普遍的是血管疾病)的主要病原學因素，這一不幸事實突出了本領域對GPVI拮抗劑(如針對GPVI的抗體)的需要。在動脈和靜脈內壁積累過多的血小板會促進動脈粥樣硬化和動脈粥樣斑塊，它們降低到達敏感組織的血流量。這種血小板依賴性的累積最終可能表現為急性心肌梗塞、慢性不穩定心絞痛、短暫性局部缺血、中風、外周血管疾病、動脈血栓形成、肺栓塞、再狹窄和多種其他症狀。
這些表現一般開始於血管內形成的稱為血栓的異常血塊。一旦形成血塊，流過血塊的持續血流可能將其從粘著中衝下。這些自由流動的血塊稱為栓子。栓子一般通過循環流動，直至被阻塞在循環系統中的窄點。這種阻塞可能發生在腦、肺或冠狀動脈中，引起疼痛、殘疾或死亡。
血管內的血塊可能來自天然發生的硬化、敗血症休克或血管的物理損傷。事實上，用於診斷和治療血管疾病的高度有侵入性方法(如血管移植物、探查和留置導管、支架、分流器和其他裝置)本身就損傷血管壁。這可能活化血小板、刺激聚集並最終導致形成血栓和栓子，進一步危害患者的生命和健康。因此，控制或降低血小板聚集和血塊形成的方法是這些疾病的控制中長期尋求的目標。
發明概述本發明提供GPVI特異性抗體，所述抗體是比本領域已報導的膠原誘導血小板功能抑制劑更有效的抑制劑。因此，本發明的GPVI特異性抗體可能是有用的抗血栓劑，並且可能具有降低的(經常與施用其他抗血栓劑相關的)副作用。
本發明的一個方面提供對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體，所述抗體以小於約7、4、3、2、1、0.6μg/ml或此範圍內包含的任何值的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體還可以以小於約1、0.5、0.2、0.1μg/ml或此範圍內包含的任何值的IC50抑制膠原誘導的血小板粘著。
本發明的另一方面提供對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體，所述抗體以等於或低於10-8M的Kd與GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。在另一實施方案中，本發明的抗GPVI抗體以等於或低於10-9M的Kd與GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。
本發明的單克隆抗體還抑制膠原誘導的ATP分泌和/或膠原誘導的血栓烷A2形成。單克隆抗體包括活性抗體片段。活性抗體片段可以包括化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。在本發明的實施方案中，CDR包括SEQ ID NO1-24中任一序列或其變體，其中CDR變體與GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。示例抗體包括OM1、OM2、OM3和OM4。
本發明還提供通過使血小板接觸對GPVI多肽、肽或其天然存在的變體具有特異性的單克隆抗體來抑制血小板聚集、膠原誘導的ATP分泌、膠原誘導的血栓烷A2形成和/或血小板粘著的方法。
本發明還提供產生對GPVI多肽、肽或其天然存在的變體具有特異性的單克隆抗體的方法。方法包括用GPVI抗原免疫GPVI缺陷型宿主並獲得抗體。GPVI缺陷型宿主包括如GPVI雜合宿主和純合GPVI敲除宿主。本發明的另一方面提供通過所述方法產生的對GPVI多肽、肽或其天然存在的變體具有特異性的單克隆抗體。
本發明還提供含有藥物有效量的本發明GPVI特異性單克隆抗體的抗血栓組合物。抗血栓劑可用於治療患者。因此，本發明的一個方面提供治療例如需要血管疾病治療的患者的方法。
本發明還提供鑑定抗血栓劑的方法，所述鑑定通過使GPVI抗原接觸本發明的GPVI特異性單克隆抗體和測試化合物，並測量對單克隆抗體與GPVI抗原結合的抑制。可以按任意順序加入GPVI抗原、GPVI特異性單克隆抗體和測試化合物。例如，可以在接觸GPVI特異性單克隆抗體之前先使GPVI抗原與測試化合物接觸。在另一實例中，GPVI抗原可以同時與GPVI特異性單克隆抗體和測試化合物接觸。
應該理解，上述一般性描述和下文的詳細描述僅用於示例和解釋，並不限制本發明。
附帶的圖表(引入並構成本說明書的部分)與描述一起說明本發明的若干實施方案，用於解釋本發明的原理。
附圖簡述

圖1為產生GPVI敲除小鼠的示意圖。圖1A顯示GPVI野生型等位基因、用於在外顯子2和3處同源重組的靶載體和得到的突變體等位基因。圖1B顯示野生型和突變的基因組中用限制性內切酶切割得到的5』和3』片段的大小差異。
圖2為顯示靜止條件下0.1-100μg/ml的OM1、OM2、OM3和OM4的Fab片段對血小板(人)與纖維膠原的粘著的影響的條形圖。
圖3是顯示靜止條件下0.001-1μg/ml的OM1、OM2、OM3和OM4的Fab片段對人血小板與纖維膠原的非Mg2+依賴性(GPVI依賴性)粘著的影響的條形圖。
圖4展示高剪應力(2600秒-1)條件下OM1、OM2、OM3、OM4和ReoPro的Fab片段對血小板(人)與酸不溶性膠原的粘著的影響。
圖5是與人血小板裂解液中GPVI反應的OM系列抗體(OM1、OM2、OM3和OM4)和驚厥素(CVX)的Western印跡。
圖6展示在GPVI敲除動物中膠原和驚厥素誘導的血小板聚集的完全缺失。
圖7展示高剪應力條件下來自GPVI敲除小鼠的血小板與酸不溶性膠原之間相互作用的完全缺失。
圖8為顯示短尾猴中OM2 Fab片段和ReoPro對離體膠原誘導的血小板聚集的影響的圖示。
圖9為顯示短尾猴中OM2 Fab片段和ReoPro對皮膚出血時間的影響的圖示。
圖10為顯示短尾猴中OM2 Fab片段和ReoPro在靜脈團注(bolusinjection)(0.4mg/kg)後隨時間變化的抗聚集效應的圖示。
圖11為顯示短尾猴中OM2 Fab片段和ReoPro在靜脈團注(0.4mg/kg)後對皮膚出血時間的時程影響的圖示。
圖12展示大鼠中OM4 Fab和7E3 F(ab′)2片段對離體膠原誘導的血小板聚集的影響。
圖13展示大鼠中OM4 Fab和7E3 F(ab′)2片段對皮膚出血時間上的影響。圖13A顯示對趾甲出血時間的影響，圖13B顯示對尾出血時間的影響。
圖14展示大鼠中OM4 Fab和7E3 F(ab′)2片段對血小、板計數的影響。
圖15是顯示內皮損傷之前(圖15A)和之後(圖15B)施用時，OM4Fab片段對大鼠中動脈血栓形成的影響的條形圖。
圖16是顯示生物素化的OM2 Fab片段在體外與人血小板的濃度依賴性結合。
實施方案描述本發明描述新GPVI特異性抗體，所述抗體為膠原誘導的血小板應答(包括但不僅限於血小板聚集、粘著、膠原誘導的ATP釋放和血栓烷A2(TXA2)形成)的有效抑制劑。本發明還描述產生抗GPVI抗體的方法。本發明的抗GPVI抗體可用於抑制血栓形成和用於治療需要抗血栓形成治療的患者。
術語「抗體」包括單克隆抗體。本發明的單克隆抗體包括活性抗體片段，如F(ab′)2和Fab片段以及任何重組產生的結合配偶體。如果抗體以等於或低於10-7M的解離常數(Kd)與GPVI多肽、肽或其天然存在的變體結合，則將其定義為「特異性結合」。在本發明的實施方案中，抗GPVI抗體以等於或低於10-8M的Kd與GPVI多肽、肽或其天然存在的變體特異性結合。在另一實施方案中，本發明的抗GPVI抗體以等於或低於10-9M的Kd與GPVI多肽、肽或其天然存在的變體特異性結合。可以使用常規技術便利地測定結合配偶體或抗體的親和力，如通過測量125I標記的IgG或其片段的飽和結合等溫線，或如Motulsky在《Analyzing Data withGraphPad Prism》(1999)，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA中所述通過使用非線性回歸分析，用未標記IgG同源取代125I標記的IgG。其他技術為本領域所公知，如Scatchard等，Ann.NY Acad.Sci.，51660(1949)所述。U.S.Publication No.2003/0186885描述了GPVI多肽、肽或其天然存在變體，其整體引入本文為參考。
可以使用本領域熟知的方法從多種來源(如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠、倉鼠或大鼠)容易地產生抗體。在本發明的一個實施方案中，宿主動物為亞美尼亞倉鼠。在另一實施方案中，宿主動物為GPVI缺陷型動物。本文所使用的「GPVI缺陷型」指與野生型動物相比，動物的內源性GPVI產生降低約50％或更高。內源性GPVI產生的降低可以是GPVI產生被完全抑制。可以通過本領域已知的多種方法產生GPVI缺陷型動物。這些方法可以包括在核酸(DNA或RNA)水平操縱動物中GPVI產生。可以通過包括但不僅限於以下的方法產生GPVI缺陷型動物敲除(參閱如Galli-Taliadoros等，J.Immunol.Methods 1811-15，1995；Robbins，Circ.Res.733-9，1993；Hergueux等.，Transplant Proc.2530-32，1993)、敲入(Colucci-Guyon等，Cell 79679-694，1994；LeMovellic等，PNAS 874712-4716，1990；Hanks等，Science 269679-682，1995；Wang等，Nature 379823-825，1996)、突變(Askew等，Mol.Cell.Biol.134115-4124，1993；Stacey等，Mol.Cell.Biol.141009-1016，1995；Hasty等，Nature 350243-246，1991；Valancius等，Mol.Cell.Biol.111402-1408，1991；Wu等，PNAS 912819-2823，1994；Hone等，Gene166197-204，1995；Toth等，Gene 178161-168，1996)、缺失(You等，Nature Genet.，15285-288，1997；Holdener-Kenny等，Bioessays1483 1-839，1992)、反義寡核苷酸技術(Wagner等，Nature Biotechnol.14840-844，1996；Kitajima等，Science 2581792-1795，1992；Urban等，Farmaco.58243-58，2003；Orum等，Curr Opin Mol Ther.3239-43，2001；Sohail等，Curr Opin Mol Ther.2264-71，2000；Smith等，Eur J PharmSci.11191-8，2000)、幹擾RNA(RNAi)技術(Scherr等，Curr Med Chem.10245-56，2003；Nishikura，Cell 107415-418，2001；Hannon，Nature4418244-251，2002；U.S.專利No.5,506,559)或通過使用任何其他化學品、天然存在的、重組的或合成的肽、多肽、蛋白質、多糖、小分子和設計用於降低或抑制宿主中GPVI產生的任何其他化合物。
不限於任何理論，不產生或產生低於正常量的內源性GPVI的宿主可能得到比產生正常水平的GPVI宿主更強的免疫應答。因此，與從產生GPVI的正常宿主獲得的抗體相比，可能產生在較低劑量下更有效的抑制膠原誘導的血小板應答(如血小板聚集、血栓形成和/或血小板活化)的GPVI抗體。在敲除動物中產生抗體的方法已描述於Pass等，Scand.J.Immunol.58298-305(2003)；Zlot等，J.Lipid Res.4076-84(1999)；Declerck等，J.Biol.Chem.2708397-8400(1995)和Castrop等，Immunobiology 193281-287(1995)。
可以如整體引入本文為參考的US專利出版物No.US 2003/0186885A1所述免疫宿主。簡言之，用「GPVI抗原」免疫宿主，所述「GPVI抗原」包括但不僅限於分離自血小板或其他表達GPVI的細胞的天然GPVI多肽、肽或其天然存在的變體；由原核或真核細胞表達的重組GPVI多肽、肽或其天然存在變體的重組形式；得自多種物種(包括人)的血小板；表達GPVI多肽、肽或其天然存在變體的細胞；編碼GPVI多肽、肽或其天然存在變體的核酸；或它們的任一組合。
一般對宿主動物腹膜內施用與佐劑或載體綴合的純化的GPVI多肽或基於GPVI多肽胺基酸序列的肽。可以通過使用佐劑(如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑)增強GPVI多肽的免疫原性。加強免疫之後，收集血清小樣並測試對GPVI多肽的反應性。用於這些測定的多種測定法的實例包括《AntibodiesA Laboratory Manual》，Harlow和Lane(編)，ColdSpring HarborLaboratory Press，1988中所述以及如對流免疫電泳(CIEP)、放射性免疫測定、放射性免疫沉澱(RIP)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡測定和夾層測定和FACS等方法。參閱U.S.專利No.4,376,110和4,486,530。
可以使用熟知的方法便利地製備單克隆抗體，參閱如U.S.專利No.RE32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993、《Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimension in Biological Analyses》，Plenum Press，Kennett、McKearn和Bechtol編，1980中所述的方法。簡言之，以約一周間隔(任選在佐劑存在下)對宿主動物腹膜內注射GPVI抗原。進行免疫直至得到所需的抗體效價。
然後通過使用轉染了GPVI-FcRγ鏈的CHO細胞的FACS分析或本領域已知的任何其他方法測定小鼠血清的抗體效價。對選擇的小鼠給予加強劑量的GPVI抗體。三天後，處死小鼠並按已建立的方法將其脾細胞與市售的骨髓瘤細胞P3U1(ATCC)融合。將骨髓瘤細胞在無血清培養基中洗滌若干次並與小鼠脾細胞融合。融合劑為50％PEG(Roche)。將融合物置於含有補充了HAT的DMEM培養基的96孔平底平板(Corning)中，接著培養1-2周。收集來自所得雜交瘤的上清液並通過使用表達GPVI和FcRγ的野生型CHO細胞的FACS分析來分析抗GPVI抗體的存在。還使用野生型CHO細胞進行FACS分析以消除產生針對CHO細胞抗原的抗體的克隆。可以在大量培養基中培養陽性克隆，接著通過A蛋白或G蛋白瓊脂糖柱(Phamacia)純化上清液。應該理解，可以使用許多技術產生針對GPVI多肽和肽的抗體，此實施方案絕不限制本發明的範圍。
可以使用備選技術產生本發明的單克隆抗體，如Alting-Mees等在整體引入本文為參考的《Molecular Biology》的Strategies中的″MonoclonalAntibody Expression LibrariesA Rapid Alternative to Hybridomas″，31-9(1990)所述。類似的，本發明的單克隆抗體包括(如使用重組DNA技術)構建以整合入編碼特異性結合抗體的基因可變區的結合配偶體。這些技術描述於Larrick等，《Biotechnology》，7394(1989)。
可以結合本領域的認識程度產生其他類型的抗體。例如，可以如Knight等，Mol.Immunol321271-81(1995)所述，通過用含有純化的單克隆抗GPVI抗體抗原結合位點的抗原來免疫宿主並測試所得血清或單克隆上清液的活性來獲得抗獨特型抗體。在本發明的實施方案中，可以通過用含有本發明抗GPVI抗體的互補性決定區(CDR)的肽免疫宿主來獲得抗獨特型抗體。本發明的抗獨特型抗體包括活性抗獨特型抗體片段，其指化學、酶或重組產生的抗獨特型抗體片段，包括Fab、F(ab)2或含有至少一個特異性結合GPVI抗體的互補性決定區的肽。此外，本發明包括生物合成的GPVI抗體結合位點(如Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879(1988)所述)、含有分離的重鏈可變結構域的單結構域抗體(如Ward等，Nature 341544(1989)所述)和含有改造為含有(能特異性結合GPVI多肽的)人抗體元件的抗體。還可以使用噬菌體展示技術產生抗GPVI抗體，如Ventor等，Ann Rev.Immunol.1243355(1994)及其引用的參考文獻(全部引入本文為參考)中所述。
本發明的抗體還包括活性抗體片段，其指化學、酶或重組產生的抗體片段，包括Fab、F(ab)2或含有至少一個特異性結合GPVI多肽、肽或其天然存在變體的互補性決定區(CDR)的肽。利用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的普通酶方法去除Fc抗體結構域以產生二價F(ab)2和一價Fab片段。這些方法在Gorini等，J.Immunol.1031132(1969)；《Handbook ofExperimental Immunology》第1卷DM Wier編輯，Blackwell AldenPress，Oxford，UK，1997和《AntibodiesA Laboratory Manual》，Harlow和Lane編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；和U.S.專利No.4,470,925(Auditore-Hargreaves)(全部引入本文為參考)中有基本描述。
可以將完整的GPVI特異性抗體和抗體片段如Fab和F(ab)2片段與藥物或載體分子共價偶聯。此外，可以直接交聯或通過合適的載體分子交聯本發明的GPVI特異性抗體以形成多價體複合物。在一個實施方案中，如Reno等(U.S.專利No.5,506,342)(引入本文為參考)所述，通過共價交聯使F(ab)2代謝穩定。
可以通過配體(膠原)依賴的結合測試對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體阻斷血小板活化的能力。阻斷血小板功能的單克隆抗體可能是有用的抗血栓劑。
還可以人源化本發明的抗體。因此在臨床應用中優選人抗體和人源化抗體。參閱如LoBuglio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220-24(1989)；Meredith等，J.Nucl.Med.33，23-29(1992)；Salah等，Hum.Antibod.Hybridomas 319-24(1992)；Knight等，Mol.Immunol 321271-81(1995)和Lockwood等，Q.J.Med.89903-12，(1996)。
開發全人抗體一般需要合適的人免疫B淋巴細胞源。產生人抗體的一種方法包括從置於體外培養的得自非免疫個體的幼稚B細胞庫中免疫和擴大具有適當特異性的B淋巴細胞。Ohlin和Borrebaeck，《Methods ofImmunological Analysis》，第II卷，Masseyeff等編輯，VCHVerlagsgesellschaft mbH，Weinheim，298-325頁(1992)；Borrebaeck和Ohlin，《Protocols in Cell and Tissue Culture》，Doyle等編輯，J.Wiley Sons Ltd.，Chichester 25E1.1-7(1993)。已經通過此方法開發了針對HIV-1糖蛋白的人抗體。Ohlin等，Immunology 68325-331(1989)；Ohlin等，Clin.Exp.Immunol.89290-295(1992)；Duenas等，Immunology891-7(1996)。更最近的，已經開發了利用植入人免疫細胞或引入完整的人免疫球蛋白基因座的動物的體內技術。llan等，Curr.Opin.Mol.Ther.4102-109(2002)；lshida等，Cloning Stem Cells 491-102(2002)。已經通過用多種人抗原免疫這些動物產生了全人抗體。
可以通過用相應的人抗體序列替換單克隆抗體的大部分或全部結構部分來產生人源化抗體。從而產生僅抗原特異性可變區或互補性決定區(CDR)由非人序列組成的雜合分子。設計人源化抗體的多種策略綜述於Winter和Milstein，Nature 349293-99(1991)；Harris，BCSTBS523(4)1035-38(1995)；Morrison和Schlom，《Important Advances inOncology》，J.B.Lippincott Co.(1990)；L.Presta，″HumanizedMonoclonal Antibodies，″《Annual Reports in Medicinal Chemistry》，Academic Press，(1994)和A.Lewis和J.Crowe，″Generation ofHumanized Monoclonal Antibodies by Eest Fit″Framework Selectionand Recombinant Polymerase Chain Reaction″Generation of Antibodiesby Cell and Gene Immortalization.Year Immunol.1993，第7卷，110-118頁，(C.Terhorst、F.Malvasi和A.Albertini編Basel，Karger，以上各文獻均全文引入本文作為參考。
還可以通過Ig特異性吸附(如A蛋白層析)或通過使用固定GPVI肽的親和層析來選擇和純化抗GPVI抗體，以人源化對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的抗體。可以通過標準方法解離重鏈和輕鏈，並純化單鏈。可以測定單鏈的局部胺基酸序列並根據Lathe等，J.Mol.Biol.1831-12(1985)的方法產生每個鏈的簡併寡核苷酸。接著可以通過PCR或其他標準方法從產生抗GPVI抗體的細胞克隆編碼這些抗體鏈的DNA並測序。
可以分析抗體DNA和胺基酸序列並與已知的人重鏈和輕鏈序列進行比較。基於序列比較，可以通過用人序列取代非人DNA部分從而形成具有GPVI特異性的嵌合抗體來使GPVI特異性抗體鏈人源化。在一個實施方案中，使用Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218(1987)所述的表達載體用人J1和K恆定區使GPVI特異性抗體人源化。製備非人-人雜合體的方法為本領域所熟知，並詳細描述於如Knight等，Mol.Immunol321271-81(1995)；U.S.專利No.5,705,154(Dalie等)；5,693,322(Creekmore等)；5,677,180(Robinson等)；5,646,253(Wallace等)；5,585,097(Bolt等)；5,631,349(Diamantstein等)和5,580,774(Beavers等)(全部引入本文為參考)。為使高親和力嵌合抗體的產生最大化，可以使用Queen等，(U.S.專利No.5,585,089)和Queen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，8610029-33(1989)的方法。
還可以使用噬菌體展示方法產生人源化抗體，如Rader等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，958910-8915(1998)和Steinberger等，J.Biol.Chem.27536073-36078(2000)所教導以及如Son等，J Immunol Methods.286187-201(2004)，Lee等，J Immunother.27201-210(2004)和其他本領域技術人員所教導。
抗體分子與抗原結合的部分僅由重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變(V)區中的少數胺基酸組成。通過V區摺疊使這些胺基酸緊密靠近。IgG可變區胺基酸序列的比較顯示多數變異性存在於三個稱為互補性決定區(CDR)的區域內。每個鏈(H和L)含有三個CDR。特異性不同的抗體具有不同的CDR，而具有完全相同特異性的抗體一般具有相同或高度保守的CDR。本發明包括含有本發明GPVI抗體的至少一個互補性決定區(CDR)或其變體的單克隆抗體或肽。本發明包括含有SEQ ID NO1-24中至少一個胺基酸序列或其變體的單克隆抗體或肽。
本文中含有CDR的抗體或肽的「變體」指含有與SEQ ID NO1-24基本相同的胺基酸序列，但由於一個或多個刪除、插入或替換而具有與SEQ ID NO1-24不同的胺基酸序列的抗體或肽。變體與含有相應CDR的抗體或肽相比還保留了與GPVI多肽、肽或其天然存在變體的至少70％、80％、90％或100％的結合親和力。可以根據本領域已知的任何方法測定結合親和力，如Fujimura等，Thromb.Haemost.87728-734(2002)所教導和下文實施例4所示例的。變體優選含有與SEQ ID NO1-24至少60％、65％、70％、80％、85％或90％相同的CDR。可以通過如使用GAP電腦程式6.0版(Devereux等(Nucl.Acids Res.12387，1984)所述，可得自the University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))比較序列信息來測定同一性百分比。GAP程序利用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math 2482，1981)修訂的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443，1970)比對方法。GAP程序優選的默認參數包括(1)核苷酸的一元比較矩陣(包括相同時為1不同時為0的值)和Gribskov和Burgess(Nucl.Acids Res.146745，1986)的加權比較矩陣，如Schwartz和Dayhoff編輯，《Atlas of Protein Sequence and Structure》，NationalBiomedical Research Foundation，353-358頁，1979所述；(2)每個缺口罰分為3.0，每個缺口中的每個符號額外罰分0.10；和(3)末端缺口無罰分。
變體可以包括保守性替換的序列。保守性替換指用具有相似生理化學特徵的殘基取代給定的胺基酸殘基。保守性替換的實例包括脂肪殘基彼此替換，如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸彼此替換，或極性殘基彼此替換，如賴氨酸和精氨酸、穀氨酸和天冬氨酸或穀氨醯胺和天冬醯胺之間。其他這種保守性替換(如具有相似的疏水性特徵的整個區域的替換)是眾所周知的。
可以使用本領域已知的多種方法篩選候選抗GPVI抗體對血小板粘著和活化的影響。這些方法包括如U.S.專利No.5,686,571所述的血小板粘著抑制劑測定法、可以使用較少體積的血和較少抗體的Diaz-Ricart等的改良恆流測定法(Blood 82491-496，1993)，如Brown和Larson(BMCImmunology 29-15，2001)所述、Matsuno等(British J.Haematology92960-967，1996)和Nakamura等(J.Biol.Chem.273(8)4338-44，1998)(「Nakamura方法」)所述的平板測定法(均特別引入本文為參考)。對於每種情況，都可以在存在或不存在Mg2+的情況下將候選GPVI激動劑或拮抗劑與反應組分預孵育或共孵育。不存在Mg2+情況下的孵育阻斷GPIa/IIa的功能，從而殘留的膠原依賴性活性主要由GPVI受體介導。
修改的Nakamura方法可以用於測定靜止條件下血小板對固定的酸不溶性纖維膠原的粘著。修改的Nakamura測定概述於下文。對原始方法的主要修改包括用未標記的血小板代替51Cr標記的血小板，並通過用市售的試劑盒定量粘著血小板釋放的LDH活性來測量粘著。本領域技術人員了解如何根據測試的特定抗GPVI抗體對測定條件進行其他修改。
粘著測定——用I型酸不溶性馬腱纖維膠原包被微量滴定板的孔。將4×108/ml濃度的血小板懸於Tyrode-HEPES緩衝液或補充了Mg2+(1ml)的Tyrode-HEPES緩衝液中，並如前述(Tandon等，Br.J.Haematol.89124-30，1995)進行粘著測定。簡言之，在加入到用膠原包被的孔之前，先在室溫下將血小板和樣品(如抗體溶液)孵育30分鐘。在存在或不存在Mg2+的情況下在室溫粘著60分鐘。重複洗滌孔以去除未粘著的血小板，將粘著的血小板溶於Triton X-100中。使用基於比色測定的市售LDH測定試劑盒(CytoTox 96，Promega，Madison，Wl，USA)測定釋放的LDH活性。
ATP釋放和血栓烷A2(TXA2)生成的測定——在雙通道生物發光凝集測定儀(650CA型-Chronolog Corporation Havertown PA，USA)中測量膠原誘導的ATP釋放。簡言之，將富含血小板血漿(用貧血小板血漿將血小板計數調整至3×108/ml)與螢光素酶-螢光素試劑(ChronologCorporation)混合。接觸膠原之前，先在存在或不存在測試抗體溶液(如Fab片段)的情況下於37℃孵育5分鐘。同時測量聚集和ATP釋放。在所需時間通過加入抑制TXA2合成的抑制劑的混合物終止反應。將血小板懸液的上清液轉移到小管中並凍存於-20℃至測量膠原誘導的TXA2形成。以TXB2(TXA2的穩定代謝物)測量TXA2。
血小板聚集測定——Sun等，J Cardivascular Pharmcol.40557-585(2002)所述的血小板聚集測定提供了檢測或測定抗凝血活性的簡單方法。將抗GPVI抗體(如完整IgG、F(ab′)2或Fab片段)或對照緩衝液(0.15M NaCl、0.01 M Tris.HCl，pH 7.4)加入含有富含血小板血漿(200μl)的試管中。在用膠原誘導聚集之前，先將混合物在聚集測定儀的加熱管中在37℃孵育3到5分鐘。將試管置於四通道聚集測定儀(AG10 Kowa，Japan)中，所述測定儀通過雷射散射測定微粒形成動力學，並通過光透過的變化測定聚集。用0.5-4μg/ml的膠原起始聚集。膠原的最佳濃度為給出至少70％的光透過變化的濃度，並對每個實驗進行測定。在加入膠原後至少監測8-10分鐘的聚集。
體外測定——還可以使用Diaz-Ricart及其同事(Arteriosclerosis，Thromb.Vase.Biol.16883-888，1996)開發的系統進一步測定GPVI特異性抗體或抗體片段。此測定用去內皮的兔主動脈和人內皮細胞基質測定流動條件下GPVI抗體對血小板的影響。
體內測定——可以用血小板功能的標準模型測定GPVI抗體或抗體片段的體內活性，如Coller和Scudder，Blood 661456-59(1985)；Coller等，Blood 68783-86(1986)；Coller等，Circulation 801766-74(1989)；Coller等，Ann.Intern.Med.109635-38(1988)；Gold等，Circulation 77，670-77(1988)和Mickelson等，J.Molec.Cell Cardiol.21393-405(1989)所述。
以上測試證明本發明的GPVI特異性抗體比其他人已經報導的更為有效。具體的，本發明的GPVI特異性抗體以比本領域抗體更低的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。術語「IC50」在本領域中是觀察到50％抑制時的濃度，並且是任何大於0的正值。用接觸血小板後在5分鐘內誘導70％-90％血小板聚集的濃度測定誘導抑制膠原誘導的血小板聚集的IC50。術語「抑制」指任何表型特徵的減弱或消失，或該特徵的發生率、程度或可能性的降低或消失。就血小板聚集而言，「抑制」指血小板聚集可測量的降低或消失。可以通過上述測試或本領域已知的任何其他方法來測試這種抑制。類似的，就血小板粘著而言，「抑制」指血小板對表面的粘著的可測量的降低或消失。可以通過上述測試或本領域已知的任何其他方法來測試這種抑制。
本發明的GPVI特異性抗體以低於約7、4、3、2、1、0.6μg/ml或此範圍內的任何值的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。本發明的GPVI特異性抗體還以低於或等於約1、0.5、0.2、0.1μg/ml抑制膠原誘導的血小板粘著。本發明的GPVI特異性抗體還抑制膠原誘導的ATP分泌和/或膠原誘導的血栓烷A2形成。本發明的GPVI特異性抗體包括活性抗體片段。活性抗體片段包括化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段和含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
可以根據已知方法將本發明的GPVI特異性抗體配製進藥物組合物。本發明的藥物組合物含有至少一種GPVI特異性抗體，包括但不僅限於完整單克隆抗體、Fab片段、F(ab)2片段和含有至少一個CDR序列的肽或其變體。GPVI特異性抗體可以與其他已知的活性物質組合。
本發明的組合物含有與可藥用賦形劑混合的至少一種GPVI特異性抗體，所述可藥用賦形劑包括但不僅限於溶劑(如Tris-鹽酸、乙酸、磷酸、水)、防腐劑(如硫柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)、乳化劑、鹽、聚合物、緩衝液、增溶劑、佐劑和/或載體。合適的賦形劑及其製劑方描述於Remington《The Science and Practice of Pharmacy》，第20版，Mack Publishing Co.(2000)。此外，這些組合物可以含有與聚乙二醇(PEG)、金屬離子複合的GPVI特異性抗體，所述抗體摻入多聚體化合物如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝膠等或摻入脂質體、微乳、微團、單層、多層或共層載體、紅細胞血影或球芽中。
本發明還包含(如通過抑制血小板聚集或血小板粘著)抑制血栓形成的方法，所述方法包括使活化或靜息血小板接觸針對GPVI的抗體。「抑制血栓形成」指患者、患者群或體外測試系統中血栓形成事件的降低或消失或血栓形成事件的發生率、程度或可能性的降低。本發明還涉及使患者(定義為需要抗血栓形成治療的任何人或非人動物)降低血栓形成或血小板聚集或血小板活化的發生率、可能性或程度的治療，或涉及血管疾病的治療可能對其有益的受試者(包括人和非人動物)。這些待治療的非人動物包括馴養或野生的脊椎動物，包括但不僅限於小鼠、大鼠、兔、魚、禽、倉鼠、狗、貓、豬、綿羊、馬、牛和非人靈長類。
對患者的治療包括施用藥物有效量的本發明含有抗GPVI抗體的組合物。本領域的普通技術人員可以經驗性地確定施用這些組合物的最佳劑量和給藥計劃。儘管如此，藥物有效劑量是提供可測量的抗血栓形成效應(如體內或體外測定中血栓形成、血小板聚集或血小板活化的發生率、程度或可能性的降低)或提供患者中血管疾病、血塊或栓子形成或缺血事件性的可能性、發生率或程度的可測量的降低的劑量。
可以以單次給藥或在療程中以多次給藥施用藥物有效量。本發明範圍內的試劑盒包括容器，所述容器中含有一劑或多劑藥物有效劑量的本發明含有抗GPVI抗體的組合物。這些試劑盒包括單獨的、混合或懸於適當可藥用溶劑和/或其他賦形劑的抗GPVI抗體或在施用前配製成混合或懸於適當可藥用溶劑和/或其他賦形劑的抗GPVI抗體。
可以通過本領域普通技術人員所熟悉的任何方法施用本發明的組合物，如通過靜脈團注、連續或間歇輸注靜脈給藥。在備選的實施方案中，可以腹膜內、體內、關節內、心室內、鞘膜內、肌內、皮下、局部、扁桃體、黏膜、鼻內、經皮膚、陰道內、經口或吸入施用組合物。
本發明的GPVI特異性抗體還可用於篩選可用作抗血栓劑的化合物。篩選方法包括使GPVI抗原接觸測試化合物和GPVI特異性抗體，並測量對GPVI特異性抗體與GPVI多肽、肽或其天然存在變體的結合的抑制。可以以任意順序加入GPVI抗原、GPVI特異性抗體和測試化合物。例如，可以在接觸GPVI特異性單克隆抗體之前先使GPVI抗原與測試化合物接觸。在另一實例中，GPVI抗原可以同時與GPVI特異性單克隆抗體和測試化合物接觸。
對結合的抑制提示測試化合物競爭(或幹擾)與GPVI特異性抗體相同的GPVI結合位點。就篩選抗血栓劑而言，「GPVI抗原」指(但不僅限於)從血小板或其他表達GPVI的細胞分離的天然GPVI多肽、肽或其天然存在變體、由原核或真核細胞表達的重組GPVI多肽、肽或其天然存在變體或表達GPVI多肽、肽或其天然存在變體的細胞。測試化合物可以是任何化學品、蛋白質、肽、多肽或核酸(DNA或RNA)。測試化合物可以是天然存在的或通過本領域已知方法進行合成。本發明的篩選方法可以利用高通量篩選(HTS)方法。高通量篩選方法綜述於Khandurina等，Curr Opin Chem Biol.6359-66(2002)；Kumble，Anal Bioanal Chem.377812-819(2003)和Bleicher等，Nature Rev Drug Disc 2369-378(2003)。
對於鑑定為抑制GPVI特異性抗體或其抗體片段與GPVI抗原結合的化合物，可以通過本文公開的任何方法或本領域已知的其他方法進一步測試其對血小板功能的影響。這些血小板功能包括膠原誘導的血小板聚集、膠原誘導的血小板粘著、膠原誘導的ATP分泌和膠原誘導的血栓烷A2形成。
通過以下實施例說明本發明，所述實施例毫無限制本發明的意圖。
實施例1單克隆GPVI抗體的製備如下文所述免疫正常小鼠(Balb/c、雌性)、亞美尼亞倉鼠(雄性)和GPVI敲除小鼠(產生於Otsuka GEN institute)以產生單克隆抗體。
如前述產生GPVI敲除小鼠(Mori等Neurosci.Res.43251-7，2002)。如圖1A所示，通過用pMC1-neo-聚腺苷酸(Stratagene)盒替換129/Sv小鼠基因組λ克隆(Clalsite)的GPVI基因基因組片段來構建靶載體(Ezumi Y.等，Biochem Biophys Res Comm 27727-36，2000)，被替換的基因組片段含有外顯子2的最後5個鹼基和外顯子3的前一半。電穿孔使線性化的構建體進入來自129/Sv小鼠的AB2.2 ES細胞(LexiconGenetics Inc.，The Woodlands，TX)並在G-418中選擇細胞。通過分別用5』和3』外部探針探查Sphl或Kpnl消化的基因組DNA來篩選G-418抗性ES細胞克隆中在外顯子2和3處成功進行的同源重組(圖1B，Southern印跡數據未顯示)。使來自同源重組ES細胞的嵌合體小鼠與C57BL/6J小鼠交配以獲得雜合突變體(F1)。使獲得的雜合突變體進行交配並通過Southern印跡進行確認來產生純合突變體(F2)。用提取自尾尖的基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)測定小鼠的基因型。在純合突變體中未觀察到出生率、出生體重、生長發育、孟德爾分配或出血障礙的異常。用背景匹配的野生型雜合小鼠作為對照。亞美尼亞倉鼠得自CytogenResearch and Development Inc.Boston，MA。在Otsuka MarylandMedicinal Laboratories按照Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)方案保持和繁殖所有動物。
用含有GPVI cDNA的質粒(「p-target」)、表達GPVI-FcRγ鏈的CHO細胞系(「CGP6」，其中用Invitrogen的LipofectamineTM2000進行轉染)、從表達GPVI-FcRγ鏈的CHO細胞純化的GPVI(「PGP6」)、從人血小板純化的天然GPVI(「nGP6」)和大腸桿菌中表達的重組局部GPVI(「PGAP6」)(缺乏第一個Ig結構域)免疫正常小鼠。通過組合U.S.Publication No.2003/0186885所述的凝集素親和、離子交換層析和驚厥素親和方法純化來自人血小板的天然GPVI和來自用GPVI-FcRγ轉化的細胞的PGP6。
通過用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉染含有全長人GPVIcDNA的pTarget載體(Promega)(「p-target」)和含有全長FcRγ cDNA的pcDNA3.1(+)zeocin載體(Invitrogen)來建立穩定表達GPVI和FcRγ的CHO細胞(「CGP6」)。在補充了G418和zeocin的培養基中選擇表達兩種受體的細胞。用多複製人抗GPVI抗體(前述Okuma博士的血清)或FITC標記的驚厥素通過使用Epic Altra FACS分析儀(BeckmanCoulter)的FACS分析檢測GPVI表達。通過使用市售的抗FcRγ多克隆抗體(Upstate Biotechnology)的免疫印跡進行FcRγ表達的檢測。
通過將編碼缺少人GPVI整個第一個Ig結構域的GPVI肽的cDNA插入pET21載體(Novagen)來製備重組局部GPVI。在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達此局部蛋白質。如生產商所述從包涵體中純化表達的蛋白質(「PAGP6」)。
用CGP6和人血小板免疫亞美尼亞倉鼠。GPVI敲除小鼠也用CGP6和人血小板進行免疫。
腹膜內注射除p-target以外的免疫原。皮內注射p-target。以含佐劑(Titermax Gold，Cytrx Corporation)的乳劑注射重組或純化的蛋白質。一些抗原與小鼠IL-6(500U/次注射)一起免疫以增強免疫系統。免疫動物直至獲得10-50000之間的血清效價。
通過常規雜交瘤技術產生單克隆抗體。使用P3U1細胞作為融合配偶體。為篩選陽性雜交瘤克隆，使用表達GPVI-FcRγ的CHO細胞在Beckman Coulter的Epic Altra FACS分析儀中進行FACS分析。對於用CGP6免疫的動物，用轉染GPVI-FcRγ的CHO細胞和未轉染的野生型CHO細胞進行FACS分析以區分產生非GPVI抗體(如CHO細胞相關抗原的抗體)的克隆。
接著在含有10％胎牛血清(含有＜1μg/ml血清的可忽略量的牛IgG)(Invitrogen Corporation，CA)的培養基中培養產生抗GPVI抗體的雜交瘤細胞。通過Waters 650系統(Waters Corporation，MA)上的G蛋白-瓊脂糖(Amersham Biosciences，NJ)或A蛋白-瓊脂糖(AmershamBiosciences，NJ)親和層析從無細胞的培養基上清液中純化IgG。通過G蛋白-瓊脂糖的親和層析純化小鼠IgG。用A蛋白-瓊脂糖純化倉鼠IgG。用低pH甘氨酸(pH 2.75)從親和基質上洗脫與G蛋白結合的IgG，收集到鹼性溶液中以中和酸並在鹽水中透析以用於功能測定。以pH梯度7.5-3.0洗脫與A蛋白結合的倉鼠IgG。抗體在pH 4.5洗脫。在大多數情況下，用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technology)分析時抗體純度＞90％。
使用標準方法，通過木瓜蛋白酶消化從完整IgG製備二價F(ab′)2片段。在100mM檸檬酸、pH 6.5、5.0mM EDTA中製備IgG溶液(5mg/ml)並按酶與IgG比例1∶50(重量/重量)用預活化的木瓜蛋白酶(無半胱氨酸)在37℃消化15小時。用新製備的碘乙醯胺結束反應，並通過MonoQ柱(Amersham Biosciences，NJ)的離子交換層析將F(ab′)2片段從未消化的IgG和Fc中分開。混合含F(ab′)2的級分、濃縮並按照Parham等，J.Immunol.Meth.53133-173 (1982)的方法還原/烷基化以獲得一價Fab片段。最後，通過Superdex 75(Amersham Biosciences，NJ)的分子排阻層析純化Fab片段至均一。避免在半胱氨酸存在下用木瓜蛋白酶將IgG直接轉換為一價Fab，因為在一些情況下，木瓜蛋白酶過度消化IgG，產生不穩定且大小較小的Fab片段。
首先，如上文所述用免疫原(包括從人血小板純化的GPVI(「nGP6」)、含有GPVI cDNA的質粒(「p-target」)和表達GPVI-FcRγ鏈複合物的CHO細胞(「CGP6」))免疫野生型Balb/c小鼠。參閱表1。篩選超過8500個克隆之後，鑑定了三個對GPVI具有顯著但適度的親和力的克隆(兩個來自CGP6，一個來自PGP6)。令人吃驚地，來自p-target、nGPVI和PAGP6免疫的超過5500個克隆中未得到一個具有生物活性的GPVI陽性克隆。在獲得具有增強的親和力和生物活性的抗體的嘗試中免疫了不同物種的動物。用CGP6免疫了亞美尼亞倉鼠，因為此抗原在野生型小鼠中產生了兩個陽性克隆。由於人血小板在其表面表達天然GPVI，還使用經洗滌的人血小板作為免疫原。從CGP6免疫中獲得了七個GPVI陽性克隆，從人血小板免疫中獲得了一個克隆。參閱表2。


其後用GPVI敲除(GPVI-KO)小鼠作為免疫宿主。GPVI-KO小鼠缺乏GPVI，不應答於高劑量的膠原和驚厥素(GPVI特異性激動劑)。因此，理論上注射的GPVI在GPVI缺陷型小鼠中可能免疫原性更高，並因而產生對GPVI肽具有高親和力的GPVI抗體。GPVI-KO小鼠的免疫結果示於表3。用經洗滌的人血小板懸液免疫GPVI-KO小鼠未產生陽性克隆。然而，用CGP6免疫GPVI-KO小鼠得到了八個克隆，通過FACS分析中螢光強度的大量右側偏移判斷其對GPVI具有高親和力。

接著從GPVI陽性克隆中獲得IgG免疫球蛋白來自野生型小鼠的3個克隆、來自倉鼠融合物的8個克隆和來自GPVI-KO小鼠融合物的8個克隆。如上述通過使用G蛋白(野生型和GPVI-KO小鼠)或A蛋白(倉鼠)的親和層析純化IgG。從所有克隆純化的抗體以相對低的IgG濃度(0.1-7μg/ml(17個克隆)，10-30μg/ml(2個克隆))誘導完全的血小板聚集，提示這些抗體與GPVI和FcR IIA交聯，或與GPVI分子交聯。為排除GPVI-FcRIIA的可能性，製備了F(ab′)2片段。在初步研究中，從兩種抗體製備的F(ab′)2片段活化人血小板(儘管與完整IgG相比需要高若干倍的濃度)。這證實了二價抗體引起的GPVI交聯可能是所觀察到血小板活化的原因。為避免GPVI交聯，通過還原/烷基化將所有的F(ab′)2片段轉變為Fab片段。以比完整IgG活化人血小板的濃度高若干倍的濃度進行測試時，得到的Fab片段未活化人血小板。
實施例2GPVI特異性抗體是膠原誘導的血小板聚集和粘著的有效抑制劑在靜止和流動條件下測試按照實施例1製備的Fab片段對膠原誘導的血小板功能(包括膠原誘導的血小板聚集和血小板對固定膠原的粘著)的抑制潛力。
如下測試抗體的體外血小板聚集。由於膠原應答在個體間存在差異，首先進行膠原劑量實驗以確定在加入後5分鐘內給出70％-90％血小板聚集的膠原量。此外，測定中使用的膠原類型可能顯著影響應答。從經驗看，酸不溶性馬腱膠原(Nycomed，Germany)提供最強的血小板聚集應答。Nieswandt (J.Biol.Chem.27523998-24002，2000和U.S.專利出版物No.2002/0141992)、Lecut等(J.Thrombosis and Haemostasis 12653-2662，2003)和Moroi等(Thromb.Haemost.89996-1003，2003)也使用酸不溶性馬腱膠原，而其他人使用應答較弱的膠原形式，如牛膠原I型纖維(Smethurst等，Blood 103903-911，2004和WO 03/054020)。在下文示例的測定中，用1-4μg/ml酸不溶性馬腱膠原(Nycomed，Germany)檢測特定的Fab製劑對血小板聚集的影響。使用的膠原類型與Qian等(Human Antibodies 1197-105，2002)、WO 01/00810、WO 02/080968及其相關應用中所使用的相同，但如下文所討論的，與Qian，WO 01/00810和WO 02/080968公開的GPVI抗體相比，本發明的GPVI抗體顯示明顯更強的抑制效果。
在1/10體積的3.8％檸檬酸鈉(作為抗凝血劑)中收集血液進行血小板聚集測定(Nakamura等，J.Biol.Chem.273(8)4338-44，1998)。通過室溫下以180xg離心全血15-20分鐘獲得富含血小板血漿(PRP)。在進行血小板聚集研究之前，計數血小板並用貧血小板血漿調整至3-4×108個血小板/ml。所有實驗都在採血後3-4小時內進行，且全程將PRP保持在室溫下。在四通道聚集測定儀AG10(Kowa，Japan)中進行聚集研究，其通過雷射散射測量微粒形成動力學，通過光譜可見區650nm處的光透過測量聚集。加入酸不溶性馬腱膠原(Nycomed，Germany)之前，將PRP與不同量的Fab片段在37℃孵育10分鐘(靜置5分鐘接著攪拌5分鐘)，並再監測聚集5-10分鐘。
使用Nakamura等，J.Biol.Chem.2734338-4334(1998)先前描述的改良方法檢查靜止條件下血小板對膠原的粘著。簡言之，在加入用膠原包被的孔(酸不溶性馬腱膠原，2μg/孔)中之前，先將經洗滌的血小板與所需量的Fab片段在存在和不存在Mg2+的條件下於室溫孵育30分鐘。室溫孵育60-90分鐘後，用緩衝鹽水溫和洗滌去除未粘著的血小板，通過用市售的LDH試劑盒(Promega，MA)測定粘著血小板的LDH含量來量化粘著。
在Glycotech(Rockville，MD)開發的流式小室中測定流動條件下血小板對固定膠原的粘著。在以高剪應力(2600秒-1，2分鐘)通過膠原(5μg/孔的酸不溶性馬腱膠原)(Nycomed，Germany)包被的流式小室之前，先將用重組水蛭素(50單位/ml)抗凝的全血與含有Fab片段的溶液在37℃孵育15分鐘。用磷酸緩衝鹽水洗滌未粘著的血小板，用戊二醛固定粘著的血小板(0.5％，重量/體積，1小時)並用甲苯胺藍/硼酸鈉染色(0.05％，5分鐘)。通過數字影像分析估計血小板表面覆蓋。用來自10個非重疊影像的平均值測定表面面積覆蓋百分比。
在選擇的抗體中，來自四種IgG的Fab片段OM1、OM2、OM3和OM4抑制人血小板由膠原誘導的血小板聚集。參閱表2、3和4。Fab片段對膠原誘導的血小板聚集的抑制效能的順序為OM1＞OM2＞OM3＞OM4。每種抗體抑制膠原誘導的血小板聚集的平均IC50和SD值示於表4。
還測試了每種抗體對大鼠、狗和猴血小板的交叉反應性。猴血和狗血購自Covance Research Inc，Vienna，VA。Sprague Dowley大鼠得自Charles River Laboratories，Willmington，MA。所有四種Fab片段均抑制猴血小板由膠原誘導的聚集。有趣的是，OM4與大鼠血小板交叉反應。這些GPVI特異性抗體是測試GPVI特異性抗體在動物模型中的效應的有用工具。2004年4月29日將產生OM1、OM2、OM3和OM4抗體的雜交瘤分別以ATCC No.PTA-5938、PTA-5939、PTA-5940和PTA-5941保藏於美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA)。
表4抗GPVI Fab片段對人血小板由膠原誘導的聚集的影響和與非人血小板的交叉反應性

*使用來自3個不同受試者的血小板獲得劑量應答曲線。通過非回歸分析計算IC50值。值為3個實驗的平均值±SD。
**與動物血小板的交叉反應性基於各個Fab片段抑制膠原誘導的血小板聚集的能力和FACS分析中的正向右移。(+)符號代表Fab片段抑制膠原誘導的聚集和正向右移，而(-)符號代表兩個測試均無反應。
***未測定。
為進行比較，在與測試GPVI特異性抗體相同的條件下對若干相同供者用ReoPro(Centocor，Inc.)(廣泛使用的人-小鼠嵌合抗GPIIb-IIIaFab片段)和抗GPIIb-IIIb單克隆抗體7E3(Colter和Scudder，Blood661456-1459，1985)的F(ab′)2片段進行測試。ReoPro以1.71μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。因此OM1具有比ReoPro更強的抑制潛力，而OM2與ReoPro等效。在此測定中ReoPro比OM3和OM4有效2-4倍。7E3 F(ab′)2與大鼠血小板交叉反應，而ReoPro則不然(見表4)。
還測試了靜止條件下Fab片段對血小板粘著的影響。在存在(GPIa-IIa及GPVI依賴性)及不存在Mg2+(GPVI依賴性)的情況下下進行粘著。非Mg2+依賴性粘著僅依賴於GPVI的存在，並被相對低濃度(IC50範圍0.1-1μg/ml)的全部四種Fab抑制，如圖2所示。OM1、OM2和OM3具有相似的抑制活性(IC50範圍0.1-0.2μg/ml)而OM4達到相似的抑制則需要稍高的劑量(IC50範圍0.2-1μg/ml)。與非Mg2+依賴性粘著過程所需的Fab片段相比，Mg2+依賴性粘著需要相對較高劑量的Fab片段(見圖2)。然而，Fab均不能完全阻斷血小板對膠原的Mg2+依賴性粘著。
使用更低的劑量(0.001-1μg Fab/ml)重複靜止條件下Fab片段對非Mg2+依賴性血小板粘著的影響。如圖3所示，0.1μg Fab/ml的OM2和OM4 Fab片段抑制40％-60％的血小板粘著，而相同濃度的OM1和OM3 Fab片段抑制10％-20％的血小板粘著。這一偏差可能是由於批次差異和供體的差別。總之，OM系列Fab片段以低於0.5μg/ml的濃度有效抑制GPVI依賴性(非Mg2+依賴性)粘著。
還在接近體內情況的條件下如上述測試了抗GPVI Fab片段對血小板粘著的抑制效應。在高剪應力條件下(2600秒-1)，OM1、OM2、OM3、OM4的Fab片段顯著抑制血小板對固定膠原的粘著。與對照樣品相比，抗GPVI Fab誘導聚集物大小和形態的顯著改變(圖4)。作為比較，ReoPro(Centocor，Inc.)也阻止聚集物形成，但在膠原纖維上觀察到了單個血小板的均一層(圖4)。
聚集物的形態是兩個事件的結果(1)血小板原始單層覆蓋的區域和(2)其後的聚集物形成(從而給總體情況加入體積量綱)。聚集物形成的顯著減少與抗GPVI Fab的表面覆蓋一起提示GPVI不僅涉及原始粘著過程，而且在粘著後事件(包括血小板活化和其後的血栓生長)中發揮重要作用。
聚集和粘著測定證明本發明GPVI特異性抗體的Fab片段如OM1、OM2、OM3和OM4是血小板功能的有效抑制劑。它們在抑制膠原誘導的血小板聚集上比小鼠單克隆抗體9O12.2更有效，後者產生自用編碼重組可溶性GPVI-Fc(rsGPVI-Fc)融合蛋白的cDNA免疫的小鼠，如Lucet等(J.Thrombosis and Haemostasis 12653-2662，2003)、WO 02/80968和US專利出版物2004/0253236所述。另外，OM抗體在抑制對膠原的非Mg2+依賴性粘著上比9O12.2Fab片段更有效。
Nieswandt(J.Biol.Chem.27523998-24002，2000和U.S.專利出版物No.2002/0141992)報導了針對小鼠GPVI的大鼠單克隆抗體JAQ1。然而飽和濃度的JAQ1(20μg/ml)僅對膠原誘導的血小板聚集顯示有限的抑制效應(參閱U.S.專利出版物2002/0141992，第29段)。此外，在我們或其他人的實驗中，在FACS分析或Western印跡中JAQ1不識別人GPVI(參閱Takayama等，J.Thrombosis and Hemostasis 1475-81，2003)。
其他人已經產生了單鏈Fv(ScFv)。例如，Qian等(Human Antibodies1197-105，2002)報導了GPVI的單鏈Fv(ScFv)抗體，其在使用2μg/ml與本發明所使用的相同膠原進行的膠原誘導血小板聚集研究中IC50為80-90μg/ml。因此與Qian等相比，本發明的GPVI特異性抗體在抑制膠原誘導的血小板聚集上顯著地更有效。與本發明的GPVI特異性抗體相比，還報導於WO 01/00810、WO 02/80968及其相關出版物的ScFv需要顯著更高的濃度(110-150μg/ml ScFv)來抑制膠原誘導的血小板聚集。
類似的，Smethurst等(Blood 103903-911，2004和WO 03/054020)報導了在膠原誘導的血小板聚集中IC50為12-16μg/ml的GPVI ScFv抗體。比較而言，OM1、OM2、OM3和OM4比Smethurt的ScFv更有效。另外，儘管U.S.專利No.6,245,527和6,383,779公開了抗GPVI抗體，但他們未提供在抑制膠原誘導的血小板聚集上與本發明的抗體同樣有效的抗GPVI抗體的任何實例。
實施例3GPVI特異性抗體抑制膠原誘導的分泌和血栓烷A2形成還測試了本發明GPVI特異性抗體Fab片段對膠原誘導的分泌和血栓烷A2(TXA2)形成的影響。分泌指由激動劑誘導的從血小板的α和緻密顆粒釋放生物活性內含物。
量化由激動劑誘導的釋放的一種方法是使用化學發光方法通過螢光素酶測定來測量培養基中的ATP含量。使用生物發光聚集測定儀(Chronolog Corporation，PA)和螢光素酶-螢光素試劑對富含血小板血漿(PRP)測試膠原誘導的ATP分泌。生物發光聚集測定儀同時測定激動劑誘導的血小板聚集和ATP分泌。簡言之，用注射器將人血直接抽到3.8％檸檬酸鈉中(9∶1體積的血∶檸檬酸鹽)。通過在180xg離心15分鐘製備富含血小板血漿(PRP)。將PRP(360μl)與40μl螢光素酶-螢光素試劑(Chrono-lume；Chronolog Corporation，PA)混合併將混合物與不同量的測試Fab、ReoPro或對照在37℃孵育5分鐘。5分鐘時加入1-4μg/ml膠原(酸不溶性馬腱膠原)(Nycomed，Germany)並監測聚集和ATP分泌，持續8分鐘。反應的最後(10-11分鐘)加入已知量的ATP溶液以獲得偏轉量(deflection)，其用於計算激動劑激發後血小板分泌的ATP量。
在上文使用的平行樣品中測定血栓烷A2形成。上文加入膠原步驟10分鐘後，在200μL PRP中加入500μL終止液(130mM NaCl中的50mMEDTA，2mM Indomethacin)以終止血栓烷A2形成。將懸液在4℃以1000xg離心10分鐘。保留上清液並凍於-20℃至進行血栓烷B2測試，血栓烷B2為血栓烷A2的穩定代謝物。使用市售的試劑盒(血栓烷B2Biotrak測定，Amersham)定量血栓烷B2。
OM1、OM2、OM3和OM4抗體的全部Fab片段均有效抑制膠原誘導的人血小板ATP釋放(表5)。1μg/mL的OM1顯示高於90％的抑制，3μg/mL OM2、OM3和OM4也得到高於90％的抑制。ReoPro在抑制ATP分泌上比抗GPVI抗體效率低，提示抗GPVI Fab是膠原誘導的ATP釋放的更好的抑制劑。已知血小板釋放的次級激動劑協同血栓生長。因此，膠原誘導分泌的抑制劑(如本發明的GPVI特異性抗體)是血栓生長的有效抑制劑。
表5抗GPVI Fab片段對人血小板受膠原誘導的ATP釋放的影響*


*結果得自四個不同的血小板供者膠原誘導的血栓烷A2產生也被OM1、OM2、OM3和OM4 Fab片段(表6)強烈抑制。在測試的四種Fab片段中，1μg/mL的OM1顯示高於90％的抑制。3μg/mL的OM2和OM3也得到高於90％的抑制。3μg/mL的OM4抑制血栓烷A2形成的約86％。相反，1μg/mL和3μg/mL的ReoPro對血栓烷A2形成的抑制效應很低或無抑制效應。還顯示阻斷GPVI抑制TXA2的產生和粘著於膠原的血小板上活化的IIb-IIIa複合物的表達(Nakamura等，J.Biol.Chem.2734338，1998；Nakamura等，J.Biol.Chem.27411879，1999)。因此，抗GPVI Fab片段抑制TXA2產生提示本發明的GPVI特異性抗體抑制引起活化的IIb-IIIa複合物表達的上遊信號事件，並最終減弱血栓生長。
表6-抗GPVI抗體Fab片段對人血小板中膠原誘導的血栓烷A2形成的影響*


*使用來自四個不同供者的血小板得到結果實施例4抗GPVI抗體Fab片段與GPVI的結合親和力和反應性按照Fujimura等Thromb Haemost 87728-34(2002)的方法測定結合親和力。按照lodo珠方法(Pierce，IL)由未標記的IgG製備結合親和力測定中使用的125I標記抗體。簡言之，將一個lodo珠在含有0.5mCi無載體Na125I(Amersham)碘化緩衝液中浸泡5分鐘，接著加入候選IgG(100μg)。室溫孵育5分鐘後，將反應混合物應用於PD10柱(Amersham)以將與125I結合的IgG從游離碘中分開。從柱上洗脫含有125I-IgG的級分，用小體積(1μl)進行TCA沉澱。在γ計數器中對沉澱物和得到的上清液計數，以定量IgG中摻入的125I。混合沉澱中具有最高計數的級分(＜95％)並在分光光度計中在280nm處讀數以測定蛋白質濃度。在γ計數器中對已知體積進行重新計數，以獲得標記IgG的比活性。多種抗體的比活性範圍在0.33-0.97μCi/ug IgG。
通過將經洗滌的人血小板(5×108/ml)與1nM125I-IgG在存在和不存在多種濃度的未標記同源IgG(0-500nM)的情況下孵育1小時來測定結合親和力。通過將混合物在BSA(鹽水中的10％溶液)溶液上分層和在15000×g離心10分鐘將游離和結合的放射性分開。小心去除上清液和BSA層後，切去管子的尖頭並在γ計數器中計數沉澱物的放射性。產生八到十個三次重複點的競爭結合等溫線以評估單個IgG的結合。使用非線性回歸分析軟體Prism(GraphPad Software Inc.CA)分析數據。
結合親和力實驗顯示全部四種抗體都易於與血小板結合，親和力範圍0.7-1.7nM(表7)。將本發明抗體與本領域已報導抗體的結合親和力進行比較ReoPro(Kd＝6.25±2.6×10-9M)(來自Sassoli等ThrombHaemost 85868-902，2001)，scFv-10B12(Kd＝7.9×10-7M)(來自Smethurst等，Blood 103903-91，2004)和9O12.2-IgG(Kd＝18×10-9M)(來自WO02/080968)。ReoPro和scFv-10B12為一價片段，而此實施例中使用的OM系列和9O12.2為IgG。全部四種OM抗體以比ReoPro、scFv-10B12和9O12.2-IgG已報導更高的親和力與人血小板結合(表7)。一價片段一般具有比其相應完整IgG多少有所降低的親和力，然而，該降低預計並不顯著。
表7.抗GPVI抗體的結合親和力

OM系列抗體的結合研究來自使用不同個體血小板的單次實驗。每個數據點以一式三份進行實驗。
*數據來自Sassoli等Thromb Haemost 85868-902，2001。
**數據來自Smethurst等，Blood 103903-91，2004。10B12是由噬菌體展示方法得到的針對GPVI的人特異性scFv抗體。
***數據來自WO 02/080968。9O12.2是單克隆抗GPVI抗體。
進行Western印跡分析以測定OM系列抗體對來自多個物種的GPVI的反應性。將來自多個物種的血小板(1×108/ml)溶於含有EDTA、EGTA、PMSF和NEM(各1mM)的2％SDS中。在4-20％預製Tris-甘氨酸梯度小型凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分開蛋白質，並將分開的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(Invitrogen，Carlsbad CA)上。切下單個泳道並用TBS-T(10mM Tris.HCl pH 7.4、150mM NaCl和0.5％Tween 20)中的5％脫脂乳封閉60分鐘。將硝酸纖維素條與OM抗體(2μg/ml)或生物素化的驚厥素在4℃孵育過夜。用TBS-T粗洗膜，並用綴合HRP的山羊抗小鼠IgG(OM1、OM2和OM4)、綴合HRP的山羊抗倉鼠IgG(OM3)或鏈黴抗生物素-HRP(生物素化驚厥素)於室溫標記探針1小時。用遠過量的TBS-T洗膜三次。用增強化學發光檢測系統(ECL-Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)使免疫反應性條帶顯像。
在免疫印跡中，全部四種OM抗體均與來自人血小板的變性GPVI反應(圖5)。用猴血小板也觀察到類似的反應性(印跡未顯示)。抗體均不與小鼠、豬、狗、兔或豚鼠血小板反應。僅OM4與大鼠血小板裂解液陽性反應。這些數據顯示全部四種OM系列抗體都識別來自人和猴的GPVI，而OM4另外還識別大鼠血小板的GPVI。
實施例5互補性決定區(CDR)測定了OM1、OM2、OM3和OM4的互補性決定區(CDR)序列。
使用TRIzol(Invitrogen)從OM1、OM2、OM3和OM4雜交瘤分離總RNA。使用隨機引物用Superscript First-Strand System(Invitrogen)合成cDNA。接著使用Heavy Primers或Light Primers混合物(Amersham)通過用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的聚合酶鏈式反應擴增抗體可變區相應的DNA序列。將擴增的DNA連接進pCR4-TOPO載體(Invitrogen)，並使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將得到的構建體轉化進化學感受態細胞。在卡那黴素存在下培養轉化細胞並用E.Z.N.A.Plasmid Miniprep KitII(Omega Bio-tek)分離擴增質粒。使用ABI PRISMBigDye Terminator v3.1循環測序試劑盒(Applied Biosystems)在ABIPRISM 310遺傳分析儀上對插入DNA進行測序。使用OMIGA 2.0軟體(Oxford Molecular)分析DNA序列並轉換為胺基酸序列。
OM1、OM2、OM3和OM4的CDR示於表8。
表8抗GPVI抗體的CDR序列OM1H1SYWMN(SEQIDNO1)H2MIHPSDSETTLNQKFKD(SEQ ID NO2)H3DDYYDSSSHALDY(SEQ ID NO3)L1RASQSVSTSTYSYIY(SEQ ID NO4)L2FASYLES(SEQ ID NO5)L3QHIWEIPWTF(SEQ ID NO6)
OM2H1DHYIS(SEQ ID NO7)H2WIYPGYGNIRYNEKFKG(SEQ ID NO8)H3SADGYFRYFDV(SEQ ID NO9)L1RASGNIHNYLA(SEQ ID NO10)L2NSEILAD(SEQIDNO11)L3QHFWTAPFTF(SEQ ID NO12)OM3H1DFYMN(SEQ ID NO13)H2SISGGSSDIKYADVVKG(SEQ ID NO14)H3WGDHWDLDY(SEQ ID NO15)L1QASQNIGNELN(SEQIDNO16)L2GASSLYP(SEQ ID NO17)L3KQDLNYPITF(SEQ ID NO18)OM4H1SFGMH(SEQIDNO19)H2FISSGSSTIYYADIVKG(SEQ ID NO20)H3SGYANAMDY(SEQIDNO21)L1KASQDVSPAVT(SEQ ID NO22)L2WASTRHT(SEQ ID NO23)
L3QQHYSFPWTF(SEQ ID NO24)實施例6GPVI和血栓形成在先前的研究中使用GPVI缺失或FcRγ-KO/GPVI缺陷型小鼠顯示了GPVI在血栓形成中的作用(Nieswandt等，The EMBO Journal202120-2130(2001))。GPVI缺失和FcRγ-KO/GPVI缺陷型小鼠均缺少FcRγ鏈。在此實施例中，使用不缺少FcRγ鏈的GPVI-KO小鼠證實了GPVI與血栓形成的關係。
如上文所述產生GPVI敲除小鼠。這些小鼠的血小板不能應答於高劑量的膠原(20μg/ml)和GPVI特異性激動劑——驚厥素(3μg/ml)，但正常應答於ADP(5μM)(圖6)。雜合GPVI缺陷型小鼠產生與野生型相比一半量的GPVI，對膠原和驚厥素顯示降低的應答，但提高激動劑劑量後觀察到正常應答(圖6)。這些觀察證實了GPVI作為血小板表面主要膠原受體的作用。
首先通過共注射膠原-腎上腺素(一般誘導致死性肺血栓栓塞症)測試GPVI在血栓形成和體內穩態中的作用(見表9)。用氯胺酮/甲苯噻嗪(150/15mg/kg，IP)麻醉小鼠，在右頸靜脈中注射膠原和腎上腺素混合物(800/60μg/kg)。然後觀察動物15分鐘並按如下歸類(a)動物在注射10分鐘內死亡，和(b)存活動物顯示暫時性呼吸困難，在10分鐘內緩解。縫合存活動物的手術創傷並將動物歸還動物實驗室。約83％(18個中的15個)的GPVI野生型小鼠在注射後5分鐘內死亡。所有的雜合GPVI缺陷型小鼠(18個中的18個)在注射後5分鐘內死亡。與野生型和雜合動物相反，約55％的GPVI-KO小鼠(純合)在膠原和腎上腺素的致死性注射後存活，提示GPVI在膠原注射誘導的肺血栓栓塞症中發揮重要作用。
表9.GPVI在肺血栓栓塞症中的作用

如表10所示，GPVI敲除小鼠與野生型和雜合小鼠具有基本相同的尾出血時間。將GPVI敲除小鼠的出血時間與敲除β3整合素的小鼠進行了比較，β3整合素也見於血小板上並於血小板聚集和血栓形成相關(Kairbaan等，J.Clin.Invest.103229-238，1999)。與GPVI缺陷型小鼠相反，純合β3敲除小鼠持續出血。因此，由於不明顯影響出血時間(因為GPVI敲除小鼠的出血時間與野生型相似)，體內施用抗GPVI Fab片段可能更安全。
表10野生型、雜合和純合小鼠的尾出血時間與β3敲除小鼠比較

*J Clin Invest 103229，1999**與野生型和雜合小鼠差異顯著。多數情況下不得不人工止血以防止死亡。
為進一步證實GPVI在血栓形成中的作用，以2600秒-1的剪應力將來自野生型、雜合和GPVI-KO小鼠的全血灌注到包被I型膠原的蓋玻片上。來自GPVI-KO小鼠的血小板不能粘著於膠原纖維，而來自野生型和GPVI雜合小鼠的血小板粘著於膠原纖維並形成大血栓。在野生型和GPVI雜合小鼠間在表面覆蓋度和血栓形態上沒有差異。
實施例7短尾猴中OM2 Fab片段對離體膠原誘導的血小板聚集和皮膚出血時間的影響劑量升級研究由於在使用短尾猴血小板的體外膠原誘導的血小板聚集測定中在OM抗體中顯示出最強的抑制效果，因此進一步評估了OM2 Fab片段。使用提高的劑量通過靜脈注射對短尾猴施用OM2 Fab片段，並評估其對離體膠原誘導的血小板聚集和皮膚出血時間的影響。以類似方式測試ReoPro。
吸入麻醉後，以1小時間隔將OM2 Fab片段或ReoPro靜脈注射到前臂頭靜脈中。在每次注射後30分鐘，採血用於測定膠原誘導的血小板聚集。通過將用檸檬酸鈉抗凝的血連續離心製備富含血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。採血後1小時通過比濁法測定血小板聚集。取決於來自每隻猴的血小板的應答性，用於誘導血小板聚集的膠原濃度在5至20μg/mL之間。每次注射抗體後30分鐘，通過用帶子以40mmHg縛緊前臂肌肉並用Triplett出血時間設備(Helena Laboratory)割破皮膚測定皮膚出血時間。用濾紙吸收傷口流出的血並測定出血時間直至出血停止或1800秒後。使用累積劑量的抗體評估抗體的效應。
OM2 Fab片段對膠原誘導的血小板聚集顯示劑量依賴性抑制效應(圖8)。在0.2mg/kg或更高的累積劑量下，OM2 Fab片段抑制超過80％的血小板聚集。
ReoPro在膠原誘導的血小板聚集上也顯示出劑量依賴性抑制效應(圖8)，但以0.35mg/kg或更高的累積劑量抑制超過80％的血小板聚集。
0.8mg/kg累積劑量的OM2 Fab片段僅輕微延長皮膚出血時間(基線值的2.4倍)(圖9)。儘管OM2 Fab片段在18.8mg/kg累積劑量為時輕微延長出血時間，但出血時間沒有超過0.8mg/kg時所觀察到的出血時間。
相反，ReoPro顯著延長皮膚出血時間(圖9)。在0.35mg/kg的累積劑量下，平均出血時間比基線值延長5倍。此外，ReoPro造成的出血時間延長是劑量依賴性的。在1.55mg/kg累積劑量下，出血時間比基線水平延長9.5倍。
總之，OM2 Fab對離體膠原誘導的血小板聚集顯示與ReoPro等效的抑制效應。然而，OM2 Fab片段對皮膚出血時間的影響比ReoPro輕微許多。這些結果提示與GPIIb/IIIa阻斷相比，阻斷GPVI具有更好的風險/收益比，因此可能更適於臨床治療。另外，以0.4和0.8mg/kg施用ReoPro後，一隻猴的注射位點出現紅斑。儘管此斑在數天後消失，但是在施用OM2 Fab後卻未觀察到異常。
藥物動力學研究靜脈團注後，在三隻短尾猴中評估OM2 Fab片段對離體膠原誘導的血小板聚集和皮膚出血時間的影響隨時間的變化。類似地評估了ReoPro的影響的變化。
此研究選擇的0.4mg/kg劑量，因為OM2 Fab片段和ReoPro分別以0.2mg/kg和0.35mg/kg抑制離體膠原誘導的血小板聚集。將抗體靜脈團注進前臂頭靜脈後，在1、2、3、6和24小時採血。如上文劑量升級研究中所述，在每次採血1小時後測定血小板聚集。取決於每隻猴的血小板的應答性，此研究中用於誘導血小板聚集的膠原濃度為5或10μg/mL。出血時間的測定也如上文劑量升級研究中所述在每次施用抗體後1、2、3、6和24小時進行。
在每次給藥後1、2、3和6小時，以0.4mg/kg注射的OM2 Fab片段抑制離體膠原誘導的血小板聚集超過80％(圖10)。注射24小時後，血小板聚集恢復到接近基線水平。
類似的，給藥後1和2小時，以0.4mg/kg注射的ReoPro抑制離體膠原誘導的血小板聚集超過80％(圖10)。然而，與OM2 Fab片段相反，血小板聚集以時間依賴性方式恢復給藥後3小時抑制73％、6小時抑制47％，24小時為6％。
如圖11所示，OM2 Fab在給藥後1至6小時之間輕微延長皮膚出血時間(比基線水平長1.7到2.0倍)。出血時間在注射24小時後回到接近基線水平，與血小板聚集的恢復一致。
相反，ReoPro在給藥1小時後顯著延長出血時間(比基線水平長10.7倍)(圖11)。出血時間的延長以時間依賴性方式減弱。
這些結果顯示OM2 Fab片段在血小板聚集上的抑制半衰期比ReoPro長。此外，這些結果再次提示OM2 Fab片段的風險/收益比優於ReoPro。
實施例8OM4 Fab片段對大鼠中離體膠原誘導的血小板聚集、出血時間和血小板計數的影響另外測試了OM4 Fab片段對離體膠原誘導的血小板聚集、尾和趾甲出血時間的影響。為進行比較，以類似的方式測試7E3 F(ab′)2片段，7E3F(ab′)2來自已建立的針對人血小板糖蛋白複合物GPIIb/IIIa產生的小鼠抗體(Collar等J.Clin Invest.72325-338，1983)。從使用得自ATCC的7E3雜交瘤的大量培養物獲得7E3 IgG。如Collar等J.Clin Invest.72325-338，1983所述製備F(ab′)2片段。在使用大鼠進行的初步研究中，OM4Fab和7E3 F(ab′)2的最佳劑量分別測定為20 mg/kg和10mg/kg。離體膠原誘導的血小板聚集被OM4 Fab保持抑制30分鐘，其後抑制在60-90分鐘消除，提示OM4 Fab在大鼠中的快速清除。所有的觀察在施用載體、測試和參照抗體20分鐘後進行。
用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉成年雄性Sprague-Dawley大鼠。將填充肝素的導管插入股靜脈、股動脈和頸動脈用於給藥，分別記錄血壓/心率並採血。平衡期後，從頸動脈抽出少量血樣(～1.2mL，用10U/mL肝素抗凝)用於血小板計數測定。使用全血聚集測定儀(Chrono-log，Havertown，PA)測定1μg/mL膠原引發的血小板聚集程度。還通過以下方法測定趾甲出血時間在分開趾甲腹的點切去一個後肢趾甲，並每15秒用將血吸收到一片濾紙上(不接觸甲切口表面)。甲出血時間定義為切斷趾甲和不再有血吸收到濾紙上的時間點之間所經過的時間。
將載體、OM4 Fab或7E3 F(ab′)2施用於股靜脈。20分鐘後，如上述抽取第二個血樣用於聚集測定儀和血小板計數測定。抽取最後的樣品後立即測定趾甲和尾出血時間。通過用鋒利的手術刀片去除尾末端的3mm並將尾末端的2-3cm浸入37℃鹽水中來測定尾出血時間。尾出血時間定義為切斷尾和尾切口表面不再流血的時間點之間所經過的時間。每組(載體、OM4 Fab片段和7E3 F(ab′)2)使用六隻大鼠。
與載體相比，OM4 Fab和7E3 F(ab′)2片段都在施用抗體片段20分鐘後對血小板聚集產生統計學顯著程度的抑制(P＜0.05)(圖12)。儘管OM4 Fab組的波動性稍高，抑制是高度可再現的。靜脈施用載體、OM4Fab和7E3 F(ab′)2片段化合物後，血壓和體中心溫度無變化。
施用7E3 F(ab′)2片段顯著延長趾甲出血時間，而施用OM4 Fab對六隻測試動物中的四隻無影響(圖13A)。在兩隻動物中，施用OM4 Fab使趾甲出血時間延長到26和31分鐘。相反，除了一隻趾甲出血在18分鐘停止以外，7E3 F(ab′)2片段在所有情況下都使趾甲出血時間延長超過30分鐘(圖13A)。學生t檢驗指出，接受7E3 F(ab′)2片段的動物的平均趾甲出血時間顯著長於OM4 Fab和載體組。與載體相比，OM4 Fab未誘導任何趾甲出血時間的顯著延長。
與趾甲出血時間相似，施用7E3 F(ab′)2片段的所有動物的尾出血時間顯著延長，而施用OM4 Fab對六隻測試動物中的四隻無影響(圖13B)。在兩隻動物中，尾出血時間延長至26和＞30分鐘。相反，7E3 F(ab′)2片段在所有情況下都使尾出血時間延長超過30分鐘(圖13B)。靜脈施用載體、OM4 Fab和7E3 F(ab′)2片段對血小板聚集無顯著影響(圖14)。
從此研究中得到的數據清楚地顯示OM4 Fab(20mg/kg)和7E3F(ab′)2片段(10mg/kg)對膠原誘導的血小板聚集引發相似程度的抑制，但7E3 F(ab′)2片段顯著延長出血時間。OM4 Fab抑制血小板功能而不顯著影響出血時間的能力提示其可能有益於治療。OM4 Fab可以提供與目前可用的血小板抑制劑相似的正效益而沒有其不利的出血副作用。
實施例9OM4 Fab片段在大鼠動脈血栓形成模型中的效應還在大鼠體內動脈血栓形成模型中研究了OM4 Fab片段的效應。儘管文獻中已經報導了體內血栓形成的多種模型，但由Folts(參閱如Circulation 83(6 Suppl)IV 3-14，1991)開發的模型被廣泛用於測試抗血栓劑的效力。此原始模型開發於犬冠狀動脈，但為了此研究修改模型用於大鼠頸動脈測試。簡言之，機械損傷頸動脈，其後使其狹窄。血管損傷和使血管變窄(模擬血栓形成的發病機制即動脈硬化和狹窄的兩種條件)的組合引起血栓形成。可以分別通過去除和替換血管阻塞物機械去除和重新形成血栓。這引起下文更詳細討論的循環血流減少(CFR)。抗血栓劑可以減少CFR數或完全防止形成CFR。
用戊巴比妥(50mg/kg，腹膜內注射)麻醉大鼠並通過氣管插管機械透氣。切開股靜脈的一段用於藥物注射。通過腹側頸正中切口並剝離結締組織來暴露頸動脈。將小流量探測器(Transonic，1 RB，Transonic SystemsInc.，Ithaca，NY)置於動脈遠端測量血流量。使用兩種條件誘導血栓形成。第一種用合上棘輪的持針鉗在中央暴露的動脈上每次10秒的三個連續十字鉗閉產生損傷。第二種通過吹起血管阻塞物(1.5mm內徑，In VivoMetric，Healdsburg，CA)減少基線血流量的50％，所述阻塞物由置於損傷位點的C形氣球組成。由於形成血栓，血流量在2-5分鐘內逐漸降到0。通過給氣球放氣物理移除血栓，血流量立即恢復。當減少50％血流量後，血流量減少到0和血流量恢復時計為1個CFR。重新減少50％血流量後，血流量再次逐漸降低，由於形成新的血栓而引起下一次CFR。計數30分鐘觀察期內的CFR數。將數目轉換為半周期。
在損傷前組中，在應用機械損傷之前2分鐘靜脈團注20mg/kg的鹽水或OM4 Fab片段。記錄30分鐘的CFR。
在損傷後組中，通過內皮損傷和減少50％流量引發CFR。觀察CFR15分鐘，接著靜脈團注20mg/kg的載體或OM4 Fab片段。記錄30分鐘的CFR。
用不成對t檢驗比較鹽水和OM4損傷前和損傷後組中的CFR數。P＜0.05則認為是顯著的。
損傷前組機械損傷前注射的20mg/kg的OM4 Fab片段使CFR數從10.5±4.1(平均值±SD)降低到4.1±5.2(圖15A)。此降低具有統計學意義(p＜0.02，t檢驗)。
損傷後組建立CFR後注射的20mg/kg OM4 Fab片段也使CFR從12.2±3.8降低到3.5±3.6(圖15B)。這一降低也具有統計學意義(p＜0.003，t檢驗)。此結果證明OM4 Fab片段甚至在血小板和內皮下膠原間已開始相互作用之後仍能抑制血栓形成。此外，這些結果提示抗GPVI抗體能有效抑制由內皮損傷/血流量擾動(被提出是臨床症狀中血栓疾病的觸發機制)誘導的體內動脈血栓形成。
實施例10GPVI佔據率與對膠原誘導的血小板聚集的抑制之間的關係研究了體外人血小板中血小板表面GPVI佔據率和生物素化OM4Fab片段對膠原誘導的血小板聚集的抑制效應之間的關係。
用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)將OM4 Fab片段生物素化。將生物素溶液(150μL，10mg/mL，溶於蒸餾水)加入PBS中的OM4 Fab片段溶液(5mg，2mg/mL)中。將反應試管在冰上孵育2小時。為了去除游離的生物素，在冷室中將反應混合物用鹽水透析過夜。
從三個健康供體採血(含1/10體積的3.8％檸檬酸鈉抗凝血劑)，並通過室溫180xg離心15分鐘獲得富含血小板血漿(PRP)。計數血小板並用貧血小板血漿調整至3×108個血小板/mL。在採血4小時內進行聚集測量。在AG10聚集測定儀(Kowa，Japan)中進行聚集研究。在加入膠原前，將PRP與生物素化的OM4 Fab片段(0、0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、10和20μg/mL)在37℃孵育10分鐘並再監測聚集5-10分鐘。在評估抗體之前對每個供體測定誘導70％-90％聚集所需的膠原量。
將PRP(3×108個血小板/mL，每份400μL)與生物素化OM4 Fab片段(0、0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、10和20μg/mL)在室溫下孵育10分鐘。然後按以下製備經洗滌的血小板。在PRP中補充1μg/mL PGE1、1mM EDTA和EGTA並以2000xg離心10分鐘。棄去血漿後，將血小板沉澱物懸於血小板洗滌緩衝液(PWB補充了1mM EDTA和EGTA、0.1％NaN3、100ng/mL PGE1和0.35％BSA的磷酸緩衝鹽水，pH 7.4)。接著離心血小板並再次洗滌。將經洗滌的血小板懸於小體積PWB中並計數血小板。最後，通過與等體積含有1％Triton X-100的磷酸緩衝鹽水混合來溶解經洗滌血小板(1×108個血小板/mL)。
使用鏈黴抗生物素(Pierce，21125)作為俘獲試劑、山羊抗小鼠IgG抗體-HRP(American Qualex，A106PU)作為檢測試劑，通過ELISA方法定量生物素化的OM4 Fab片段。
在全部三個供體中，膠原誘導的血小板聚集被3μg/mL濃度的生物素化OM4 Fab片段抑制超過75％。
在佔據率測定中，假定20μg/ml生物素化OM2 Fab片段(結合量26.4±5.5ng/5×107個血小板)下佔據率為100％。如圖16所示，結合OM2 Fab片段的量在3μg/mL時飽和(24.3±3.5ng/5×107個血小板)。3μg/mL時生物素化OM2 Fab片段的佔據率為92％。此結果提示發揮對膠原誘導的血小板聚集最大的抑制效果需要血小板表面GPVI超過90％的佔據率。
總之，本發明的GPVI特異性抗體可能是有用的抗血栓劑。如上文所證明，GPVI特異性抗體是膠原誘導的血小板功能的有效抑制劑。
根據本說明書中所引用參考文獻的教導可以最徹底的理解本說明書，所述參考文獻全部以其整體引入本文為參考。參考本文公開的說明書和實踐，本發明的其他實施方案對本領域技術人員而言是顯而易見的。說明和實施例旨在僅作為示例，本發明的實際範圍和精神由以下的權利要求書指出。
PCT/RO/134表

與保藏的微生物或其它生物材料有關的聲名(PCT細則第13條之2)


與保藏的微生物或其它生物材料有關的聲名(PCT細則第13條之2)


與保藏的微生物或其它生物材料有關的聲名(PCT細則第13條之2)


與保藏的微生物或其它生物材料有關的聲名(PCT細則第13條之2)

權利要求
1.對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體，其中單克隆抗體以低於7μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集，且其中單克隆抗體以低於10-8M的Kd與GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。
2.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體以低於3μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。
3.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體以低於1μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。
4.權利要求1-3中任一項的單克隆抗體，所述單克隆抗體含有選自以下的活性抗體片段化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
5.權利要求4的單克隆抗體，其中肽含有選自SEQ ID NO1-24或它們的變體的至少一個CDR。
6.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體為IgG。
7.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體與人GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。
8.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體選自OM1、OM2、OM3和OM4。
9.權利要求1的單克隆抗體，其中單克隆抗體以低於或等於1μg/ml的IC50抑制非Mg2+依賴性膠原誘導的血小板粘著。
10.權利要求9的單克隆抗體，其中單克隆抗體以低於或等於0.1μg/ml的IC50抑制非Mg2+依賴性膠原誘導的血小板粘著。
11.權利要求9或10的單克隆抗體，所述單克隆抗體含有選自以下的活性抗體片段化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
12.權利要求11的單克隆抗體，其中肽含有選自SEQ ID NO1-24或它們的變體的至少一個CDR。
13.選自OM1、OM2、OM3和OM4的單克隆抗體。
14.產生對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體的方法，所述方法包括用GPVI抗原免疫GPVI缺陷型宿主並收穫單克隆抗體。
15.權利要求14的方法，其中單克隆抗體含有選自以下的活性抗體片段化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
16.權利要求14的方法，其中GPVI抗原包括天然GPVI多肽、肽或其天然存在變體、重組GPVI多肽、肽或其天然存在變體、表達GPVI多肽、肽或其天然存在變體的細胞、編碼GPVI多肽、肽或其天然存在變體的核酸或它們的組合。
17.權利要求14的方法，其中GPVI缺陷型宿主為GPVI敲除宿主。
18.權利要求14的方法，其中單克隆抗體以低於7μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。
19.權利要求14的方法，其中單克隆抗體以低於3μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。
20.權利要求14的方法，其中單克隆抗體以低於1μg/ml的IC50抑制膠原誘導的血小板聚集。
21.權利要求14的方法，其中單克隆抗體以低於或等於1μg/ml的IC50抑制非Mg2+依賴性膠原誘導的血小板粘著。
22.權利要求14的方法，其中單克隆抗體以低於或等於0.1μg/ml的IC50抑制非Mg2+依賴性膠原誘導的血小板粘著。
23.根據權利要求14的方法產生的對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的單克隆抗體。
24.權利要求23的單克隆抗體，其中單克隆抗體含有選自以下的活性抗體片段化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
25.權利要求24的單克隆抗體，其中肽含有選自SEQ ID NO1-24或它們的變體的CDR序列。
26.權利要求23的單克隆抗體，其中單克隆抗體為IgG。
27.權利要求23的單克隆抗體，其中單克隆抗體與人GPVI多肽、肽或其天然存在變體特異性結合。
28.抗血栓組合物，所述組合物含有藥物有效劑量的權利要求1、13或23中至少一項的單克隆抗體。
29.製造抗血栓組合物的方法，所述組合物含有混入可藥用賦形劑中的權利要求1、13或23中至少一項的單克隆抗體。
30.治療患者的方法，所述方法包括對患者施用權利要求28的組合物。
31.治療患者的血管疾病的方法，所述方法包括對患者施用權利要求28的組合物，其中該治療抑制血栓形成。
32.抑制血小板聚集的方法，所述方法包括使血小板接觸權利要求28的組合物，其中該組合物抑制血小板聚集。
33.抑制膠原誘導的ATP分泌的方法，所述方法包括使血小板接觸權利要求28的組合物，其中該組合物抑制膠原誘導的ATP分泌。
34.抑制膠原誘導的血栓烷A2形成的方法，所述方法包括使血小板接觸權利要求28的組合物，其中該組合物抑制膠原誘導的血栓烷A2形成。
35.抑制血小板粘著的方法，所述方法包括使血小板接觸權利要求28的組合物，其中該組合物抑制血小板粘著。
36.權利要求35的方法，其中血小板粘著為非Mg2+依賴的。
37.鑑定抗血栓劑的方法，所述方法包括使抗GPVI抗原與權利要求1、13或23的單克隆抗體和測試化合物接觸，並測量單克隆抗體與GPVI抗原結合的抑制。
38.權利要求37的方法，其中單克隆抗體含有選自以下的活性抗體片段化學、酶或重組產生的Fab片段、F(ab)2片段或含有至少一個對GPVI多肽、肽或其天然存在變體具有特異性的互補性決定區(CDR)的肽。
39.權利要求38的方法，其中肽含有選自SEQ ID NO1-24或它們的變體的CDR序列。
40.抗獨特型抗體，其對權利要求1、13或23的單克隆抗體的抗原結合位點具有特異性。
41.產生抗獨特型抗體的方法，所述方法包括用含有權利要求1、13或23的單克隆抗體抗原結合位點的抗原免宿主並收穫抗獨特型抗體。
42.試劑盒，其在容器中含有至少一劑藥物有效量的至少一種權利要求1、13或23的單克隆抗體。
全文摘要
本發明描述了針對血小板膜糖蛋白VI(GPVI)產生的抗體、產生抗GPVI抗體的方法和這些抗體作為研究和免疫治療劑(特別是抗血栓治療劑)的用途。
文檔編號A61K39/395GK1964990SQ200580018695
公開日2007年5月16日 申請日期2005年4月26日 優先權日2004年4月29日
發明者N·N·坦登, 松本豐, 瀧澤久生, 億山慶滋 申請人:大冢製藥株式會社