生物樣品的玻璃化方法

2023-05-29 21:56:51

專利名稱：生物樣品的玻璃化方法
技術領域：
本發明涉及生物樣品玻璃化的方法，這樣在復甦後該生物樣品依然存活。

背景技術：
能夠冷凍保存卵母細胞、胚胎、精子和其它類似的生物樣品，對廣泛應用輔助生殖技術是非常關鍵的。但是，由於這些細胞體積大且卵母細胞和早期胚胎對低溫非常敏感，冷凍技術在多數種類中沒有得到好好發展。
傳統上，用「緩慢冷凍技術」冷凍保存胚胎。低濃度冷凍保護劑和緩慢控制的冷凍速度(一般在0.1℃-0.3℃/分鐘間)使細胞在冷凍過程中緩慢脫水從而防止細胞內形成結晶。基於此，用此種方法冷凍保存卵母細胞、胚胎和其它發育細胞導致轉移後其致孕能力和保孕能力下降。卵母細胞對冷凍保存損傷尤其敏感，因為冷凍期間其中期紡錘體微管的完整性受到破壞。
另一種更重要的冷凍方法依賴於用高濃度冷凍保護劑所形成的玻璃化，迅速冷卻該保護劑時導致玻璃樣狀態形成。然而，該玻璃化技術的缺點在於此類冷凍保護劑對卵母細胞、胚胎和其它脆弱的發育細胞有很大毒性。可通過提高冷凍速率使冷凍保護劑的毒性縮至最小，快速冷凍可通過將位於電鏡格柵或薄壁吸管(straw)(開口的拉伸的吸管)中的卵母細胞直接投放到液氮內來完成。然而，這兩種方法都很麻煩，且胚胎的恢復很成問題。
因此仍需要使生物樣品玻璃化的方法，該方法(應)能使樣品細胞的冷凍速率達最大；在玻璃化和以後的復甦期間保持該樣品的存活，避免樣品遭受機械壓力；並提供簡易操作來進行冷凍保存和復甦。
發明概述 本發明涉及生物樣品玻璃化的方法。根據本發明的方法，使生物樣品直接與冷凍物質接觸。接觸該冷凍物質時，該生物樣品發生玻璃化。已發生玻璃化的生物樣品可貯存一段時間，以後再復甦。復甦後的生物樣品仍存活。根據本發明優選的生物樣品是可發育的細胞。
本發明也涉及生物樣品玻璃化的方法，包括應用轉移工具將該生物樣品置於冷凍物質比如液氮中，這樣使該生物樣品直接接觸該冷凍物質。然後該生物樣品在該轉移工具中發生玻璃化，優選轉移工具是套環。再優選使該轉移工具和生物樣品置於冷凍物質內並轉移到含冷凍物質的容器中。該容器優選是小瓶。然後使含有該冷凍物質、套環和玻璃化生物樣品的小瓶密封並冷凍保存直至再需要此生物樣品之時。
本發明另一方面是在玻璃化之前在冷凍保護劑中處理該生物樣品。
本發明還涉及已發生玻璃化之生物樣品的復甦方法。該復甦方法學包括從其得以冷凍保存的冷凍物質中取出該生物樣品並將該生物樣品置於溫暖的復甦溶液中。該復甦溶液可存在於任何恰當的容器中，優選存在於培養皿或吸管內。
本發明還有一方面是發育細胞玻璃化的方法，其中將一或多個發育細胞直接置於冷凍物質中，這樣每個發育細胞直接接觸該冷凍物質並因此發生玻璃化，其中該發生玻璃化的發育細胞在復甦、培養和移植到恰當的宿主有機體中時受精率與未發生玻璃化的同樣的發育細胞相同。優選地，將該發育細胞置於套環內與冷凍物質接觸。
本發明還涉及哺乳類囊胚或哺乳類分裂期胚胎發生玻璃化的方法，包括將一或多個囊胚或分裂期胚胎直接置於冷凍物質中，這樣每一囊胚直接與該冷凍物質相接觸並因此發生玻璃化，其中至少80％，更優選地，90％玻璃化的囊胚或分裂期胚胎在復甦並，優選在合適的基礎培養基中培養後依然存活。優選地，將該囊胚或分裂期胚胎置於套環內與冷凍物質接觸。
本發明還涉及馬胚胎或豬胚胎玻璃化的方法，包括將一或多個胚胎直接置於冷凍物質中，這樣每個胚胎直接與冷凍物質相接觸並因此發生玻璃化，其中至少25％，更優選地，50％玻璃化胚胎在復甦並，優選在合適的基礎培養基中培養後依然存活。優選將該胚胎置於套環中與冷凍物質接觸。
本發明還涉及生物樣品玻璃化的試劑盒。該試劑盒一般含有敘述生物樣品玻璃化(方法)的說明書，其中將生物樣品直接與冷凍物質相接觸。該試劑盒也包括一種或多種可選成分，包括但不限於，轉移工具，更優選套環、有合適的大小和形狀以便容納該套環和其中的玻璃化樣品的小瓶、基礎培養基、轉移溶液和冷凍保護劑。
本發明還涉及通過本發明的方法發生玻璃化的生物樣品。
附圖簡述


圖1為根據本發明生物樣品玻璃化方法的圖解說明。
詳述 本申請中，全文使用以下術語並根據申請目的定義如下 基礎培養基為培養、操作、運輸或貯存此處的生物樣品而特定生產的固體或液體製品。
冷凍保存在極低溫度下對生物樣品的保存。
可發育細胞有機體的生殖體，具有發育成能夠獨立存在的新有機體個體的能力。可發育細胞包括，但不限於，精子、卵母細胞、胚胎、桑葚胚、囊胚或其它早期胚胎細胞。
直接接觸若生物樣品或含有該生物樣品的培養基、溶液或物質的大多數表面與冷凍物質直接接觸的話，則該生物樣品，包括囊胚和胚胎，與該冷凍物質「直接接觸」。
冷凍物質任何能夠使生物物質發生玻璃化的物質，包括但不限於，液體氣體如液氮、液丙烷、液氦或乙烷半融物(slush)。
套環小生物樣本的操作工具，一般由一持有一塊尼龍或金屬絲如白金或鎳鋼等的竿狀柄組成，該尼龍或金屬絲在其游離端形成一個閉環。
轉移工具用來操作生物樣品使之進入冷凍物質的工具，玻璃化期間其環繞和/或容納該生物樣品和/或含有該生物樣品的培養基、溶液或物質，使之維持在原位，並且/或者便於在該冷凍物質中輕鬆操作該生物樣品，其中該轉移工具使該生物樣品與該冷凍物質直接接觸。該轉移工具可以是本領域一般知曉的任何此類工具，包括但不限於，套環、帶柄的網或帶柄的槳。此處定義的術語「轉移工具」不包括電鏡格柵或吸管(包括密封和開口的拉伸的吸管)。
存活的能生存並正常發育一段時間的生物樣品。
玻璃化(使玻璃化)一種現象，其中使生物樣品迅速冷卻至極低溫度，這樣樣品內的水未經結晶而形成玻璃樣狀態。
本發明在美國臨時專利申請第60/104,266號的基礎上，指生物樣品玻璃化的方法，該專利全文在此引入供參考。
根據本發明的方法，將生物樣品直接置於冷凍物質中這樣該生物樣品與該冷凍物質直接接觸。接觸該冷凍物質時，該生物樣品發生玻璃化。已發生玻璃化的生物樣品可貯存一段時間，以後再復甦。復甦的生物樣品依然存活。
因此本發明用途廣泛。其可用於畜牧業、實驗室研究、瀕危物種保護以及人類輔助生殖。
本發明的生物樣品可以是任一種活細胞生物樣品，但優選發育細胞，更優選哺乳類發育細胞。此類細胞包括，但不限於，精子、胚胎、囊胚、桑葚胚和卵母細胞。此類優選細胞可來自任何所需的哺乳動物包括但不限於人類；非人類靈長類比如猴；實驗動物比如大鼠、小鼠和倉鼠；農業家畜如豬、綿羊、牛、山羊和馬；和有重要的動物學意義的和/或瀕危動物等等。本發明範圍也包括使用其它活生物體來源的其它發育細胞，比如爬行動物、兩棲動物和昆蟲比如果蠅屬。本發明使用的其它合適的細胞包括幹細胞，包括人幹細胞，和植物組織細胞。以下實施例用許多不同類型的細胞說明本發明的用途，包括倉鼠胚胎，該胚胎對損傷極為敏感，因此成為任何冷凍技術的良好模型。這些實施例也表明本發明對牛卵母細胞和胚胎很有效，本領域技術人員知曉後者對冷凍損傷極為敏感。
優選地，在玻璃化前將該生物樣品置於轉移工具上。該轉移工具可以是將該生物樣品運送到冷凍物質中的任何工具，從而使該生物樣品與該冷凍物質直接接觸，使該生物樣品迅速冷卻，因此使該生物樣品玻璃化而非在細胞內形成冰晶，後者反過來最終破壞細胞壁和其它重要的細胞成分。
本發明的方法有別於現有領域以前的方法，其中生物樣品是包含在容器比如封閉的吸管或拉開的吸管中，而不是與冷凍物質直接接觸。
另外，本方法學有別於現有領域以前的方法，該方法將生物樣品置於開口的平盤比如顯微鏡格柵上，這不利於輕鬆操作包含在冷凍物質中的樣本，使樣本的處理變得困難並最終使玻璃化樣品難於復甦。因此本發明可以在玻璃化過程中更好地對生物樣品進行處理並籍此解決以前的顯微鏡格柵玻璃化方法中存在的樣品復甦問題。
根據本發明，在玻璃化過程中轉移工具包繞和/或容納生物樣品，使之維持原位，這樣在此過程中生物樣品不會丟失。因此，轉移工具不僅如平盤板或顯微鏡格柵一樣使生物樣品置於其上，也確實可以幫助生物樣品維持原位，就像套環通過很強的粘附力來環繞生物樣品或含有該生物樣品的培養基、溶液或物質一樣。本發明優選的轉移工具包括但不限於，套環、帶柄的小網或小鏟。可用本領域已知的任何方法修飾這些鏟、網或套環，以幫助其固定生物樣品，包括在套環、網或鏟內另加入聚合篩孔或絲格。在一優選實施方案中，該套環是開放套環，經竿狀尾與小瓶帽內部直接連接，該小瓶具有合適的大小和形狀以便使玻璃化的生物樣品和套環冷凍保存於其中。令人驚訝和意外發現的是，本玻璃化方法學中使用套環具有提高冷卻速率、容易觀察、方便操作和玻璃化樣品在復甦和培養時存活率很高等優點。
在一優選實施方案中，在玻璃化前用少量冷凍保護劑處理該生物樣品。本發明的方法學也可降低該生物樣品與使用的冷凍保護劑之液相的接觸時間縮短，從而降低冷凍保護劑對該生物樣品的毒性。在冷凍保護期間大劑量使用冷凍保護劑比如乙二醇、聚乙二醇、二甲基亞碸、甘油、丙二醇、糖和甲基戊二醇，以及本領域熟知的其它物質，可對敏感細胞比如卵母細胞和胚胎細胞產生毒性。本發明所使用的任何可選擇的液相冷凍保護劑，與該生物樣品的接觸時間比本領域所述的以前的冷凍保護方法要短。
通過縮小冷卻時間、降低與液相冷凍保護劑的接觸時間和對生物樣品進行可靠的固位和操作，本發明解決了本領域成功冷凍保存敏感生物樣品比如發育細胞所長期存在的問題。如實施例中進一步說明的一樣，本發明表明了使囊胚或分裂期胚胎發生玻璃化的成功率，這樣，復甦並在合適的基礎培養基中培養時，該冷凍保存的囊胚或分裂期胚胎的存活率是80％，優選90％，更優選超過90％。另外，本發明使發育細胞發生玻璃化，其中該玻璃化的發育細胞在復甦、培養和植入恰當的宿主有機體內時，會產生與同樣植入但未經冷凍保存的發育細胞相同的受精率。這幫助解決了長期存在的由於使用冷凍保存的發育細胞而產生的低致孕率問題。
另外，本方法學可以對以前不能冷凍保存的生物樣品進行冷凍保存。應注意的是，豬胚和馬胚如會可根據本發明發生玻璃化，其中至少25、30、35、40或45％，更優選50、55、60、65、70或75％玻璃化的胚胎在復甦和培養後依然存活。
根據本發明，通過本領域熟知的任何方式收集一或多個生物樣品並優選地將之轉移到基礎培養基中。該基礎培養基可含有一或多種可選的成分，比如避免該生物樣品受低溫影響的冷凍保護劑和/或提高粘度的化合物，以便幫助該物質維持於轉移工具中，優選套環。提高粘度的化合物可以是本領域所知的任何此類化合物，包括但不限於，Ficoll、Percoll、透明質酸、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和甘油。
根據本發明，將該生物樣品優選置於轉移工具上。該樣品可置於基礎培養基中，再用轉移工具比如套環或小槳將該生物樣品從該基礎培養基中舀出來。在一優選實施方案中，轉移工具是套環，並優選將該套環浸在基礎培養基中以便在套環上形成基礎培養基薄膜，再用移液管將該生物樣品直接置於套環中。若發育細胞比如胚胎、精子或卵母細胞用作生物樣品，可將一或多個置於每個套環內。
然後使含有該生物樣品的轉移工具迅速置於冷凍物質中，這樣該生物樣品直接接觸冷凍物質從而發生玻璃化。優選地，用移液管將該生物樣品移至轉移工具上與將該生物樣品置於冷凍物質之間的時間是45秒或更短，更優選30秒或更短。冷凍物質可以是液氮、乙烷半融物或任何其它的本領域熟知的冷凍物質。優選地，在玻璃化後的全部操作期間使該生物樣品置於冷凍物質內直至樣品復甦。
再將玻璃化的生物樣品轉移到貯存容器內。在一優選實施方案中，轉移工具是連至小瓶蓋內部的套環。該小瓶裝滿了冷凍物質，並放在與使生物樣品發生玻璃化的冷凍物質所使用的容器相同的貯存器中。發生玻璃化後，可將仍位於套環內的生物樣品密封於小瓶內而無需從冷凍物質中取出之。然後其冷凍物質中含有玻璃化生物樣品和套環的密封小瓶可無限期地冷凍保存。
之後，可使生物樣品復甦，存活的生物樣品還可以發育。通過從貯存罐取出含有玻璃化生物樣品的小瓶，迅速從小瓶中取出含有生物樣品的轉移工具並將轉移工具和樣品投至復甦液中來完成復甦(過程)。在一優選實施方案中，將貯存小瓶置於含冷凍物質的貯存器中，優選與小瓶內所含冷凍物質相同之冷凍物質的貯存器。在冷凍物質中，打開小瓶，取出含有生物樣品的轉移工具，迅速投到復甦液中。復甦液可以是任何足以使生物樣品得以復甦並保護其存活的溶液或物質，包括但不限於本領域所知的適於作為特定生物樣品的基礎培養基的培養基。復甦後可採用對於該種類及該樣品利用過程而言任何已知的適宜方式來對該生物樣品進一步操作。
依據
圖1還說明了本發明的優選方法。如I所示，將在適宜基礎培養基中的生物樣品直接加至套環或直接舀至套環。如I中所示該套環與有磁性的小瓶蓋相通。隨後立即將該套環直接投入保存在容器中的冷凍物質中，該容器可以是裝滿液氮的絕緣盒。或者，可將該冰凍物質直接放在小瓶中，並且生物樣品通過本身與小瓶中的冰凍物質直接接觸可發生玻璃化，從而減少了對分離貯存器的使用。在液氮下，將該套環放在貯存瓶中，該玻璃化樣品保存於套環中。可通過使其直立放於貯存器中小瓶-大小的孔中來充滿多個小瓶，或者，可選擇地，用鉗或其它工具可將單個小瓶置於液氮下。然後多個小瓶可無限期地冷凍保存於任何適宜的容器中，例如III中說明的標準杜瓦瓶。在以後的任何時間，如IV所示，與以上所述的該玻璃化過程恰恰相反，可將套環從在冷凍物質如液氮下的小瓶中取出。在復甦前，應用含有包埋小瓶的冷凍物質的貯器是便利的，但不是必須的，但是在小瓶中的冷凍物質本身足以使生物樣品在復甦前進行操作時得以冷凍保存。然後將生物樣品直接放在復甦液中。將復甦液以任何方便的形式放在，包括如V所示的開放的培養皿中或在吸管中以便直接裝入轉移槍中。將該生物樣品立即放在復甦液中稀釋，並且從套環中飄浮出來。然後可將生物樣品以任何本領域所知的適當方式進行培養。
應用本發明的方法，敏感生物樣品例如精子、卵母細胞和胚胎的玻璃化比傳統冷凍保存步驟具有優勢，這是因為本方法缺少生物樣品與冷凍物質間的損傷層。該因素和不到1-5μl極少量的所用的一般生物樣品或培養基、溶液或其它含有所用生物樣品的物質，在冷卻時導致極快速和均勻的熱交換。高速率冷凍防止對敏感細胞例如發育細胞的冷損傷。本發明達到的極快的冷凍速率也明顯降低與所用的任何選擇性冷凍保護劑的接觸時間並因此降低其對樣品的冷凍毒性。
本發明方法其它的優點包括(具有)在操作時便於觀察樣本的開放系統；不需要貴重或複雜的裝置便能對大量樣品進行快速冷凍；標記和貯存方法非常簡易；及可以對少量和即刻樣品進行復溫和恢復。對於需要封閉系統的應用例如人類臨床應用而言，使用標準冷凍瓶能使它們密封於標準塑料紙中，或可選擇地，可封住冷凍瓶蓋內的釋放孔，防止任何可能的病毒交叉傳播。
冷凍保存後卵母細胞生存能力的最終評定是指致孕和保孕以生成正常的可生育的幼體的能力。對於此有兩個原因說明倉鼠是絕佳動物模型。首先倉鼠對體外環境非常敏感，這使它成為非常敏感的模型，因為本發明的發明者未發現任何文獻報導過用任何方法冷凍保存後可成功地產生倉鼠幼仔。第二，倉鼠的妊娠期只有16天，並且在3-4個月後可達性成熟期。後面的實施例證實了本發明可成功冷凍保存多種卵母細胞，此後可將這些卵母細胞復甦並用以產生正常的幼仔，成熟率至少達90％。
牛卵母細胞和優選地牛胚胎據報導對冷損傷異常敏感。而且在卵母細胞中的高脂成分與牛卵母細胞對冷凍保存過程中敏感性增加相關。如後面的實施例所示，用本發明的方法使牛胚胎和分裂期卵母細胞發生的玻璃化，使其在培養中後來可發育至桑葚胚/囊胚期，並且成功孵化的百分率很高。
該發明也涉及用於生物樣品玻璃化的試劑盒。該試劑盒一般包含該生物樣品玻璃化的說明，其中該樣品直接與冷凍物質接觸。該試劑盒還包括1個或多個可選擇成分，包括但不限於，轉移工具，最優選套環，裝套環和與其所含的玻璃化樣品的具有適宜大小和形狀的小瓶、基礎培養基、轉移溶液和冷凍保護劑。
通過下面非限制性實施例進一步對本發明進行說明，申請中列出的參考文獻在這裡引用作為參考。
實施例1-用於牛和倉鼠卵母細胞和胚胎玻璃化的方法和物質 A.培養基 在以下實施例中，所用的培養基是胚胎培養基-10，按Lane等人分子生殖和發育(Mol.Reprod.Dev)50433-450(1998)描述的方法製備，應用Hepes緩衝的HECM-10改變液進行胚胎的收集和冷凍保護，其中用20mM Hepes(pH 7.35)代替20mM NaHCO3。在應用前，立即將冷凍保護液加入培養基中。如Gardner等人人類生殖133434-3440(1998)所述的培養基G1.2和G2.2用於牛胚胎的培養。所有的鹽、碳水化合物、胺基酸、二甲亞碸(DMSO)、乙二醇和蔗糖均購自Sigma化學公司(St.Louis，MO)。牛血清白蛋白購自BayerDiagnostics。
B.倉鼠胚胎的收集和培養 如前面Lane等人分子生殖和發育(Mol.Reprod.Dev)50433-450(1998)所述，從超-排卵母倉鼠中收集倉鼠胚胎。在1-細胞或2-細胞期將倉鼠胚胎冷凍保存。如Lane等人分子生殖和發育50433-450(1998)所述，將倉鼠胚胎在HECM-10中進行培養。在用三硝基甲苯處理後應用碘化丙啶染色法對產生的囊胚數目進行測定。
C.牛胚胎的體外成熟/體外受精/體外培養(IVM/IVF/IVC) 如Krisher等人生物生殖(Biol.Reprod.)601345-1352(1999)所述，從卵巢上將未成熟的牛卵母細胞分離，並使其成熟。將成熟的卵母細胞玻璃化和復甦，或不進行玻璃化和復甦以作為對照，並且應用Krisher等人生物生殖601345-1352(1999)所述的方法進行體外受精。在受精後將假定的合子分離並在連續培養基G1.2和G2.2培養，在每一培養基培養72小時。經過總共144小時後，評定發育到桑葚胚/囊胚和囊胚期的情況。
D.應用套環的玻璃化 用於玻璃化的套環是尼龍套環(20μm寬，直徑0.5-0.7mm)綁在不鏽鋼管上，後者又用環氧樹脂固定在冷凍小瓶的瓶塞上。(HamptonResearch，Laguna Niguel，CA)。通過2步加入冷凍劑將卵母細胞和胚胎玻璃化。開始，將卵母細胞和胚胎在含有10％DMSO和10％乙二醇的冷凍液I中放置1-3分鐘。然後轉移至含有20％DMSO和20％乙二醇，10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II中放置20秒鐘。然後將細胞轉移至事先浸入溶液II中製成薄膜的套環上。對於倉鼠胚胎，在套環上放置10-12個胚胎，對於牛胚胎，在每個套環上放3-6個胚胎，然後將懸浮於尼龍套環中的胚胎直接放於液氮中。通過事先將冷凍小瓶浸入液氮下，將含有胚胎的套環插入含有液氮的冷凍小瓶中並同時將其在液氮下密封。
用蔗糖通過2步稀釋將卵母細胞和胚胎復甦。將冷凍小瓶置於液氮下，打開小瓶並且從液氮中將含有細胞的套環取出，然後將其插入含有0.25 M蔗糖的基礎培養基的孔中，該卵母細胞/胚胎立即從套環上脫離並進入復甦液中。在2分鐘後將卵母細胞從此溶液中取出，並且轉移至含有0.125M蔗糖的基礎培養基中再放置5分鐘。接著，在基礎培養基中將卵母細胞和胚胎衝洗兩次並達5分鐘，並且然後恢復培養。
E.應用開口的拉伸吸管技術的玻璃化 為了進行比較，應用Vajta等人冷凍通訊(Cryo-Letters)18191-195(1997)描述的該開口的拉伸的吸管技術(OPS)將倉鼠胚胎玻璃化。將10-12個胚胎分2步加到由乙二醇和DMSO組成的冷凍保護劑中，其濃度與上面的相同。將胚胎抽吸到1μl的第二冷凍保護液滴中，然後用毛細管作用加到開口的拉伸的吸管中，將含有該胚胎的吸管直接投入至液氮中。如果復甦的話，通過如上所述的復溫和復甦過程逐漸增大壓力使胚胎從吸管中排出。
F.胚胎轉移 將倉鼠桑葚胚/囊胚轉移至3(-1天非同步性)天假孕受體中。將8個胚胎轉移至每一子宮角。在孕14天，將一些動物處死並且確定種植和胚胎發育率。使其它的雌性動物在孕16天時產仔，並在幼仔出生不久記錄其數目。
G.統計學分析 用線性對數回歸來評價處理組間發育差別，其中該分布是二項的(Glim 4.0，Numerical Algorithms Group，Oxford，UK)。將實驗天數作為因子進行擬合。確定Gaussian歸一化和方差齊性時應用方差分析評價細胞數目差別。通過用於多重比較的Bonferroni′s方法來評價組間的多重比較。
實施例2-玻璃化和倉鼠胚胎的隨後發育 依據本發明的方法，應用套環將倉鼠2-細胞胚胎玻璃化，並且與直接和冷凍保護劑接觸的對照胚胎或應用實施例1中所述的OPS方法而玻璃化的胚胎結果相比較。從輸卵管收集胚胎，並分至對照、套環和OPS玻璃化組。如下面表1所示，與應用OPS玻璃化的胚胎相比，在套環中玻璃化時，明顯更多的胚胎發育至桑葚/囊胚和囊胚期。
如表1所示，與對照胚胎相比，應用任何一種技術玻璃化後再培養，能持續發育至桑葚/囊胚或囊胚期的2-細胞胚胎明顯減少。然而如表1所示由玻璃化2-細胞胚胎產生的囊胚(分裂率指標)的細胞數目明顯與未經玻璃化的2-細胞胚胎數目在統計學意義上相等。應用套環也可以將大鼠2-細胞胚胎成功玻璃化，並且與對照組相似(n＝10)，其在復甦後能正常發育且分裂率達75％。
為進一步評價玻璃化敏感細胞的能力，用1-細胞胚胎重複該實驗，但1-細胞胚胎與冷凍保護劑稀釋液接觸的時間由2分鐘降至1分鐘。初步的研究證實1-細胞胚胎與冷凍保護液接觸2分鐘(不發生玻璃化)使其發育能力嚴重降低。同樣胚胎收集自輸卵管並且被分配至對照、套環或OPS玻璃化組。
如表1所示，在用套環進行的玻璃化之後，倉鼠1-細胞胚胎在培養中能分裂和持續發育桑葚胚/囊胚期。與應用OPS玻璃化的胚胎相比較(表1)應用套環玻璃化的胚胎玻璃化的發育率明顯較好。應用套環也能將倉鼠卵母細胞成功玻璃化(n＝20)並且隨後使其進行受精，與對照非冷凍保護卵母細胞相比較，其以10％的比率發育至桑葚胚/囊胚期。
表1.玻璃化後培養的倉鼠胚胎的發育情況 M/B桑葚期/囊胚發育期 B囊胚發育 N＝對單細胞胚胎而言至少每個處理組有100個胚胎(重複4次)；對2-細胞胚胎而言至少每個處理組有400個胚胎(重複8次) a與對照組有明顯差異(P＜0.05) b與對照組和套環玻璃化組有明顯差異(P＜0.05) 實施例3-玻璃化後倉鼠1-細胞和2-細胞倉鼠胚胎的存活力 應用套環或通過OPS方法將倉鼠胚胎玻璃化。復溫後在轉移至假-孕受體之前將胚胎培養至桑葚/囊胚期(玻璃化和對照胚胎)。如表2所示，與未行冷凍劑保護的對照胚胎相比較，事先在2-細胞期進行玻璃化的桑葚胚/囊胚期的胚胎種植和發育成活胎鼠的存活力沒有差別。但是如表2所示，當採用OPS玻璃化時，能種植並發育活胎鼠的胚胎明顯較少。接受在2-細胞期應用套環玻璃化的桑葚胚/囊胚的兩隻雌鼠產仔產下5隻幼鼠。這些幼鼠發育成了形態上正常和可育的成鼠。
類似的，如圖2所示，1-細胞的倉鼠胚胎的著床和胚胎發育沒有受到使用套環的玻璃化方法的影響。沒有OPS玻璃化的胚胎因為在從前的實驗中的低的存活率而被轉移。又有2隻接受了2-細胞所稱用套環玻璃化的桑葚胚/囊胚的雌鼠產仔並生下共9隻幼鼠。生下幼鼠6-9天後，該雌鼠吃掉了一隻幼鼠。其它的幼鼠發育成形態正常並能生育的成鼠。
表2.玻璃化後宮內倉鼠胚胎的發育 a與對照胚胎有明顯差異(P＜0.05) 實施例4-牛卵母細胞、分裂期胚胎和囊胚的玻璃化 為判定本發明玻璃化方法成功將不同細胞類型的胚胎玻璃化的能力，用如實施例1所述的方法將牛卵母細胞和胚胎玻璃化，對其生存率和以後的發育進行評定，結果如表3所示。將卵母細胞和胚胎分至對照組或應用本發明方法應用套環玻璃化組中，如表3所示，應用套環將體外產生的牛囊胚成功玻璃化且80％擴增的囊胚能在玻璃化後再擴增和孵育。對照囊胚培養的結果是培養48小時後100％的囊胚孵育。而且應用套環玻璃化能成功地將75％的完全孵育的囊胚玻璃化。如表3所示，應用本發明的玻璃化方法玻璃化的8-細胞牛胚胎，能進行玻璃化並且復溫後的生存率(通過向桑葚胚/囊胚期的發育來判定)與未經冷凍保護的新鮮胚胎的生存率相等。與新鮮胚胎相比，在該4-細胞期胚胎的玻璃化導致生存率的輕微下降，但是如表3所示，許多胚胎能正常發育至桑葚胚/囊胚期。牛卵母細胞對冷損傷異常敏感並且很少有報導證實在行冷凍保護後取得的任何成功。在體外，應用套環將成熟牛MII卵母細胞成功玻璃化。行玻璃化和復溫的卵母細胞隨後受精，有33％繼續發育桑葚胚/囊胚期(n＝42)。
表3.玻璃化後培養的牛胚胎的發育狀況 M/B，桑葚/囊胚發育期 B囊胚發育 HB孵化的囊胚發育 n/a未得 n/d未確定 實施例5-人和小鼠囊胚玻璃化的方法和材料 A.培養基 用於胚胎培養的培養基是G1.2和G2.2(IVF Sciences Scandinavian，Gothenburg，瑞典)。胚胎收集培養基是G1.2的HEPES的改變液並且冷凍保護和復甦的基礎培養基為不含胺基酸和維生素的G2.2 HEPES-緩衝改變液。在上述兩種培養基中，通過用20mM HEPES代替20mMNaHCO3來改變培養基，並調整pH為7.35。
B.小鼠 從4-6周齡F1雌小鼠(C57BL6×CBa)中收集胚胎。用5iu孕與促性腺激素(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)刺激小鼠，並且48小時後再用5iu的人絨毛膜促性腺激素(hCG；Sigma Chemical Co.)，在注射hCG後將雌鼠與同系雄鼠置於一起，次日早晨，陰道栓的出現表明交配的發生。在注射hCG 22小時後收集合子並且通過在含0.5mg/ml透明質酸酶的H-G 1.2中孵育不到一分鐘使合子從環丘中裸露出來。在H-G 1.2將合子衝洗兩次並進行培養。
C.小鼠胚胎培養 在37℃，含5％CO2的潮溼空氣中，在20μl G 1.2培養基液滴中將小鼠合子分成10組進行培養。培養48小時後，在G 2.2培養基中將8-細胞胚胎衝洗3次，再在G 2.2培養基液滴中培養48小時。培養96小時後評價囊胚的發育。
D.人胚胎培養 依據Gardner等人人類生殖Hum.Reprod.133434-40(1998)所述，建立囊胚生長培養體系。在將卵母細胞復甦後，為行人工受精在補充了胎臍血清(FCS)的Ham′s F-10中孵育卵丘包囊的卵母細胞。依據起始精液參數用50-70-95非連續梯度或小梯度方法(精子提純，Nidacon，Gothenburg)製備精液，在Ham′s F-10中衝洗得到的產生的精液塊。就正常人工受精而言，每一卵母細胞需加入50-100,000精子/ml。如果進行胞質內注射(ICSI)，用透明質酸酶和吸管將卵母細胞剝離。將每一成熟卵母細胞放在添加了15％FCS的6μl磷酸緩衝鹽中。將配偶精子放在6μl PVP(IVF Sciences Scandinavian)液滴中。用Ovoil(IVF Sciences Scandinavian)平鋪所有液滴。用裝有Narishige顯微操縱器的Nikon倒置顯微鏡進行ICSI。衝洗注射後的卵母細胞，並將其放在含有G 1.2的試管中，直至進行受精結果的評定。在人工受精或ICSI15-18小時後進行受精結果的評定。在器官培養皿中用27-號的可處理針通過解剖將細胞柱和細胞丘取下。衝洗乾淨得到的2原核胚胎並且隨後將其分2-3組並在含5％CO2的空氣中在1-ml Falcon培養中的G 1.2培養基中進行培養。
培養48小時後，將胚胎衝洗3次並且再培養72小時。第6天的囊胚認為是不很適合進行此前本領域已知方式的冷凍保護，也就是其不完全擴增或者內細胞群發育差，本發明的該方法選用此囊胚進行玻璃化。
E.應用套環的玻璃化 用於玻璃化的套環由與不鏽鋼管相連的尼龍套環(20μm寬，直徑0.5-0.7mm)構成。該鋼管固定在冷凍小瓶的瓶塞上。購買安裝好的套環(Hampton Research，Laguna Niguel，CA)然後粘至小瓶中。在蓋上放置金屬片，這樣需要的話可以使用帶有小磁鐵的手柄來操作該套環。
通過2步加入冷凍保護劑的方法使囊胚玻璃化。開始將囊胚放在含有10％DMSO和10％乙二醇的冷凍保護液I中2分鐘，之後在含有20％DMSO和20％乙二醇、10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II中放置20秒。冷凍保護劑的這些濃度和與胚胎的接觸時間長短在前已證明最適於應用套環方法進行齧齒動物和家畜胚胎的玻璃化。把囊胚放在冷凍保護液I中時，將套環放在冷凍保護液II中使在套環上形成薄膜。然後將囊胚從溶液II中轉移套環上的冷凍保護劑膜上。此後將含有囊胚的套環投入浸入並裝滿液氮的冷凍小瓶中。通過事先將冷凍小瓶浸入液氮，可將含有囊胚的套環投入含有液氮的冷凍小瓶中並且同時在液氮下將小瓶封口。將小瓶貯存於標準容器中。
用蔗糖2步稀釋法復甦囊胚。把冷凍小瓶浸入液氮下將小瓶打開，並且將含有囊胚的套環從液氮中取出，並直接放進含有0.25M蔗糖的基礎培養基孔中。該囊胚立即從該套環上掉入復甦液中。2分鐘後將囊胚從該溶液中取出。將囊胚轉移至含有0.125M蔗糖的基礎培養基中再放置3分鐘，接下來5分鐘內在該基礎培養基中將囊胚衝洗兩次然後進行培養。
玻璃化以後，將小鼠和人的囊胚在培養基G 2.2中培養6小時，在評定囊胚生長之前評定其再擴增。之所以選擇6小時孵育是因為在轉移之前這是用於復甦囊胚評定的該正常時期。
F.囊胚生長的評定 對小鼠和人囊胚的生長均進行評定，作為以後的存活力標誌。將囊胚轉移至加入10％胎臍帶血清的培養基G 2.2中以評定囊胚的附著和生長。在4孔板上培養囊胚，該4孔板用0.1％500μl明膠液滴在37℃在含有5％CO2的空氣中預包被。24小時後對囊胚的孵化和附著進行評定，並且再培養24小時後進行囊胚生長的評定。內細胞群(ICM)和滋養外胚層的生長，依據其數量，在0和3之間給分，如Spindle和Pederson，JExp.Zool.，186305-318(1972)所述，其中0分是無生長而3是過度生長。
G.小鼠囊胚存活力的評定 通過將其轉移到假孕受體來進行小鼠囊胚玻璃化後存活力的評定。復溫後轉移之前，將囊胚在培養基G 2.2中培養6小時。6小時後收集所有的再擴增囊胚並隨機選擇需轉移的囊胚。每一個子宮角轉移6個囊胚，在孕15天，進行種植、胎兒發育和胎兒重量的評定。將非冷凍保護的囊胚作為對照。
H.統計分析 用Yates校正的卡方分析來評定玻璃化後囊胚孵化、附著和存活力的差異。起先對ICM和滋養層細胞生長的數據進行Kolmogorov-Smirnov檢驗以判定數據的歸一性。然後F-檢驗評定兩組數據的方差齊性。該歸一性和方差齊性確立後，用Student′s t-檢驗評定生長的差異。
實施例6-小鼠囊胚的玻璃化 根據本發明應用套環使總共160個小鼠囊胚發生玻璃化。玻璃化後，100％的這些囊胚能夠在培養物中再擴增。如表4所示，與對照胚胎相比，發生玻璃化的囊胚在培養物中孵化和貼壁的能力沒有差別。同樣，如表4所示，ICM或滋養外胚層在培養物中的生長能力與對照和玻璃化的囊胚沒有區別。
在玻璃化和復甦後，將60個囊胚轉移到假孕受體中，並將其存活率與未經冷凍保存的同胞對照囊胚進行比較。與對照囊胚相比，玻璃化囊胚種植和發育成胚胎的能力沒有差別。玻璃化的囊胚所形成的胎鼠之體重(0.245±0.021g)與對照囊胚(0.250±0.017g)類似。所有玻璃化過的囊胚及對照囊胚產生的胎鼠形態都正常。另外使接受了8個玻璃化囊胚(每個子宮角4個)的雌性受體產仔。出生3個形態正常的幼仔。
表4.小鼠囊胚套環玻璃化對再擴增及生長的影響 1對照和玻璃化囊胚之間所測得的任何指標都無差別 對照和玻璃化囊胚n≥100 實施例7-人囊胚的玻璃化 根據本發明的方法應用套環使十八個人囊胚發生玻璃化，這些囊胚為極小至半擴增之間的囊胚。其中11個(83.3％)在培養物中發生再擴增。如表5所示，ICM和滋養外胚層在培養物中的孵化能力和生長與玻璃化的囊胚和未經冷凍保存的對照囊胚類似。
表5.人囊胚套環玻璃化對再擴增和生長的影響 1對照和玻璃化囊胚任何測量指標都沒有差別 實施例8-第8天牛囊胚的玻璃化 以下溶液用於本實施例 冷凍液 溶液1含10％乙二醇和10％DMSO的基礎培養物(如實施例1所示) 溶液2含0.65M蔗糖和20％乙二醇和20％DMSO和10mg/ml Ficoll 復甦液 溶液1含0.25M蔗糖的基礎培養基 溶液2含0.125M蔗糖的基礎培養基 溶液3基礎培養基 溶液4基礎培養基 根據實施例1所述方法產生牛囊胚。玻璃化前使所有囊胚進行一定程度的擴增。用標準裝置將該囊胚吸至套環上，該套環已浸入冷凍液2中。每個套環含一個囊胚。然後將含有囊胚的套環在冷凍液1中處理2分鐘，然後在包括Ficoll粘液的冷凍液2中處理30秒，再迅速將其直接投至液氮中進行玻璃化。將該囊胚在液氮中冷凍30-90分鐘，然後復甦。
為復甦囊胚，將該囊胚和在其中發生玻璃化的套環依次置於復甦液1-4中各5分鐘。
在根據本發明進行玻璃化和復甦的13個囊胚中，9個囊胚在培養48小時後孵化。
第二批4個囊胚如上所述經過玻璃化、復甦和培養，培養48小時後全部成功孵化。
按實施例1所述方法產生第三批8-天牛囊胚。共使用了12個囊胚，並將2個已擴增的囊胚置於每個套環內。如上所述使該囊胚玻璃化、復甦和培養，只是復甦過程如下進行。溶液1中2分鐘；溶液2中5分鐘；溶液3中5分鐘和溶液4中5分鐘。培養48小時後11個囊胚孵化。
實施例9-九天牛囊胚的玻璃化 按照實施例1所述方法產生牛囊胚，按實施例8所述方法使之玻璃化。然後如實施例8所述復甦和培養該囊胚。48小時後，80％的囊胚孵化。
實施例10-七天牛囊胚的玻璃化 如實施例1所述產生七天的牛囊胚，並如實施例1所述用G 1.2/G 2.2進行培養。共有20個囊胚按照實施例8所述方法發生玻璃化和復甦，並且冷凍2小時，每個套環2到3個囊胚。然後如實施例8所述復甦和培養該囊胚。復甦後的囊胚培養48小時後，20個囊胚中有15個孵化，2個發生再擴增。
七天囊胚的第二次實驗按上述方法進行，每個套環1到2個囊胚。培養48小時後，33個經玻璃化的囊胚中有29個發生孵化。
實施例11-牛卵母細胞的玻璃化 在本實施例中，使應用本發明之方法而發生玻璃化的牛卵母細胞與應用已知的開口的拉伸的吸管(OPS)之方法發生玻璃化的卵母細胞以及未經冷凍的對照卵母細胞進行了比較。應用實施例8所述溶液，使待玻璃化的卵母細胞在溶液1中處理35秒，溶液2中單獨處理30秒或溶液2和粘液中處理30秒。然後按照每個吸管1-3個或每個套環1-3個細胞將之投入到液氮中冷凍。玻璃化後，所有的卵母細胞按以下步驟復甦溶液1中1分鐘；溶液2中5分鐘；溶液3中5分鐘；和溶液4中5分鐘，所用溶液均為實施例8的溶液。然後使該牛卵母細胞返回到成熟培養基中2小時，再按正常方式受精。一天後，將該卵母細胞如實施例1所述移至G 1.2培養基中。4天後，如實施例1所述將分裂的胚胎轉移到新鮮的G 1.2培養基中。對照卵母細胞分裂率為37.5％，根據現在的方法發生玻璃化的卵母細胞分裂率為19％，用OPS方法發生玻璃化的卵母細胞分裂率為14％。再將該卵母細胞轉移到新鮮的G 2.2培養基中培養4天。在八天末，24個原來的裸露卵母細胞對照中僅有2個發育至了桑葚期。作為比較，根據本發明發生玻璃化的16個卵母細胞中3個卵母細胞發育至桑葚胚期。作為比較，應用OPS方法已經玻璃化的28個卵母細胞中，無任何細胞發育至桑葚胚期，該卵母細胞只有4個存活，最成功的OPS方法的單個實施例發育至16-32細胞期。
實施例12-用於小鼠和人卵母細胞玻璃化的方法和材料 A.培養基 用於胚胎培養的培養基是添加了5mg/ml人血清白蛋白(Gardner等人，Hum.Reprod.133434-40(1998))的G 1.2和G 2.2。用於胚胎收集和玻璃化的培養基是HEPES緩衝的、無EDTA的G 1.2改變液，用20mM HEPES代替20mM NaHCO3並調整pH值為7.35。
B.小鼠 從4-5周齡F1(C57BL6×CBa)雌鼠收集卵母細胞。用5iu孕馬促性腺激素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)刺激雌鼠並且53個小時後再用5iu的人絨毛膜促性腺激素(hCG；Sigma Chemical Co.)。注射hCG後14個小時收集卵母細胞並通過在H-G 1.2中用0.5mg/ml透明質酸酶作用不到一分鐘降解周圍的環丘，使卵母細胞裸露。在H-G 1.2中將卵母細胞衝洗兩次並且進行人工受精或冷凍保護。
C.人卵母細胞的收集 根據Gardner等人，人類生殖(Hum.Reprod.)133434-40(1998)的方法刺激病人產生多個卵母細胞。將卵母細胞自濾泡中衝洗出來，置於G 1.2中培養4小時。通過在G 1.2中與透明質酸酶溫育去掉周圍的環丘使卵母細胞裸露。再將未成熟的卵母細胞置於含有胎兒臍帶血清的G2.2中培養24小時。然後使成熟的MII卵母細胞作為對照或應用套環進行玻璃化。
D.小鼠和人類卵母細胞的套環玻璃化 應用2個加有冷凍保護劑的步驟使卵母細胞玻璃化。首先將卵母細胞置於含有10％DMSO和10％乙二醇的冷凍保護液I中1分鐘，再轉移到含20％DMSO和20％乙二醇、10 mg/ml Ficoll(分子量40萬)和0.65M蔗糖的溶液II中約20秒。然後將卵母細胞轉移到已浸入到溶液II中而形成薄膜的套環上，直接投入液氮中。通過預先將冷凍瓶浸入到液氮下，含卵母細胞的套環可投到含液氮的冷凍瓶中並同時在液氮下密封。該小瓶貯存於標準的罐中。
用含蔗糖的2步稀釋(法)復甦卵母細胞。在冷凍瓶漫在液氮下時打開小瓶，從液氮中取出含細胞的套環，將其直接放到含有0.25M蔗糖的H-G 1.2基礎培養基的孔中。卵母細胞立即自套環掉入復甦液中。2分鐘後從此溶液中取出卵母細胞，轉移到含0.125M蔗糖的H-G 1.2基礎培養基中。3分鐘後用H-G 1.2洗卵母細胞2次，5分鐘，再恢復培養。
E.小鼠卵母細胞的體外受精和胚胎培養 從12-16周齡的F1(C57BL6×CBa)雄鼠附睪中抽吸出精子，注入到FG1培養基中(如Gardner和Lane，1997，Hum.Reprod.Update 3367-382中所述)，該培養基添加1mg/ml穀胱苷肽和5mg/ml HSA(Scandinavian IVF Sciences，Gothenburg，Sweden)。人工受精使精子獲能1.5小時。在卵母細胞人工受精前，應用Fertilase 670nm雷射定位來和準值1.48μM的雷射束(MTM醫學技術，Montreux，Switzerland)在卵母細胞帶上產生一個小孔(5μM)。將卵細胞放於100μl FG1液滴中並與大約1×104個精子共孵育4小時。將卵母細胞衝洗兩次並在20μlG 1.2液滴中於37℃及6％CO2、5％O2和89％N2中進行培養。在次日早晨，通過2-細胞胚胎的出現來評定受精情況。將所有的2-細胞移至新鮮的G 1.2液滴中。在48小時後在G 2.2中將培養胚胎衝洗乾淨，並且在G 2.2中再培養48小時至囊胚期。
F.人卵母細胞的存活力評定 通過染料-排斥法評定人卵母細胞存活力。將卵細胞在含有25μg/ml碘化丙錠的H-G 1.2中放置10分鐘，然後在H-G 1.2中衝洗5分鐘。經過玻璃化過程未存活的卵母細胞核物質染色陽性，而存活的卵母細胞不著色。
G.統計分析 用線性-對數回歸評價處理組間發育的差異，其中該分布是二項分布(Glim 4.0，Numerical Algorithms Group，Oxford，UK)。將實驗日期作為實驗因素。當證實Gaussian正態性和方差齊後應用方差分析評價細胞數目間的差異。通過用於多重比較的Bonferroni′s方法來評價處理組間的多重比較。
實施例13-冷凍保護後培養的小鼠卵母細胞的發育 如表6所示，與應用緩慢-冷凍方法冷凍保護的卵母細胞相比，應用本發明方法玻璃化的卵細胞具有明顯較高的生存率。類似地，如表6所示，與緩慢-冷凍方法相比，應用本發明方法玻璃化的卵母細胞的受精率明顯較高。如表6所示，應用本發明方法冷凍的卵母細胞與人工受精的對照組新鮮卵母細胞具有相等的受精率。如表6所示，應用緩慢-冷凍方法冷凍保護的卵母細胞的受精率明顯較低。未冷凍的對照卵母細胞有70.0％總卵母細胞發育到囊胚期或有95.4％2-細胞胚胎發育至囊胚期。如表6所示與對照卵母細胞相比，應用套環玻璃化的卵母細胞的該囊胚發育率沒有差異。相反，如表6所示在通過緩慢-冷凍而冷凍保護的卵母細胞中總卵母細胞或2-細胞胚胎的囊胚發育率明顯下降。
表6.小鼠卵母細胞的冷凍保存對小鼠受精和胚胎發育的影響 N＝每組處理組至少300個胚胎 *與所有其它組有明顯差異(P＜0.05) **與所有其它組有極明顯差異(P＜0.01) 實施例14-冷凍保護後小鼠卵母細胞的後繼存活力 將自新鮮或冷凍保護的卵母細胞(應用本發明方法發生玻璃化或緩慢-冷凍)衍生的囊胚轉移到假孕受體中，並且評定其種植和胎鼠發育情況，結果見表7。自應用本發明方法玻璃化的卵母細胞衍生的囊胚與新鮮卵母細胞具有相似的種植率，但是胎鼠發育輕微減緩。相反，與對照卵母細胞或應用本發明方法玻璃化的卵母細胞相比，應用緩慢冷凍方法冷凍的卵母細胞的種植率和胎鼠發育率明顯下降。另外，使各轉移有8個囊胚的2個雌鼠產仔，這些囊胚來自玻璃化的卵母細胞。出生了11個幼仔(7和4)，所有幼仔都發育成了形態正常並具有生育能力的成年小鼠。出生的11個幼仔中，8雌3雄。
表7.冷凍保存對轉移後小鼠存活力的影響 N＝每個處理組至少轉移50個囊胚 a-c表示有明顯差異的不同字母(p＜0.05) 實施例15-冷凍保存後人卵母細胞的存活率 用本方法玻璃化後評定人卵母細胞的存活力。如表8所示，觀察到此存活率很高。
表8.冷凍保存後人卵母細胞的存活率 實施例16-小鼠分裂期胚胎的玻璃化 根據實施例1所述方法收集胚胎。單細胞胚胎在收集後立即進行套環玻璃化，而2-細胞胚胎在24小時後獲得。根據實施例1所述方法進行培養。
根據實施例12所述方法應用套環使單細胞和2-細胞胚胎發生玻璃化。與未經冷凍保存的新鮮胚胎相比，小鼠1-細胞或2-細胞胚胎在培養時發育至囊胚期的能力沒有差別。結果如以下表9所示。
表9.根據本發明發生玻璃化後小鼠1-細胞和2-細胞胚胎的發育狀況 #與新鮮胚胎比較套環玻璃化的1-細胞或2-細胞胚胎培養發育能力沒有差別。
實施例17-應用本發明小鼠精子的玻璃化 按照實施例12所述方法收集成熟的小鼠精子。
將1μl含10％DMSO和10％乙二醇的冷凍保護液I液滴加到培養皿蓋上。將1μl精子溶液加到溶液1液滴上。20秒後，加入1μl含20％DMSO和20％乙二醇、10mg/ml Ficoll(MW 400,000)和0.65M蔗糖的溶液II並將整滴置於套環上，將該套環投放入液氮。復甦時，將該套環置於20μl含0.25M蔗糖的基礎培養基中30秒，再將20μl基礎培養基加到此液滴上，放置1分鐘，最後加入2ml基礎培養基。然後，通過測定活動能力獲得活精子。
應理解本發明並不限於上面所示範的具體的實施方案，其還包括屬於下列權利要求範圍的所有此類變更的形式。
權利要求
1.用於生物樣品的玻璃化的系統，其包括
(a)套環；
(b)包含保持在所述套環中的冷凍保護劑的基礎培養基；和
(c)包含在所述基礎培養基中的一種或多種玻璃化的發育細胞；
其中所述一種或多種玻璃化的發育細胞在復甦後將是有生存能力的。
2.權利要求1的系統，其還包括
(d)小瓶，其中該小瓶具有合適的大小和形狀以保存含有一種或多種玻璃化的發育細胞的套環。
3.權利要求1的系統，其中該套環保持1-5μl的體積。
4.權利要求1的系統，其還包括
(d)與所述一種或多種玻璃化的發育細胞直接接觸的冷凍物質。
5.權利要求1的系統，其中該發育細胞包含卵母細胞、桑葚胚或囊胚。
6.權利要求1的系統，其中該發育細胞包含胚胎。
7.用於生物樣品的玻璃化的系統，其包括
(a)套環；
(b)包含保持在所述套環中的冷凍保護劑的基礎培養基；和
(c)與所述套環接觸的復甦液。
8.權利要求7的系統，其中該套環保持1-5μl的體積。
9.用於生物樣品的玻璃化的系統，其包括
(a)轉移工具；
(b)包含冷凍保護劑的培養基的薄膜，其中通過培養基和轉移工具之間的粘附力將所述薄膜保持在一定位置；和
(c)保持在所述薄膜中的一種或多種發育細胞。
10.權利要求9的系統，其中所述轉移工具包圍所述薄膜。
11.權利要求9的系統，其中該發育細胞包含卵母細胞、桑葚胚、囊胚或胚胎。
12.權利要求9的系統，其中該發育細胞包含胚胎。
全文摘要
本發明涉及生物樣品玻璃化的方法。根據本發明的方法，使生物樣品與冷凍物質直接接觸。接觸該冷凍物質時，該生物樣品發生玻璃化。已發生玻璃化的物質可以貯存一段時間，以後再復甦。復甦後的生物樣品依然存活。根據本發明優選的生物樣品是發育細胞。
文檔編號A01N1/02GK1934940SQ20061006822
公開日2007年3月28日 申請日期1999年10月13日 優先權日1998年10月14日
發明者T·福雷斯特 卡特裡娜, T·萊恩 米歇爾 申請人:T·福雷斯特 卡特裡娜, T·萊恩 米歇爾