血小板特異性的嵌合性免疫球蛋白及其使用方法

2023-05-29 18:21:31 8

專利名稱：：血小板特異性的嵌合性免疫球蛋白及其使用方法
技術領域：
：本發明所屬技術領城在凝血塊的形成過程中，血小板的凝聚起著主導作用，在正常的情況下，凝血塊是為了防止血細胞從血管中漏出。但是，在某些病狀下，凝血塊會限制或者完全地阻止血液的流通，導致細胞壞死。例如，在動脈粥樣化的位點發生的血小板凝聚及其隨後形成的血栓是形成眾多疾病，例如，心膠痛、急性心肌梗塞以及在成功地進行了凝血溶解和血管成形後的再次阻塞的重要原因。急性心臟病患者一般都接受溶血製劑，例如組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和鏈激酶的治療，這些製劑將溶解凝血中的血纖維蛋白。與血纖維蛋白作用相伴隨的主要的併發症是血小板凝聚所引發的再次閉塞，它還能夠造成心臟的進一步受損。由於糖蛋白(GP)IIb/IIIa受體是已知的引起血小板凝聚的主要因素，那麼，封閉這些受體的製劑就被認為是能夠減少甚至完全防止在凝血溶解治療後的再次閉塞並從而提高溶血的速率。這些製劑還被認為是可以用在其它的血管閉塞性和血栓栓塞的疾病中。封閉血小板凝聚的一種方法是使用對GPIIb/IIIa受體為特異性的單克隆抗體。在歐洲專利申請第205,207和206,532號中，揭示了鼠單克隆抗體，命名為7E3，該抗體抑制血小板的凝聚並表現為可用於治療人的血栓疾病。已知的是鼠單克隆抗體具有的某些特性能夠嚴重地限制它們在人體治療中的應用。作為外源性蛋白，鼠抗體能夠刺激那些降低或者損害其治療效率和/或在患者身上引起變應性和過敏性反應的免疫反應。在血栓栓塞疾病中，需要重複使用這些治療製劑，因而就會提高這類免疫反應的發生率。包括非人體來源的結合區與人體來源的恆定區的嵌合性抗體已被提出並被認為是消除鼠抗體的這些免疫反應的一種措施，見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(81)6851(1984)和PCT申請NO.PCT/GB8500392。由於恆定區主要負責抗體分子的免疫反應性，那麼帶有人體來源的恆定區的嵌合性抗體就被推測為很少引起人體的抗鼠反應。然而，無法預測的是把人體來源的恆定區與具有所需要的特異性的鼠結合區相結合是否一定能夠使所得到的嵌合性抗體的免疫反應被降低和/或改善其結合能力(例如，免疫致病性的程度和/發生次數)。與本發明相關的
背景技術：
本發明涉及包括有非人體來源可變區或抗原結合區與人體來源恆定區的血小板特異性嵌合免疫球蛋白。這種嵌合免疫球蛋白可以是對GPIIb/IIIa受體或其它血小板成分為特異性的。這些抗體可與血小板結合併且防止血小板凝聚，從而用作抗血栓劑使用在防止或降低在各種臨床情況下(例如，溶解血栓治療之後以及伴隨著血管成形術)發生的血管閉塞及復發性閉塞和在防止血管狹窄及重複性狹窄之中。在另一個實施方案中，與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體相結合的試劑被用於減少和防止堵塞、復發性堵塞(例如，急性堵塞)、狹窄和/或重複性狹窄。本發明的抗血小板抗體還可以用於造影。附圖的簡要說明圖1是使用克隆化的可變區作為探針對7E3單克隆抗體的mRNA的重鏈和輕鏈的Northern分析。圖2A和2B是質粒β7E3VKhCK(圖2A)和p7E3VHhCG4(圖2B)，它們各自帶有對嵌合性7E3免疫球蛋白的輕鏈和重鏈進行編碼的嵌合性基因結構。圖3是由載體p7E3VKhCK和p7E3VHhCG4編碼的嵌合性7E3免疫球蛋白與血小板的結合。圖4是嵌合性7E3(c7E3)免疫球蛋白對血小板凝聚的抑制。圖5是說明血漿抗體濃度(ng/Ml)對時間(天數)的點陣圖解，表明在三位長期冠心病患者接受5分鐘靜脈滲透0.20-mg/kg劑量的c7E3Fab後，c7E3Fab(γ1，κ)的迅速從血漿中消失的速度。圖6A-6C是在使用了抗體(γ1，κ)兩小時後一次施給嵌合性7E3Fab(0.15mg/kg，0.20mg/kg或0.25mg/kg)濃縮藥丸對血小板活性的效果的總結。當對受體封閉(圖6A)，血小板凝聚(圖6B)，和失血時間(圖6C)進行分析後，這些劑量對血小板活性的作用得到證實，其中的線條是平均值。圖7A-7C表明在進行血管成形術之前以0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥c7E3Fab(γ1，κ)的抗血小板效果的作用時間。其中的線條表明的是在基線上時間為0至第24小時的受體封閉(圖7A)，血小板凝聚(圖7B)，和失血時間(圖7C)的平均值。圖8A-8C總結的是在11位患者中按0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥，然後再進行12小時c7E3Fab(γ1，κ)的連續滲透(10μg/分)的抗血小板活性。其中的線條表明的是受體封閉百分度(圖8A)，給藥前的血小板凝聚百分度(基線上的零點)(圖8B)，和失血時間(圖8C)的平均值。圖9是在實施例4中對47位患者進行滲透後的從基點到24小時的血細胞比容的絕對變化值。圖10是表明對三組接受治療的人員進行隨機處理後，不需要進行緊急重複經皮血管治療的概率的Kaplan-Meier點陣圖。圖11是對接受治療的人員中的關鍵組(圖中右側)的優勢比例和95％的置信區間的圖示。其中的數據表示主要效率終點[死亡，非致命性梗塞，緊急血管成形或手術，對不應性局部缺血放置冠狀動脈內斯坦特(stent)或主動脈內的氣囊泵]。此外，對每一亞組的主要終點的絕對事件比率在左側例表給出[事件比率(％)]。圖12給出的是所有患者中在6個月追蹤期不發生事件的分數。圖13表示的是在那些接受了成功的治療之後30天沒有發生事件的患者之中的在隨後6個月追蹤期內不發生事件的患者的分數。圖14表示的是在接受了成功的初期治療後48小時沒有發生事件的患者在隨後6個月追蹤期內不發生事件的患者的分數。圖15表明的是在所有的患者中在隨後6個月追蹤期內不需對與治療有關的動脈(PRA，治療有關的動脈)進行血管再造的患者的分數。圖16表明的是125I-c7E3Fab與未刺激的HUVEC的結合飽和度。該飽和數據被用於產生在圖17A-17E中的點陣圖(Scatchardplots)。圖17A-17E顯示了對125I-c7E3Fab與未刺激的HUVEC的結合飽和度的點陣圖(Scatchardplots)(圖17A)；HUVEC被用50單位/ml的TNFα刺激24小時(圖17C)；在不含血清的培養基中的未被刺激的HUVEC(圖17D)；未被刺激的HUVEC在有0.02％疊氮化物存在來防止抗體的加冒和內化(圖17E)。HUVEC用提高濃度的125I-c7E3Fab培養，存在有或不存在100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性結合。結合的125I-c7E3Fab為橫坐標，被游離抗體除過的結合數量為縱坐標。曲線的線性回歸得到的公式在圖中給出。直線(-)的斜率被定為Ka值。與Y軸的交叉是BMAX或最大抗體結合量。每一個圖中的數據點都是三份重複實驗的平均值。圖18顯示125I-LM609與內皮細胞結合的點陣圖(Scatchardanalysis)HUVEC用提高了濃度的玻連蛋白受體-特異性抗體125I-LM609培養，存在有或不存在有100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性的結合。結合的125I-LM609為橫坐標，被游離抗體除過的結合數量為縱坐標。曲線的線性回歸得到了公式Y＝1.0831e+10-1.2188e+9xR2＝0.888。直線(-)的斜率被定為K值。與Y軸的交叉是BMAX或最大抗體結合量。每一個圖中的數據點都是三份重複實驗的平均值。圖19顯示了抗體與125I-c7E3Fab對內皮細胞的競爭性結合。HUVEC用1μg/ml125I-c7E3培養，存在有提高了濃度的未標記的競爭物。抗-CD51是單克隆抗體，識別玻連蛋白受體的α-鏈；抗-IIIa是與GPIIIa反應的單克隆抗體；玻連蛋白是從人血漿中分離出來的天然蛋白質；c7E3Fab是嵌合性7E3Fab片段；m7E3IgG是鼠7E3IgG；抗-7E3是兔的可變區特異性抗-7E3抗體；LM609是單克隆抗體，結合複合體αVβ3(玻連蛋白受體)，但是，不結合GPIIb/IIIa；10E5是單克隆抗體，與GPIIb/IIIa反應，但是，不識別內皮細胞GPIIb/IIIa；嵌合性MT412是抗-CD4抗體，作為同模相符的嵌合性Fab片段的對照。每個數據點都是三份重複實驗的平均值。圖20A-20B的柱形圖顯示在用c7E3Fab處理之後，在內皮細胞上的粘性蛋白質的表達。用c7E3Fab處理過4小時後的在HUVEC上的E-選擇蛋白表達，以及用c7E3Fab處理過24小時後的在HUVEC上的ICAM-1的表達，都用125I-抗-E-選擇蛋白結合(圖20A)或125I-抗-ICAM-結合(圖20B)監測。HUVEC被用指定的濃度的7E3Fab或嵌合性MT412Fab(一種抗-CD4的，同模相符的陰性對照抗體)抗體處理4小時或24小時。TNFα被用來作為陽性對照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1表達。每個數據點都是三份重複實驗的平均值+SEM。圖21A-21B的柱形圖顯示PMN與用c7E3Fab處理後的內皮細胞的黏結。HUVEC被用100μg/ml嵌合性7E3Fab或100μg/ml嵌合性MT412Fab抗體處理了4小時(圖21A)或24小時(圖21B)。TNFα被用作陽性對照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1表達，以及它們對PMN的黏結。每個數據點都是三份重複實驗的平均值±SEM。本發明的技術方案本發明的嵌合免疫球蛋白包括單個的免疫球蛋白嵌合重鏈和嵌合輕鏈。嵌合重鏈包括從非人體來源的抗原結合區(從對血小板為特異性的非人抗體的重鏈衍生的，例如，從對GPIIb/IIIa受體為特異性的抗體衍生的)與人體來源的重鏈恆定區結合在一起。嵌合性輕鏈包括非人抗原結合區(例如，從非人體來源的抗體的輕鏈衍生的抗原結合區)與人體來源的輕鏈恆定區結合在一起。本發明的免疫球蛋白可以是單價的，雙價的或多價的。單價的免疫球蛋白是二聚體(HL)，由嵌合重鏈通過二硫鍵與嵌合輕鏈相結合在一起而形成的。二價的免疫球蛋白是四聚體(H2L2)，由兩個二聚體通過至少一個二硫鍵結合在一起而形成。多價的免疫球蛋白也可以被製造出來，例如，使用可聚合的重鏈恆定區(例如，μ重鏈恆定區)。嵌合免疫球蛋白片段，例如Fab、Fab』、和F(ab』)2也可被製造出來。嵌合免疫球蛋白的非人體來源的抗原結合區是從對血小板為特異性的免疫球蛋白中產生。優選的免疫球蛋白是對血小板GPIIb/IIIa受體為特異性，並且能夠阻止配體結合到糖蛋白的IIb/IIIa受體的複合體上。當血小板粘結在血管壁受到損傷的位置時就開始產生血栓。血小板的粘結是受血小板表面受體調控的，這些受體與暴露出來的內皮下組織的細胞外的基質蛋白相結合，例如vonWillebrand因子，膠原，纖維連結素，玻連蛋白和昆布胺酸。血小板的粘結導致單層的血小板排列。隨後血小板的激活是在對激活劑，例如腎上腺素，ADP，膠原或凝血酶等發生反應時產生。激活導致血小板表面的糖蛋白IIb/IIIa受體(GPIIb/IIIa)被暴露出來。在被激活的血小板上的GPIIb/IIIa就可與纖維蛋白原相結合，並且調控血小板的凝聚。GPIIb/IIIa與其它粘結性蛋白的結合，例如vonWillebrand因子的結合還可以導致血小板的交聯和凝聚。因此，粘結性分子例如纖維蛋白原和vonWillebrand因子與GPIIb/IIIa的結合就造成血小板的凝聚，並且是血栓形成中的一個共同步驟，這樣就使得GPIIb/IIIa受體成為治療劑的具有吸引力的靶標，這些治療劑可以幹擾GPIIb/IIIa與這些分子的相互作用。此外，使用抗GPIIb/IIIa嵌合抗體可以在不幹擾血小板的初始粘接的條件下抑制被激活的血小板的凝聚。這種對血小板凝聚的選擇性的抑制可能正是人們所期望的，因為在不發生凝聚的條件下血小板的粘結可以對止血有利。適宜的對血小板為特異的抗體包括7E3和10E5。參見歐洲專利申請205,207號，206,532號，和206,533號，其中的教導通過引述在此結合於本文。最優選的是的7E3抗體(或者是與相同的或功能上等同的對象產生反應的抗體)，因為它是對複合形式的GPIIb/IIIa受體為特異性的。其它的對GPIIb/IIIa受體(被7E3識別的抗原)為特異的抗體，例如那些對IIb/IIIa成分為特異性的抗體也可被使用。還可以使用對其它血小板抗原為特異性的抗體。例如與血小板α粒膜蛋白GMP-140起反應的抗體，例如S12抗體(J.Biol.Chem.，2599799-9804(1984)；美國專利No.4,783,330)也可被使用。嵌合抗體的抗原結合區可以從非人體來源的免疫球蛋白中衍生。優選的抗原結合區來源於鼠，因為鼠抗血小板，特別是GPIIb/IIIa受體的抗體可以從鼠中產生並且是可獲得的。其它的動物和嚙齒類提供了抗原結合區的另外來源(參見Newmanetal..Bio/technology，101455-1460(1992))。在一個實施方案中，嵌合免疫球蛋白的抗原結合區包括非人體來源的對血小板為特異性的免疫球蛋白的、足夠對抗原結合區為特異性或選擇性的至少一部分，例如從非人體來源的免疫球蛋白產生的一種或多種輔助性確認區(參見Winter，美國專利No.5,225,539，歐洲專利No.0,239,400，英國專利No.2,188,638；Adairetal.，WO91/09967；Jolliffeetal.，WO91/09966)。在另一個實施方案中，嵌合免疫球蛋白包括至少一條由非人體來源的免疫球蛋白的重鏈的可變區與人體來源的重鏈的恆定區的至少一部分相連接的嵌合重鏈和一條從非人體免疫球蛋白的輕鏈產生的可變區與人體來源的輕鏈的恆定區的至少一部分共價連接的嵌合輕鏈。其它的可變區與恆定區的組合方式也是可能的(參見美國專利第5,169,939號)。嵌合抗體的恆定區是從人免疫球蛋白中產生的。重鏈恆定區可以從五種同型物α，δ，ε，γ，μ中選擇。進而言之，不同亞組的重鏈(例如IgG亞組重鏈)對不同的功能因子負責，因此，選擇所需的重鏈恆定區就可以產生具有所需功能因子的嵌合抗體。優選的恆定區是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)，和γ4(IgG4)。輕鏈恆定區可以是κ和λ型。總而言之，在製備嵌合抗體時對嵌合免疫球蛋白的每一輕鏈和重鏈成分都製造一個融合基因，該基因包括對非人體來源的血小板特異性可變區的功能部分的至少一部分(如將可變區與相鄰段進行功能性重新安排)進行編碼的第一DNA片段與對人體來源的恆定區的至少一部分進行編碼的第二DNA片段連接。每一個融合基因都是在表達載體中組建或插入到其中，產生含有處於可表達形式的融合基因的表達載體。在一個實施方案中，含有抗原結合區的DNA是通過間隔序列與恆定區共價結合在一起。在另一實施方案中，可以製造出缺少一個或多個間隔序列的結構。能夠表達這些基因產物的受體細胞就被用這些基因進行轉染。被轉染的受體細胞在允許對所插入的基因進行表達的條件下進行培養，然後回收表達出來的免疫球蛋白和免疫球蛋白鏈。對Ig輕鏈和重鏈的可變區進行編碼的基因可以從產生血小板特異性抗體的淋巴細胞中獲取。例如，那些產生抗GPIIb/IIIa抗體的雜交瘤細胞系是本發明嵌合抗體的免疫球蛋白可變區的一種來源。其它的嚙齒類細胞系也是可選用的。用人血小板或包含GPIIb/IIIa受體成分或血小板片段對嚙齒類進行攻擊，在產生抗體的細胞和骨髓瘤細胞系之間形成融合雜交細胞，將所得雜交細胞克隆化，選擇那些產生抗血小板或GPIIb/IIIa受體的抗體的克隆，從而產生所需的細胞系。用常規的克隆技術可以從人的產生抗體的細胞中得到恆定區。另外，由於代表兩類輕鏈和五類重鏈的基因已經被克隆化了，所以人體來源的恆定區可以從這些克隆中得到。嵌合抗體結合片段例如F(ab』)2和Fab片段可以通過將嵌合重鏈基因製成被剪切的形式而製取。例如，對F(ab』)2重鏈部分進行編碼的嵌合基因包括對重鏈的關節區和CH1部分進行編碼的DNA序列。這些片段可以通過對嵌合免疫球蛋白進行酶切來得到。例如，使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶切可以分別得到Fab和F(ab』)2片段。優選地，對嵌合輕鏈和重鏈(或它們的一部分)進行編碼的融合基因可以裝配於兩種不同的並可對受體細胞進行共轉染的表達載體之中。每一個載體都包含兩個可選擇的基因，一個基因用於在細菌系統中進行選擇，另一個用於在真核細胞體系中進行選擇，每一個載體含有不同的一對基因。這些載體可以使融合基因在細菌系統中生產和放大，然後在真核細胞中進行共轉染並選擇被共轉染的細胞。用於細菌體系的可選擇的基因包括例如那些具有氨苄青黴素抗性的和那些具氯黴素抗性的基因。在對真核轉染物進行選擇的兩種選擇性基因優選(i)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(gpt)，和(ii)從Tn5來的磷酸轉移酶(定名為neo)。選擇gpt依據的是這個基因所編碼的酶將黃嘌呤作為底物合成出嘌呤核苷酸的能力；其它的內生性酶的類似物是無法完成這一任務的。在含有黃嘌呤黴酚酸的培養基中，因為該培養基可以阻止次黃苷單磷酸鹽轉變成黃嘌呤單磷酸鹽，所以，只有表達gpt的基因可以在其中存活下來。neo基因的產物封閉由抗生素G418和其同類的抗生素所造成的對在真核細胞中的蛋白合成的抑制。這兩種選擇程序可以同時使用或者順序使用，以對插入到真核細胞中的兩個不同的DNA載體上的免疫球蛋白鏈基因的表達進行選擇。優選的受體細胞系是骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞可以對轉染的Ig基因所編碼的免疫球蛋白進行合成，組建和分泌。此外，它們還具有對免疫球蛋白進行糖化的機制。特別優選的受體細胞是一種不產生Ig的骨髓瘤細胞系，例如，SP2/0。這些細胞系僅僅產生由轉染的免疫球蛋白基因所編碼的免疫球蛋白。骨髓瘤細胞可以在培養基中或者在小鼠的腹膜中生長，並分泌免疫球蛋白，然後從腹水中獲取這些免疫球蛋白。其它的淋巴細胞例如B淋巴細胞或雜交瘤細胞也可作為適當的受體細胞。現在已有幾種用含有免疫球蛋白編碼基因的載體對淋巴細胞進行轉染的方法。一種優選的將DNA引入到淋巴中的方法是電穿孔法(electroporation)。在這一方法中，在有要被引入的DNA存在的條件下對受體細胞進行電脈衝刺激。參見Potteretal..Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161(1984)。另一種引入DNA的方法是原生質體融合。在這一方法中對含有包含嵌合Ig基因的重組質粒的細菌的細胞壁用溶菌酶進行處理。所得到的原生質球與骨髓瘤細胞用乙二醇進行融合。原生質融合完成後，對被轉染的細胞進行選擇和分離。另外的一種可以將DNA引入到眾多細胞的方法是磷酸鈣沉澱法。嵌合免疫球蛋白基因還可以在非淋巴細胞中進行表達，例如在細菌或酵母菌中。當在細菌中進行表達時，免疫球蛋白重鏈和輕鏈就變為內含體的一部分。因此，這些鏈就必須被分離和提純，然後組建到功能性免疫球蛋白分子中。其它的在大腸桿菌E.coli中進行表達的方法是已知的(參見Pluckthun，A.，Bio/Technology，9545-551(1991)；Skerra，A.etal.，Bio/Technology，9273-278(1991))，包括從E.coli分泌含有信號序列的融合蛋白。血小板特異性嵌合免疫球蛋白的用途本發明的嵌合血小板特異性抗體可用作抗血栓治療製劑。例如，嵌合抗體(或其片段)可用於患有血栓或具有發生血栓危險的患者以抑制血小板的凝集和血栓的發生。這些抗體還可以用於抑制由血小板凝集引起的血流異常(例如，血液循環異常)及其進而造成的血栓或血栓的復發情況。這些抗體可以用於防止血栓形成或復發性血栓(復發性閉塞)的各種情況。此外，這些抗體還可用於抑制狹窄或復發性狹窄(減低，延遲或預防)的各種情況。例如，患有或可能患有冠狀動脈疾病的患者可以通過使用有效劑量的本發明的嵌合抗血小板抗體或抗體片段(例如，嵌合抗GPIIb/IIIa抗體或優選其片段，例如，嵌合7E3Fab或F(ab』)2)來抑制血管的閉塞，復發性閉塞，狹窄和/或復發性狹窄。例如，本發明的抗體可以使用於個體(例如，哺乳動物，例如人)以防止肺部血栓，瞬時性失血(TIA)，深度靜脈血栓，冠狀動脈分流手術，插入人造瓣膜和血管(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)或安置血管(冠狀或外周)斯坦特。本發明的抗體還可以用於患者在進行冠狀動脈介入術(例如，血管成型術、安置斯坦特、安放斯坦特的血管成型術、血管移植)或其它的血管介入術[例如安置外周血管斯坦特，放置人造瓣膜或容器(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)]。例如，抗體可以在對個體進行氣囊，冠狀動脈癍塊切除(atherectomy)，和雷射血管成形術(angioplasty)及其它適當的血管成形術之前，之中或之後來防止血小板凝集或血栓。抗體可在進行血管成形術之前，之中和/或之後使用。這類處理方式可以防止血栓的形成，進而降低在血管成形術之後的併發症的出現，例如，死亡、心肌梗塞，進行導致PTCA時的局部缺血事件或冠狀動脈分流手術(急性局部缺血事件)。此外，這種治療可以獲得長期的效果，減少冠狀動脈介入手術(例如，血管成形術、安置斯坦特、安置斯坦特的血管成型術)的局部缺血事件和併發症的發生，例如，死亡、心肌梗塞，導致進行PTCA時的局部缺血事件或冠狀動脈分流手術(血管再造)，指示性降低，延遲或防止狹窄或復發狹窄。另外，在進行各種手術之前、之中和/或之後使用本發明的抗體，還可以長期降低或防止由於其它的血管介入術[例如，安置外周血管斯坦特、插入人造瓣膜或容器(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)]造成的局部缺血或綜合症的發生。例如在實施例4中所示，當在進行血管成形手術[經皮經腔冠狀動脈血管成形術(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)]之前將嵌合抗血小板抗體(嵌合7E3Fab片段)作為輔助治療劑使用時，就可以提高失血時間，並且降低拮抗劑引導的血小板凝聚，正如用體外血小板凝聚檢測方法所測的結果所示。在實施例4和5中的實驗的結果還表明對血小板GPIIb/IIIa的封閉和用c7E3抗體(Fab片段)對血小板凝聚的抑制可以在人的體內產生有效的抗血栓效果。在實施6和7中給出的結果是使用嵌合7E3抗體片段的隨機的雙盲性對照研究結果。在實施例6中給出的數據揭示了對進行血管成形手術和有發生血管堵塞(復發性閉塞)高度危險的患者給以嵌合7E3抗體片段，可以有效地防止急性堵塞，同時降低了急性局部缺血的發生。正如在實施例7中進一步所表明的，對這類患者採用相同的處理可以降低、延遲、和/或防止以後的復發性血管狹窄。這種使用嵌合抗GPIIb/IIIa抗體片段(見實施例7)所產生的對非急性局部缺血併發症的長期有利效果是沒有先例的。此外，那些能夠選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結合的化合物和試劑可以用來防止或者降低狹窄或重複性狹窄的發生，同時能夠帶來有效的在臨床上降低非急性局部缺血併發症的發生率。當使用這些化合物時，還可以另外地防止閉塞或者重複性閉塞。這些化合物包括，例如GPIIb/IIIa拮抗藥，免疫球蛋白或非免疫球蛋白的肽或蛋白質(例如合成性的或者重組的)及它們的類似物，核苷酸或核苷酸類似物。當患有或有可能患冠狀動脈疾病的患者接受有效劑量的這些選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結合的化合物時，就可以抑制血管的閉塞，復發性閉塞，狹窄和/或復發性狹窄。在一個實施方案中，血管的狹窄和/或復發性狹窄都可以通過給予有效治療劑量或預防劑量的一種能夠同GPIIb/IIIa或被指定為αvβ3的玻連蛋白受體相結合的化合物或製劑[例如，GPIIb/IIIa拮抗物、免疫球蛋白、非免疫球蛋白的肽或蛋白質(例如，合成性的或重組性的)、它們的類似物、核酸或核酸類似物]來得到抑制。血小板糖蛋白GPIIb/IIIa(還被稱為CD41/CD61)屬於整合蛋白受體，這類物質擁有共同的結構和免疫學特徵。與GPIIb/IIIa非常接近的一個整合蛋白是玻連蛋白受體(αvβ3，也被稱為CD51/CD61)，它使用與GPIIb/IIIa同樣的β亞單位(即β3)，但是具有不同的α亞單位。玻連蛋白受體是在細胞上表達的，例如，內皮細胞和平滑肌細胞(而且，在某些程度上，也在血小板上表達)，調節對許多胞外性基質蛋白(例如，玻連蛋白、纖連蛋白、vonWillebrand因子、血纖蛋白原、骨橋蛋白、血小板反應蛋白、膠原、基底膜聚糖)的黏結。GPIIb/IIIa與玻連蛋白受體之間具有足夠的同源性，所以，直接抗GPIIb/IIIa的單克隆抗體7E3也同樣與在內皮細胞上表達的玻連蛋白受體相結合(實施例10)。對血管壁的損傷導致一系列細胞活性和增殖的調節子的釋放。血小板凝集、血小板脫粒作用、倒位、在凝聚中涉及的血小板表面現象都導致血栓形成並釋放其它的因子(例如，生長因子和細胞激活素，如由血小板衍生的生長因子)，從而刺激在受傷位點的細胞增殖和遷移。炎症細胞激活素可以引起產生基質蛋白(例如，膠原、骨橋蛋白、玻連蛋白)，並積聚在受傷位置。這樣，細胞遷移就被激發，血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬體、成纖維細胞、以及其它的炎症因子就向傷口遷移，導致傷癍(例如，動脈粥樣化)，使血管流徑變窄(狹窄或復發性狹窄)。當細胞(例如，內皮細胞)遷移到傷口的時候，αvβ3整合蛋白或玻連蛋白受體也被牽涉於其中。αvβ3就與粥樣化傷癍中的胞外基質蛋白結合，例如，玻連蛋白、骨橋蛋白或其它的基質蛋白。交聯的αvβ3受體，例如與玻連蛋白結合之後，就可以送出遷移/活化信號，還可以產生促進遷移的物質。復發性狹窄使血管流徑變窄，導致血栓發生。在不受某一具體理論限制的同時，應該有理由相信給以能夠結合GPIIb/IIIa和αvβ3，並能夠抑制它們的功能的製劑(例如，抗體c7E3Fab)，就可以抑制血小板凝集、脫粒和倒位，並能夠使血管壁鈍化，不宜形成血栓和發生急性臨床病症。因此，就可以降低凝聚中涉及的血小板表面現象，使凝血酶的生成數量被減小，其它的因子的釋放被降低(例如，生長因子和細胞激活素)，抑制細胞的增殖、遷移，以及抑制傷癍的形成。根據前所未見的長期效果，例如在給予嵌合性抗-GPIIb/IIIa抗體片段(見實施例7)顯示的對非急性局部缺血綜合症的降低那樣，給予能夠與存在於內皮細胞上的血小板GPIIb/IIIa和αvβ3整合蛋白反應並抑制其功能的試劑(例如，抗體c7E3Fab)，就可以降低和防止冠狀動脈介入術後的非急性局部缺血綜合症(例如，手術後3-6個月或更長)。例如，可以給予的有與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體結合的抗體、抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab』、F(ab』)2等。適宜的抗體可以是多克隆的或單克隆的，術語抗體和免疫球蛋白包括多克隆抗體和單克隆抗體。術語抗體和免疫球蛋白還包括單鏈抗體、嵌合性抗體、人源化抗體、靈長源化抗體(CDR-剪切)，以及包含從不同種來源的不同部分的嵌合性或CDR-剪切的單鏈抗體。參見例如Cabilly等人的美國專利第4,816,567號；Cabilly等人的歐洲專利第0,125,031B1號；Winter的美國專利第5,225,539號；Winter的歐洲專利第0,239,400B1號；還可以參見Newman，R.等人BioTechnology，101455-1460(1992)關於靈長源化抗體；Ladner等人的美國專利第4,946,778號和Bird，R.E.等人在Science，242423-426(1988)關於單鏈抗體的文章。可以使用同GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體結合的鼠7E3或嵌合性7E3抗體。在另外一個實施方案中，使用的抗體是在GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體上與7E3抗體結合的同一表位發生反應的抗體(功能性等同物)。例如，可以使用阻止7E3單克隆抗體與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體的結合的抗體。在一個優選的實施方案中，這種交叉反應的抗體或其部分(例如，Fab片段)對血小板上的GPIIb/IIIa受體和對內皮細胞上的玻連蛋白受體都有很高的親和性，例如，至少為約5.0×107M-1，或更高，優選約1.0×108M-1。這樣的抗體可以通過適宜的免疫原來得到(例如，血小板、分離的和/或純化的GPIIb/IIIa或αvβ3、或它們的鏈的成分、特別是β3鏈，這些物質的部分或它們的合成分子，例如合成性肽)。對於免疫抗原、多克隆或單克隆抗體的生產，可以採用任何適宜的方法。眾多的這類方法已經被介紹了[參見例如，美國專利第5,336,618號(Coller)；Kohler等人，Nature，256495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；Milstein等人，Nature266550-552(1977)；Koprowski等人，美國專利第4,172,124號；Harlow，E.和D.Lane，1988，AntibodiesALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor，NY)；CurrentProtocolsInMolecularBiology，Vol.2(Supplement27，Summer1994)，Ausubel，F.M.等人，Eds.，(JohnWileySonsNewYork，NY)，Chapter11，(1991)]。給藥血小板的凝聚誘發鏈鎖凝固並且產生更加穩定的(血)纖維蛋白網狀結構和凝血塊，它們可以被血栓溶解劑來溶化掉。本發明的選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結合的抗體或化合物可以單獨地或與血栓溶血製劑，例如，纖維蛋白溶酶原激活子(例如，組織血纖維蛋白溶酶原激活子、尿激酶、鏈激酶、重組的組織纖維溶酶原激活子)，或抗凝固劑(例如，抗凝血酶)，或抗血小板劑例如阿斯匹林、肝素、水蛭素或香豆素抗凝固劑(例如苄丙酮香豆素)等結合使用於人體(如，人)，從而防止及降低血栓溶解治療後的復發性閉塞並加速凝血塊的溶解。這些化合物、抗體或其片段可以在使用血栓溶血劑、抗溶血酶製劑、抗凝固製劑或抗血小板之前、之後或同時按有效劑量使用，從而防止那些能夠導致閉塞或重複性閉塞的血小板凝集和/或延遲或防止狹窄或復發性狹窄。有效劑量的(即足以獲得所需治療效果的劑量，例如抑制血小板凝聚並從而抑制血栓的形成或復發性血栓的劑量，能夠降低或延遲或防止狹窄或重複性狹窄或局部缺血的有效劑量)化合物或抗體或抗體片段可以按腸胃外的形式，優選靜脈輸入的方式，在藥物上可接受的載體，例如無菌生理鹽水中對患者給藥。還可包括緩衝劑。這些抗體的製劑還可以包括另外的添加劑，例如穩定劑(多乙氧基醚80，USP/NF)。這些抗體可以單一劑量、連續性使用或以多重滲透(例如，濃縮藥團注射然後進行連續滲透)使用。此外，這些化合物和抗體還可以被可調控的釋放方式[例如，用聚合物或外貼緩釋裝置(patch)]或另外的適當的方式來給藥。給藥的劑量將要根據不同的因素，例如臨床症狀，患者的體重以及是否伴有其它藥物(例如，血栓溶解劑)等一起使用而決定。在用抗血小板抗體的重複治療中，會發生藥物引起的血小板減少症，其原因可能是身體將抗體所包被的血小板認作是外來蛋白質，從而產生更多的抗體來抵抗它們，並將它們以比正常情況更快的速度通過網狀內皮的系統清除出去。由於GPIIb/IIIa受體在血小板的表面上的濃度很高(每個血小板上有約80,000受體)以及在循環系統中的血小板的數量很大(約0.25-0.5×106/μl)，因而使用抗血小板抗體的治療的一個顯著的併發症是血小板減少症。然而，使用嵌合抗血小板(抗GPIIb/IIIa)抗體可以避免這種問題。本發明的嵌合抗血小板抗體可以消除(減少或防止)在使用其它抗血小板抗體時產生的血小板減少症。例如，在使用嵌合7E3Fab(參見實施例6和7)時只觀察到很少的血小板減少症的症狀的出現。另外，當對人給予嵌合7E3Fab抗體片段時，顯示出了與其來源於鼠的等同物相比為另人吃驚的低的誘發性免疫反應(參見實施例4和7)，特別是從對鼠7E3Fab的可變區的免疫原性的角度來看更是如此。當與血小板結合時，抗血小板嵌合性抗體的來源於鼠的主要成分就與血小板表面相結合，例如通過GPIIb/IIIa受體，因此，就將使得它們無法與免疫系統相接觸，並使嵌合抗體在功能上與其相對應的來源於人的抗相同表位的抗體無法區分。因此，本發明的其它嵌合抗血小板抗體儘管具有來源於鼠的抗原結合區，但是它們在非免疫性上是非常類似的。本發明的血小板特異性嵌合免疫球蛋白還可以用於血栓造影。要達到這一目的一般優選使用抗體片段。如上所述，嵌合性重鏈基因可以被以剪切的形式設計出來，從而生產出嵌合性免疫球蛋白片段(例如Fab，Fab』和F(ab』)2)用於免疫閃爍圖造影(immunoscintigraphicimaging)。這些分子可以直接用或者通過螯合劑例如DTPA被放射性同位素例如131碘，125碘，99m鎝，或111銦等標記，產生放射性免疫閃圖劑。另外可以在嵌合抗體位點中設置一個放射性金屬結合(螯合)區，從而對標記物提供位點。這樣，嵌合免疫球蛋白可以被設計為一種具有非人體來源的血小板特異性可變區、人體來源的恆定區(優選被剪切的)、以及一個由金屬結合蛋白質例如金屬硫因產生的金屬結合區的蛋白質。血小板特異性嵌合免疫球蛋白或其片段可以對那些被懷疑患有血栓的病人給藥。當以足夠的時間允許被標記的免疫球蛋白到達血栓位點區時，則由標記產生的信號被光掃描設備例如γ照相機檢測到。然後將檢測到的信號轉換成血栓的圖像。這種圖像就可以幫助在體內確定血栓的位置並設計出適合的治療方案。本發明將由以下的實施例得以進一步的說明，但並不受其限制。本發明的最佳實施例實施例1嵌合血小板特異性IgG4的製備A.總體方案由7E3雜交瘤對用於重鏈和輕鏈基因的可變區進行克隆化的總體方案是基於對功能性重新排列(和表達)Ig基因的可變區和相應的結合區(J區)的基因組之間的連接。J區DNA探針可以用於篩選基因庫以分離連接到J區的DNA，在種系表形(未被重新排列的)中的DNA還可以雜交到J探針中，但是並不連接到可變區序列上，可以通過對分離出來的克隆用限制酶分析對其進行確認。因此，克隆化的方案是使用JH和JK從被重新排列的重鏈和輕鏈基因中分離出可變區。對這些克隆進行Northern分析(Northernanalysis)以確認它們的序列是否在7E3雜交瘤中被表達。那些含有被表達了的序列的克隆被放置到含有人體來源的恆定區的表達載體中，並被轉染到小鼠骨髓瘤細胞中以確定是否有抗體的產生。然後對從細胞中產生的抗體與7E3鼠抗體比較以確定其結合特異性和功能性。有關的細胞系和鼠雜交瘤7E3被存放於ATCC(AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852，USA)，存放日期是1985年5月30日，保存號是HB8832，並被確認為是存活的。B.材料和方法除非另有說明，本文中所給出的份數和百分數都是以重量為基準的，溫度以℃度為準。重鏈基因組庫的構建為了從7E3雜交瘤中分離出重鏈的可變區基因，用噬菌體λ載體gt10建立了依照大小選擇的基因組庫。使用JH探針對被EcoRI消化的7E3DNA進行了Southern分析(Southernanalysis)，揭示了對應於被重新排列的重鏈的位置的一個單一的3.5kb帶。這個片段非常可能含有7E3重鏈可變區基因。從7E3雜交瘤細胞中分離出來的大分子DNA被用限制性內切酶EcoRI完全消化。然後對該DNA在0.7％瓊脂凝膠上進行分級分離，並從凝膠中直接獲取尺寸範圍為3-4kb的DNA。在用苯酚/氯仿萃取後和交聯葡聚糖G-50凝膠過濾後，對3-4kb的片段用λgt10臂(PromegaBiotech，Inc.)配位，再用從PromegaBiotech獲取的Packagene在體外將其包裝在噬菌體顆粒內。用32磷標記的JH探針在濃度為大約每150mm培養皿中有30,000噬菌體的條件下對這個庫進行直接篩選。在5×SSC，50％甲醯胺，2×Denhardt試劑，200μg/mL變性的鮭魚精子DNA中以42℃的溫度對這些噬菌斑進行雜化18-20小時。最後，用0.5×SSC，0.1％SDS在65℃進行清洗。用放射自顯影照相鑑定了陽性的克隆。輕鏈基因組庫的構建為了分離用於7E3輕鏈的可變區基因，在λ載體EMBL-3上構建基因組庫。大分子量的DNA用限制內切酶Sau3A進行部分消化，並在10-40％蔗糖濃度梯度上進行按大小尺寸的分組。具有18-23kb的DNA片段與EMBL-3臂相配位，然後再用Packagene將其在體外裝入到噬菌體顆粒中。用JK探針在濃度為大約每150mm培養皿中有30,000噬菌體的條件下對這個庫進行篩選。雜化和清洗的條件都與前述重鏈基因組庫的相同。DNA探針小鼠重鏈JH探針是含有J3和J4碎片的2kbBamHI/EcoRI的片段。小鼠輕鏈JK探針是含有所有5種JK碎片的2.7kbHindIII片段。32磷標記的探針用從Amersham，Inc.獲取的製劑盒進行缺口轉譯來製備。用交連葡聚糖G-50柱進行離心把游離的核苷酸去除。該探針的特異活性大約是109cpm/μg。Northern分析總量為15μg的細胞RNA用1％瓊脂/甲醛凝膠(Maniatis，etal，MolecularCloning)進行電泳並轉移到硝化纖維素上。在5×SSC，50％甲醯胺，2×Denhardt溶液和200μg/mL變性的鮭魚精子DNA中用42℃對漬點用缺口轉譯的DNA探針進行雜化。最後清洗的條件是0.5×SSC，0.1％SDS，65℃。採用電穿孔法的DNA轉染被轉染的質粒DNA被在溴化乙錠/氯化銫梯度離心至平衡兩次來進行純化。將10-50μg的質粒DNA加到放置在冰上的處於PBS中的8×106SP2/0細胞中，將該混合物放在Biorad電穿孔設備上。進行電穿孔的電壓是200伏特，然後將細胞放置到96孔微滴盤中。48小時後用藥品進行篩選，然後經過1-2個星期將對藥物有抗性的克隆鑑定出來。抗體生產的定量化按照顆粒濃度螢光免疫分析法(Jolley，M.E.etal.，(1984)J.Immunol.Meth.6721)用純化的IgG得出的標準曲線分析組織培養上清液中的IgG蛋白含量。使用山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和用結合有山羊抗人IgGFc抗體的螢光素對帶有人恆定區的嵌合7E3抗體的濃度進行確定。本分析用自動化的儀器(PandexLaboratories，Inc.)完成。血小板特異性嵌合IgG4抗體的純化用DiafloYM100超濾膜(Amicon)對組織培養上清液進行濃縮，然後裝載到蛋白質A瓊脂糖柱上。用pH6.5-pH3.5的檸檬酸鈉的pH梯度將嵌合抗體從該蛋白質A柱上洗脫下來。被純化的抗體用DiafloYM100超濾膜進行濃縮。抗體的濃度根據其在280nm的吸收來確定。抑制結合的分析被純化的抗體(鼠7E3或嵌合7E3)與放射性碘化的7E3競爭與人血小板相結合。用檸檬酸化的人全血以1875rpm離心3.5分鐘來製備富含血小板的血漿(PRP)。將125碘標記的7E3抗體(150,000cpm)加入到適當稀釋濃度的純化的受試抗體中，然後加入150μlPRP中來啟動該反應。在室溫下保育1-2小時，然後將其放入0.4mLmicrofuge管中的30％蔗糖內以12,000g離心4分鐘將結合有抗體的血小板與游離的抗體分離開來。在管的尖部的含有血小板/抗體的小丸被取出並放在γ計數器上計數。碘化的7E3與嵌合7E3之間對血小板的競爭同碘化的7E3與未標記的7E3IgG之間的競爭進行比較。對血小板凝聚的抑制將純化的7E3或嵌合的7E3抗體加入到檸檬酸化的人全血中，並在37℃保育10分鐘。血小板凝聚的速率是在用膠原或ADP活化後使用全血集合度計(ChronologCorp.)測量的。C.結果血小板特異性可變基因區的克隆化在用JH和JK探針分別對大約100萬個噬菌斑進行篩選之後，從其重鏈和輕鏈基因組庫中分離出來了幾個陽性克隆。在進行了至少3次純化之後，從每一個陽性的克隆中分離出來了細菌噬菌體DNA，用EcoRI(重鏈克隆)或HindIII(輕鏈克隆)進行消化，並用1％瓊脂糖凝膠進行分組。將該DNA轉移到硝基纖維素上，用JH(重鏈)或JK32磷標記的DNA探針對漬點進行雜化。在重鏈中分離出兩個克隆，含有與JH探針雜化了的3.5kbEcoRIDNA片段。用JK探針鑑定出了兩類分別為3.0和6.0kb的HindIII片段。與來自於7E3雜交瘤的原始重鏈和輕鏈可變區相對應的克隆化的DNA要與從雜交瘤中分離出來的mRNA雜化。在重鏈或輕鏈位置上的非功能性DNA重新排列將不被表達。圖1給出的是Northern分析，表明的是推斷的3.5kbEcoRI重鏈片段和推斷的6.0kbHindIII輕鏈片段各自與來自7E3雜交瘤的適當大小的mRNA的雜化。這些亞克隆的片段被缺口轉譯進行32磷標記，並且被雜化到含有來自於SP2/0(7E3雜交瘤的融合伴侶)或來自於7E3的全RNA的northern漬點，如圖1所示。3.5kbEcoRI重鏈片段與7E3RNA的2kbmRNA發生雜化，而不與SP2/ORNA的2kbmRNA發生雜化。相似地，6.0kb輕鏈HindIII片段與7E3RNA的但不與SP2/ORNA的1250bpmRNA相雜化，這些尺寸分別是重鏈和輕鏈mRNAs的正確尺寸。因為克隆化的DNA片段含有在7E3雜交瘤中表達的序列，這些數據就表明這些克隆含有來自於7E3雜交瘤的正確的可變區序列。然而，其功能性的最後測試是由這些序列與適當的恆定區序列結合在一起時能夠指導合成具有與鼠7E3抗體相似的特異性和親和性的抗體而證實。載體和表達系統從7E3雜交瘤克隆化的推斷的輕鏈和重鏈V基因被結合到如前所述的(Sun，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))在表達載體中的人κ和G4恆定區基因中。pSV184ΔHneo17-1AVκhCκ的17-1AVκHindIII片段被用與來自於7E3的推斷的輕鏈可變區基因相應的6.0kbHindIII片段所取代。相似的pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG4的17-1AVHEcoRI片段被用與來自於7E3的推斷的重鏈V區基因相應的3.5kbEcoRI片段所取代。所得到的質粒，被命名為p7E3VκhCHκ和p7E3VHhCG4，如圖2所示。為了表達嵌合重鏈和輕鏈基因，將這兩個質粒共轉染到非生產型小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0中。輕鏈質粒具有對G418的抗性，重鏈質粒具有對黴酚酸的抗性，因此使得它們可以對含有從每一個質粒來的表達基因的克隆進行篩選。具有對G418和黴酚酸抗性的克隆被擴展到穩定的細胞系中並保持在有這兩種藥物的條件下。對從這些細胞系來的組織培養上清液測試抗體，使用的是顆粒濃度螢光免疫分析法，山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和被螢光素標記的同種抗體。在被檢測的最初10個細胞系中有一個產生大約2μg/mL抗體的細胞系(命名為c-7E3F6)被選來用於進一步研究。血小板結合活性的檢測在用蛋白質A瓊脂糖柱對c-7E3F6進行提純後，對抗體進行濃縮並用血小板結合活性檢測法與鼠7E3IgG進行比較。圖3表示的是鼠7E3和c-7E3F6(推斷的嵌合抗體)同放射性標記的7E3競爭與血小板同等程度的結合。結合曲線表明鼠7E3和嵌合7E3在這一標準下的結合特性是相等的。c-7E3F6對血小板凝聚的抑制純化的c-7E3F6與鼠7E3用測量受試抗體對人血小板凝聚的抑制力的功能性檢測來進行比較。其檢測的結果列於表4中，表明這兩種抗體在同樣濃度下對膠原引起的血小板凝聚的抑制程度是相等的。c-7E3F6還對ADP引起的血小板凝聚具有相似的抑制能力。血小板結合檢測以及抑制血小板凝聚的檢測表明(1)正確的可變區基因確實被從7E3雜交瘤克隆出來；(2)用人恆定區取代鼠恆定區並沒有對7E3可變區的結合和功能特性造成任何影響，正如這些檢測所示。纖維蛋白原包被的珠粒檢測嵌合c-7E3F6抗體在定量性、功能性的檢測中，即測定抗體抑制血小板同纖維蛋白原包被的珠粒的凝集的檢測中被發現是陽性的。Coller，B.etal.(1983)J.Clin，Invest，73325-338。實施例2嵌合IgG1和IgG3的生產對於從鼠7E3抗體來的重鏈的可變區進行編碼的DNA碎片通過以相應的7E3可變區片段取代17-1A重鏈或輕鏈可變區片段而連接到在表達載體pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG1和pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG3(Sunetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))上存在的人γ1和γ3恆定區。所得到的嵌合重鏈基因與嵌合輕鏈基因被共轉染到SP2/0細胞中，以獲得分泌γ1，K、和γ3，K抗體的穩定細胞系。實施例3對嵌合7E3Fab在人體應用上的初步研究製備嵌合7E3Fab片段嵌合7E3(c7E3)Fab片段的生產是用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶對純化的嵌合7E3IgG(γ1重鏈，κ輕鏈)進行酶消化來完成的。用一系列設計的純化步驟，即生產不含其它的消化的片段和汙染成分(例如，蛋白質、核酸、病毒)的純化步驟來分離Fab片段。最後的產品是一種無菌的非熱原溶液，含有2mg單克隆嵌合7E3Fab/mL0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉，pH7.2。在某些製劑中，包含有最終濃度為0.001％(w/v)的多乙氧基醚80。使用前用0.22微米低蛋白結合過濾器進行過濾。產品儲存於2-8℃。藥物動力學c7E3Fab在人體血漿中的消失人體血漿中的消失是在三個患有穩定的冠心病的患者中進行的。用5分鐘靜脈滲透給藥0.20-mg/kg的c7E3Fab，在給藥後的2分鐘起至72小時收取血樣。可預見的是有一部分的抗體以非結合態存在於血漿中。為了對這些非結合的抗體成分進行定量，要儘快地將血漿與血小板分離開來以防止在體外的進一步結合。用固相酶免疫分析法(EIA)檢測血漿中游離的c7E3Fab濃度。在該檢測中，從兔抗血清中提純的抗鼠7E3IgG親和性分離物被用於固相捕捉，同時還使用了在同樣的兔抗體7E3抗體製劑的生物素化的衍生物的基礎上建立的檢測體系。其結果列於表1。表1在用0.20-mg/kg劑量處理過的患者的血漿中的c7E3Fab濃度c7E3Fab(μg/mL)時間*患者A患者B患者C給藥前NDNDND2分鐘NA2.5542.3125分鐘1.1491.8731.41110分鐘0.7131.3311.11115分鐘0.6100.9160.85220分鐘0.4990.9850.75630分鐘0.4630.8150.51545分鐘0.3400.7040.4051小時0.3080.4360.1952小時0.2880.2620.1496小時0.2030.0950.10512小時0.1120.0720.06424小時0.0650.0580.05348小時0.0550.1470.17472小時0.196ND0.076*給藥與抽血的時間間隔。注意，在血被抽出來以後血小板還與血漿有額外的2分鐘接觸時間(即用離心方法對血漿的分離時間)。ND＝未檢測出/低於檢測的最低檢測水平(0.025μg/mL)。NA＝未獲得。如果將整個注射的7E3作為血漿中的游離抗體進行檢測，則抗體濃度的理論最大值就為大約5.0μg/mL(0.20mg/kg除以40mL血漿/kg)。然而，這一理論最大濃度是永遠無法獲得的，因為在注射的抗體中有很大一部分與血小板相結合了。事實上，在最早的那一次測定(2分鐘)時，血漿中平均c7E3Fab濃度(n＝2)是2.43μg/mL，這一數值是實測的最大血漿濃度(Cmax)。在注射後的按時間順序抽取的血樣中的測定值顯示了血漿中c7E3Fab濃度的迅速下降。在1小時和24小時的測定值顯示了在血漿(n＝3)中殘存的被注射的抗體的濃度分別小於0.5μg/mL和0.1μg/mL。在圖5中是血漿抗體濃度(ng/mL)對時間的點陣圖，以圖表的形式顯示了在得自所有3個患者的血漿中c7E3Fab的迅速消失。對c7E3Fab片段的藥物動力學特性進行了初步的分析。對獲得的血漿濃度的數據使用了幾種不同的模型，包括幾種混合的(隨機和固定效果)線性模型以及標準的兩室模型和不分室模型。血漿游離抗體的數據與標準的藥物動力學模型並不符合。由於對c7E3Fab的作用點是在血小板的受體上，游離抗體的血漿濃度與其作用點處的濃度不發生任何直接的聯繫這一結果並不是無法預見的。c7E3Fab在血漿中的迅速消失，部分上反應了抗體與血小板的GPIIb/IIIa受體的迅速結合。在所檢測的模型中隨機效果線性模型與血漿濃度的數據最相吻合。使用這一模型獲得了藥物動力學參數Clp，Vd和t1/2的初步值，並列於表2。表2c7E3Fab*的藥物動力學數值參數數值Clp(份數/小時)15.6Vd(L)6.8t1/2(小時)0.1(6分鐘)*使用了隨機效果線性模型對數據進行處理。Clp＝在血漿中的消失被定義為血漿濃度的下降除以該濃度的比率並被計算為每小時的速率，即如果在某一時刻的速率延續一小時，則計算的速率就將是在那一小時內去除的藥物的份數。Vd＝體積分布被定義為所給藥的劑量除以測定的血漿濃度與血漿體積的乘積。計算中對體重為70公斤的人選用3升血漿體積。t1/2＝半消除期。人體尿樣的檢測3名穩定的冠心病患者以靜脈注射0.25-mg/kgc7E3Fab後，收集他們的尿樣(這三名患者的血漿消失數據如上所述)。按以下的注射後的時間收取他們的尿樣0-2小時，2-6小時，6-12小時，12-24小時。此外，還收集了給藥前的尿樣。用對如上所述EIA進行了稍微修飾的方法在所收取的尿樣的選樣中測定游離的7E3Fab。在所有的案例中，都沒有在尿樣中檢測到c7E3Fab。基礎毒理學基礎毒理學的研究是用嵌合7E3Fab在18隻猴子(Cyonomolgus屬和獼猴屬)中進行的。濃縮藥丸劑量上至0.6mg/kg，然後滲透上至0.8μg/kg/分，共96小時(包括對肝素，阿斯匹林和重組的組織血纖維蛋白溶酶原激活子的研究)。在所有的猴子中、所有的劑量內以及所有的組合情況下，7E3都是安全的，並且完全都是可以忍受的，沒有任何顯著的失血併發症或其它的有害反應。在穩定的心絞痛患者中的嵌合7E3Fab的劑量階梯劑量梯度的研究是在52名停止接受抗血小板治療10天以上的穩定的心絞痛患者(男，43～75歲)中進行的。使用了不同的劑量。這些患者要麼接受了一次性靜脈注射0.15～0.30mg/kg嵌合7E3Fab(20名患者)，要麼是接受一次性濃縮藥丸，然後以12～96小時進行靜脈滲透(10μg/分)(32名患者)。在使用了濃縮丸劑c7E3Fab(0.15-0.30mg/kg)兩小時後，確定血小板GPIIb/IIIa受體的封閉，對20μMADP(拮抗劑)反應的血小板凝聚，以及失血時間。受體封閉和作為對拮抗劑反應的血小板凝聚是按照以上所述確定的(Gold，H.K.etal.，J.Clin.Invest.86651-659(1990))。失血時間是用Simplate方法進行確定的。正如受體封閉的百分數(由可利用的受體結合位點來確定)所指出的，隨著所用劑量的提高，對受體的封閉也逐步提高。在受體封閉增高的同時，相伴隨的還有對血小板凝聚抑制(以給藥前的數值或基線為準的百分數)的升高，以及失血時間的增長。在所有三個參數中的峰值都是在0.25mg/kg觀察到的。這一劑量相應的血漿濃度為5μg/mL，即在集合度計的小杯中有升高了濃度的嵌合7E3Fab存在時對正常人體的富含血小板的血漿保育15分鐘後觀察到抑制峰值的濃度。(從正常人體來的血漿的凝聚程度是用穿過小杯的光量的百分數來決定的。在加入拮抗劑之前，血漿相對來說是不透明的，將此時的透光量的百分數定為0點。當把拮抗劑ADP加入到不含抗體的對照樣品中時，隨著凝聚的發生，透光量就逐漸提高。然而，當有c7E3Fab存在時就觀察到了由劑量引起的對凝聚的封閉，並且完全抑制由5μg/mLc7E3Fab產生。)對受體的封閉，失血時間以及血小板凝聚的抑制的期間進行了確定。在兩小時處觀察到了受體封閉，血小板凝聚以及失血時間的峰值，並且是隨著時間而逐漸回復的。在6～12小時內失血時間回到接近正常值處。由於受體封閉和功能性抑制的峰值是以0.25mg/kg獲得的，所以對該劑量的藥物進行連續滲透所造成的血小板抑制的期間進行了檢測以確定血小板抑制的期間是否可以被延長。在5名接受了0.25mg/kg給藥並以10μg/分連續72小時滲透嵌合7E3Fab的患者中，受體封閉、血小板凝聚的抑制以及失血時間的延長的程度都在整個連續滲透的期間內保持不變，一旦連續滲透被中斷，就開始發生回復現象。在12、24、48、和96小時的滲透中也發生了同樣的結果。沒有任何一個患者發生了過敏反應。沒有與這種處理相關的在血液學和化學實驗數值上的顯著變化。也沒有任何嚴重失血現象發生。非顯著的失血現象是很少見的，僅在那些患有牙周病的患者中出現了輕微的牙齦滲血以及輕微的鼻出血。這一實驗的結果表明，嵌合7E3Fab可以按劑量對患者給藥，產生對血小板的抑制長達幾天的效果。免疫原性結果在鼠7E3F(ab』)2和Fab的實驗中(150名患者)，用敏感性酶聯免疫分析系統對免疫反應進行了檢測，發現16％的患者(24/150)發生免疫反應。所有的反應都是低效價的，典型的範圍是1∶50到1∶200。在受試組內包括用0.01-0.25mg/kg鼠7E3F(ab』)2處理過的正常的自願者，用0.05-0.20mg/kg鼠7E3F(ab』)2處理過的非頑固性心絞痛患者，用0.1mg/kg鼠7E3F(ab』)2或0.15-0.35mg/kg鼠Fab處理過的PTCA患者，以及分別用一次性靜脈注射0.01-0.30mg/kg鼠7E3Fab處理過的、一次性給藥0.25或0.30mg/kg然後連續滲透12～36小時(0.15μg/kg/分或10μg/分)鼠Fab或按6小時間隔兩次注射鼠Fab(一次給藥0.2mg/kg-0.30mg/kg，隨後以0.05mg/kg第二次給藥)的頑固型心絞痛患者。用人-鼠嵌合7E3Fab可以明顯地降低免疫原性。在52名患有頑固型心絞痛並用嵌合7E3Fab處理過(如上所述)的劑量梯度研究中的患者身上沒有顯示出免疫反應，其確定方法是與對嵌合Fab相似的檢測法。抗血小板活性的逆轉性嵌合7E3Fab(γ1，κ)從血小板上脫落的速率比較慢，血漿中游離的嵌合7E3Fab從循環系統中可以迅速地消失(如上所述)。因此，嵌合7E3的抗血小板效果可以由使用隨機供者的血小板來逆轉。這種由轉輸血小板而引起的逆轉或解毒效應在2名接受了鼠Fab或嵌合Fab並在接近對血小板凝聚達到完全抑制的時候又接受了隨機供體血小板的患者中得到證實。對血小板功能的恢復是由測量失血時間來測定的。這一性質對於因為失血而需要進行對血小板功能恢復的患者是非常有用的。實施例4用嵌合7E3抗體在選擇性冠心血管成形術中防止血栓併發症經皮經腔冠心血管成形術(PTCA)，例如使用氣囊泵或冠狀動脈癍塊切除(atherectomy)的PTCA是一種有效的使狹窄的冠心動脈腔擴張的方法。在這一過程中，在進行血管成形術之中和之後都伴隨著固有的急性冠心血管閉塞的危險。報導的冠心閉塞的發生率在選擇性血管成形術的案例中為大約3％～6％(Detre，K.M.etal.，Circulation82739-750(1991))，並且是在醫院中發病和死亡的主要因素。在危險性高的患者中由血栓引起的重大心肌病症發生率是10-20％。在冠心血管成形術之中或緊隨其後而發生的急性冠心閉塞的原因看起來是由於對動脈血管壁的深度損傷以及由此而產生的伴有或不伴有血栓的部分閉塞性「內膜瓣(intimalflaps)」、或在血管壁損傷的部位的血栓而共同造成的。在動物中，在進行了成功的血栓溶解之後而發生的再次閉塞都有在以前發生過周期性的冠心血管流量的降低和恢復，即稱作「周期流量變化」(CFV)的病史。這些CFV幾乎完全是一種血小板調控的現象，其原因是血小板凝聚物在冠心狹窄處和內皮損傷處的重複性聚集和脫落。在人體中也發現了在冠心血管成形術後出現的周期流量變化。在血管成形術中可以用嵌合7E3抗體抑制血小板的功能並進而防止血小板的凝聚和血栓。嵌合7E3抗體在那些有高度發生血栓危險的病人中是特別有用的。這些患者可以根據解剖學(例如血管造影術對狹窄位點的損傷的特性的確定)或臨床的那些預示著急性冠心血栓和那些產生急性心肌梗塞、非頑固性心絞痛或突發性堵塞綜合症的危險徵兆(例如心肌梗塞，非頑固性心絞痛，糖尿病，65歲以上的婦女)來確診。在選擇性PTCA中的嵌合抗血小板抗體本試驗是分兩階段進行的。第一階段的主要目的是確定在進行了選擇性經皮經腔冠狀動脈成形術(PTCA)的患者中嵌合7E3Fab的最佳一次劑量和其安全性。進行第二階段試驗是為了評價將嵌合7E3(c7E3)作為濃縮丸劑進行滲透並緊接著進行不同連續期間的滲透的安全性及前期效率。第二階段研究中的患者是接受了選擇性冠狀動脈成形術並且有高度局部心肌缺血併發症危險的患者。高度危險的患者包括那些帶有B型或C型損傷特性的非頑固性心絞痛和頑固型冠心病的患者。表3給出了確定高度危險患者的標準，表4給出了血管造影學的損傷特徵的定義。前期效率是由對血小板的抑制以及防止血栓併發症的功能而測定的。在本實驗的兩個階段之中，可選用的對象是18-76歲的男性以及18-76歲的不具懷孕潛力的女性。表3具有高度局部缺血併發症危險的患者的選擇標準中等程度的高度危險1)不具有所定義的損傷特異特徵的非頑固性心絞痛。2)具有單一B損傷特異特徵的狹窄。最高危險1)帶有≥2個B型損傷特異性特徵的狹窄。2)帶有至少一個B型損傷特異特徵的狹窄的非頑固性心絞痛。3)帶有至少一個B型損傷特異特徵的狹窄的糖尿病。4)帶有至少一個B型損傷特異特徵的狹窄的≥65歲的女性。5)帶有至少一個C型損傷特異特徵的狹窄。表4損傷特異特徵A型損傷(高成功率，＞85％；低危險)-稀疏的(＜10mm長度)-沒有或幾乎沒有被鈣化-同心的-並非完全閉塞的-可接觸的-不在口部的-非尖角的碎片，＜45°-不涉及主要支管-平滑輪廓的-沒有血栓B型損傷(中等成功率，60-85％；中等危險)-管狀(10-20mm長度)-中度-重度鈣化-偏心的-完全閉塞＜3個月-近端中等彎曲的碎片-位於口部-中等角度的碎片，＞45°，＜90°-分叉的損傷，需要兩條導線-非規則輪廓-有一些血栓存在C型損傷(低成功率，＜60％；高危險)-彌散-完全閉塞，＞3個月-近端極度彎曲的碎片-不能保護主要側枝-極度尖角的碎片，＞90°-帶有脆性損傷的變性的靜脈移植物第一階段在第一階段，將患者分組接受一次劑量靜脈注射嵌合7E3(γ1，κ)Fab片段(按實施例3的描述製備的和配方的)。對一共15名患者(3女12男)進行了治療，病人的平均年齡是62歲(46-76歲)。在表5A和表5B中對所有一次劑量的患者和在單個劑量組內的患者給出了人口學的輪廓。在劑量梯度方案中，有5名患者(n＝5)在進行選擇性PTCA之前約30分鐘時接受了單一劑量的0.15mg/kg，0.20mg/kg，0.25mg/kg的c7E3Fab。在此程序中，所有的患者都接受了阿斯匹林(標準劑量)並用肝素(標準劑量)進行了充分的抗凝集治療。雖然，PTCA程序對第一階段的病人被劃分為選擇性的，15個患者中的6個患有非頑固性靜止心絞痛(unstablerestangina)。進行冠心擴張的部位總結於表6(底部)。15名第一階段患者中的7名接受了在單一血管中一個損傷的PTCA，6名接受了在單一血管中多個損傷的PTCA，2名接受了在多條血管中的PTCA(表6)。為了獲得最佳單一劑量c7E3的效率標準被預測定義為在進行滲透2小時後達到下列平均值的最低劑量(1)將失血時間延長了至少20分鐘；(2)對GPIIb/IIIa受體進行了封閉使得基線位點受體的80％以上被封閉；和(3)作為對20μMADP的反應，對血小板凝聚的抑制≤基線的20％。表5A嵌合7E3抗血小板抗體按年齡、體重、身高、性別和種族對病人的分類連續對照單一劑量全部患者32915年齡平均值57.454.260.1中間值57.056.062.0最小值383746最大值767476標準偏差9.710.59.7體重(kg)平均值82.888.285.5中間值84.884.284.0最小值42.367.370.5最大值113.0122.7107.0標準偏差16.619.011.1身高(cm)平均值171.2176.7173.6中間值172.8177.8175.2最小值152.4157.5160.0最大值7.98.87.8標準偏差性別女性813男性24812種族001白人26811黑人512亞洲人001西班牙裔100表5B嵌合7E3抗血小板抗體基於年齡、體重、身高、性別和種族的患者分級0.25mg/kg0.25mg/kg0.25mg/kg7E3*7E3*7E3*0.15mg/kg0.20mg/kg0.25mg/kg10mcg/分鐘10mcg/mg10mcg/分鐘7E37E37E36小時12小時24小時安慰劑全體患者5551111109年齡平均值60.657.262.659.155.058.154.2中間值63.056.065.060.053.058.558.0最小值47465140423837最大值73687676737574標準偏差10.58.311.310.58.910.310.5體重(kg)平均值83.880.592.285.883.878.388.2中間值76.378.096.089.085.079.984.2最小值74.570.582.060.442.362.367.3最大值107.095.099.1113.0111.895.0122.7標準偏差13.89.57.717.819.610.719.0身高(cm)平均值170.8171.9178.1169.3170.9173.7176.7中間值173.0175.2177.8167.6172.7175.2177.8最小值160.0160.8169.0157.5152.4165.1157.5最大值177.8182.9188.0177.8185.0180.3185.4標準偏差7.08.87.06.410.85.48.8性別女性3003411男性2558798種族0010000白人3448998黑人2003201亞洲人0100000西班牙裔0000010表6血管造影特性被治療的損傷的數目對照c7E3Fabc7E3Fab第一階段第二階段單一血管/單一損傷8721單一血管/多重損傷067多重血管/單一損傷121多重血管/多重損傷002未知001被治療的損傷的位置RCA3913LCX4314LAD3917*在患有多重血管疾病的患者中，計數每一條血管。RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈第二階段在第二階段中，患者被給予0.25mg/kg濃縮丸劑，然後連續滲透10μg/分c7E3Fab6、12或24小時。受試組中的32名患者(8女，24男)參加了第二階段的研究。接受c7E3Fab處理的患者的平均年齡是57歲(範圍是38～76歲)有9名患者(1女，8男)作為對照參加了本試驗。對照組患者的平均年齡是56歲(範圍是37～74歲)。對照患者是如上所述的高危險患者，不接受c7E3的治療，但是按照接受c7E3的患者一樣被監測。在表5A和表5B中列出了所有第二階段的患者以及各接受單一劑量處理組的患者的人口學輪廓。在進行PTCA的氣囊擴張之前30分鐘用c7E3Fab給藥。阿斯匹林和肝素是按照臨床標準給藥，並參考在進行了血管成形術後肝素的用量應該是每小時800單位。各有11名患者分別進入到6小時和12小時的組內，有10名患者進入24小時的組內。在32名接受了c7E3Fab治療的患者中，有21名患者經歷了在單一血管內有一個損傷的PTCA，7名患者接受了在單一血管中多重損傷的PTCA，有3名患者接受了多重血管的PTCA(表6)。有一名患者的PTCA的種類並沒有具體確定。在第二階段受試患者中的冠心擴張位置總結於表6。在9名對照患者中，8名接受了單一血管內一個損傷的PTCA，一名接受了多種血管的PTCA。這32名接受了c7E3Fab治療的患者和9名對照患者都具有那些能夠使他們被劃分為對PTCA有高度局部缺血心肌併發症危險的臨床和血管造影特徵。有2名接受c7E3Fab治療的患者和一名對照患者具有未確定的危險因素。剩下的30名接受c7E3Fab治療的患者和8名對照患者都具有至少一種使他們被劃分為有高度局部缺血併發症危險的臨床或血管造影特徵，而且其中的大多數都具有一種以上的危險特徵。表7中總結的是用於對照和c7E3處理組的危險因素，而對各劑量組內的每一患者的危險因素則列於表8A-表8D。表7高危險特性第二階段危險因素對照c7E3治療(n＝9)(n＝32)一種B型特性514兩種或兩種以上B型特性1273一種C型特性02無被鑑定的損傷特性的非頑固性絞痛114非頑固性絞痛+B型特性085非頑固性絞痛+≥2個B型特性176非頑固性絞痛+C型特性01未指定的危險特性121編號為04-006的患有糖尿病的患者。2編號為04-007的患有糖尿病的患者。3編號為03-001與02-007的患有糖尿病的患者。4患者04-004除糖尿病外，還帶有以下額外的危險因素女性，年齡＞65。5編號為03-003與05-001的患有糖尿病的患者。6患者01-018除糖尿病外，還帶有以下額外的危險因素女性，年齡＞65；編號為03-002的患有糖尿病的患者。表8A素因性高危險特性對照患者患者編號危險類型(S)1部位201-0231.非頑固性絞痛LAD01-0241.一個B型特性3LAD04-0061.糖尿病LCX2.一個B型特性(偏心的)04-0071.糖尿病RCA2.兩個B型特性(偏心的，角度緩和的碎片；＞45°，＜90°)04-0081.一個B型特性(偏心的)LCX04-0091.一個B型特性(偏心的)LCX01-0211.一個B型特性3RCA01-0221.非頑固性絞痛OM2.兩個B型特性(管狀；不正規輪廓)03-0051.未確定的危險特性RCA1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OM＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8B素因性高危險特性6小時持續滲透患者編號危險類型(S)1部位204-0011.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(偏心的)06-0011.非頑固性絞痛LCX2.一個B型特性(血栓)06-0021.一個B型特性LAD(管狀[10至20mm損傷])01-0141.非頑固性絞痛LAD2.一個C型特性(彌散＞2cm長度)01-0131.非頑固性絞痛RCA2.兩個B型特性(偏心的，一些血栓)01-0151.二個或更多個B型特性3LADLADD01-0171.一個B型特性(偏心的)LCX02-0051.非頑固性絞痛LAD2.三個B型特性(管狀，(10至20mm長度)；不正規輪廓；口部)1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支3未確定的特性表8B(續)素因性高危險特性6小時持續滲透(續)患者編號危險類型(S)1部位203-0011.糖尿LAD2.四個B型特性(偏心的，角度緩，＞45°，＜90°；不正規輪廓；中度至重度鈣化)01-0121.一個C型特性(彌散＞2cm長度)LAD01-0161.一個B型特性(一些血栓)RCAOMn1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C素因性高危險特性12小時持續滲透患者編號危險類型(S)1部位201-0181.非頑固性絞痛OMn2.65歲以上女性3.兩個或兩個以上B型特性01-0191.非頑固性絞痛迴旋2.兩個或兩個以上B型特性——02-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(完全閉塞＜3個月)02-0071.糖尿病LCX2.五個B型特性(偏心的，近端片段的中度OM1，彎曲；角度緩和的片段，＞45°，＜90°；需LADD要雙重導線的分叉損傷；完全閉塞＜3個月)03-0021.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病3.兩個B型特性(中度彎曲片段，不正規輪廓)03-0031.非頑固性絞痛RCA2.糖尿病3.一個B型特性(不正規輪廓)1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C(續)素因性高危險特性12小時持續滲透(續)患者編號危險類型(S)1部位205-0011.非頑固性絞痛LADD2.糖尿病RCA3.一個B型特性3(偏心性)05-0021.一個B型特性(管狀)RCA2.一個C型特性LADD(完全閉塞＞3個月)05-0031.兩個B型特性LAD(角度緩和的片段，＞45°，＜90°；一些血栓)06-0031.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性(一些血栓)04-0021.非頑固性絞痛LCX2.一個B型特性(10至20mm管狀的)1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D素因性高危險特性24小時持續滲透患者編號危險類型(S)1部位201-0201.兩個B型特性(不正規輪廓，一些血栓)RCA02-0081.非頑固性絞痛2.B型特性a)4個特性(管狀；偏心的；近端片段中LCX度彎曲；不正規輪廓)b)3個特性(偏心的；角度緩和的片段LCX＞45°，＜90°)05-0051.非頑固性絞痛RCA2.一個B型特性305-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個C型特性(彌散(＞2cm長度))04-0031.兩個B型特性LAD(偏心性；帶有雙重導線的分叉)04-0041.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病3.65歲以上女性1列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈LADD＝LAD的對角線分支Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D(續)素因性高危險特性24小時持續滲透患者編號危險類型(S)1部位204-0051.兩個B型特性(偏心性，一些血栓)RCA02-0091.非頑固性絞痛2.B型特性a)3個特性(不正規輪廓，一些血栓；需要雙重LAD導線的分叉損傷)b)1個特性(需要雙重導線的分叉損傷)LADc)2個特性(偏心性；需要雙重導線的分叉損傷)DB05-0041.一個B型特性OM1(需要雙重導線的分叉)OM21列於表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動脈LCX＝左迴旋冠狀動脈LAD＝左前下冠狀動脈DB＝Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性對血小板功能的抑制(第一階段的結果)為了鑑定嵌合7E3Fab對血小板功能的抑制活性，對GPIIb/IIIa受體結合位點的存在程度(記錄為被封閉的GPIIb/IIIa的平均百分數)，對由拮抗劑20μMADP引起的血小板凝聚的抑制的平均值，以及平均失血時間進行了一系列的檢測。對由拮抗劑引起的受體的封閉和血小板的凝聚的測定基本上按照如上所述進行(Gold，H.K.etal.，J.Clin.Invest.，86651-659(1990))。對於受體封閉的測定，在0時測定了受體的存在程度並將在此時所存在的受體數定義為被封閉受體為0％(基線)。其它時間點的數值都是相對於該基線或給藥前的測量的受體存在數值。失血時間是用Simplate方法進行的。圖6A-6C總結的是在按單一濃縮藥丸嵌合7E3Fab給藥之後2小時的劑量反應，以受體封閉(圖6A)，血小板凝聚(圖6B)和失血時間(圖6C)來表示。在圖6A-6C中的實線表示的是在每一劑量組中的5名患者的平均值。隨著c7E3Fab劑量的提高，受體封閉也有逐步的提高，正如被封閉的受體的百分數所顯示的那樣(圖6A)。在兩小時處的受體封閉的平均數值對0.15mg/kg為53.8％，對0.20mg/kg為80.2％，對0.25mg/kg為86.6％。受體封閉的增加伴隨著有對血小板凝聚抑制的增加，以對給藥前的數值的百分數表示(圖6B)。在2小時處的平均血小板凝聚數值對0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各組分別為基線值的46.1％，44.6％和17.9％。同樣，在進行了滲透後的2小時處也表現出與劑量有關的失血時間的延長(失血時間的測量僅取了30分鐘，圖6C)。失血時間對於0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各劑量分別為26.0分鐘，27.5分鐘和30分鐘。在所使用的條件下，以及根據這些檢測所得到的結果，對於抗血小板活性的最佳劑量被確定為0.25mg/kg。圖7A-7C表示的是單次濃縮藥丸劑量0.25mg/kg給藥後的作用時間，在該劑量觀測到最大的血小板效果。圖中的線表示的是從0時(基線)到24小時的平均數值，如圖在X軸上所示，上圖表示的是對受體的封閉(圖7A)，中圖表示的是對血小板凝聚(圖7B)的結果，下圖表示的是失血時間(圖7C)。在兩小時處見到了受體封閉，血小板凝聚和失血時間的效果峰值，並隨時間逐步回復。失血時間在12小時處回復到接近正常值。沒有任何一個患者發生血小板減少症。對血小板功能的抑制(第二階段的結果)在第二階段中，GPIIb/IIIa受體和血小板凝聚的數據並沒有從所有患者中取得，在接受了24小時滲透的患者中，只從2名患者身上獲取了這些數據。因此，只總結了6小時和12小時的數據。在6小時和12小時滲透的組內，受體封閉的平均值在整個滲透期間都保持在大於基線的80％的水平上。在2小時處，6小時和12小時滲透組內的20μMADP引起的血小板凝聚的平均值分別為基線的13％和15％，並且，12小時組內則在整個滲透期間內都低於25％。對所有3個滲透期間的2小時平均失血時間都大於30分鐘。圖8給出的結果是在接受了0.25mg/kg劑量後又接受了12小時的10μg/分的嵌合7E3Fab連續滲透的患者的結果。12小時滲透所產生的結果在圖8中由淺色區表示，線條表示的是平均值。在整個的滲透期間內，對受體的封閉程度，對血小板凝集的抑制程度以及對失血時間的延長都得到了保持，一旦中止了滲透則它們就開始恢復。表9從圖8A-8C中得出的平均數值0.25mg/kg+10μg/分12小時從起始滲透起平均失血時間平均凝聚平均結合計算的小時數(分)(％基線)(％基線)05.51000.023014.793.563022.489.11223.524.485.61813.961.172.9248.660.969.23614.575.060.6第一階段和第二階段患者的臨床效果在47名接受了c7E3Fab治療的患者中，沒有任何一個人在PTCA的過程中或之後經歷了血栓。在所有47名接受了c7E3治療的人同中，除了2名以外，都成功地進行了PTCA，正如血管造影所確定的那樣，將損傷減小到小於50％的血管直徑。在兩例不成功的擴張患者中，01-012接受了將左前下冠狀動脈的由90％狹窄減少到70％的擴張，但是進一步的擴張是技術上無法實現的。第二名患者(患者01-019)，開始時進行了成功的擴張，但是隨後又對主要的縱向解剖(沒有明顯的血栓)放置了冠心內的斯坦特(stent)。在9名對照人員中，有1名(01-022)在進程15分鐘時發生了急性血栓封閉，需要進行緊急冠狀動脈分流手術(CABG)，並得到復原。其他8名的對照患者都得到了成功的擴張，使狹窄的部位被降低至50％或更少。患者01-019(12小時滲透組)接受了氣囊擴張，使左迴旋冠狀動脈的95％的損傷被降低了50％。其後，該患者經歷了明顯的血管迷走神經的異常，導致了心動過緩，低血壓，短暫的心搏停止。它被送回到導管插入室並且進行了緊急的冠狀動脈內斯坦特安裝術。該斯坦特在左主冠狀動脈發生了錯位，該患者被送去進行了緊急的冠心動脈分流手術。根據調查的結果，沒有患冠心內血栓的明顯跡象，不論是在血管造影中或是手術期中都是如此。該名患者還發生了周期發作的(peri-operative)心肌梗塞。術後8天該患者脫離危險並恢復。有3名接受c7E3Fab治療的患者各自分別患有PTCA術後的胸部疼痛，程度並不一致。患者01-009(0.25mg/kg單一劑量組)在c7E3處理後9小時後發生胸痛，患者05-003(12小時滲透組)在接受了c7E321小時後發生了絞痛，患者06-003(12小時滲透組)在接受c7E3處理2天後發生心絞痛。調查結果表明，這些胸痛的表現與標誌著復發閉塞的局部缺血表徵並不相關。患者02-004(0.25mg/kg單一劑量組)在接受c7E3Fab治療之前就患有長期的胸痛並在PTCA過程中繼續有胸痛。在術後的那一天ECG的變化以及伴隨著的心酶(前一天抽取)的升高表明這位患者經歷了周期性(peri-procedural)非Q波心肌梗塞(肌酸酐激酶峰值＝462，MB分數＝64)。在用c7E3Fab處理的52天時，受試組中發生一例死亡。患者06-002(6小時滲透組)患有間隙肺病，充血性心衰和非頑固性絞痛的病史，進行過成功的近左下冠狀動脈的PTCA術。在試驗過程中，該患者發生了持續性的心室纖維性顫動，兩次需要電除顫，此後，試驗進展順利。當離開了導管室後，該患者又發生了藍視(症)，並立即給予利尿劑和輸氧治療。然而，該患者隨後又發生了呼吸困難並需要呼吸輔助器。該患者隨後在醫院內的情況變得更為複雜，包括膿毒症、成年人呼吸系統壓迫綜合症、貧血(進行了多次輸血)、心臟局部缺血。該名患者在c7E3Fab治療後的第52天死於多重系統功能衰竭。安全性第一階段和第二階段圖9表示的是所有劑量組的患者在滲透終止後的從基線到24小時的血細胞比容的絕對變化值。在圖上標出了變化為0的一條參照線。對照組中的一名患者(01-022)以及一名c7E3Fab治療的患者(01-019)的血細胞比容的數據並沒有在圖中表示出來，因為這兩名患者都在第一個24小時內需要進行緊急冠心分流手術並輸血(見以下)。在-12處的第二條低線表明根據心肌梗塞血栓溶解(TIMI)標準被定義為少量出血的所需血細胞比容的變化(Raoetal.，J.Am.Coll.Cardiol.111-11(1988))。在對照的病人和所有c7E3Fab劑量組的病人之間的血細胞比容的變化是相似的。表10總結的是滲透終止後24小時血小板計數變化的平均值。血小板計數的變化在未接受治療的對照組和c7E3Fab治療組中具有相似的分布，並沒有明顯的與劑量相關的效果。表10滲透結束後24小時血小板計數平均變化值％劑量％變化範圍對照(n＝9)-0.7(-20.2，+13.2)0.15mg/kg(n＝5)-17.4(-24.5，+19.5)0.20mg/kg(n＝5)-11.6(-20.8，+4.7)0.25mg/kg(n＝5)+2.9(-8.9，+4.4)6小時*(n＝11)-7.7(-28.3，+19.4)12小時*(n＝11)0.0(-24.3，+24.4)24小時*(n＝10)-3.9(-9.0，+50.0)*注射濃縮藥丸劑量0.25mg/kg後c7E3Fab(10μg/分)的滲透時間對第一階段和第二階段結果的討論本研究的第一階段結果表明，c7E3在用阿斯匹林和肝素處理過的PTCA患者群中的劑量反應特徵與在劑量階梯試驗(實施例3)中的頑固性心絞痛患者中的特徵是相同的。嵌合7E3產生了血小板GPIIb/IIIa受體的劑量依賴性封閉，並且這種受體封閉與對血小板功能的抑制相關。此外，第二階段的結果表明，用連續滲透可以獲得對血小板Fab功能長達24小時的抑制效果。在所有的患者中，不論其滲透時間長短，停止滲透後6-12小時就會發生血小板功能的恢復。c7E3處理的患者的臨床結果，從血管造影學或臨床終點的觀點來看，都比根據它們的危險性的概況所預測的結果好得多。在c7E3處理的患者中，沒有任何人在此過程之中或之後發生血栓。此外，除2名患者以外，其他的患者都進行了在血管造影學上為成功的治療。所有進入第二階段的患者以及進入第一階段的15名患者中的6名都是根據臨床或血管造影特徵而被定義為高危險性的患者。單個的臨床特徵(例如非頑固性絞痛，糖尿病，婦女年齡大於65歲)或血管造影的損傷特異性特徵(例如B型或C型)都使患者發生併發症的危險性被提高，多重這些因素的效果是相加性的。在第二階段中，被處理的患者中的17名患有非頑固性心絞痛並帶有或不帶有另外的臨床或血管造影損傷特異危險特徵。此外，在第一階段中的6名患者被確認具有非頑固性心絞痛。在公開的文獻中，患有非頑固性心絞痛的患者發生重大併發症(死亡，心肌梗塞，急性冠心血管分流或重複性PTCA)的發生率為10％～15％(DeFeyter，P.J.Editorial.Am.HeartJ.118860-868(1989)和Rupprecht，H.J.etal.EurHeartJ.11964-973，(1990))。血管造影特徵同樣是對PTCA綜合症有高度預測性的(Ellis，S.G.，1990，「Electivecoronaryangioplastytechniqueandcomplications」，InTextbookofInterventionalCardiology，E.J.Topol，Ed.，(W.B.SaundersCo.，Philadelphia)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990)；andACC/AHATaskForceReportGuidelinesforpercutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，J.Am.Coll.Cardiol.12529-545(1988))。29名第二階段c7E3處理的患者由於其損傷特異性特徵而達到了該標準，其中的12名具有一個B型損傷，14名具有2個或更多個B型損傷，3名具有C型損傷。此外，在試驗中的很多患者都接受了在一個或多個血管中的多重損傷的擴張，因此而增加了本程序的潛在危險性[Samson，M.etal.，Am.HeartJ.1201-12(1990)]。根據這些患者的血管造影學定義的高度的危險因子的數目和程度，局部缺血併發症的預測發生率在10％～20％的範圍內[Ellis，S.G.Electivecoronaryangioplastytechniqueandcomplications，InTextbookofInterventionalCardiology，(Ed.E.J.Topol)，W.B.SaundersCo.，philadelphia(1990)；DeFeyter，P.J.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990)]。對照組中同樣包括高度危險的患者。然而，一般而言，對照組患者中的危險因子的數量和程度是較低的。9名對照患者中的5名具有單一的危險因子，即一個B型損傷(4名患者)或非頑固性絞痛(1名患者)，而32名第二階段c7E3處理的患者中有26名具有C型損傷或兩種甚至更多的高度危險特徵。在這兩組之間，危險程度上的不同是顯著差異的(Fisher’sexacttestp＝0.018)。非常有趣的是，對照組中具有急性堵塞(患者01-022，具有2個B型損傷特徵的非頑固性絞痛)是被鑑定為具有多於一種危險因子的3名患者之一(有一名對照患者具有未確認的危險特徵)。因此，當對照組3名高度危險患者中的一名發生了血栓時，而同屬於這種最高危險性的26名經c7E3Fab處理的患者中卻沒有任何一人發生血栓。本研究還表明在那些已經接受了靜脈注射肝素或口服阿斯匹林治療的患者中可以獲得用c7E3的安全有效的抗血小板效果。在對照組和c7E3處理的患者之間對比其失血現象，表明在各組的基線之間沒有血細胞比容變化的明顯差異。其它的副作用都不是經常發生的，而且是中等程度和比較緩和的。在整個試驗中發生了一例死亡，而且是在c7E3Fab治療後幾乎2個月時發生的，該患者患有間隙性肺病和心衰，並在PTCA後發生了呼吸困難且並發有膿毒病，成年人呼吸抑制綜合症以及最後的多器官衰竭。最終，在所有那些得到了結果的20名患者中沒有任何一人發生了人抗嵌合抗體的免疫反應。總而言之，嵌合7E3Fab可以對那些接受了阿斯匹林及靜脈注射肝素治療的患者在進行PTCA時，產生安全有效的對血小板功能的抑制。這種抗血小板作用可以保持長達24小時，即不引起顯著的失血危險性的增加，也不引起免疫系統的反應。在那些具有高度血栓併發症危險的患者中，在接受c7E3治療的組內沒有發生血栓現象。這就表明c7E3可以在這些患者中降低血栓併發症的危險。實施例5在冠心血管成形術中治療急性堵塞在冠狀動脈血管成形術中，急性冠狀動脈堵塞是在這一手術中的決定其發病率和死亡率的主要因素，在選擇性的血管成形術案例中大約為3％～6％(Detre，K.M.etal.，Circulation82739-750(1991))，但是在那些因為非頑固性絞痛或發生了急性心肌梗塞而進行血管成形術的患者中的發生率高達20％～40％(Ellis，S.G.etal.，Circulation77372-379(1988)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991))。發生急性堵塞的機制是在進行血管成形術時，在動脈上所創造的或所延展的內皮損傷區處發生的急性血栓而造成的。通常在這些位置由於血管的幾何形狀的變化而造成對血流形式的改變，一般都是由對斑塊的改動而造成的，並且一般都有內皮下邊的組織的暴露，例如內膜和中間切開的部分的暴露。因為在形成凝血的初期需要血小板的粘結和凝聚，所以嵌合7E3Fab抗體片段被用來治療在冠狀動脈血管成形術時發生的急性冠狀動脈堵塞。案例患者是一位年齡為45歲的男性醫師，並且身體狀況一直非常良好。在他接受血管成形術一周前開始發生胸部和頸部的不適。當這些病徵持續數天並惡化後，他向其同事進行諮詢。心電圖(EKG)結果揭示出前心T波的倒轉。該患者被送入當地醫院的冠心病病房，靜脈注射硝酸甘油和肝素，並口服阿斯匹林。在此後的24小時內對心異化酶進行了一系列的測定，並沒有顯示出超出正常範圍。在此後的兩天內數次心電圖記錄揭示了前心T波的持續性平緩，但是並沒有發生導致心肌梗塞的變化。住院的第二天，患者被送到心臟導管室，由左心室造影術揭示了左心室功能在整體上是正常的，但在左心室壁上的前外側有一個很小的運動減少區，同時在後下基底區也有一個運動減少區。左心室的泵血量為72％。冠狀動脈造影顯示出以左側為主的冠狀動脈系統有一個很小的但是完全堵塞右冠狀動脈的閉塞。在左側前下冠狀動脈(LAD)的中間部位有一個明顯的狹窄。在該中間LAD狹窄處的遠端有一個由此產生的斜向的很小的逐漸擴展的病灶。該患者被送回到冠心病病房，並被連續靜脈注射硝酸甘油和肝素48小時。在此期間內，他沒有感到病痛，心異化酶沒有升高，每目的心電圖僅揭示出其前心T波的持續性平緩。隨後該患者被轉移到Hermann醫院(Houston，TX)進行血管成形術。在進行血管成形術前，該患者還繼續接受靜脈注射硝酸甘油和肝素，口服阿斯匹林，並且開始口服鈣通道封閉劑。在以下的幾天內，患者的部分促凝血酶原激酶的時間(PTT)是70-90秒。在開始對其進行血栓成形手術時，活化的血凝塊時間(ACT)是173秒。給患者靜脈注射肝素5000單位，患者的左冠狀動脈口與一個8號FrenchJL3.5導嚮導管相接。用尾側右前斜向投像和顱側左前斜向投像觀察該LAD冠狀動脈，對LAD首先放置0.018英寸都卜勒導線(Cardiometrics，Inc.，MountainView，CA)。我們經常使用這種導線對高度危險性急性堵塞患者的血流進行監測。從LAD相對於損傷的遠端和近端記錄到血流速度的信號。將一個2.5mm冠狀動脈氣囊導管(Intrepid，Baxter，Inc.，Irvine，CA)通過都卜勒導線送入，該都卜勒導線是穩定在冠狀動脈處的。將該氣囊放置在跨騎在LAD損傷處的正確位置，然後對該氣囊以6個大氣壓的壓力進行系列性短暫的充氣。這樣就使得該狹窄的程度被降低，正如從血管造影上以及從血管流量峰值(APV)由12cm/秒到33cm/秒的升高所觀察到的變化證實的那樣。在進行這種擴張以後幾分鐘的觀察中，發現該流速信號開始消失。注射對比劑後顯示了在該血管成形位點又發生了狹窄，即彈性回縮，斑點扭曲和形成了血栓。然後將氣囊再次深入到該損傷位點，再次進行氣囊擴張。使該動脈得到了再次擴展並使流速信號再次回到APV為34cm/秒的水平。在繼續監視的幾分鐘內，該信號再次降低。在5分鐘內，該信號已達到相當低的水平，平均峰值速度是3cm/秒。患者開始感到胸痛。心電圖對心前區電極的監視揭示了ST部分的升高。血管造影顯示該動脈被徹底地閉塞了。在此之前幾分鐘所獲得的活化凝血時間是344秒。然後給予血小板GPIIb/IIIa受體(c7E3Fab，γ1，κ)的特異性嵌合7E3單克隆抗體Fab片段，劑量為0.25mg/kg，1分鐘靜脈注射。此後約1-2分鐘，血流速度開始回升。注入對比劑後顯示了該冠狀動脈開放的流速已經被恢復並達到血栓溶解心肌梗塞試驗的一級水平(TIMI1)。在此後的15分鐘期間內，冠狀動脈流量繼續回升並穩定在APV為23cm/秒。以後又注射了幾次對比劑，證明冠狀動脈流量確實得到了改善。患者的胸痛逐漸消失，由監測電極所產生的ST部分回到了其基線部分。在使用了c7E3Fab15分鐘後，按照要求進行了血管造影。其結果顯示了TIME3冠狀動脈流動。此時的流速信號為20cm/秒。在此後的5分鐘連續觀測中，沒有發現冠狀動脈流量的進一步改善。在此期間內的血管造影的錄像確認了在該血管成形術位點處還有少量的血栓。因此，決定冠狀動脈內注射250,000單位的尿激酶。這一血栓溶血劑在此後的大約10分鐘內被滲透進去。在此期間內由都卜勒導線測量確認在流速上沒有進一步的改善。當冠狀動脈內注射的尿激酶被完全滲透以後，即在使用了c7E3Fab後的第33分鐘時進行了再一次的冠狀動脈血管造影。該動脈開放並達到TIMI3水平的流動。在損傷位點還有一些中等程度的、殘餘的狹窄繼續存在。此外，還可以觀察到血栓的尺寸進一步縮小但並未被完全溶解。因此，決定再次進行氣囊擴張術，以減少殘存的狹窄。氣囊導管就再一次通過導線進入到損傷的位點，然後以6個大氣壓進行最後的氣囊擴張2分鐘。此後，抽出氣囊導管，導線仍保留在原位置。流速信號升高到APV為29cm/秒，並在此水平上保持數分鐘。此後的血管造影證實了該殘餘狹窄被適當地減小了。然後將導線抽回到該狹窄的近端，並再一次的記錄流速。抽出導線、氣囊導管和導嚮導管。該程序徹底完成。然後將該患者送回到冠心病病房。為了在未來的幾天使他的PTT保持在70-90秒的範圍內，繼續給他口服阿斯匹林，硝酸鹽以及鈣通道封閉劑。此後的幾次心電圖(EKG)表明前心T波倒轉得到了緩解，此後的所有EKG都是正常的。此後幾次肌酸激酶(CK)異化酶值均為＜100U/L。在進行PTCA之前血小板的計數是248,000，在接受了c7E3Fab之後的2小時，6小時，12小時，24小時和48小時的血小板計數分別為304,000、279,000、246,000、185,000和220,000。由10μMADP引起的血小板凝聚在術前由光密度計測定為73％，在術後的2小時，6小時，12小時，24小時和48小時分別為0％、13％、26％、45％和51％。血管成形術後一個星期對患者進行了跟蹤導管檢測。其LAD冠狀動脈是充分開放的並達到TIMI3級流量。在當天的晚些時候允許他回家。病歷的討論該患者接受了0.25mg/kgc7E3Fab的靜脈注射，冠狀動脈內250,000單位尿激酶注射以及多次的擴張治療，成功地治療了他的在冠狀動脈血管擴張術中發生的突發堵塞引起的急性的局部冠狀動脈缺血綜合症。這些結果表明抑制血小板糖蛋白IIb/IIIa受體結合以及血小板交連的抗血小板治療方法可以有效地幫助被急性閉塞的冠狀動脈重新獲得穩定的流通，並可以用於其它相似的臨床病例。實施例6防止高度危險血管成形術局部缺血併發症的抗GPIIb/IIIa嵌合抗體片段的隨機、雙盲評價概述自從1977年出現了冠狀動脈血管成形術後，經皮心肌血管再造術就得到了迅速的發展(Gruentzig，A.R.etal.，N.Engl.J.Med.，3161127-1132(1987))。雖然這些手術能夠使局部缺血和生命的質量得到改善(Parisi，A.F.etal.，N.Eng1.J.Med.，32610-16(1992))，急性併發症仍舊是其主要的缺陷。在醫院的這些手術之中或其後發生的在被治療的血管上的突然閉塞的發生率為4％～9％，發生的重複閉塞及急性堵塞都相伴有相當數量的發病率以及大約10倍的死亡率的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Tenaglia，A.N.etal.，Am.J.Cardiol，Inpress(1993)；Detre，K.M.etal.，Circulation，82739-750(1990)；Ellis，S.G.etal.，Circulation，77372-379(1988))。儘管血管上發生突然堵塞的機制通常都是無法確定的，但是血栓的形成以及血管的創傷都是其形成因素。使患者被確認為具有高度急性併發症危險的特徵，包括與冠狀動脈血栓(非頑固性絞痛，急性的或近期的心肌梗塞)、糖尿病、女性及冠狀動脈形態特徵(彎曲點，血栓，分叉)相關的臨床症狀，表明患者損傷的複雜性的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.17(SupplB)89B-95B(1991)；Moushmoush，B.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，2797-103(1992)；andMyler，R.K.etal.，circulation，82(Supp1II)II-88-II-95(1990))。儘管阿斯匹林已經顯示出可以降低患者在接受血管成形術時發生急性血管堵塞和急性心肌梗塞的危險程度(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988)；Barnathon，E.S.etal.，Circulation，76125-134(1987))。但是，它對血小板功能的作用相對來說較弱，而且在接受了阿斯匹林的那些高度危險的患者中繼續發生局部失血的發生率為10％～20％(Tenaglia，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol，(1993，inpress))。相反，對患者給予嵌合7E3抗體的Fab片段就獲得了對GPIIb/IIIa受體的實質上的封閉，並且抑制了血小板的凝聚(見實施例4，血小板功能的抑制)。在對進行血管成形術的患者的初期研究中，c7E3Fab降低了在進行經皮手術之中或之後發生急性血管堵塞的危險性(見實施例4和Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，4167-75(1993))。現在進行的隨機性的研究是為了進一步評價對GPIIb/IIIa受體為特異性的嵌合抗體片段在防止局部缺血併發症時的效率(EPIC實驗，c7E3Fab防止局部缺血併發症的評價)。特別是對c7E3Fab在接受血管成形術的具有高度併發症危險的患者中的臨床效果，用預期的、雙盲的、安慰劑控制的、隨機臨床的實驗進行了評價。該實驗包括在56個地區的2099名患者，他們按計劃要進行冠心血管成形術或定向性冠狀動脈癍塊切除術，並具有以下的臨床高度危險情況重度非頑固性絞痛並伴有靜止痛感和心電圖的變化，急性心肌梗塞、臨床的和冠狀動脈損傷形態特徵並伴有高度的併發症危險。患者們接受了(a)安慰劑的濃縮藥丸及滲透，(b)c7E3Fab的濃縮藥丸和安慰劑滲透，或(c)c7E3Fab的濃縮藥丸及其滲透。主要終點(Primaryendpoint)是一種複合情況，包括發生下列情況中的任何一種死亡、非致命性心肌梗塞、計劃外的血管再造手術或重複的經皮手術、計劃外的冠狀動脈斯坦特植入術或對頑固性局部缺血進行主動脈內氣囊泵插入術。在主要終點處的濃縮藥丸和滲透的降低效果是35％(12.8vs8.3％，P＝0.008)，而獨自使用濃縮藥丸的降低效果是11％(12.8vs11.4％，P＝0.43)。使用濃縮藥丸加上滲透的降低效果對每一個終點成分都是一致的，另外，在大部分患者的按年齡、性別、已經患有冠狀動脈血管血栓，急性冠狀動脈綜合症(心肌梗塞、非頑固性絞痛的)所分的亞組中也是一致的。在使用了濃縮藥丸和其滲透的組中，失血現象及輸血現象是增加的，而僅使用濃縮藥丸時是中等程度的。這一實驗揭示了用抗體片段直接抑制血小板IIb/IIIa受體能夠通過明顯降低局部缺血併發症而獲得延續的臨床效果。方法根據前述對常規經皮手術的危險性所做的研究，患者如果有發生急性血管堵塞的高度危險並且沒有由於高度失血危險而造成的禁忌，那麼，他們就是合適的患者。被認為是高度危險的患者是被分在下列三組之一的患者(1)在開始進行了直接的或「搶救性」經皮手術時，發生在12小時內的急性心肌梗塞；(2)不論採用了何種藥物治療，在此前24小時發生了早期梗塞後絞痛或非頑固性絞痛並伴有至少兩次靜止絞痛的發作以及靜止心電圖的改變；(3)根據美國心臟協會/美國心臟病學院標準制定的臨床和/或血管造影標準為高度危險患者(Ryan，T.J.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-45(1988))，該標準被修飾(Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17(SupplB)89B-95B(1991))。這些高度危險的臨床和血管造影的標準包括在目標損傷處有兩個B型特徵或一個C型特徵，或在65歲以上婦女或患糖尿病的患者中有一個B型特徵。該標準具體條件如下(I)建議採用美國食品藥物和管理局(FDA)批准的裝置對下列一種情況進行選擇性或急性的冠狀動脈血管氣囊成形術或癍塊切除(A)非頑固性絞痛和/或非Q波心肌梗塞，其定義如下1)靜止絞痛在靜止時有兩次或更多次絞痛並伴有局部缺血性ST部分或T波的異常；或2)復發性絞痛在住院期間對常規藥物治療無效並伴有局部缺血性ST部分或T波的異常的復發性絞痛；3)早期梗塞後的絞痛在記錄有心肌梗塞後的7天內的絞痛，伴隨有靜止時的絞痛以及局部缺血性ST部分或T波的異常；或由最低量的勞累引起的絞痛(2梅脫)，其中，短暫的ST部分或T波的異常的定義如下a)≥1mmST部分的壓低(在J點後80毫秒)或升高(J點後20毫秒處)，和/或b)T波的改變(通常為倒轉)，其中，在所有的患者的入選時，他們的肌酸轉移酶(CK)比正常水平低2倍。(B)急性Q波心肌梗塞1)在心肌梗塞發生並且在此之前沒有接受溶血治療時，進行直接的手術，或2)對心肌梗塞進行溶血治療失敗後進行搶救性血管成形術，其中，所接受的心肌梗塞被定義為具有如下所述的3種情況中的至少2個(1)延長性心絞痛(長於30分鐘)；(2)總肌酸轉移酶的升高超過正常水平上限的2倍以上(由CK-MB異化酶的升高來證實)；(3)心肌梗塞的心電圖(ECG)證據，定義如下a)ST部分升高至少0.1mV(在J點以後0.2秒處測定)發生在下述3個位置中的至少一處i)3個下電極之中的2個(II、III、aVF)；或ii)6個心前電極中的至少2個(V1-V6)；或iii)電極I和aVL；或iv)心前電極V1-V4ST部分的壓低與傷後或後期心電相一致(鏡子法則)；或v)在左側支動脈有堵塞，在下或前電極的主要ST發生變化；b)新的顯著的Q波≥0.04秒或其深度≥相應的R放大波的1/4，或同時具有兩者。(C)高度臨床/形態學危險特徵1)在要擴張的動脈處具有兩個或更多B型損傷特異特徵的狹窄。損傷特異性特徵依據的是ACC/AHA標準；2)在要擴張的動脈處的具有一個或更多個C型特徵的狹窄；3)年齡≥65歲的婦女並帶有至少一個B型特徵的狹窄；4)糖尿病患者並在要進行擴張的動脈處具有至少一個B型特徵的狹窄；或5)發生了由CK-MB異化酶升高而證實的心肌梗塞並在7天內對由梗塞所造成的損傷進行了血管成形術。(II)年齡在18～80歲之間的男性，不具懷孕潛力的年齡在18～80歲之間的女性(進行了絕育手術或絕經，定義為絕經至少一年以上)。(III)在開始進行規範化的專項手術和給予所研究的試劑之前有書面文件表示同意。其它條件適合但由於以下任何一種原因而被排出本實驗的患者(1)具有出血素質的病史；(2)在入選前6星期曾經做過重大手術；(3)近期(入選前6星期內)曾有臨床上為顯著的胃腸道或生殖泌尿系統的出血；(4)入選前2年內曾經發生過中風或有中風所遺留下來的明顯的神經缺陷；(5)左主冠狀動脈發生＞50％的閉塞；(6)被推斷為或被證實為有脈管炎病史；(7)在接受計劃的受試藥劑的滲透之前的七天內，曾經參加了其它的受試藥物評價的臨床研究的患者；(8)在隨機研究藥劑的服用前七天內，曾經口服過抗凝聚藥物的患者，除非在隨機服藥之前所服用的凝血酶原的份量≤對照劑量的1.2倍；(9)在進行血管成形術之前或者計劃在該手術中靜脈注射葡聚糖；(10)有曾經服用過鼠單克隆抗體或已知對鼠蛋白過敏的歷史；或(11)不能提供書面同意文件。在所有的試驗機構中，都從其試驗審核委員會獲得了他們的批准，並且從所有的患者獲得了書面的同意。受試患者的篩選工作是在1991年12月～1992年11之間完成的；共在美國的56所試驗機構中選取了2099名患者。研究規則所有的患者都接受阿斯匹林和肝素的治療。程序開始至少2小時前口服何斯匹林劑量為325mg，並在其後還保持每天325mg的劑量。肝素(豬)是以初始劑量為10,000～12,000單位靜脈給藥並接著進行每15分鐘給予至多3,000單位，但是其總量不超過20,000單位，目的是為了使活化的凝塊時間保持在「治療」範圍內，一般在程序中為300～350秒(Dougherty，K.G.etal.，Abstractsofthe63rdScientificSessions，III-189(1991)；Rath，B.etal.，Br.Heart.J.，6318-21(1990)；OgilbyJ.D.etal.，Cath.Cardiovasc.Diag.，18206-9(1989))。然後繼續將肝素以每小時1,000單位的速率連續輸入12小時。根據臨床的要求，還可以按靜脈注射或冠狀動脈內給藥硝酸鹽。嵌合7E3Fab(γ1，κ)是以含有每毫升0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉和0.001％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂80，pH7.2的無菌非熱原性溶液含2毫克單克隆Fab的形式使用的。在出院時患者所需要的唯一的藥品是每天325mg阿斯匹林。將患者隨機等分到三個雙盲研究組內。其中的一個組的患者以劑量為0.25mg/kg接受c7E3Fab的濃縮藥丸，然後以10μg/分的劑量連續12小時滲透c7E3Fab。第二組的患者接受劑量為0.25mg/kg的c7E3Fab濃縮藥丸，然後連續12小時滲透安慰劑溶液。第三組接受安慰劑藥丸和12小時的安慰劑溶液連續滲透。濃縮藥丸的使用是在程序開始前至少10分鐘進行的，並且是以5分鐘的時間完成的，所進行的滲透都是12小時的，除非發生了臨床上的不良反應。在病人出院以前，分別在給藥後的30分鐘、2小時、12和24小時對血壓的血小板計數進行測定以檢查血小板減少症的證據。對威脅生命的失血以及血小板減少症用一種事先設計好的算法進行評價和處理(Sane，D.C.etal.，Ann.Intern.Med.，1111010-22(1989))。該方法的守則中沒有關於紅血細胞轉輸的具體指示；因而實際上進行的輸血是按照各個地點的當地實踐方式進行的。血管成形術是按照標準的規則進行的。在程序前以及程序後進行的血管造影都是在冠狀動脈內給以150-300μg硝酸甘油並進行了冠狀動脈舒張以後完成的。在此程序之後，血管鞘在結束了研究藥劑的滲透後保持至少6小時。此外，將血管鞘繼續保持在該位置直至肝素滲透結束後的至少4小時以及直至達到了可接受的被激發的部分促凝血酶原激酶時間從而保持止血。研究終點一個獨立的臨床終點委員會審核了那些可能代表著研究終點或主要負作用現象的所有情況。這個委員會在整個研究期間對具體處理方法是一無所知的，隨後審核了病例記錄、心電圖以及所需要的相關的醫療記錄。對每一事件的確定需要兩個審核委員的一致意見。該實驗的主要終點是一個複合的臨床終點結果，包括在隨機選擇後的第一個30天內發生了任何一種下列情況(1)由任何原因導致的死亡；(2)非致命性心肌梗塞；或(3)緊急救護(a)第二次血管成形術。重複經皮救護以治療復發的急性局部缺血(氣囊血管成形術和癍塊切除)。按預定計劃進行的(例如，階段性的程序)都不屬於終點事件；(b)冠狀動脈分流術。緊急(非選擇性)手術搶救以治療復發的急性局部缺血；(c)插入冠狀動脈血管內斯坦特(stent)。將冠狀動脈內斯坦特放置在能夠使被擴張了的血管保持立即開放的位置；或(d)插入主動脈內的對抗搏動的氣囊泵。對於那些被認為不屬於重複血管成形術或手術搶救的患者的復發性局部缺血放置氣囊泵。在本研究中，「開放」的定義是TIMI2-3級流量並且手術醫生可以用肉眼觀察到小於或等於50％的狹窄，但心電圖又沒有局部缺血證據。終點心肌梗塞的定義如下1.在隨機取樣的並在24小時內發生心肌梗塞的患者中，為了確診隨後發生的非致命性梗塞需要對兩種酶進行測定(a)肌酸激酶(CK)或肌酸激酶MB比正常值的上限至少高三倍，代表著從前一個「谷」升高至少33％(其定義為從前一個峰值降低了25％但是又保持在比正常的上限至少高2倍的水平上)；或(b)在前一個峰值降低了50％並且其「谷」值小於正常上限的兩倍之後或CK-MB升高了至少100％並保持在正常上限3倍以上的水平上。用記錄的新的長時間絞痛(長於2分鐘)並伴隨著心肌酶的再次升高的現象來確定再次梗塞的起始時間。在沒有記錄到絞痛的情況下，再次梗塞的起始時間就被定義為緊接著前一個新的酶的升高之後所測定到的低谷的時間。定義，僅適用於這樣的患者，即在參加本研究時所發生的心肌梗塞後24小時之內有復發性絞痛和/或酶的低谷值開始發生的患者。在所有的病例中都使用的是CK-MB水平，除非無法獲得這些數據，在這種情況下就使用肌酸激酶全值代替之。2.在那些發生了急性梗塞24後或者最近未發生梗塞的進入本實驗的患者中，要將其確診為需要住院的心肌梗塞就要達到下列兩個標準中的一個(a)在兩個或更多個臨近的電極上的新的Q波≥0.04秒，深度比相應的R波＞1/4；或(b)CK-MB值至少大於正常上限的3倍，並且在該水平是一個≥前一個「谷」值50％的增長。在本定義中，那些在進入本研究時帶有急性心肌梗塞的患者發生再次梗塞的起始時間是產生新的長時間絞痛(長於20分鐘)的時間，或是在新的酶的升高之前測定到酶的低谷水平的時間。要想使本定義可用於實際，這兩個時間從初始梗塞時算起都必須大於24小時。3.出院後要想被確診為心肌梗塞，必須達到下述兩個條件中的一個(a)在兩個或更多個相鄰的電極上的新的Q波≥0.04秒，或深度比相應的R波＞1/4，或兩者同時發生；或(b)CK或CK-MB水平比正常的上限高2倍。主要終點的另一個要點是需要進行緊急的重複手術，定義為計劃外的送回到血管成形病房進行手術；主要終點並不包括按計劃進行的階段性程序。相似的，僅把用於治療復發性局部缺血或失敗了的血管成形術的緊急冠狀動脈手術算作主要終點。當為了治療在血管成形術時發生的急性血管堵塞以及為了消除發生這一情況的危險性而將斯坦特放置在冠心內時，才將這種斯坦特的放置算作主要終點。為了對沒有進行重複的血管再造術的患者的復發性局部缺血而放置主動脈內氣囊泵時，才將這種主動脈內氣囊泵的放置認作是主要終點。失血現象可以劃分為嚴重、輕度及非顯著性，依據的標準是血栓溶解在心肌梗塞中的研究(ThrombolysisinMyocardialInfarctionStudyGroupcriteria)(Rao，A.K.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111-11(1988))。嚴重失血的定義是顱內失血或血紅蛋白的降低大於5g/dl的失血(或當無法測定血紅蛋白時，依據血細胞比容降低至少15％)。輕度失血要麼是自發的並有大量尿血或嘔血，並伴有血紅蛋白的降低大於3g/dl(或當無法測定血紅蛋白時，依據血細胞比容降低至少10％)，或當無法確定失血位點時，血紅蛋白的降低大於4g/dl(或當無法測定血紅蛋白時，依據血細胞比容降低至少12％)。在那些接受了輸血的患者中，將其所輸血的單位數累加到所觀察到的血細胞比容的降低並除以3的數值上，以確定血細胞的總降低數量並進而確定是否有嚴重或輕度的失血發生(Landefield，C.S.etal.，Am.J.Med.，82703-13(1987))。數據處理及統計學通過公爵大學(DukeUniversity)的數據採集中心用電話隨機對患者進行採訪。隨機性是按照研究地點以及患者是否患有正在發展的急性心肌梗塞而進行的區分，基於以前的數據，選取了一組為2100名患者的樣品組群，為的是確定主要終點的33％的降低(在安慰劑組群中預計為15％)並且其乘方為0.8，α＝0.05。這些數據被研究調查員記錄到病歷表格上，並且在數據輸入前由本研究的盲點監察人員進行監察。本研究的主持人對於隨機抽樣的密碼以及研究結果一直為盲目的，直至所有的患者都被選擇完畢，並且所有終點都被臨床終點委員會進行了判斷時為止。在下表中，基線特徵對於連續的可變值是以平均值和第25和第75百分分布來表示的，而對於間斷的可變值是用百分數來表示的。對試驗中的主要終點進行了分析，即考慮在開始實驗後30天內第一次發生任何一種構成終點的現象的時間。如果在此30天的期間內未發生這些現象，在30天以後就對患者進行追蹤調查。對每一試驗的Kaplan-Meier存活曲線被用來圖示出結果(Kaplan，E.L.etal.，J.Am.Stat.Assn.，53457-81(1958))。所有試驗相互間的比較是用以治療為目的的原則(intention-to-treat)而進行的。對於主要終點而言，進行了測定趨勢(劑量反應)的對數級別的試驗(log-ranktest)，將僅接受了濃縮藥丸的患者認作是接受了濃縮藥丸和滲透組的患者的中間值(Kalbfleisch，J.D.andR.L.Prentice，TheStatisticalAnalysisofFailureTimeData，JohnWilleyandSons，NewYork(1980))。如果對趨勢的檢測是顯著性的，那麼就在對照組和每一個c7E3Fab組之間進行成對的對數級別的比較。當從1/3或2/3的患者中可獲得有關數據時，就進行安全性的臨時分析。在每一個臨時分析中，對劑量反應的檢測的顯著性是用極小的α水平來判定的，即預先設定使總體的I型的誤差率≤0.05。在最終的分析中，這種比較的顯著性水平是0.036。在最終的分析中，也使用了相似的策略(測定趨勢，然後進行成對的比較)，以探查對組成終點的各個不同成分的治療方法之間的關係，雖然這些比較主要是用來對這些現象進行解釋的。在失血綜合症的治療的最終分析中也使用了這種策略，採用的是X平方檢測。在主要分組(年齡、性別、體重、臨床亞組)中的治療效果的置信區間和差異率進行了計算並表示出來。結果患者組中的基線臨床特徵表明對這些患者進行血管成形術時發生急性併發症的危險很高，因為他們中間糖尿病患者、近期心肌梗塞患者、高齡以及帶有入選標準中的損傷特徵的婦女的數量很高(見表11)。大多數的患者都曾經有過一種或兩種血管疾病，但是左心室功能還是正常的。在表12中給出的是手術程序的詳情。對於每一種治療方案來說沒有見到明顯的差異。表13給出的是總體主要終點的結果以及其組成情況。與安慰劑組相比，c7E3Fab顯示出了分級的效果(P＝0.009)，在僅使用了濃縮藥丸的組中的綜合事件的發生率被降低了11％(P＝0.43)，在使用了濃縮藥丸以及滲透的組中的事件的發生率被降低了35％(P＝0.008)。在表13中的其它的最重要的局部缺血終點也觀察到相同的分級效果。因此，存留的GPIIb/IIIa封閉就降低了非致命性梗塞和進行緊急冠狀動脈分流手術及緊急經皮血管再造手術的頻率。而在僅使用濃縮藥丸時所產生的短時間的封閉存在著發生上述事件的非顯著性的一種傾向。在使用了濃縮藥丸和滲透的組中發生了3例死亡，這3位病人都是在進行隨機抽樣後但又在接受藥物治療之前死亡的。儘管如此，這些死亡事件都根據以治療為目的的原則而包括在本分析中。由於c7E3Fab可以防止非致命性局部缺血現象，因此對非致命性心肌梗塞的嚴重程度的預防是非常有意義的。正如在表14中所示，c7E3Fab防止了Q波梗塞以及帶有酶的大量升高的梗塞，並且顯示出了劑量反應的效果。表11基線特性安慰劑組濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(N＝708)年齡(年)+62(53，69)61(52，68)63(53，69)男性(％)737271體重(kg)848282危險因素(％)糖尿病262323高血壓555554高膽固醇575955吸菸657168血管疾病(％)外周的999大腦的344曾患過MI(％)無343030＞30天2528278-30天131314＜8天282929進程前血管成形術252022分流術151416冠狀解剖(％)1血管疾病5451552血管疾病2934313血管疾病161513MI＝心肌梗塞+中間值(第25，75百分分布)表12手術程序細節安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)程序(％)氣囊血管成形術909090癍塊切除545上述兩者565在手術室的時間(分鐘)+134(71，394)129(75，401)141(69，513)使用的對照(mL)+200(150，286)200(150，277)200(150，285)血栓溶解劑(％)3.23.72.3最低的ACT(秒)271(190，345)284(190，371)285(185，388)ACT＝活化的血凝塊時間+中間值(第25，75百分分布)表13主要發生事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透劑量反應(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值主要終點*89(12.8％)79(11.4％)59(8.3％)0.009主要終點的組成死亡12(1.7％)9(1.3％)12(1.7％)+0.96非致命性MI60(8.6％)43(6.2％)37(5.2％)0.013緊急PTCA31(4.5％)25(3.6％)6(0.8％)＜0.0001緊急CABG25(3.6％)16(23％)17(2.4％)0.177斯坦特4(0.6％)12(1.7％)4(0.6％)0.97氣囊泵1(0.1％)1(0.1％)1(0.1％)0.99*P＝0.009對於趨勢的總體試驗P＝0.43安慰劑組與濃縮藥丸組的比較P＝0.008安慰劑組與濃縮藥丸及滲透組的比較+3名死亡的患者被納入這一組，但實際上沒有接受治療MI＝心肌梗塞；PTCA＝經皮血管造橋術或癍塊切除；CABG＝冠狀動脈分流術表14c7E3Fab對心肌梗塞的效果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透劑量反應(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值Q波MI(％)2.30.90.80.018大的非Q波MI(％)4.02.42.80.197小的非Q波MI(％)2.32.91.60.342總值(％)8.66.25.20.013MI＝心肌梗塞大的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值＞5倍的正常上限；小的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值在正常上限3～5倍之間。在3個組中需要進行緊急重複性血管再造手術的非致命性局部缺血事件的發生時間是不同的，並且可以被準確地確定下來(見圖10)。在安慰劑組中大部分的事件發生在進行了引導程序後的數小時內，而在使用了濃縮藥丸的組中其發生的時間是在數小時以後(約6～12小時)，相應於對受體達到最大封閉的時間。在同時使用了濃縮藥丸和滲透的組中，局部失血現象的發生時間被明顯地推遲了，而且它們的絕對發生頻率也被明顯地降低了。表15給出的是在住院期間失血併發症的輪廓情況。如同對主要終點的效果一樣，也明顯地存在著對失血治療的分級效果。接受了濃縮藥丸以及滲透的患者顯示出在失血率及輸血率上的明顯的升高，而在僅接受了濃縮藥丸的患者中只顯示了中等程度的升高。大部分的失血現象是發生在冠狀動脈分流手術時，或在腹股溝血管穿刺的位點，雖然它們的血管修復手術的分布情況是基本相等的(在安慰劑組和接受了濃縮藥丸以及滲透的組中為1％，在僅接受了濃縮藥丸的組中為2％)。相似地，在6名患者身上發生了顱內失血現象，2例發生在安慰劑組中，1例發生在僅接受了濃縮藥丸的組中，3例發生在接受了濃縮藥丸以及滲透的組中，其中的一人並沒有接受藥物治療，因為他的顱內失血現象是在進行了隨機抽樣以後但是在進行血管成形術之前發生的。表15失血併發症和血液學測量安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)嚴重失血(％)*46(7％)76(11％)97(14％)輸血**紅細胞49(7％)92(13％)109(15％)血小板18(3％)29(4％)39(6％)血計數Nadir血細胞比容↑35(32，38)34(29，38)33(29，37)Δ血細胞比容↑5.3(3.2，7.9)6.5(4.2，9.8)6.8(4.1，10.5)指數↑1.8(1.1，2.7)2.2(1.4，3.5)2.3(1.4，3.8)Nadir血小板↑196(159，240)194(153，236)193(154，231)血小板計數24(3.5％)29(4.2％)42(5.9％)＜100,000*P＝0.001**P＜0.001↑中間值(第25，75百分分布)在這些治療結果中，次級臨床症狀發生的頻率很低並沒有很大的差別。在安慰劑組、濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組中的情況分別是30天心衰發生率(2.3％，2.4％，2.3％)，持續的低血壓(3.0％，3.6％，4.1％)，心室纖維性顫動(3.0％，2.6％，3.4％)以及臨床局部缺血的發生率(21％，17％，18％)。當把患者按照急性梗塞、非持續性絞痛或高度解剖性危險分組治療以評價c7E3Fab的效果時(參見圖11)，在所有3個選定的組內都見到了c7E3Fab的有益效果。相似地，其效果在按年齡或性別所分的亞組中都是相同的。雖然其效果對體重較大的患者更為明顯，但是作為體重的一個函數，c7E3Fab濃縮藥丸及滲透的有益效果在整個患者群中都是存在的。在僅接受了濃縮藥丸的患者中以及接受了濃縮藥丸和滲透的患者中，發生嚴重失血的危險性在較輕體重的患者中高於體重較重的患者。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對於體重最輕的患者來說，發生嚴重失血的數字分別是21％、15％和7％，而在體重最重的患者中相應地分別為8％、7％和7％。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對於體重最輕的患者來說，接受了輸血的患者的數字分別是24％、20％和11％，而在體重最重的患者中相應地分別為11％、7％和4％。討論這些結果確認了血小板、推測的血小衍生的調節子和血小板功能對於那些進行經皮經腔冠狀動脈成形術的患者在發生急性局部缺血的情況下的重要性。在設計EPIC試驗時，特別考慮了要選擇一組具有高度發生急性血管堵塞(復發性堵塞)和其相伴隨的併發症的危險的患者。對於以前的數據進行分析可以表明有些患者可以被認定為是具有高度危險的患者，依據的是他們的臨床血栓病症，例如急性梗塞(Stack，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111141-49(1988))，嚴重的非延續性絞痛(Myler，R.K.etal.，Circulation，82(SupplII)II-88-II-95(1990))，或血管造影顯示了血栓(Sugrue，D.D.etal.，Br.HeartJ.，5662-66(1986)；Hettleman，B.D.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，15154A(1990))。其他的患者也是高度危險的，依據的是生理上的因素，例如血管口徑窄小，滲血或血管形態畸形(Sinclair，I.N.etal.，Am.J.Cardiol.，6161G-66G(1988)；Ruocco，N.A.etal.，Am.J.Cardiol.，6969-76(1992)；Ellis，S.G.etal.，Am.J.Cardiol.，6330-4(1989))。在本試驗中，這兩類患者都有相當數量參加了本試驗，使得我們能夠進一步了解對每一類患者抑制血小板凝聚的內在關係。收取這些高度危險的患者被認為會使發生局部缺血現象在安慰劑組中的發生率為15％，儘管對每一位患者都給予了阿斯匹林和大劑量的肝素，這一預測的缺血發生率幾乎與現實相一致。c7E3Fab使得組成事件的發生率降低了35％，其主要效果見於進行緊急血管成形術或緊急冠狀動脈分流術的需要以及非致命性心肌梗塞都被有效地降低了。c7E3Fab的濃縮藥丸延遲了這些事件的起始時間，相應於對血小板凝聚的有效作用時間。然而，過了4～6小時以後，開始發生局部缺血現象。這一時間間隔相應於在給予鼠c7E3Fab濃縮藥丸之後，血小板凝聚恢復到其初始值的約50％時的時間間隔。除了延遲效果外，聯合使用對血小板產生長效抑制的(見實施例4)濃縮藥丸和滲透還能夠防止急性局部缺血事件的發生。組成終點提供了對在進行血管成形術期間的局部缺血現象的這種治療方法的總體評價。本試驗中最重要的發現之一是在不同的終點時的緩解效果的一致性。對心肌梗塞的緩解是實質性的，並且與同時的對此後需要進行緊急臨床搶救的降低是一致的。就經皮冠狀動脈術的評價而言，對非致命性梗塞的分類是一項重要的任務。經常發現肌酸激酶MB異化酶高於正常上限，在所報導的情況中有4％～21％的患者發生了這種情況(Klein，L.W.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17621-6(1991)；Hunt，A.C.etal.，Eur.HeartJ.，12690-3(1991)；Pauletto，P.etal.，Am.J.Cardiol.，69999-1000(1987)；Spadaro，J.J.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，12230-4(1986))。當這些酶的升高並不與相應的臨床症狀完全一致時，就沒有記載到出現長期的有害結果。因此，防止那些沒有伴隨著臨床局部缺血事件的孤立的酶的升高就可能不具有非常深遠的意義。為了保證在這一模糊區的客觀性，就要有系統地採集酶和心電圖數據，採用盲點終點委員會，並且要確認心肌梗塞就要求心肌特異性酶的提高至少要達到3倍以上。c7E3Fab降低所有情況的心肌梗塞，包括那些伴隨著中等程度的酶的升高、大量的酶的升高和產生Q波的心肌梗塞這一現象，再次確認了那些被防止的病狀的臨床重要性，特別是進行緊急冠狀動脈再造手術的需要也被降低了。雖然沒有預期到也沒有觀察到對死亡率的作用，但因注意的是在濃縮藥丸和滲透組內有3名沒有接受藥物的患者死亡。根據以治療為目的的原則，將這些死亡事件在主要分析中進行處理。所有的其他的死亡的患者都實際上接受了為他們選定的治療。由於與血管成形術所伴隨的死亡率很低，因此要確認對死亡率產生25％有益或有害治療效果，就需要進行對20,000名以上的患者的試驗。GPIIb/IIIa受體封閉對在高度危險的血管成形手術中的臨床終點的有益效果是令人信服的，並且與近期開始進行的用同樣的抗體在復發性非持續性絞痛患者的血管成形術的實驗的良性結果相一致(Simoons，M.L.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21269A(1993))。由於本試驗是第一次的大規模的IIb/IIIa受體封閉試驗，因此就存在著對其引起血小板減少症的危險的關注。然而c7E3Fab僅產生了很小的、臨床上非顯著的血小板減少症的增加。特別是，對這一試驗結果的分析揭示出在接受了濃縮藥丸及滲透的治療組內有更多的患者(5.2％)發生了血小板減少現象(血小板計數＜100,000/μL)，高於濃縮藥丸治療組(3.6％)和安慰劑組(3.4％)。因此，與安慰劑組相比，在濃縮藥丸及滲透處理組中的血小板減少現象的發生(血小板計數＜100,000/μL)被提高了(P＝0.062)。嚴重的血小板減少症(血小板計數＜50,000/μL)發生在濃縮藥丸及滲透處理組中的11名患者中(1.6％)，在安慰劑組中有5名(0.7％)患者發生了這一現象。在濃縮藥丸及滲透組和安慰劑組中各僅有4名患者(＜1％)同時發生血小板減少症和嚴重的、危及生命的或致死性負作用。所有的血小板減少症的情況都是短暫的，並且一般都發生在最初的幾天內。在治療的患者中，失血併發症和輸血都有明顯的增加。這一增加主要是在股穿刺位點的失血的結果，並且在這3組中都沒有導致Nadir血細胞比容或危及生命的併發症的明顯的變化。無論是否將進行手術的患者包括或不包括在本分析中，這些趨勢都保持不變。在本盲點研究中，由於對所採用的治療方案的不確定性，就可能導致在某些試驗地區出於對止血的關心而降低了進行輸血的標準。根據我們以往的經驗，已經得到證實的是經過重新修訂的用於處理失血和對接受了溶血劑的患者進行輸血的守則，可以有效地減少使用血製品(Wall，T.C.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21597-603(1993))。作為體重函數的治療效果與失血危險之間的相互作用實際上比預期的更為複雜。雖然在安慰劑組患者中主要症狀的發生率和嚴重失血的危險性依據體重的變化是很小的，但是在c7E3Fab濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組的患者中非常清楚地存在著隨體重的降低而發生主要結果症狀的增高和嚴重失血增高的趨勢。在進行經皮血管擴張術之前、之中或之後對患者臨床採用本封閉GPIIb/IIIa受體的方法的判定要依據避免局部缺血現象對給予的血產品的相對平衡值來決定。在參加本試驗的高度危險的患者中，這一平衡表現出對患者是有益的。急性心肌梗塞和緊急重複血管擴張術的預後影響是嚴重的，幸運的是，進行輸血的要求繼續下降(Donahue，J.G.etal.，N.Engl.J.Med.，327369-73(1992)；Dodd，R.Y.N.Engl.J.Med.，327419-21(1992)；Nelson，K.E.etal.，Ann.Intern.Med.，117554-9(1992))。努力採用降低不必要的失血和輸血以及更有效地使用抗血栓劑的實際計算方法，包括抗血栓劑和抗血小板劑，應該可以進一步提高在本試驗中所觀察到的臨床效果。在實踐中，對那些帶器械的患者給予有效的、非腸道抗血栓劑時，必須注重依其體重來調節抗血栓藥劑的劑量(例如，肝素的劑量在此並不依據體重而進行調節)。在所有參加本試驗的地區內採用更加詳細的確定降低失血的方法的守則和評價方法，可以獲取更多的關於失血併發症發生的信息。在患者群中，廣泛的有效治療的一致性是血栓形成在很多患者中為更重要因素的強有力的證據，儘管在某些病例中突然阻塞可能是血栓性的或生理性的。由濃縮藥丸劑所產生的對發病的延遲以及由濃縮藥丸和滲透共同產生的對發病的防止，都意味著在大多數情況下受到損害的動脈的表面都在本程序之後的18～24小時喪失了其血栓形成功能。實際治療方案中應該考慮到在有高度危險發生急性血管堵塞的患者中對持續的抗血栓效果的需求。總而言之，本試驗表明了在進行高度危險的經皮血管擴張手術的患者中提供有效的、持續的對GPIIb/IIIa受體的封閉可以降低和/或防止復發性閉塞及突發性堵塞。雖然這一有益效果的獲取是以增加失血的危險性為代價的，但是基於臨床的和本程序前所做的血管造影的預測，對於那些患有急性局部缺血併發症危險的病人採取這種治療方法所得到的總體臨床效果則是對患者有益的。本試驗首次為抑制細胞組分的功能提供了真實有效、意義深遠的治療方法，並為將來在生物技術上選擇其它的細胞組分(integrin)目標以及對這一特異性GPIIb/IIIa採取非抗體的或多肽方法鋪設了寬廣的道路。實施例7冠狀動脈手術後早期使用抗GPIIIb/IIIa嵌合抗體片段降低臨床復發性狹窄在進行了氣囊血管成形術或經皮冠狀動脈手術後發生的重複狹窄是極為常見的，在術後的6個月內，有25％的病例導致了絞痛症狀的重複發生以及需要重複進行血管擴張術，其總的花費在美國每年高於20億美元(Popma，J.J.etal.，Circulation，841426-1436(1991)；Topol，E.J.etal.，Circulation，871489-1497(1993)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993))。重複狹窄的主要生物學起因是血管壁的損傷，由擴張的氣囊或手術器械在手術位點造成，以及伴隨著的血小板凝聚的形成和內側平滑肌細胞從它們的休止與收縮狀態到可移動、繁殖和分泌功能狀態的表形上的改變(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729(1993))。儘管已經有不同的藥物製劑在調節血管壁損傷後的特徵性肌內膜生長的試驗中為成功性的，而且小型研究也建議它們可帶來在血管造影上的有益效果，但是迄今為止還沒有一個大規模的臨床試驗在患者中證實了藥劑的有效性，而且也沒有已知的能夠降低這些病狀的藥物治療(Popma，J.J.etal.，Circulation.841426-1436(1991)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993)；MercatorStudyGroup，Circulation，86100-110(1992))。冠狀動脈血管成形術是一種常規手術並輔助於口服阿斯匹林和靜脈內注射肝素。然而，這種抗血栓方法只能對血小板的凝聚產生很弱的抑制。很多不同的拮抗劑包括凝血酶、膠原蛋白和二磷酸腺苷都可以激發血小板，甚至在有阿斯匹林存在時也是如此。對血小板的分子生物學的研究已經闡明了GPIIb/IIIa組分是負責血小板凝聚的受體(Plow，E.F.etal.，Prog.Hemostas.Thromb.，296320-331(1988)；Coller，B.S.J.Clin.Invest.，76101-108，(1985))。嵌合7E3抗體的Fab片段，選擇性地與血小板的IIb/IIIa組分結合。當最初的研究確認了嵌合單克隆抗體Fab片段的初步安全性和有效性後，就在2,099名患者中進行了多中心、雙盲、安慰劑控制的試驗(見實施例6)。除了在急性狀態下的嚴重局部缺血現象得到降低的主要有效終點，即代表著對急性堵塞的抑制(見實施例6)之外，還確定了c7E3能夠降低臨床重複狹窄的發生，正如在其後6個月的追蹤期內的局部缺血或進行重複血管擴張的需要的結果而證實的那樣。方法本研究的人群和守則的詳情都如實施例6中所述。簡而言之，合適的病人是指曾經進行過冠狀動脈成形或定向性癍塊切除並正在發生或近斯內發生過心肌梗塞、非頑固性絞痛或高度危險的血管造影損傷形態的患者，正如美國心臟學會/和美國心內科學院的標準所定義的那樣(ACC/AHATaskForceReport，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-545(1988))。排除的原則是失血性素質、年齡≥80歲、近兩年內曾經發生過中風或在過去的6周內曾進行過重大手術。該守則在所有56個參加的地點都得到了該處的學術審查委員會的批准，並且或得了所有的患者的同意。患者口服阿斯匹林(325mg/天)，第一次服藥是在程序開始的至少2小時前進行。靜脈注射肝素是在程序中進行的，為的是獲得至少300秒的活化凝血塊的時間。除了阿斯匹林和肝素以外，患者隨機地被給予下述3種處理中的一種(1)安慰劑濃縮藥丸和12小時的安慰劑滲透；(2)0.25mg/kg的活性c7E3(Centocor，Malvern，PA)的濃縮藥丸和12小時的安慰劑滲透；或(3)同樣劑量的活性c7E3濃縮藥丸並隨後立即進行12小時的10μg/分的c7E3滲透。濃縮藥丸的服用是在冠狀動脈手術程序開始前的10分鐘進行的。主要終點是30天內的任何一種原因造成的死亡，其原因有心肌梗塞、對急性局部缺血進行的冠狀動脈分流術、對急性局部缺血進行重複的經皮冠狀動脈手術，為了治療局部缺血而進行主動脈內的氣囊泵放置和腔內斯坦特。所有這些現象都由一個獨立的臨床終點委員會來進行審核，該委員會在整個研究期間內是盲目的，而且對每一症狀進行分類時至少得有2個審查委員的一致意見。在隨後的6個月的追蹤期內繼續保持雙盲。除了隨後的死亡或致命性心肌梗塞之外對患者們進行追蹤，以確定進行包括經皮冠狀動脈手術或冠狀動脈分流術或進行這兩種手術的重複性血管擴張的需要。與急性階段終點不同，放入斯坦特或在主動脈內置入氣囊泵都不被包括在這一結果內，因為本方法所注重的是進行血管擴張的需要，而不是作為突然局部缺血的替代品。出院後的心肌梗塞的確診的條件是兩個或更多個相鄰的電極上有新的顯著的Q波≥0.04秒或比相應的R放大波的深度≥1/4的深度；或者肌酸激酶或肌酸激酶心肌帶超過正常上限的2倍以上。收集血管擴張的數據以及最初的目標血管是否經過了重複的手術或經皮血管擴張的數據。追蹤的完成率是97.2％。為了評價6個月的調查結果是否與緊急階段的結果不同，在所進行的分析中就包括了從開始到6個月期間的所有發病情況，接受了成功的早期手術的患者的30天終點以後的發病情況(其定義為根據臨床醫生的檢測證實獲得了最後的狹窄小於50％並且沒有局部失血併發症)，以及接受了成功的早期手術的患者的48小時以後的發病情況。對於30天終點的選擇依據的是以前的很多心血管手術試驗的病例。以48小時為一階段點，是因為已知定義限定的幾乎所有的冠狀動脈手術後的急性堵塞病狀都是在這一個期間內發生的(Detre，K.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，13230A(1989)；Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；deFeyter，P.J.etal.，Circulation，83927-936(1991))。通過公爵大學(DukeUniversity)的數據採集中心用電話隨機對患者進行採訪。隨機性是按照研究地點以及患者是否患有急性心肌梗塞而進行的區分。這些數據被研究調查員記錄到6個月的病歷表格上，並且在數據輸入前由本研究的盲點監察人員對表格的質量進行監察。本研究的主持人對於隨機抽樣的密碼以及追蹤調查結果一直為盲目的，直至所有的追蹤調查完畢，並且所有的病例都被臨床終點委員會進行了判斷，從而完成了資料庫的建立。統計學分析所有的治療之間的比較都是按以治療為目的的原則進行的。對發病率的評價採用了Kaplan-Meier方法(Kaplan，E.L.andP.Meier，J.Am.Stat.Assn.，53457-481(1958))，並且以存活曲線用圖示的方法表示其結果。採用常規化的對數級別統計方法(log-rankstatistic)對安慰組、濃縮藥丸組、濃縮藥丸及滲透組的發病率進行了劑量反應的檢測(結果分別為0，1和2)。對安慰劑組與採用了c7E3的各組之間的比較也採用了對數級別統計的方法。部分危害模型(Proporstionalhazardsmodels)(Cox)適用於判定起始病徵與結果之間是否存在著因果關係的檢驗。這些都是結合了治療差異模式在所有的治療組中進行的，並且對各治療組分別進行了檢驗以確定他們之間的差異。此外，部分危害回歸模式(Proporstionalhazardsregressionmodels)(Cox)適用於所有的在48小時追蹤後的組成終點以判定那些與後來發生的病狀或治療效果有關的因子。本分析中的這些因子包括治療方案，進行過血管擴張的單一損傷或多重損傷，治療期間的長短，在開始時的心肌梗塞或非頑固性絞痛或其它的高度危險的入選病狀，性別，年齡≥65歲或＜65歲，體重以及糖尿病。結果病人的選取從1991年12月1日開始直到1992年11月18日截止，共選擇了2099名患者。在整個研究中的各種特徵都在以上給出了(見實施例6，表10)。表16給出的是那些曾經進行了成功的先期血管成形術或癍塊切除術並使他們能夠入選為以後發生臨床重複狹窄的患者的初始病症。在那些曾經進行了成功的先期手術的患者的起始病症中並沒有由於治療方案而造成的顯著差異。表16進行過成功的先期手術的患者的人口學特徵安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透(N＝609)(N＝605)(N＝620)年齡(年)60.0±10.359.7±10.460.2±10.6性別(％)430(71.7％)434(71.7％)445(71.8％)體重(公斤)84.9±16.083.5±16.583.3±15.7危險因素(％)糖尿病155(25.8％)146(24.1％)139(22.4％)高血壓321(53.7％)329(54.8％)314(50.8％)高膽固醇316(52.7％)337(55.7％)324(523％)吸菸377(64.7％)428(71.8％)423(69.5％)血管疾病外周的47(7.9％)52(8.7％)52(8.5％)大腦的21(3.5％)19(3.1％)27(4.4％)曾經患過MI(％)無275(45.8％)239(39.5％)253(40.8％)＞30天109(18.2％)126(20.8％)128(20.6％)8-30天45(7.5％)55(9.1％)57(9.2％)＜8天171(28.5％)185(30.6％)182(29.4％)進程前血管成形術145(24.3％)121(20.0％)139(22.6％)分流術88(14.7％)85(14.0％)95(15.3％)冠狀解剖(％)1血管疾病337(56.2％)324(53.6％)354(57.1％)2血管疾病170(28.3％)198(32.7％)191(30.8％)3血管疾病93(15.0％)83(13.7％)75(12.1％)手術種類氣囊540(90.0％)549(90.7％)561(90.5％)癍塊切除(atheretomy)37(6.2％)27(4.5％)34(5.5％)上述兩者23(3.8％)29(4.8％)25(4.0％)目標血管LAD241(40.2％)229(37.9％)262(42.3％)LCX1.44(24.0％)1.59(26.3％)1.65(26.6％)RCA234(39.0％)253(41.8％)219(35.3％)LeftMain4(0.7％)1(0.2％)3(0.5％)移植35(5.8％)35(5.8％)43(6.9％)接受了c7E3濃縮藥丸的患者以及接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者們都顯示了明顯的失血併發症的升高，主要發生在第一個48小時內，並且其輸血率幾乎增加了一倍(安慰劑組7％，濃縮藥丸且13％，濃縮藥丸及滲透組15％，P＜0.001)。12小時的連續滲透在下述患者中沒有進行完全，安慰劑組中48名患者(7.0％)，濃縮藥丸組85名患者(12.5％)，濃縮藥丸及滲透組患者107名(15.8％)。在接受了c7E3的患者中沒有見到血小板減少症或過敏反應的升高。人抗嵌合抗體(HACA)的陽性反應在濃縮藥丸組中為5.2％，在濃縮藥丸及滲透組中為6.5％。大多數產生陽性HACA反應的患者都是低效價的反應。濃縮藥丸組中產生陽性HACA反應的全部32名患者的效價都≤1∶1600。濃縮藥丸及滲透組中產生陽性HACA反應的全體40名患者中的34名的效價都≤1∶1600。在濃縮藥丸及滲透組中有6名患者的HACA效價在1∶6400與1∶51200的範圍內，而在濃縮藥丸組中沒有發生這種現象。到30天時，與安慰劑組(12.8％，P＝0.009)相比，接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者(8.3％)中的嚴重局部缺血現象(死亡，心肌梗塞，急性血管擴張術)被降低了35％(見實施6，表13)。表17給出的是6個月的數據，其中有死亡、心肌梗塞、以及需要進行冠狀動脈分流術或重複性冠狀動脈手術的結果，並且伴隨針對下列各種情況的血管擴張手術(a)所有入選的患者，(b)入選後的48小時內沒有局部缺血並發現象但又進行了成功的治療的患者，和(c)那些進行了成功的先期治療並在第一個30天內沒有發生病症的患者。到6個月時局部缺血現象和血管擴張手術被降低了23％(27％對35％，P＝0.001；見表17，所有入選的患者，死亡、MI、CABG、PTCA)。造成這種有益的長期效果的主要原因是在那些進行了先期成功的手術的患者中降低了對再次進行分流手術或血管成形術的需要，正如重複進行的目標血管擴張在c7E3濃縮藥丸及滲透組中(16.4％)與安慰劑組中(22.3％)相比所顯示的被降低而證實(P＝0.007；見表17)。在僅採用了濃縮藥丸的組的結果，根據本實驗的標準而言並沒有產生比安慰劑組強很多的結果，並且是非顯著性的。在另外的一個分析中，對所有的在30天內沒有經歷主要病狀的患者的6個月的數據進行了研究。這一分析的結果列於表18。這些數據指出在那些接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者中，需要進行重複性血管擴張術的患者降低了21％。表176個月的結果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝696)(N＝695)(N＝708)所有受試患者死亡(％)3.42.63.00.827MI(％)10.58.06.90.016CABG(％)11.09.79.40.339PTCA(％)20.819.814.30.001複合死亡，MI，CABG，PTCA(％)35.032.426.90.001任何血管擴張術(CABG/PTCA)(％)29.427.223.10.008目標血管重複擴張(％)22.320.816.40.007所有進行了成功的手術的患者在48小時(N＝606)(N＝618)(N＝639)死亡(％)2.72.33.00.664MI(％)2.62.42.50.860CABG(％)7.67.47.00.701PTCA(％)16.417.211.50.010複合死亡，MI，CABG，PTCA(％)25.324.119.10.007任何血管擴張術(CABG/PTCA)(％)23.022.518.00.025(所有患者)(N＝636)(N＝655)(N＝666)目標血管重複擴張(％)18.9％18.4％15.6％0.134所有進行了成功的手術的患者在30天(N＝549)(N＝576)(N＝598)死亡(％)1.71.31.50.789MI(％)2.01.91.70.716CABG(％)5.65.74.70.438PTCA(％)12.514.410.00.180複合死亡，MI，CABG，PTCA(％)19.220.115.20.072任何血管擴張術(CABG/PTCA)(％)18.418.314.60.077目標血管重複擴張(％)16.816.414.30.265表18在所有30天時沒有發生病狀的患者的6個月時的結果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝601)(N＝611)(N＝643)死亡(％)1.81.31.00.38MI(％)2.42.52.20.85CABG(％)5.95.54.40.24PTCA(％)13.814.810.70.12CABG/PTCA(％)18.418.314.60.077複合死亡19.519.615.40.059MI，CABG，PTCA(％)從基線時的複合情況34.832.226.90.001(包括0-30天)(％)所有受試患者的所有病狀的數據(死亡，非致命性梗塞或需要進行冠狀動脈擴張術)還在圖12中給出。那些進行了成功的手術並且在30天內沒有發生病症的患者的數據還在圖13中給出。對急性階段終點而言，81％的病狀是在前48小時發生的。這一情況在所有各受試組都是相似的(安慰劑組82.0％，濃縮藥丸組79.7％，濃縮藥丸及滲透組是81.4％)。參考在進行了成功的先期手術的患者的第一個48小時內發生病狀的情況，就可以確定在第1個30天內所要進行的目標血管擴張術。正如在圖14中所示，對於c7E3濃縮藥丸組和c7E3濃縮藥丸及滲透組之間的亞急性局部缺血病狀直到30天以後才有明顯的差異。除了對包括沒有進行先期治療的血管的複合死亡，心肌梗塞和血管擴張術進行分析外，對目標血管擴張術進行單項分析也是很有意義的。對所有患者在6個月時而言，目標血管擴張在濃縮藥丸及滲透組中比其他受試各組明顯地降低了26％(見圖15)。值得注意的是，按照本試驗的條件進行追蹤調查的結果顯示出僅採用濃縮藥丸的治療並沒有對目標血管擴張造成任何影響。在開始時對亞組間的分析以區別具有急性冠狀綜合症(非頑固性絞痛，最近的或急性的心肌梗塞)的患者與那些患有頑固性絞痛但沒有高度危險的血管形態的患者(表19)。這一研究表明在這兩個亞組中對複合事件都有顯著的降低效果，但是，對需要重複進行冠狀動脈手術的降低只在患有頑固絞痛的患者中為顯著的(表19)。這一發現在進行了成功的手術的患者中的開始及48小時的結果之間是一致的。表19對急性冠狀動脈綜合症與頑固性絞痛患者的亞組的分析從開始至6個月的事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值急性冠狀動脈綜合症N288306299複合事件33.1％28.8％25.5％0.039重複PTCA20.2％16.9％15.4％0.129頑固性絞痛N408389409複合事件36.3％35.3％28.0％0.012重複PTCA21.3％22.1％13.5％0.004從48小時至6個月時的事件急性冠狀動脈綜合症N252277271複合事件23.5％21.4％17.8％0.094重複PTCA14.8％15.2％11.9％0.325頑固性絞痛N354341368複合事件26.6％26.4％20.0％0.034重複PTCA17.5％18.7％11.1％0.013討論從本大規模、多中心、隨機試驗所獲得的結果證實了在接受了濃縮藥丸及滲透以封閉血小板IIb/IIIa部分的進行冠狀動脈治療的患者中使復發性狹窄的臨床發生得到了降低。其有益效果的程度在6個月時為大約23％，包括所有的局部缺血事件，例如死亡、非致命性心肌梗塞和重複血管擴張術，而在目標血管擴張術上的降低為26％。這些使用c7E3濃縮藥丸及12小時滲透所獲得的有益效果使急性堵塞和急性階段負反應結果被降低到不需要進行後來的冠狀動脈血管擴張術的程度。在本試驗中所用的單克隆Fab片段對血小板IIb/IIIa表面部位有非常有效的結合性並且很少被解脫下來。前述的對接受了c7E3並進行血管成形術的患者的研究表明在終止抗體的滲透以後還持續存在著對IIb/IIIa結合位點的至少36～48小時的佔據，以及對血小板凝聚的至少72小時的抑制(見實施例4；又見，Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，41675-175(1993)；Tcheng，J.E.etal.，Circulation.88(1993))。雖然這些效果都隨時間逐步消失並回到基線值，但是c7E3對血小板凝聚的抑制效果的期間是非常有意義的，因為在本試驗的條件和標準下，濃縮藥丸及安慰劑滲透的治療中沒有觀察到在急性階段或6個月的結果中產生明顯的臨床效應。這一觀察結果指明通過使用抗GPIIb/IIIa抗體來降低急性局部缺血或臨床復發性狹窄可能需要更長時間的接受這些製劑(正如採用濃縮藥丸及滲透藥物所示)，而且更長期地對GPIIb/IIIa的抑制可以產生進一步改進的治療效果。還值得注意的是，c7E3還被報導可與玻連蛋白受體相結合(Hynes，R.O.，Cell，6911-25(1992))，其原因可能是該受體含有GPIIb/IIIa的β3成分。這一玻連蛋白受體(vitronectin)可能參與對狹窄或復發性狹窄的調節，將抗GPIIb/IIIa的物質與該受體結合可能有助於所觀察到的效果。其他GPIIb/IIIa受體的抑制物具有對目標及同源成分的不同程度的特異性(Sutton，J.etal.，ClinicalResearchAFCR，41118A(1993))。進行比較試驗可以將這些分子相互作用分解到與之相應的臨床效果。在本試驗中，沒有進行系統性的6個月的重複血管造影檢驗以定量地確定各受試組中的效果。雖然重複的血管造影在很多的重複狹窄試驗中都被進行了(Forrester，J.S.etal..J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729，(1993)；Topol，E.J.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Adelman，A.G.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Serruys，P.W.etal.，Circulation，841568-1580(1991))，但是它有一個主要的缺陷，即在無症狀的患者中對目標血管狹窄的診治經常會導致在實際上不需要進行的重複的治療。與之相反，本試驗提供了對大量患者的臨床實際治療的一種模擬。復發狹窄試驗的真正目的是顯示對需要重複血管擴張術的顯著降低，因為最近進行的一些復發狹窄試驗記錄中的血管造影效果的本身並不是與臨床完全相關的或單項適合的。進而言之，由於死亡及心肌梗塞在接受了經皮冠狀動脈治療的患者中並不是很常見的，因此由有效的藥物治療調節所得到的最重要的效果應該是重複的目標血管擴張術，正如在本試驗所見到那樣。因為在本試驗中的患者們接受的治療除了在使用的藥物、濃縮丸和滲透不一樣以外，在其他的方面包括在追蹤調查完成之前始終保持雙盲性方面都是一樣的，因此可以合理地得出的結論是對復發性狹窄的降低產生了所觀察到的臨床的有益的效果。這就顯示了本第一次的大型隨機試驗表現出在是否需要進行隨後的血管擴張術方面的有益的臨床降低效果，並且可被解釋為在臨床上更少地發生了復發性狹窄。這些結果是通過IIb/IIIa封閉劑的濃縮藥丸及滲透而達到的，並且導致受傷血管壁的真正的癒合。儘管c7E3的滲透只進行了12小時，但這種製劑的抗血小板效果可以延續數天，而且在急性階段沒有發現重複發生局部缺血事件的證據。更重要的是在6個月時降低目標血管擴張術的獨立的有益效果表明緊急c7E3藥物治療的持續效應，並且可以被認作是血管壁癒合的臨床證據。用血小板IIb/IIIa封閉而使臨床復發狹窄被降低這一現象進一步地說明了血小板凝血在復發性狹窄中的作用，而這種血小板凝聚已經被認為是在血管成形術後或內皮受傷的新內膜損傷發生的關鍵(Schwartz，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，201284-1293(1992)；Toppl，E.J.MayoClin.Proc.，6888-90(1993)；Willerson，J.T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810624-10628(1991))。雖然內側平滑肌細胞的增殖也可能在復發性狹窄中扮演非常重要的角色(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729，(1993))，但本試驗的結果表明，有效的抗血小板及抗凝血途徑可能是對這一重要的臨床現象為非常有益的。本試驗支持了這樣一種觀點，即現行的使用阿斯匹林作為唯一的抗血小板劑在冠狀動脈治療中(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988))是非常不夠的，無法完成血管損傷的血小板反應的拮抗。實施例8隨機性雙盲安慰劑對照試驗的其它發現管鞘尺寸和失血併發症用EPIC試驗(見實施例6和7)對失血併發症進行分析，確定在進行PTCA/DCA時管鞘尺寸是否與失血併發症相關。管鞘尺寸及導嚮導管的尺寸是由醫生臨床決定的。對主要的失血現象，如腹股溝失血、輸血、血管修補、nadirHct作了預測的分析。儘管對已知失血預測因素進行了調整，包括插入導管期間使用的肝素以及治療方案(P＝0.0004)，管鞘尺寸仍舊可以預測腹股溝的失血。較多的血管的修復伴隨著較大的管鞘尺寸這一傾向並非顯著性的(P＝0.0004)。嚴重失血(10.5％)、輸血(11.8％)和nadirHct(34％)並不依據管鞘的尺寸而變化。接受了c7E3Fab的患者發生比不接受c7E3Fab的患者有更多的腹股溝失血(55％vs.30％，P＜0.006F-7.5F8F-8.5F9F-11Fn＝375n＝1416n＝291腹股溝失血140(38％)674(48％)147(51％)血管修復5(1.3％)17(1.2％)7(2.4％)這些結果表明大尺寸的管鞘伴隨著更多的腹股溝失血但並不影響PTCA/DCA的嚴重失血併發症。c7E3與腹股溝的失血增加有關，但是可以通過採用較小尺寸的管鞘和導嚮導管而使之最小化。冠狀動脈治療中抑制血小板GPIIb/IIIa受體後的局部缺血現象與失血現象的關係EPIC(評價c7E3在防止局部缺血併發症中的作用)試驗(見實施例6和7)表明用c7E3Fab這種血小板受體GPIIb/IIIa的有效拮抗劑的治療，可以防止在進行高度危險的冠狀動脈成形術(PTCA)時的局部缺血併發症，但是對於其失血現象則需要將輸血從安慰劑組的7％升高到c7E3Fab組的14％。為了對其進行更深一步的調查，對失血指徵(nadir血細胞比容，失血指數，血細胞比容的變化，所輸入的血紅細胞的單位數)與本試驗的主要終點(死亡，心肌梗塞，冠狀動脈分流術(CABG)，或對急性局部缺血進行的PTCA或針對治療失敗而進行的冠狀動脈斯坦特插入)之間的關係進行了調查。在失血與主要終點之間發現了很強的相關關係(對於所有失血指徵P＝0.0001)。這一相關關係存在於下述各項治療中安慰劑，c7E3Fab濃縮藥丸，c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透。因此，具有顯著失血的患者就更容易發生局部缺血併發症。這一很強的相互關係可能是由於伴隨主要終點事件(如CABG)的失血的增高而造成的。另外，失血以及所伴隨的低血壓也可能是造成術後的局部缺血併發症的主要因素之一。支持這一點的是，在進行了成功的PTCA後的患有低血壓(除了在主要結果事件以後的低血壓)的患者是非常明顯的更容易發生主要結果事件，並且更容易發生嚴重失血及主要結果事件。低血壓沒有低血壓P值數2391597-主要終點(％)46(16.1)103(6.5)＜.001終點+嚴重失血(％)18(39.9)10(9.7)＜.001其結論是，失血似乎是可以引起在某些患者身上的局部缺血併發症，而降低失血的方法(例如改變肝素的劑量)可以進一步地在冠狀動脈治療中提高GPIIb/IIIa抑制的抗局部缺血的效率。在高度危險血管成形術中積極性血小板抑制的經濟益處及害處在2,100名患者的EPIC隨機試驗中(見實施例6和7)採用高劑量的c7E3Fab的積極性血小板抑制使得高度危險的冠狀動脈血管成形術(PTCA)中發生的死亡、復發性梗塞和復發性局部缺血被降低了35％，但是，PTCA後的嚴重失血增加了一倍。為了評價這種臨床綜合效應的經濟學結果，進行了更詳細的經濟學方面的展望及研究。對每一位參加試驗的患者收集了他們的參加試驗後6個月的住院花費(不包括服務費)和所用資源的數據。對於沒有複雜的住院過程的患者的平均基本住院花費為9300美元。嚴重併發症對基本住院花費的影響是按照多變量線性回歸模型(multivariablelinearregressionmodel)進行分析的平均住院花費等於＝9065美元+5923美元(緊急PTCA)+28,219美元(緊急CABG)+3645美元[(復發)梗塞]+3462美元(嚴重失血)這一模型顯示將緊急PTCA從4.5％減少到0.8％，緊急CABG從3.6％減少到2.4％以及將(復發)梗塞從8.6％減少到5.2％就使得c7E3片段的治療方法比安慰劑治療方法對每個患者平均降低了費用682美元。然而，由於嚴重失血被增加了一倍，即從7％至14％，那麼這種方法就喪失了242美元的潛在的可能節約的優勢，其結果是對每位患者來說實際上的花費的淨節省值為440美元。實際上對於高劑量c7E3Fab(X＝$10,970±7,284)與安慰劑(X＝$11,376±12,555)之間的平均費用的差距為406美元，與模型的預測值非常接近。因此，通過對高度危險的PTCA的局部缺血併發症的明顯降低，使用嵌合抗GPIIb/IIIa片段的對血小板的積極性抑制就提供了改善的醫療效果和淨花銷的節省。在保證治療的有益效果的同時，採用能夠使服用c7E3時的嚴重失血率被降低的方法還可以使預測的淨花費的節省數升高到每位患者為700美元。在冠狀動脈治療中用血小板GPIIb/IIIa拮抗劑可使活化的凝血時間得到提高活化的凝血時間(ACT)被用於經皮經腔冠狀動脈血管成形術(PTCA)以監測對凝血酶抑制的程度和在使凝血現象被最小化的嘗試中的抗凝聚作用。在引入有效的血小板抑制劑例如嵌合單克隆c7E3Fab抗體後，對在PCTA中的調節ACT的方法的實用性還沒有進行檢驗。直至目前為止，c7E3對ACT的影響還是未知的，並且還沒有被推測出來。血小板GPIIb/IIIa的拮抗機制的對ACT方法的可能的影響已經被調查了。在該試驗中接受了PTCA的2099名患者被隨機地給予安慰劑(n＝696)或GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab(n＝1403)。與安慰劑組相比，接受了很高劑量的肝素(＞14,000單位)的患者的數目比較少，儘管這些接受了c7E3Fab的患者也接受了相似劑量的肝素，但在根據體重進行了校正之後他們都具有明顯的高的(P＜0.001)ACT。肝素劑量安慰劑對象％c7E3Fab對象％＜10,000單位或僅滲透112(16)265(19)10,000單位220(32)497(36)10,000-14,000單位141(21)298(22)＞14,000單位209(31)316(23)結論是，血小板GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab將活化凝血時間延長了35～40秒。這一點在肝素劑量輔助治療法以及在GPIIb/IIIa為指導的治療法中進行冠狀動脈治療時都具有非常重要的意義。使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體防止血管成形術的局部缺血併發症的評價試驗的性別差異進行了使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體，即單克隆c7E3Fab抗體防止血管成形術中的局部缺血併發症的評價試驗的性別差異研究(見實施例6和7)。進行經皮治療(PTCA)的患者在治療前的不長時間內接受了下述三者之一的盲點處理c7E3濃縮藥丸並隨後進行12小時c7E3滲透、c7E3濃縮藥丸或安慰劑。儘管事實上女性都比男性的年齡稍大，體重稍輕，並且具有更多的心血管危險因素，但是，女性及男性在下列各項目中都沒有顯出性別差異死亡頻率(2.2％vs.1.3％)，MI(7.5％vs.6.3％)，緊急PTCA(2.6％vs.3.1％)，緊急分流手術(1.7％vs.3.2％)，在30天內的斯坦特置入、主動脈內氣囊泵的放置或複合的對那些局部缺血負作用事件的處理(10.5％vs.11.0％，P＝0.74)。對於這些複合處理的已知因素的調整(治療方案、體重、高血壓、外周血管疾病)，以及對任何涉及性別的潛在的統計學作用的調整都不會改變這些結果。用c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透的治療在兩種性別中都對局部失血事件的頻率產生了相似的降低。女性顯示出比男性更多的嚴重失血(12.6％vs.9.8％)，需要更多的輸血(PRBC)(19.5％vs，9.0％)並且具有更高的失血指數(Δ血細胞比容/3+PRBC單位，2.4vs.1.9)。在預測失血指數的回歸模型中，儘管對已知的失血預測因子進行調整(治療方案、年齡、體重、開始時的血細胞比容、高血壓)，性別在統計學上仍舊是獨立的預測因子(P＝.0041)。結論是，在接受了高度危險的血管成形術和c7E3Fab治療以後，女性顯示出了比男性更多的失血，但是，在其它的負作用上，並沒有顯示出增加。實施例9嵌合性7E3Fab對人血小板上的GPIIb/IIIa的親和性嵌合性7E3Fab和鼠7E3FabIgG對三位正常供者的血小板的結合在37℃進行了研究，並且用直接結合等值點陣圖(directbindingisothermplots)和質量作用定律的線性表達(linearrepresentationsofmassactionlaw)進行了研究。標記的抗體125I-鼠7E3IgG(m7E3IGg)用碘標記來製備。特異性活性和蛋白質濃度分別是4.1μCi/μg/和45μg/ml。用HAS-生理鹽水進行1∶20的稀釋(0.1％人血清白蛋白在0.9％NaCl溶液中)，得到100,000cpm/10μl。125I-嵌合性7E3Fab(c7E3Fab)用碘標記來製備。特異性活性和蛋白質濃度分別是0.995μCi/μg/和0.29μg/ml。用HAS-生理鹽水進行1∶62.5的稀釋得到100,000cpm/10μl。抗體濃度為250μg/ml的工作溶液是用鼠7E3(m7E3)IgG和c7E3Fab製備的。用HAS-生理鹽水進行了幾次稀釋得到所需要的濃度。在40μl冷的抗體製劑中加入固定相應標記的抗體，既10μl，所得到的混合物用於抗體結合檢測。血小板用常規方法製備富集血小板(PRP)。血液被收集在檸檬酸鈉抗凝聚劑中，然後在1小時內將富集血小板調整到200-300,000血小板/μl。抗體結合檢測對抗體結合的檢測使用了修飾的Coller方法[Coller，B.S.，J.Clin.Invest.76101-108(1985)]。將50μl抗體溶液的等份試樣與450μl富集血小板混合，這兩種原料都預先加熱到37℃，然後將混合物在37℃培養30分鐘。該反應混合物的100毫升等份試樣立即在200μl的30％蔗糖上展層，一式三份，然後以10,000xg離心5分鐘。沉澱中含有沉降的被結合的抗體(離心管的尖部)，上清液中未結合的抗體並被與沉澱分開，對這兩部分的放射性進行確定並記錄。對來自三個不同供者的血小板各自進行了本檢測。數據分析根據對每個檢測中的上清液和沉澱的放射性讀數，對每個抗體濃度中結合抗體的組分進行測定。原理是結合的放射性標記的抗體與冷的抗體相一致，因此，對根據標記抗體測定的組分可以表示抗體分子的整個情況。這個結合抗體(Ab)組分，以及抗體的總濃度([Ab])被用來計算每個數據點的結合抗體和游離抗體的摩爾濃度。首先，用[結合Ab]對於[游離Ab]做出結合等位圖。四個參數的曲線符合於蘋果計算機上的KaleidaGraph軟體(SynergySoftware，Reading，PA)。該公式和四個相符的數據是y＝m1+((m2-m1)/(1+(x/m3)^m4))其中y＝[結合Ab]，x＝[游離Ab]，四個參數為m1＝平臺上部數值(飽和結合時，總的抗原/表位濃度，[總Ag])；m2＝平臺下部數值(在加入很低濃度Ab時，[結合Ab]趨近於0的數值)；m3＝在中間y值時的x值(當[游離Ab]與抗原表位的結合為50％時的數值)；以及m4＝該曲線上線性部分斜率的指數。在50％結合處的[游離Ab]值(上述計算中的第三個參數)就是根據質量作用定律的抗體和抗原之間進行反應的Kd值，假定為獨立的未交互作用的位置。另外，平臺上部的[結合Ab]數值(第一個參數)就相當於抗原位點全部飽和，給出了抗原位點的濃度。有了這個數值，就可以計算出每個血小板的GPIIb/IIIa受體數值。除了直接分析結合等位(bindingisotherm)之外，這些數據還用質量作用定律的線性轉換進行了分析。現在共有六種可用的線性轉換，其中的一個是通常被稱作Scatchard點陣圖(具體見下面)(FazekasdeSt.Groth，S.，「TheQualityofAntibodiesandCellularReceptors」，InImmunologicalMethods，Vol.I，Lefkovits，I.AndB.Pernis，Editors，AcademicPress，Inc.NewYork，1-42，1979)。點陣圖的公式所有的公式都是從質量作用定律推導出來的Kd＝[Ab]×[Ag]/[Ab∶Ag]其中[Ab]、[Ag]以及[Ab∶Ag]分別是游離Ab、游離Ag以及Ab∶Ag複合物的平衡摩爾濃度。結合等位[結合Ab]/[總Ag]＝1/(Kd+[游離Ag])×[游離Ab]點陣圖a[結合Ab]/[游離Ab]＝([總Ag]/Kd)-1/Kd×[結合Ab]點陣圖b1/[游離Ab]＝(-1/Kd)+([總Ag]/Kd×1/[結合Ab]點陣圖c1/[結合Ab]＝(1/[總Ag])+(Kd/[總Ag])×1/[游離Ab]點陣圖d[游離Ab]/[結合Ab]＝(Kd/[總Ag])+1/[總Ag]×[游離Ab]點陣圖e[游離Ab]＝Kd+[總Ag]×[游離Ab]/[結合Ab]點陣圖f[結合Ab]＝[總Ag]-Kd[結合Ab]/[游離Ab]被標記抗體的結合力當抗體被放射線同位素標記後，一部分的抗體會失去活性以及同目標抗原結合的能力。因此，非活性的被標記的抗體的比率必須用實驗來確定，並在製圖之前從抗體總濃度中減去[Trucoo，M.andS.dePetris，「DeterminationofEquilibriumBindingParametersofMonoclonalAntibodiesSpecificforCellSurfaceAntigens」，InImmunologicalMethods，Vol.II，Lefkovits，I.AndB.Pernis，Editors，AcademicPress，N.Y.1-26(1981)]。在此假設的是，非活性的抗體都由於標記而完全失去活性，餘下的抗體(即可發生結合的抗體)具有相同的親和常數。125I-標記的7E3Fab和7E3IgG，濃度為0.14-0.2μg/ml，與濃度為大約300,000血小板/μl的血小板培養。在平衡時，結合的抗體比率被確定，對7E3Fab和7E3IgG分別為89％和78％。根據質量作用定律推算的全部活性抗體的比率，在這些濃度時對這兩種抗體都是93％。因此，這些結果就表明有4％的7E3Fab和15％的7E3IgG為失活的，並很可能是放射性標記的結果。結果實驗的數據按照上述作圖(未顯示)，並製備了每個實驗的具有相符曲線等式的結合等位圖和線性圖。表20給出了根據使用相符曲線等式從每個數據點確定的Ka數值和表位密度(即每個血小板所具有的GPIIb/IIIa分子的數目)。c7E3Fab與人血小板的結合遵循了常規的結合形式。結合等位揭示的平滑曲線如同根據均質單克隆AbFab片段與均質細胞表面抗原結合所得到的曲線。該反應的解脫常數和結合常數經過計算分別為5.15納摩爾和1.94E08M-1。在血小板上的GPIIb/IIIa抗原的數目為69590(約等於70000)。經過比較，得到m7E3IgG與血小板的解脫常數和結合常數分別為3.56納摩爾和2.81E08M-1。對於7E3IgG的GPIIb/IIIa密度，計算結果為73355表位/血小板。這些數字指出，7E3Fab和7E3IgG的抗原結合位點的嚴緊反應常數是相似的。根據這些數據以及考慮了比率常數，計算得到的m7E3IgG與血小板的結合是雙臂的結合。表207E3與人血小板結合的親和常數和血小板的表位密度供者抗體Ka，M-1表位/血小板#1091c7E3Fab1.26E0859,129m7E3IgG共價1.71E0872,540M7E3IgG單價2.72E0831,898#1253c7E3Fab1.33E0871,506m7E3IgG共價2.95E0868,841m7E3IgG單價3.53E0829,408#2010Bc7E3Fab3.23E0878,136m7E3IgG共價3.77E0878,685M7E3IgG單價3.62E0833,780平均c7E3Fab1.94E08±1.12E0869590±9647m7E3IgG共價2.81E08±1.04E0873355±4972M7E3IgG單價3.29E08±4.96E0831695±2193實施例10嵌合性7E3Fab對內皮細胞上的玻連蛋白受體的結合血小板糖蛋白GPIIb/IIIa屬於一類整合蛋白受體，它們享有共同的結構性和免疫學性特徵。與GPIIb/IIIa緊密相關的一個整合蛋白是玻連蛋白受體(αvβ3)並使用與GPIIb/IIIa相同的β亞單位，但具有不同的α亞單位。玻連蛋白在內皮細胞上表達並調節與各種胞外基質蛋白的黏結(例如，玻連蛋白、纖連蛋白、vonWillebrand因子、血纖蛋白原、骨橋蛋白、血小板反應蛋白、膠原蛋白、基底膜(蛋白)聚糖)。GPIIb/IIIa與玻連蛋白受體之間具有足夠的同源性，所以，作為直接抗GPIIb/IIIa的抗體7E3還可以與內皮細胞上表達的玻連蛋白受體結合。因而，本研究就針對嵌合性7E3Fab(c7E3Fab)與內皮細胞的相互作用的特徵來進行，並確定該相互作用的任何可能的功能性後果。抗體本研究中使用的抗體包括抗-GPIIb/IIIa嵌合性7E3Fab(c-116E；由木瓜蛋白酶對IgGFab酶解得到的產物)；抗-CD4嵌合性MT412Fab，用作同源相配嵌合性Fab片段對照(由細胞系C128A產生；公開於WO91/10722號國際申請中)；抗-E-選擇蛋白H18/7F(ab』)2(M.Bevilaqua贈送品)；抗-ICAM-1#19(G.Riethmuller的贈送品)；抗-CD51(AMAC)，一種識別玻連蛋白受體的α鏈的單克隆抗體；抗-IIIa(AMAC)，一種與GPIIIa反應的單克隆抗體；鼠7E3IgG；抗-7E3是兔源的，可變區特異性抗-7E3多克隆抗體製劑；單克隆抗體LM609(D.A.Cheresh，ScrippsResearchInstitute，LaJolla，CA的贈送品)，它與αvβ3複合物(玻連蛋白受體)結合，但是不與GPIIb/IIIa結合；單克隆抗體10E5，與GPIIb/IIIa反應，但是不識別內皮細胞αvβ3(Centocor)。抗體的碘化嵌合性7E3Fab和嵌合性抗-CD4MT412Fab(cMT421Fab)通過孔徑0.22微米，13毫米大小的過濾器(Millipore，Millex-GV#SLGV01305)，然後再進行放射性標記。抗體的放射性標記採用Na125I(Amersham)和使用碘珠(Iodobeads，PierceChemicals，Rockford，IL)，通過瓊脂糖G25柱(PharmaciaPD-10SephadexG-25M)，去除未反應的125I碘化物。事先對該柱用在磷酸鹽緩衝生理鹽水中的0.1％人血清白蛋白(Albuminar-25，ArmourPharmaceuticalCo.，Kankakee，IL)進行封閉，並用0.01％Tween80-PBSS洗脫緩衝液平衡。碘化以後，抗體經過0.22微米過濾，抗體的濃度用280納米的光吸收來確定，使用1.5OD/mgmL-1作為吸收係數。HUVEC的培養從細胞系統公司(CellSystem，Kirkland，WA)購買了第一代的HUVEC細胞，培養在用2％明膠塗敷過的組織培養燒瓶中的含有血清的培養基(HUVEC培養基，CellSystem)上，直到第四代，此時以5×106細胞/毫升冷凍。對於HUVEC結合以及活化實驗，將細胞融化，以大約1×104細胞/井直接接種到2％明膠塗敷過的96井組織培養盤上，培養3到5天，直至融合，然後進行檢測。對於檢測HUVEC的傳播和黏附的實驗，細胞融化到用明膠塗敷過的T-150組織培養燒瓶中，生長到約85％融合。然後將細胞進行胰蛋白酶消化，接種到如下所述的塗敷過的基質上。125I-c7E3結合HEVUC被接種到96井的去除細胞組織培養盤(Dynatech)，生長至融合。為了達到飽和結合，用含有10％FCS(或如果需要，用不含血清的)HUVEC培養基將125I-c7E3稀釋。一套細胞用示蹤物培養，加入0.02％疊氮化鈉來防止示蹤抗體的加帽和內化。使用100倍的過量冷c7E3Fab來限制非特異性結合。細胞用示蹤物在37℃培養4小時，用200μl培養基洗兩次，移去細胞，用伽瑪計數器對放射性結合定量。對每個井中的細胞數量，用胰蛋白酶消化樣品井，用血細胞計記數。檢測一式三份。對於Scatchard數據分析，結合的125I-c7E3在橫坐標上作圖，游離抗體濃度除以結合的數量在縱坐標上作圖。對曲線的線性回歸得到了(-)的斜率，它被定為Kλ值。與X軸的交點被定為Bmax或最大抗體結合量。該Bmax值被轉換為每個細胞的位點數值，使用的公式如下結合的分子數/細胞＝Bmax(in摩爾)×(摩爾/1015摩爾)×(Avrogadro’s數/摩爾)/細胞數/井對於競爭結合，使用的方法與Scatchard分析所用相同，但是，使用了恆定的1μg/ml濃度的125I-c7E3Fab，雖然未標記的競爭物的濃度有增加。該檢測是在含有10％FCS的HUVEC完全培養基中進行的。對HUVEC活化的測定A.E-選擇蛋白和ICAM-1的表達HUVEC被接種到外突井的組織培養盤並生長至融合。用含有所示濃度抗體的100μlHUVEC完全培養基處理4或24小時。用50單位/ml的TNFα(Genzyme)作為陽性對照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1的表達。培養後，移去培養基，換以含有1μg/ml的125I-抗-E-選擇蛋白抗體的HUVEC完全培養基50μl(對經過4小時刺激的細胞)，或者換以含有1μg/ml的125I-抗-ICAM-1抗體的HUVEC完全培養基50μl(對經過24小時刺激的細胞)。細胞在37℃培養1小時，用200μl的培養基洗兩次，移去小井，用伽瑪計數器定量放射性結合。B.PMN與HUVEC的黏結HUVEC被接種到外突井的組織培養盤並生長至融合。用含有所示濃度抗體的100μlHUVEC完全培養基處理4或24小時。用50單位/ml的TNFα(Genzyme)作為陽性對照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1的表達，並進而提高對多形核白細胞(PMN)的黏結。PMN從被單聚溶解培養基(MonopolyResolvingMedium，FlowLabs)肝素化過的人血中分離。將PMN重懸浮於5ml的RPMI中，在室溫下用100μl111銦(Amersham)進行15分鐘的111銦標記。用50ml的RPMI對細胞洗兩次，重懸浮於含有10％FCS的RPMI中，達到4×106/ml。從HUVEC單層中移去培養基，每個小井中加入100μl的PMN，37℃培養30分鐘。用200μl的培養基洗兩次，除去為結合的PMN。用伽瑪計數器對每個小井計數來定量結合的PMN。實驗一式三份。C.HUVEC對塗敷表面的黏結和傳播將HUVEC接種到用2％明膠塗敷的T-150燒瓶，當到達約85％融合時取用。細胞經過短暫胰蛋白酶消化，清洗，重懸浮在HUVEC完全培養基，濃度為3×105細胞/毫升。用10μg/ml的c7E3Fab或CMT412Fab處理細胞，然後立即以300μl/井接種到8格的玻璃載玻片(NUNC#177402)上，或接種到8格的Permanox塑料載玻片(NUNC#177445)上，或者接種到48井的組織培養塑料盤(Corning)上，放入37℃的二氧化碳溼潤保溫箱內。每種表面都在室溫下預先塗敷4小時，使用的塗料是20μg/ml的纖連蛋白(SigmaF2006)、40μg/ml的血纖蛋白原(SigmaF4883)或20μg/ml的玻連蛋白(SigmaV8379)，各自都稀釋於PBS。塗敷之後，用PBS短暫洗每個小井兩次。接種4小時後和24小時後，用安裝在反相對比顯微鏡上的照相機對細胞拍照。結果C7E3Fab對人內皮細胞的結合每個細胞的抗體親和性以及數量對使用125I-c7E3Fab的飽和結合數據進行Scatchard分析(圖16和17A-17E)揭示了125I-c7E3Fab對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)親和性為大約Kλ＝1×108M-1(表21)。用TNFα處理之後，親和性沒有變化，而該處理正是提高內皮細胞上炎症調節蛋白質例如E-選擇蛋白和ICAM-1的處理。此外，當使用不含血清的培養基或在有疊氮化鈉(0.02％)防止加帽和內化的條件下進行檢測的時候，親和性也沒有改變。表21125I-c7E3Fab與內皮細胞結合的Scatchard分析的總結結合的7E3Fab/細胞Kλ(M-1)未刺激的HUVEC677,0001.34×108未刺激的HUVEC/不含血清677,0001.19×108未刺激的HUVEC+疊氮化物677,0001.23×108用TNF刺激4小時的HUVEC677,0001.38×108用TNF刺激24小時的HUVEC602,0001.28×108HUVEC培養時，使用的是提高了濃度的125I-標記的c7E3Fab，而且有或者沒有100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性結合。按照上述對數據進行Scatchard分析。Scatchard分析還揭示了每個內皮細胞結合有約650,000個125I-c7E3Fab分子。該數值在用TNFα或在有不含血清的培養基或疊氮化物存在進行刺激的時候都不發生變化。如果125I-c7E3Fab與內皮細胞上的αvβ3結合的話，則所得到的每個細胞上的位點的數量，就會與用LM609這種識別αvβ3複合物的抗體進行飽和結合分析得到的數字非常接近。Scatchard分析指出每個細胞結合有300,000個LM609抗體(圖18)。125I-c7E3Fab與內皮細胞的結合特異性進行了競爭性實驗來確定是否其它的抗-GPIIb/IIIa、抗-αvβ3、或其它的抗體可以抑制125I-c7E3Fab的結合(圖19)。LM609是一種與αvβ3複合物(玻連蛋白受體)結合但是不與GPIIb/IIIa結合的抗體，當IC50≈0.03μg/ml時，它有效地與125I-c7E3Fab競爭。鼠的IgG形式的7E3和嵌合性Fab形式的7E3分別在IC50值約為0.2μg/ml時和IC50值約為1.0μg/ml時與125I-c7E3Fab發生結合競爭。一種兔的可變區特異性抗-7E3抗體在IC50值約為1.0μg/ml時也封閉了125I-c7E3Fab的結合。而一種等位相配的對照Fab片段MT412(抗-CD4)沒有與125I-c7E3Fab競爭結合。另一種與GPIIb/IIIa結合但是不識別內皮細胞「GPIIb/IIIa」的抗體10E5也沒有競爭性。抗-αv抗體(從AMAC購買的克隆AMF7)和抗-IIIa抗體(從AMAC購買的克隆SZ.21)以及玻連蛋白都沒有與125I-c7E3Fab競爭結合。嵌合性7E3Fab對HUVEC激活的效果LPS、IL-1以及TNFα都可以激活內皮細胞表達黏結蛋白，例如E-選擇蛋白和ICAM-1。這些黏結蛋白調節白細胞與內皮細胞的黏結，使它們轉移到到炎症位點。在體外，與活化試劑接觸4小時得到了E-選擇蛋白的最佳表達，24小時得到對ICAM-1的最佳表達。用HUVEC與c7E3Fab培養4小時和24小時都沒有改變E-選擇蛋白以及ICAM-1的表達(圖20A-20B)，這是用125I-抗體結合進行的測定。嵌合性7E3Fab處理(0.01，0.1，1.0，10，或100μg/ml)或對照Fab處理(1.0，10，或100μg/ml嵌合性MT412Fab)HUVEC都沒有明顯地提高HUVEC與PMN的黏結(圖21A-21B；100μg/ml)。在顯微鏡下，用100μg/mlc7E3Fab處理過4小時或24小時的細胞，與未處理的細胞在洗掉單分子層之前和之後都沒有任何明顯的區別。c7E3Fab對HUVEC與基底物塗敷的表面的黏結和在其上的傳播HUVEC分別進行以下物質處理(1)加培養基，接種到玻連蛋白塗敷的玻璃或塑料上；(2)用嵌合性7E3Fab(10μg/ml)處理，接種到a)玻連蛋白塗敷的玻璃或塑料上，b)血纖蛋白原塗敷的玻璃或塑料上，或c)纖連蛋白塗敷的玻璃或塑料上。注意，HUVEC在開始的時刻，已經用胰蛋白酶處理了，並用10μg/ml的c7E3Fab處理過。然後，立即將細胞接種到小室載玻片或48井的組織培養盤上，於37℃培養。接種後6小時，用反相對比顯微鏡進行相差顯微照相。接種到血纖蛋白原或纖連蛋白塗敷的塑料上的未處理的細胞看起來與在玻連蛋白塗敷的塑料上的未處理細胞很相似。親和性MT412處理過的細胞看起來與未處理的細胞很像。比較未處理的和cMT412Fab處理過的細胞表明，加入c7E3Fab6小時後對HUVEC與纖連蛋白、玻連蛋白、血纖蛋白原塗敷過的Permanox塑料、玻璃和組織培養塑料表面的黏結和在它們之上的傳播都沒有影響。在接種24小時後也沒有顯示任何效果。嵌合性7E3Fab對人的內皮細胞的親和性與嵌合性7E3Fab對血小板上GPIIb/IIIa的親和性相似(Ka＝1.94×108M-1)。c7E3的親和性在有疊氮化合物時並沒有變化，表明抗體沒有發生內化作用。在不含有血清的培養基中嵌合性也沒有變化，表明在小牛血清中的蛋白質沒有改變c7E3Fab對內皮細胞的結合。每個內皮細胞結合有大約650,000個c7E3Fab分子，而每個血小板結合有大約80,000-100,000個c7E3Fab分子。假設內皮細胞的表面積是500μm2，而血小板的表面積是22μm2，那麼，c7E3Fab結合位點的密度在血小板上就是4500/μm2，在內皮細胞上是1000/μm2。因此，雖然好象內皮細胞上有很多7E3結合位點，但是，它的密度卻不到血小板上該結合位點密度的四分之一。競爭結合實驗表明，c7E3Fab通過玻連蛋白受體發生與內皮細胞的特異性結合，因為對玻連蛋白受體為特異性的抗體LM609與c7E3Fab競爭對內皮細胞的結合。用玻連蛋白受體特異性抗體進行的飽和結合測量的內皮細胞上玻連蛋白受體的數量為大約300,000。這是c7E3Fab結合的位點數目的一半。這種不一致性的原因可能是較小的c7E3Fab具有提高了的對不與LM609IgG的位點結合的能力，或者因為LM609IgG抗體的結合是二價的。c7E3Fab的結合沒有顯示出對內皮細胞的激活的作用，既沒有象E-選擇蛋白或ICAM-1黏結蛋白質那樣，也沒有象內皮細胞與PMN結合那樣。在把c7E3Fab接種到玻連蛋白、纖連蛋白、或血纖蛋白原塗敷的玻璃或塑料表面之前與內皮細胞結合，也沒有改變細胞在這些表面上的傳播能力和與這些表面的黏結能力。這種發現與以往的用m7E3IgG(20μg/ml)抑制HUVEC與血纖蛋白原或玻連蛋白塗敷的玻璃表面黏結的報導不同[Charoetal.，J.Biol.Chem.262，9935-9938，(1987)]。對這種差別的解釋可能包括(1)此處的檢測是在含有血清(10％FCS)的培養基中進行的，而先前的報導中的檢測是在不含有血清的培養基中進行的；(2)此處的檢測使用了c7E3Fab，而以往用的是m7E3Fab；(3)此處使用的是10μg/ml的c7E3Fab，而以往使用的是20μg/ml的m7E3Fab。然而，在此處的HUVEC激活實驗中，高達100μg/ml的c7E3Fab都沒有影響早已經通過被接種到明膠塗敷的組織培養塑料盤上建立起來的HUVEC單層。總而言之，嵌合性7E3Fab與內皮細胞的玻連蛋白受體在體外發生結合。嵌合性7E3Fab與內皮細胞上的大約650,000個位點結合，親和性大約為Ka＝1×108M-1。該抗體顯示出通過玻連蛋白受體(αvβ3)與內皮細胞特異性結合，因為αvβ3-特異性的抗體LM609完全抑制c7E3Fab的結合。c7E3Fab與內皮細胞的結合沒有顯示出對細胞的激活，正如對激活-特異性標記物的分析結果一樣。特別是，E-選擇蛋白和胞內黏結分子-1(ICAM-1)的表達在接受c7E3Fab處理時沒有被提高。與抗體的結合沒有顯示出對內皮細胞單層的幹擾或妨礙它們在基質蛋白塗敷的表面上的建立。讓HUVEC同c7E3Fab接觸並沒有改變HUVEC與經過玻連蛋白、纖連蛋白、或血纖蛋白原塗敷的表面的黏結和在這些表面上的傳播。另外，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)對多形核白細胞(PMN)的黏結並沒有因為抗體的處理而被提高。總的來說，c7E3在體外與內皮細胞上的玻連蛋白受體結合，而該結合併沒有顯示出對細胞的激活，或影響它們在基質蛋白上的傳播和黏結。等同物本
技術領域：
的普通技術人員可以充分理解並且能夠使用不超出常規的試驗方法而得出本發明所述具體實施方案的等同方案。這些等同物都是本發明的權利要求書所要包括的。權利要求1.一種抑制狹窄和/或復發性狹窄的方法，包括給患者以有效劑量的對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的化合物。2.根據權利要求1所述的方法，其中的所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述的對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或它的一部分。4.根據權利要求2所述的方法，其中的免疫球蛋白或其片段是包括非人源的抗原結合區和至少一部分的人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白的片段。5.根據權利要求4所述的方法，其中的抗原結合區是從對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體(例如，7E3單克隆抗體)為特異性的抗體衍生的。6.根據權利要求4所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab』、或F(ab』)2片段。7.一種抑制狹窄和/或復發性狹窄的方法，包括給患有冠心病的病人以有效劑量的能夠與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體發生特異性結合的化合物。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的化合物是與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體發生特異性結合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體具有特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其片段。10.根據權利要求8所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結合區和至少一部分人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白片段。11.根據權利要求10所述的方法，其中所述的抗原結合區是從對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體具有特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。12.一種抑制接受了冠狀動脈手術治療後人體發生復發性狹窄的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的包括對血小板為特異性的非人源抗原結合區和人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。13.根據權利要求12所述的方法，其中所述的手術是血管成形術。14.根據權利要求12所述的方法，其中所述的手術是斯坦特的安放。15.根據權利要求12所述的方法，其中所述的手術包括血管成形術和斯坦特安放。16.根據權利要求13所述的方法，其中所述的抗原結合區是對糖蛋白IIb/IIIa受體為特異性的。17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的抗原結合區是從單克隆抗體7E3衍生來的。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述的免疫球蛋白選自Fab、Fab』、和F(ab』)2片段。19.一種抑制進行過血管手術後人體發生狹窄和/或復發性狹窄的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa特異性結合的化合物。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的手術是斯坦特的安放。21.根據權利要求19所述的方法，其中所述的血管手術是冠狀動脈介入術。22.根據權利要求21所述的方法，其中所述的手術是斯坦特的安放。23.根據權利要求21所述的方法，其中所述的手術是血管成形術。24.根據權利要求21所述的方法，其中所述的手術包括血管成形術和斯坦特的安放。25.根據權利要求19所述的方法，其中所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa具有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。26.根據權利要求25所述的方法，其中所述的對糖蛋白IIb/IIIa具有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。27.根據權利要求25所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結合區和至少一部分人源恆定區的對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。28.根據權利要求27所述的方法，其中所述的抗原結合區是從對糖蛋白IIb/IIIa為特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。29.根據權利要求27所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab』、和F(ab』)2片段。30.一種抑制進行了血管手術後人體發生狹窄和/或復發性狹窄的方法，該方法包括給所述的人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體特異性結合的化合物。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述的手術是斯坦特的安放。32.根據權利要求30所述的方法，其中所述的血管手術是冠狀動脈介入術。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述的手術是斯坦特的安放。34.根據權利要求32所述的方法，其中所述的手術是血管成形術。35.根據權利要求32所述的方法，其中所述的手術包括血管成形術和斯坦特的安放。36.根據權利要求30所述的方法，其中所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。37.根據權利要求36所述的方法，其中所述的對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。38.根據權利要求36所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結合區和至少一部分人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白和嵌合性免疫球蛋白片段。39.根據權利要求38所述的方法，其中所述的抗原結合區是從對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的單克隆抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。40.根據權利要求38所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab』、和F(ab』)2片段。41.一種降低或防止人體血管成形術和/或斯坦特安放後發生局部缺血綜合症的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa特異性結合的化合物。42.根據權利要求41所述的方法，其中所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa有特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。43.根據權利要求42所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括從對糖蛋白IIb/IIIa有特異性的抗體衍生來的非人源抗原結合區和至少一部分人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白和嵌合性免疫球蛋白片段。44.根據權利要求41所述的方法，其中所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結合的化合物。45.根據權利要求44所述的方法，其中所述的化合物是對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結合的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。46.根據權利要求45所述的方法，其中所述的對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結合的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。47.根據權利要求45所述的方法，其中所述的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結合區和至少一部分人源恆定區的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白片段。48.根據權利要求47所述的方法，其中所述的抗原結合區是從對糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。49.根據權利要求48所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab』、或F(ab』)2片段。全文摘要本發明描述了對GPⅡb/Ⅲa和玻連蛋白受體為特異性結合試劑。該試劑可以被用來降低或防止閉塞、復發性閉塞(例如急性堵塞)、狹窄和/或復發性狹窄。在一個實施例中,本方法使用了一種免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段,例如包括非人的抗原結合區和人恆定區的血小板特異性嵌合免疫球蛋白或其片段。文檔編號A61K38/00GK1186439SQ96194312公開日1998年7月1日申請日期1996年6月5日優先權日1995年6月7日發明者巴瑞·S·科勒,大衛·M·奈特申請人:森特克公司,紐約州立大學研究基金會