肌萎縮性側索硬化症和其它脊髓病症的基因治療的製作方法

2023-05-29 15:28:26 3

專利名稱：：肌萎縮性側索硬化症和其它脊髓病症的基因治療的製作方法
技術領域：
：本發明涉及治療影響受治療者運動功能，特別是受腦和/或脊髓疾病或損傷影響的運動功能的病症的方法和組合物。
背景技術：
：肌萎縮性側索硬化症(ALS)是一種進行性神經變性病狀(condition)，涉及腦和脊髓中大運動神經元的喪失。該病的特徵是進行性衰弱、萎縮和痙攣狀態，導致在發病5年內癱瘓和呼吸衰竭。家族性ALS佔所有ALS病例的10。/。；這些病例中約25。/。是由於Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(SODl)的突變造成的[l]。迄今為止，S0D1基因中鑑定到109個不同的突變，這些突變覆蓋了所有5個外顯子[2]。除了在重神經絲鏈(heavyneurofilamentchain,NFH)基因、動力蛋白激活蛋白基因、嚢泡(vesicular)結合蛋白1基因和ALSIN基因上的非常罕見的突變外，S0D1是已鑑定的唯一的主要ALS易感性基因座。SOD1是主要存在於的胞質的酶，其催化超氧離子分解成氧和過氧化氫，然後過氧化氬^L穀胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶降解形成水。許多證據認為，突變型SOD1蛋白通過獲得的相反的功能具有神經毒性，該功能可引起氧化性病理狀態和蛋白聚集，伴有穀氨酸代謝、線粒體功能、軸突運輸和鈣平衡的次級紊亂[3]。突變型S0D1蛋白在小鼠體內高水平的轉基因表達產生運動神經元疾病的表型，並且發病年齡和疾病持續時間依賴於拷貝數[4],這一觀察有力支持了突變型S0D1具有毒性。迄今為止，很少有治療性幹預改變了轉基因ALS小鼠的運動神經元表型。儘管迄今為止已測試了超過100種小分子，但這些分子甚至是邊際效益(marginalbenefit)都很少具有(如利魯唑[5]、塞內昔布(celecoxib)5[6]、arimoclomol[7])。相比之下，一些形式的蛋白治療是有益的。因此，通過轉基因[8]或經IM注射和隨後逆向軸突運輸到運動神經的AAV2遞送系統[9]施用胰島素樣生長因子1,以改進存活。另外2個作為神經保護劑顯示有治療前景的蛋白是促紅細胞生成素[10]和血管內皮因子(VEGF)[11，12]。後者令人感興趣，因為遺傳分析表明VEGF基因的減效變體是ALS的危險因子[13]。此外，缺少低氧反應啟動子元件的小鼠出現緩慢進行性運動神經元疾病[14]。隨後，有文獻表明，慢病毒遞送VEGF到ALS小鼠的脊髓延緩死亡[15]。2個獨立的研究者報導，將VEGF注入ALS小鼠[16]和大鼠[17]的腦脊液也延緩疾病的進程。基因治療是一種新興的針對影響中樞神經系統(CNS)病症的治療方式。能有效感染有絲分裂後神經元的病毒載體的發展促進了CNS基因治療。中樞神經系統由脊髓和腦組成。脊髓將來自外周神經系統的感覺信息傳導給腦，並將來自腦的運動信息傳導給各種效應器。將基因遞送到中樞神經系統的病毒載體的綜述參見Davidson等，(2003)NatureRev.4:353-364。認為腺伴隨病毒(AAV)載體可用於CNS基因治療，因為該載體具有.有利的毒性和免疫原性特徵，能轉導神經元細胞，並能介導CNS中的長期表達(Kaplitt等，(1994)Nat.Genet.8:148-154;Bartlett等，(1998)Hum.GeneTher.9:1181-1186;Passini等，(2002)J.Neu認i.22:6437-6446)。AAV載體的一個有用的特性在於某些AAV載體在神經元細胞中具有進行逆向和/或順向運輸的能力。在一個腦區的神經元通過軸突相互連接到遠側腦區，因此為載體的遞送提供了運輸系統。例如，可將AAV載體施用在神經元軸突末端處或其附近。神經元內吞AAV載體，並以逆向模式將其沿軸突運輸到細胞體。腺病毒、HSV和偽狂犬病病毒也顯示出可在腦內將基因遞送到遠側結構的相似的特性。(Soudas等，(2001)FASEBJ.15:2283-2285;Breakefield等，(1991)NewBiol.3:203-218;deFalco等，(2001)Science,291:2608-2613)。幾個研究組報導，通過AAV血清型2(AAV2)的腦轉導限於顱內注射位點(Kaplitt等，(1994)Nat.Genet.8:148-154;Passini等，(2002)J.Neurosd.22:6437-6446和Chamberlin等，(1998)BrainRes.793:169-175)。6近來的報導表明，神經營養性病毒載體(包括AAV和慢病毒載體)的逆向軸突運輸也可發生在正常大鼠腦部的選擇迴路(Kaspar等，(2002)Mol.Ther.5:50-56;Kasper等，(2003)Science301:839-842和Azzouz等，(2004)Nature429:413-417。Roaul等(2005)Nat.Med.11(4):423-428和Ralph等(2005)Nat.Med.ll(4):429-433報導，肌內注射表達使人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)沉默的千擾RNA的慢病毒，使治療性相關ALS嚙齒類動物才莫型的肌萎縮性側索硬化症(ALS)疾病延遲出現。子)以在細胞內介導有益效應。這些細胞也可以分泌治療性轉基因產物，該產物隨後被遠側細胞吸收，並在遠側細胞中介導其有益效應。這一過程被稱為艾叉矯正(cross-correction)(Neufeld等，(1970)Science169:141-146)。本領域需要治療人類患者中引起運動功能喪失的脊髓機能障礙的組合物和方法。發明概逸一方面，本發明提供了通過直接脊髓注射編碼治療性分子的神經營養性載體來治療患有運動神經元病症的哺乳動物的方法。在一個具體實施方式中，神經營養性載體是編碼HIFl-a的重組表達載體，其中所述載體是重組腺伴隨病毒(AAV)。它通過直接注射到患有運動神經元病症的哺乳動物的脊髓灰質來遞送。從而延長了哺乳動物的預期壽命。另一方面，本發明提供了通過直接脊髓注射編碼治療性分子的神經營養性載體來治療患有運動神經元病症的人類患者的方法。在一個具體實施方式中，將編碼與NFkB融合的HIF1-a的重組AAV載體遞送到患有運動神經元病症的人類患者的脊髓的多個位點。從而延長了人類患者的預期壽命。才艮據另一個具體實施方式，本發明提供編碼HIF1-a的重組AAV載體用於治療患有運動神經元病症的患者。運動神經元病症可以是ALS。AAV栽體可以是編碼HIFl-a的重組AAV2/7或AAV2/8載體。要理解，前面的大體描述和下面的詳述都只是示例性和解釋性的，而不是限制要求保護的發明。附圖簡述圖l顯示遞送方式和載體假型(pseudotype)不同的脊髓載體基因組的遞送。圖2顯示遞送方式和載體假型不同的腦載體基因組的遞送。圖3顯示肌內注射AAV載體後遞送到肌肉的載體基因組的數目。圖4顯示以編碼HIF-1cxNF-kB的AAV載體轉導小鼠腦後，EPO、VEGF和IGF-1的基因表達。圖5顯示Kaplan-Meier存活曲線，說明脊內施用AAV2/8HiflaNF-kB後，ALS小鼠存活時間呈統計學顯著性(p=0.033)增加(對照小鼠存活133天，而Hif-laNF-kB處理小鼠存活139天)。圖6顯示以AAV2/8HiflaNFkB處理的ALS小鼠脊髓中Hif-laNF-kB的原位雜交，說明轉導主要見於脊髓的腰區。動物6817、6715和6389用AAV2/8Hif1aNFkB處理；動物1460是對照動物。發明詳述為使本發明更容易理解，首先定義某些術語。額外的定義在整個詳述中提出。除非另外指明，本發明的實施將使用常規的免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術，這些都是為本領域所熟知的技術。參見^口Sambrook,Fritsch禾口Maniatis，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(分子克隆實驗手冊)，第2版(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(最新分子生物學實驗方法)(RM.Ausubel等編輯，(1987));系列METHODSINENZYMOLOGY(酶學方法)(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(實用方法)(M丄MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor編輯.(1995))、Harlow和Lane編輯(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL(抗體實-險手冊)和ANIMALCELLCULTURE(動物細胞培養)(R.I.Freshney編輯(1987))。說明書和權利要求中所用的單數形式"一個"、"一種"和"該"包括多個所指物，除非上下文另外清楚說明。例如，術語"一種細胞"包括多個細胞及其混合物。本文所用的術語"包含"是用來指組合物和方法包括所述的元素，但不排除其它元素。當用來限定組合物和方法時，"主要由...組成"是指排除對組合物具有任何必要意義的其他元素。因此，本文限定的主要由元素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的痕量汙染物和藥學上可接受的載體(如磷酸鹽緩衝鹽溶液、防腐劑等)。對於使用本發明所述的組合物，"由...組成"是指排除超過痕量元素的其它成分和和實質性方法步驟。由每個過渡術語限定的具體實施方式在本發明的範圍內。所有數字符號(如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍)是近似值，以增量0.1正向(+)或負向(-)變化。要理解，儘管不總是明確陳述，但所有數字符號前加術語"大約"。還要理解，儘管不總是明確陳述，但本文所述試劑只是示例性的，這些試劑的等同替代是為本領域所已知的。術語"轉基因"指被引入細胞、並能在合適條件下轉錄成RNA和任選地翻譯和/或表達的多核苦酸。一方面，該多核苷酸賦予它被引入其中的細胞所需的特性，或者導致所需治療性或診斷性結果。提及病毒滴度時使用的術語"基因組顆粒(gp)"或"基因組等同替代"是指含重組AAVDNA基因組的病毒粒子的數目，與感染性和功能性無關。特定載體製品中基因組顆粒的數目可通過如本文實施例中所述或例如Clark等(1999)Hum.GeneTher"10:1031-1039和Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278所述程序測定。提及病毒滴度時使用的術語"感染單位(iu)"、"感染顆粒"或"複製單位"是指感染性的和能複製的重組AAV載體顆粒的數目，該數目通過例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述的感染中心試驗(也稱為複製中心試驗)測定。提及病毒滴度時使用的術語"轉導單位(tu)'，是指導致功能性轉基因產物產生的感染性重組AAV載體顆粒的數目，該數目通過如本文實施例所述或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol"144:113-124或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU試驗)所述的功能性試驗測定(LFUassay)。術語"治療性的"、"治療上有效量"和它們的相關術語是指預防受治療者發病或使其發病延遲或症狀改善或獲得所需生物學結果的RNA、DNA或DNA和/或RNA的表達產物的量(所需生物學結果是如神經病理學(例如與運動神經元疾病(如ALS)相關的細胞病理學)上的矯正)。術語"治療性^j^正"是指矯正程度達到預防受治療者發病或導致發病延遲或症狀改善。可通過已知的經驗方法確定有效量。"組合物"也旨在包含活性劑和其它載體的組合，所述載體如惰性(例如可;}企測劑或標記)或活性的化合物或組合物，如佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩定劑、緩沖劑、鹽、親脂溶劑、防腐劑、佐劑等。載體也包括藥物賦形劑和添加劑蛋白質、肽、胺基酸、脂類和^t水化合物(例如糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多鬥唐或衝唐聚合物)，它們可單獨或組合存在，單獨或組合佔1-99.99%(以重量或體積計)。示例性蛋白賦形劑包括血清清蛋白(如人血清清蛋白(HSA))、重組人清蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。也可在功能上具有緩沖能力的代表性胺基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜鹼、組氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物賦形劑也旨在包含在本發明範圍內，其實例包括但不限於單糖(如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等)、二糖(如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等)、'多糖(如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、澱粉等)和糖醇(如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、拉克替醇(lactitol)、木糖醇山梨糖醇(xylitolsorbitol)(葡萄糖醇(glucitol))和肌醇)。術語載體進一步包括緩沖劑或pH調節劑；典型地，緩沖劑是從有機酸或鹼製備的鹽。代表性緩沖劑包括有機酸鹽，如檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、葡糖酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽或鄰苯二曱酸鹽；Tris,鹽酸氨基丁三醇，或磷酸鹽緩沖劑。其它載體包括高分子賦形劑/添加劑，如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯爾(ficoll)(—種高分子糖)、葡聚糖結合劑(dextrates)(例如環化糊精，如2-羥丙基-.正交，環化糊精(2陽hydroxypropyl-.quadrature.-cyclodextrin))、聚乙二酉孚、^周p木劑、^t孩i生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯，如"吐溫(TWEEN)20"和"吐溫80")、脂類(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)和螯合劑(例如EDTA)。本文使用的術語"藥學上可接受的載體"包括任何標準的藥物載體，如磷酸鹽緩衝鹽溶液、水和乳劑(如油/水或水/油乳劑)和各種類型潤溼劑。組合物也可包括穩定劑和防腐劑以及任何上面提到的載體，附加條件是它們可接受用於體內使用。載體、穩定劑和佐劑的實例參見MartinREMINGTON'SPHARM.SCI"第15版(MackPubl.Co.,Eastern(1975)和Williams&Williams,(1995)和—"PHYSICIAN'SDESKREFERENCE"(醫師的案頭參考),第52版，MedicalEconomics,Montvale,N丄(1998)。"受治療者"、"個體"或"患者，，在本文可互換使用，指脊推動物，優選指哺乳動物，更優選指人。哺乳動物包括但不限於鼠、大鼠、猿、人、農場動物(farmanimal)、運動動物(sportanimal)和寵物。"對照"是實驗中出於比較目的而在實驗中使用的另一受治療者或樣品。對照可是"陽性對照"或"陰性對照"。例如，如果實驗目的是確定改變的基因表達水平與特定類型病理狀態(參見例如下面的ALS)之間的相關性，通常優選使用陽性對照(攜帶所述改變並表現出該疾病特徵性的症狀的受治療者或來自該受治療者的樣品)和陰性對照(缺少改變的表達和該疾病臨床症狀的受治療者或來自該受治療者的樣品)。應用於基因的"差異表達"是指從基因轉錄的mRNA或該基因編碼的蛋白產物產生的差異。與正常或對照細胞的表達水平相比，差異表達的基因可以是過表達或低表達。一方面，該術語指至少1.5倍、或至少2.5倍、li或可選地至少5倍、或可選地至少10倍地高於或低於對照樣品中檢測到的表達水平的差異。術語"差異表達"也指某些細胞或組織中的核苷酸序列，該核苷酸序列在對照細胞中沉默而在該細胞或組織中表達，或者在對照細胞中表達而在該細胞或組織中不表達。本文使用的術語"調節"指改變效果或結果的量或強度，例如增強、增大、減少或降低。本文使用的術語"改善"是"緩和"的同義詞，指降低或減輕。例如一種可通過使其更能被忍受而改善疾病或病症的症狀。在基因轉移由DNA病毒載體(如腺病毒(Ad)或腺伴隨病毒(AAV))介導的方面，載體構建體指包括病毒基因組或其部分和轉基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是相對良好表徵的同源病毒組，包括超過50種血清型。參見例如國際PCT申請第WO95/27071號。腺病毒容易生長，並且不需要整合到宿主細胞的基因組中。重組腺病毒衍生的載體，特別是那些降低野生型病毒重組和產生潛力的載體也已經構建好。參見國際PCT申請第WO95/00655和WO95/11984號。野生型AAV具有高感染性並能特異性整合到宿主細胞基因組中。參見Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470和Lebkowski等(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。HIF-1是由2個亞基組成的異源二聚體蛋白(i)組成型表達的(3亞基(與其它相關轉錄因子共有)和(ii)a亞基(參見如WO96/39426,描述了HIF-la的親和純化和分子克隆)，其聚集是受翻譯後機制調控的，以致只能在低氧條件下檢測到高水平的a亞基。這兩個亞基都是鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)-PAS轉錄因子家族的成員。這些結構域調節DNA的結合和二聚化。反式激活結構域被認為存在於蛋白的C末端。HIF-1參與對許多靶基因的調控(低氧誘導因子的綜述參見諸如Bracken等，Cell.Mol.LifeSci.60(2003)1376-1393)。HIF-1的輩巴基因包括VEGF和促紅細胞生成素。為在含氧量正常條件下穩定低氧誘導因子蛋白以及提供強的組成性的轉錄激活，使用由位於氨基末端的來自HIF-la的DNA結合和二聚化結構域，和位於羧基末端的轉錄激活蛋白的功能性轉錄激活結構域組成的雜合/嵌合融合蛋白。為產生該融合蛋白，將HIF-la的內源反式激活結構域替換成異源反式激活結構域。在一個具體實施方式中，反式激活結構域來自單純皰滲病毒(HerpesSimplexVirus,HSV)VP16蛋白。在本文將這種融合蛋白在本文稱為HIFla-VP16構建體或融合構建體。在另一個具體實施方式中，反式激活結構域是NF-kb反式激活結構域，其可以是人NF-kB反式激活結構域。在本文將這種融合蛋白稱為HIFla-NFKB構建體或融合構建體。可使用任何哺乳動物的HIFl-a編碼序列。異源反式激活結構域也可以是酵母轉錄因子(如GAL4和GCN4)的其中之一。包括人編碼序列的HIF-la構建體可有利於將其遞送至人。低氧(組織或細胞的02需求超過供給的狀態)是基因表達的有效調節因子。低氧的生理反應包括紅細胞發生作用增強(Jelkman，Physiol.Rev.72:449-489(1992))和缺血組織的新生血管形成(White等，Circ.Res.71:1490-1500(1992))以及代謝轉換到基於糖酵解(Wolfe等，Eur.J.Biochem.135:405-412(1983))。這些適應性反應促進02的遞送，或讀t活不需要02的可選代謝途徑。參與這些過程的基因產物包括，例如(i)EPO,編碼促紅細胞生成素，是紅細胞發生的首要調節因子並因此是血液攜帶02能力的主要決定因子(Jiang等，J,Biol.Chem.271(30):17771-78(1996));(ii)VEGF,編碼血管內皮生長因子，是血管發生的首要調節因子，並因此是組織灌流的主要決定因子(Levy等，J.Biol.Chem.270:13333(1995);Liu等，Circ.Res.77:638(1995);Forsythe等，Mol.Cell.Biol.16:4604(1996》;(iii)ALDA、ENOl、LDHA、PFKL和PGKl,分別編碼糖酵解酶搭縮酶A、烯醇化酶l、乳酸脫氳酶A、果糖磷酸激酶L和磷酸甘油酸激酶l,其在缺少02的條件下提供產生ATP的代謝途徑(Firth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6496(1994);Firth等，J.Biol.Chem.270:21021(1995);Semenza等，J.Biol.Chem.269:23757(1994));和(iv)HOI和iNOS，編碼血紅素加氧酶1和可誘導的一氧化氮合酶，兩者分別負責血管活性分子一氧化碳和一氧化氮的合成(Lee等，J.Biol.Chem,272:5375;Melillo等，J.Exp.Med.182:1683(1995))。13這些反應的重要介質是包括DNA結合低氧誘導因子蛋白的轉錄複合體與其相關DNA識別位點一低氧反應元件(HRE)(位於低氧誘導基因的啟動子/增強子元件內)之間的相互作用。HRE由低氡誘導因子蛋白結合位點(含核心序列5，-CGTG-3，)和發揮功能所需的其它DNA序列組成，在某些元件中還包括第二結合位點。在一個具體實施方式中，低氧誘導因子蛋白是HIF-la(例如人HIF-la)。在另一個具體實施方式中，HIF-la的DNA結合結構域包括人HIF-la第1-390位胺基酸。在一個具體實施方式中，能轉錄激活的蛋白結構域不是衍生自低氧誘導因子蛋白。在另一個具體實施方式中，能轉錄激活的蛋白結構域衍生自選自下列蛋白HSVVP16、NF口B、熱激因子、p53、fos、v-jun、因子EF-C、HIVtat、HPVE2、AdEla、Spl、AP1、CTF/NF1、E2F1、HAP1、HAP2、MCM1、PH02、GAL4、GCN4或GAU1。在一個具體實施方式中，能轉錄激活的蛋白結構域是合成的。在另一個具體實施方式中，低氧誘導因子蛋白是HIF-la(例如人HIF-la),並且能轉錄激活的蛋白結構域是來自HSVVP16的轉錄激活結構域。而在另一個具體實施方式中，低氧誘導因子蛋白是HIF-la(例如人HIF-la)，並且能轉錄激活的蛋白結構域是來自NF口B的轉錄激活結構域。在一個具體實施方式中，本發明是治療受治療者神經變性病症(包括ALS)的方法，該方法包括對受治療者施用有效量的核酸分子，該核酸分子編碼具有生物活性的嵌合的反式激活蛋白，該反式激活蛋白包括低氧誘導因子蛋白的DNA結合結構域和能轉錄激活的蛋白結構域。在優選具體實施方式中，編碼具有生物活性的嵌合的反式激活蛋白的核酸分予包括低氧誘導因子(HIF)蛋白的DNA結合結構域和能轉錄激活的蛋白結構域。HIF-1是由2個亞基組成的異源二聚體蛋白(i)組成型表達的卩亞基，也稱為芳香烴核易位蛋白(ARNT)(該亞基與其它相關轉錄因子(例如二噁英/芳香烴受體(DR/AhR)共有)；和(ii)a亞基(參見，例如WO96/39426、國際申請第PCT/US96/10251號，描述了近期的HIF-la親和純化和分子克隆)，其聚集是受翻譯後機制調控的，以致只能在低氧條件期間檢測到高水平的a亞基。這兩個亞基都是鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)-PAS轉錄因子家族的成員。這些結構域調節DNA的結合和二聚化。反式激活結構域存在於蛋白的C末端。鹼性區域由約15個佔優勢的鹼性胺基酸組成，負螺旋，這2個a螺旋形成家族成員間首要的二聚化界面(Moore,A.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10436-41(2000))。PAS結構域(根據該結構域中最初鑑定出的的3個蛋白(Per、ARNT和Sim)命名)包括200-300個胺基酸，含2個不嚴格保守、主要疏水的、約50個胺基酸的區域，以PASA和PASB表示。儘管HIF-l卩(ARNT)以高水平組成型表達，但是HIF-l在細胞中的聚集對02濃度敏感，故高水平只能在低氧期間檢測到。這一觀察結果導致靶基因激活的機制的提出，其中02濃度藉此由傳感蛋白檢測，並通過複雜的信號傳導機制導致HIF-la亞基的穩定化。隨後HIF-la可與PHF-1(3形成複合體，並選擇性地結合到靶基因啟動子/增強子的HRE位點上。認為參與賦予這種反應的HIF-1a蛋白區域與參與反式激活的區域相同。對低氧產生反應HIF-1的活性被認為是通過穩定HIF-la蛋白發生的。參與這一反應的HIF-la區域位於蛋白的C末端，並與反式激活結構域重疊。例如，Jiang等，J.Biol.Chem.271(30):1777178(1996)表明在第390位胺基酸截斷的HIF-la喪失了反式激活活性，但保留了結合DNA的能力，並在含氡量正常和低氧條件下都表現出高的蛋白水平。這一結果說明，反式激活結構域和賦予該蛋白在含氧量正常條件下的不穩定性的區域位於蛋白的C末端部分。Pugh等，J.Biol.Chem.272(17):1120514(1997)進一步將參與區域定位在2個區域第549-582和775-826胺基酸。約200個胺基酸的結構域(稱為"依賴於氧的降解結構域"(ODD))介導HIF-la的降解(Huang，L.,J.Gu，M.Schau和H.Bunn.，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7987-92)。ODD的缺失(HIF-la口ODD)導致與氧濃度無關的組成型活化的HIF-la(Huang,L.，J.Gu,M.Schau和H.Bunn.1998.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7987-92;美國專利第6,124,131號)。在一個具體實施方式中，本發明提供了編碼具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的核酸分子，所述反式激活蛋白包含足以結合DNA和與HIF-ip(ARNT)二聚化的HIF-la蛋白的結構域和能轉錄激活的蛋白結構域。小鼠中，從不同啟動子產生2個HIF-la的轉錄本(1.1和1.2)，這與可變剪接相反(Wenger,R.H.等，Eur.J.Biochem.246:155-65(1997)。這些轉錄本都不依賴於氧而有效地翻譯，但差別在於轉錄本1.1編碼缺少最前面12個氨基末端的胺基酸的蛋白並以組織限制性方式表達；而轉錄本I.2是普遍表達的並編碼全長蛋白。儘管這些差別，並沒有觀察到DNA結合或反式激活活性的特異性(Wenger，R.H.等，Blood91:3471-80(1998);Gorlach,A.等，Biochem.Biophys.Acta1493:125-134(2000))。在人中也可觀察到HIF-la的幾個剪接變體。例如，發現缺少第14外顯子的HIF-la剪接變體存在於皮膚和幾種細胞系中(Gothie,E.等，J.Biol.Chem.275:6922-27(2000))。這導致讀碼框移位並編碼更短的蛋白(736個胺基酸)，該蛋白儘管仍然受低氧誘導，但缺少了羧基末端的TAD(C-TAD),因此不如野生型HIF-la活性高(Gothie,E.等，J.Biol.Chem.275:6922-27(2000))。還鑑定出缺少第11和12外顯子的顯性失活同種型，該同種型編碼516個胺基酸長的蛋白，該蛋白在含氧量正常條件下穩定並不顯示反式激活(Chun,Y.S.等，Biochem.J.362:71-79(2002))。此夕卜,缺少第12外顯子的鋅誘導的剪接變體也可作為顯性失活變體，其通過與ARNT結合併阻止其核聚集來抑制HIF的活性(Chun,Y.S.等，Biochem.Biophys,Res.Comm亂268:652-56(2000))。人HIF-la的代表性序列包括，例如Genbank登錄號NM—001530(轉錄本變體1)和NM—181054(轉錄本變體2)。人HIF-ip亞基的代表性序列包括，如Genbank登錄號NM—001668(ARNT轉錄本變體1)、NM—178426(ARNT轉錄本變體2)和NM—178427(ARNT轉錄本變體3)。在克隆HIF-la後不久，鑑定出一個與其密切相關的蛋白HIF-2a(也稱為內皮PAS(EPAS)、HIF相關因子(HRF)和PAS超家族2成員(MOP2))(Tian,H.等，GenesDev.11:72-82(1997);Ema，M.等，Proc.Natl.Acad.Sd.16USA94:4273-78(1997);Famme,I.等,Mech.Dev.63:51-60(1997);Hogenesch,J.B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:5474-79(1998))。HIF-2a與HIF-la具有48y。的胺基酸同一性，與轉錄因子的bHLH/PAS結構域家族其它成員的相似性更低(代表性人HIF-2a序列是GenBank登錄號NM一001430和U81984;代表性小鼠HIF-2a序列是GenBank登錄號U81983)。與HIF-la類似，發現HIF-2a與ARNT形成異源二聚體，並且結合HRE(Tian,H.等，GenesDev.11:72-82(1997);Ema,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4273-78(1997))。缺失分析表明HIF-la和HIF-2a共有共同的功能結構域結構。特別地，除了氨基末端的bHLH和PAS結構域外，HIF-la和HIF-2a還有由稱為抑制結構域(ID)的區域分開的2個反式激活結構域(TAD),該抑制結構域負責含氧量正常條件下抑制TAD的活性。與氨基末端TAD(N-TAD)重疊的是依賴於氧的降解結構域(ODDD),該結構域可賦予HIFa蛋白在含氧量正常條件下穩定的能力(Bracken,C.P.等，CMLS.Cell.Mol.LifeSci.60:1376-93(2003))。人和鼠的HIF-2ot與HIF-la共有廣泛的初級胺基酸序列同一性(48%)。兩個蛋白之間的序列保守性在bHLH(85%)、PAS-A(68%)和PAS-B(73%)區域最高。序列同一性的第二個區域出現在HIF-2a和HIF-la蛋白緊鄰C末端處。mfflF-la中的這一保守區顯示含低氧反應結構域(Li等，J.Biol.Chem.271(35):21262-67(1996))。HIF-la和HIF-2a之間高度的序列相似性表明兩者具有共同的生理功能。低氧條件刺激HIF-la反式激活含HRE核心序列的靶基因的能力。在低氧條件下生長的細胞中，HIF-2a的活性也得到增強。RNA表達才莫式表明，HIF-la和HIF-2a在人和小鼠組織中主要以不依賴於氧的模式普遍表達(Tian,H.等，GenesDev.11:72-82(1997);Ema,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4273-78(1997);Flamme，L等，Mech.Dev.63:51-60(1997);Wenger,R.H.等，KidneyInt.51:560-63(1997);Wiesener,M.S.等，Blood92:2260-68(1998))。然而，細胞類型特異性表達模式分析表明，與HIF-la的普遍表達相反，HIF-2a的mRNA主要在特定的細胞類型中表達，如內皮、上皮、神經元、成纖維細胞和巨噬細胞(Bracken,CP.等，CMLS.Cell.Mol.LifeSci.60:1376-93(2003))。17也發現第三個HIFa基因並命名為HIF-3a。與HlF-la和mF-2a類似，HIF-3a在許多組織表達，與ARNT形成二聚體，結合HREDNA序列並以低氧誘導和依賴於ARNT的方式上調報告基因的表達(Gu,Y.Z.等，GeneExpr.7:205-13(1998))。鑑定出HIF-3a的一個剪接變體，稱為抑制性PAS(IPAS)。IPAS似乎缺乏內源反式激活活性，但可作為HIF的顯性失活調節因子，與HIF-la的氨基末端區域相互作用並阻止DNA結合。人HIF-3a的代表性序列是Genbank登錄號NM—152794(HIF-3a轉錄本變體l)、NM—152794(HIF-3a轉錄本變體2)和NM—022462(HIF-3a轉錄本變體3)。如此處所述並對於本領域技術人員明顯的是，HIF-la、HIF-2cc和/或HIF-3a的序列，包括任何已知或已發現的剪接變體序列，可用在本發明的方法中。對於HIF-a的調節已經有許多發現。含氧量正常條件下，HIF-a的轉換非常快並導致在含氧量正常條件下基本檢測不到HlF-a蛋白(Wang,G丄.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:5510-14(1995);Yu,A.Y.等，Am.J.Physiol.275丄818-L826(1998);Huang,L.E.等，Proc.Natl,Acad.Sci.USA95:7987-92(1998))。這種含氧量正常條件下的穩定性是由與N-TAD重疊的中心200個胺基酸的ODDD控制的(Huang，L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998))。低氧時發生的HIF-la和HIF-2a的快速聚集是由增強蛋白穩定性介導的。相反，氧張力對HIF-a的轉錄或翻譯沒有主要影響(Wenger，R.H.等,KidneyInt.51:560-63(1997);Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998));Huang,L.E.等，J.Biol.Chem.271:32253-59(1996);Powell,J.D.等，Biol.Reprod.67:995-1002(2002);Kallio，RJ.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5667-72(1997))。相似地，氧不顯著影響組成型表達的ARNT的mRNA或蛋白水平(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998》；Huang,L.E.等，J.Biol.Chem.271:32253-59(1996);Kallio,P丄等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5667-72(1997))。HIF-a在含氧量正常條件的不穩定性是由多聚泛素化作用和隨後的蛋白酶體的降解作用介導的。這已使用蛋白酶體抑制劑或E1泛素激活酶的突變體而證明(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998);Kallio,P丄等，J.Biol.Chem.274:6519-25(1999))。因此，HIF-a在含氧量正常條件下被多聚泛素化，而在低氧條件下泛素化水平下降(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998);Kallio,P.J.等，J.Biol.Chem.274:6519-25(1999);Sutter,C.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4748-53(2000))。此外，顯示HIF-la物理性地與20S蛋白酶體亞基PSMA7相互作用(Cho，S.等，FEBSLett.498:62-66(2001))。Von-Hippel-Lindau(VHL)肺瘤抑制蛋白是含延伸蛋白(elongin)B和C、Cul2和Rbxl的E3泛素蛋白連接酶複合體的組分，並且正是通過這種能力，VHL介導HIF-la和HIF-2a的蛋白酶體降解(Lisztwan,J.等，GenesDev.13:1822-33(1999))。在含氧量正常條件下，HIF-la在VHL缺陷細胞中是穩定的，但是VHL轉染後可恢復含氧量正常條件下的蛋白穩定性(Maxwell,P.H.等，Nature399:271-75(1999);Cockman，M.E.等，J.Biol.Chem.275:25733-741(2000)),這一發現支持了上述結論。在含氧量正常條件下，VHL可通過其卩結構域與HIF-la的第517-571或380-417胺基酸(HIF-2a的第517-534和383-418胺基酸)結合而發揮這種作用，而a結構域與延伸蛋白結合。然後泛素轉移到HIF的殘基上，標記該蛋白為蛋白酶體降解(Cockman,M.E.等，J.Biol.Chem.275:25733-741(2000);Ohh,M.等，Nat.CellBiol.2:423-27(2000));Tanimoto，K.等，EMBOJ.19:4298-4309(2000);Masson,N.等,EMBOJ.20:5197-5206(2001);Srinivas,V.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.260:557-61(1999))。已經發現含氧量正常條件下VHL與HIF的結合，因此賦予HIF蛋白的不穩定性的主要機制由2個脯氨酸殘基(HIF-la的P402和P564，HIF-2a的P405和P530)的不可逆羥基化作用介導(Jaakkola,R等，Science292:468-72(2001);Ivan,M.等，Science292:464-68(2001);Yu，R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9630-35(2001》;Chan，D.A.等,J.Biol.Chem.277:40112-17(2002))。這些殘基只在含氧量正常條件下被羥基化，使VHL可以高親和地與HIF結合(Min,J.H.等，Science296:1886-89(2002))。鑑定egl9(秀麗隱杆線蟲(07e"w/aM/fee/egara)中的HIF脯氨醯基羥化酶)使3個哺乳動物同系物(分別名為含脯氨醯基羥化酶結構域(PHD)的l、2和3或HIF脯氨醯基鞋化酶(HPH3、2和1))的克隆成為可能(Bruick，R.K.等，Science294:1337-40(2001);Epstein,A.C,等，Cell107:43-54(2001);Ivan,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:13459-464(2002);Lieb，M.E.等，Biochem.Cell.Biol.80:421-426(2002);Huang,J.等，J.Biol.Chem.277:39792-800(2002))。還鑑定出廣泛表達的第四個PHD/HPH(Oehme，R等，Biochem.Biophys.Res.Commun.296(2):343-49(2002))。PHD/HPH是2-氧代戊二酸酯(2-oxogluterate)依賴的酶，其羥基化作用需要氧(02)。這些酶含與2個組氨酸和1個天冬氨酸殘基結合的鐵，當通過抗壞血酸(ascorbate)維持其亞鐵狀態時可與雙氧結合。一個氧轉移到HIF的扭脯氨酸殘基上；第二個氧與2-氧代戊二酸酯(2-oxogluterate)反應產生琥珀酸酯和二氧化碳。因此，缺少氧引起酶活性的喪失並不能修飾HIF的脯氨酸殘基，並且VHL/HIF不能結合，形成穩定的HIF-a蛋白。因此，PHD/HPH功能上可能作為細胞中直接的氧傳感蛋白，而直接介導HIF對生理氧濃度發生反應(Bracken,C.P.等，CMLS.Cell.Mol.LifeSci.'60:1376-93(2003))。在一個具體實施方式中，編碼嵌合反式激活蛋白的核酸分子包含非哺乳動物低氧誘導因子蛋白的結構域。如本領域技術人員所公認，對低氧的適應性反應在整個進化過程中可能是高度保守的。相應地，預期低氧誘導因子蛋白會存在於許多物種中，包括非哺乳動物的脊推動物和無脊推動物(如昆蟲)。參見例如Bacon等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,249:811-816(1998),該文獻報導了果蠅(DrasopMfl)的Sima鹼性-螺旋-環-螺旋PAS蛋白和哺乳動物的HIF-1a蛋白之間的功能相似性。本領域技術人員可通過許多技術來獲得非哺乳動物的低氧誘導因子蛋白的核酸和胺基酸序列，例如，通過交叉雜交或使用本文提到的所有或部分序列進行擴增。一旦確定了編碼候選低氧誘導因子蛋白的序列，可使用例如用來確定人HIF-la蛋白內那些結構域位置的同類技術來確定足以結合HRE並與fflF-ip形成二聚體的蛋白部分的位置。用於本發明組合物和方法的非哺乳動物低氧誘導因子蛋白的相關結構域也可合成產生或通過對編碼已知哺乳動物低氧誘導因子蛋白的DNA進行位點定向操作來產生。還預期，各種哺乳動物和非哺乳動物低氧誘導因子蛋白之間共同的序列基序將表明儘管可能不是天然存在於任何物種但將仍會產生可用於本發明方法和組合物的結構域的共有序列。為了用這樣的非哺乳動物低氧誘導因子蛋白結構域代替本文所示例的人HIF-la蛋白結構域，需要使這些結構域能與HRE結合併與HIF-ip(ARNT)形成二聚體。例如，儘管HIF-la亞基在含氧量正常條件期間不穩定，但是在正常含氧水平條件下在培養細胞中過量表達該亞基能誘導正常被低氧誘導的基因的表達。一個可選策略是修飾HIF-la亞基，使其不再因含氧量正常條件而去穩定，因此在一系列氧條件下將更有效。設計用來自諸如單純皰滲病毒(HSV)VP16、NFicB或酵母轉錄因子GAL4和GCN4的轉錄激活蛋白的強反式激活結構域替換低氧誘導因子蛋白的C末端(或反式激活)區域，以在含氧量正常條件下穩定蛋白，並提供強且組成性的轉錄激活。為在含氧量正常條件下穩定低氧誘導因子蛋白，並提供強且組成性的轉錄激活，構建由HIF-1a的DNA結合和二聚化結構域和單純皰滲病毒(HSV)VP16蛋白的反式激活結構域組成的雜合/嵌合融合蛋白。通過基因治療將該雜合/嵌合體施用至受治療者的細胞，誘導正常情況下對低氧的反應是表達上調的基因(即VEGF等)的表達。已表明組成上穩定的雜合HIF-la用於治療缺血患者是有效的(美國專利第6,432，927和7,053,062號，兩者都通過引用整體結合入本文)。因此，如本文描述和示例，施用編碼具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的核酸分子可治療有相應需要的患者的神經變性運動病症，所述反式激活蛋白包括低氧誘導因子蛋白(如HIF-la)的DNA結合結構域和能轉錄激活的蛋白結構域(如HSVVP16的轉錄激活結構域、NFKB的轉錄激活結構域)。在一個具體實施方式中，DNA結合結構域是HIF-la的DNA結合結構域，能轉錄激活的蛋白結構域是HSVVP16的轉錄激活結構域。這個HIFla/VP16構建體(含HIF-la的DNA結合結構域和HIF-lP二聚化結構域和HSVVP16的轉錄激活結構域)的代表性cDNA核酸序列如下-.21A丁GGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGG-CGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAAC丁CATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCACATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCG22AGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAG(SEQIDNO:1).該代表性核酸序列中，HIF-la的DNA結合和HIF-lP二聚化結構域的ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTG丁TTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACTCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCACATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAG(SEQIDNO:2).該代表性序列中，HSVVP16的轉錄激活結構域的序列如下CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATG丁CAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGACCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGA丁A丁GGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAG(SEQIDNO:3).本發明包括編碼具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的其它核酸，所述反式激活蛋白例如包括HIF-la的DNA結合和二聚化結構域和NF口B蛋白(例如人NFkB蛋白)的反式激活結構域的蛋白。真核轉錄因子通常由分離並獨立的DNA結合和轉錄激活結構域組成(Mitchell和Tjian，Science245:371-378(1989))。結構域的獨立性得以製成由異源蛋白的DNA結合和激活結構域組成的功能性融合蛋白。Brent和Ptashne構建了由lexaDNA結合蛋白和酵母轉錄因子GAL4的激活結構域組成的嵌合真核調節蛋白(Nature312:612-615(1985))。使用融合蛋白已鑑定出幾種類型的可作為轉錄激活子的蛋白結構域。這些結構域胺基酸相似性很小，但經鑑定通常為高度酸性(如GAL4和GNC4)、富含穀氨醯胺(如Spl)或富含脯氨酸(如NF1，Ma和Ptashne，Cell51:113-119(1987);Courey和Tjian(1988);Mermod等，Cell58:741-753(1989))。已知最有效的激活結構域之一包含在單純皰疹病毒(HSV)病毒粒子蛋白16(VP16)的羧基末端100個胺基酸內(Sadowski等，Nature335:563-564(1988);Triezenberg等，Genes&Dev.2:718-729(1988))。VP16(也稱為Vmw65或a-基因反式誘導因子(trans-inducingfactor))是HSV的結構蛋白，可激活病毒即時早期啟動子的轉錄，包括ICPO和ICP4的即時早期啟動子(Campbell等，J,Mol.Biol.180:1-19(1984);Kristie和Roizman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4065-4069(1984);Pellet等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5870-5874(1985))。儘管VP16特異地激活含所謂TAATGARAT元件的啟動子，但這種特異性是由與VP16氨基末端結構域形成複合體的細胞DNA結合蛋白賦予的(McKnight等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7061-7065(1987);Preston等，Cell52:425-434(1988))。本發明提供了編碼包括DNA結合蛋白的功能性部分和轉錄激活蛋白的功能性部分的雜合/嵌合反式激活蛋白的核酸。這種雜合/嵌合反式激活蛋白具有許多優勢，包括特異性激活含低氧反應元件(HRE)的低氧誘導基因的表達，使其因此達到異常高水平的基因表達。編碼這種雜合/嵌合反式激活蛋白的核酸能在脊推動物細胞中發揮功能，並且可以編碼天然存在的轉錄反式激活蛋白或蛋白的結構域(例如包括脊推動物細胞在內的真核細胞中天然存在的轉錄反式激活蛋白或結構域)、病毒反式激活蛋白或結構域，或任何能刺激脊推動物的啟動子轉錄的合成胺基酸序列。這種反式激活蛋白的實例包括但不限於Muller等(Nature336:544-551(1988))鑑定的淋巳特異性轉錄因子、fos蛋白(Lucibello等，Oncogene3:43-52(1988))、v-jun蛋白(Bos等，Cell52:705-712(1988))、因子EF-C(Ostapchuk等，Mol.Cell.Biol.9:2787-2797(1989))、HIV-1tat蛋白(Arya等，Science229:69-73(1985))、乳頭瘤病毒E2蛋白(Lambert等,J.Virol.63:3151-3154(1989))、腺病毒E1A蛋白(綜述於Flint和Shenk,Ann.Rev.Genet(1989)、熱激因子(HSF1和HSF2)(Rabindran等，PNAS88:6906-6910(1991))、p53蛋白(Levine，Cell88:323-331(1997),Ko和Prives，GenesDev.10:1054-1072(1996))、Spl(Kadonaga等，Cell51:1079-1090(1987))、API(Lee等，Nature325:368-372(1987))、CTF/NF1(Me畫d等，Cell58:741-753(1989))、E2F1(Neuman等，Gene173:163-169(1996))、HAP1(Pfeifer等，Cell56:291-301(1989))、HAP2(Pinkham等,Mol.Cell.Biol.7:578-585(1987))、MCM1(Passmore等，J.Mol.Biol.204:593-606(1988))、PH02(Sengstag和Hinnen,NAR15:233-246(1987))和GALll(Suzuki等，Mol.Cell.Biol.8:4991-4999(1988))。在本發明特定具體實施方式中，反式激活蛋白是單純皰疹病毒VP16(Sadowski等，Nature335:563-564(1988);Triezenberg等,GenesandDev.2:718-729(1988))、NFkB((Schmitz和Baeuerle，EMBOJ.10:3805-3817(1991);Schmitz等，J.Biol.Chem.269:25613-25620(1994)和Schmitz等,J.Biol.Chem.270:15576-15584(1995))和酵母激活子GAL4和GCN4。當然，本領域技術人員會理解用於本發明所述的組合物和方法的轉錄激活結構域也可以是合成的，即基於不包含在已知天然存在的蛋白中的序列。參見例如Pollock和Gilman，PNAS94:13388-13389(1997),該文獻教導了轉錄激活是內在靈活的過程，其中很少(如果有的話)需要特定結構或立體特異性蛋白接觸。該文獻也綜述了可作為轉錄激活子起作用的許多不同分子，包括短肽基序(短至8個胺基酸)、簡單兩親性螺旋和甚至與轉錄激活無關的蛋白的誘變結構域。才艮據本發明，將編碼DNA結合結構域和反式激活結構域的核酸序列結合以^f果留每個結構域各自的結合特性和反式激活特性。在本發明各種具體實施方式中，編碼能激活轉錄的反式激活蛋白或其一部分的核酸可以在不完全破壞編碼的DNA結合結構域功能的基因座插入核酸。低氧誘導因子蛋白中DNA結合和二聚化功能不需要的區域和轉錄反式激活功能不需要的蛋白質區域為已知和/或可通過本領域已知方法鑑定，包括例如定位突變(mappedmutation)分析以及鑑定缺少定位突變的區域，後者與其它區域相比對突變更不敏感並且是分子的功能上更加相關的部分。使用標準分子生物學4支術可產生合適的重組構建體，包括在Maniatis(MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實-驗手冊)(ColdSpringHarbor,N.Y,ColdSpringHarborLaboratory)(1989))中提出的技術。可將編碼嵌合反式激活蛋白的重組DNA構建體置於(即可操作性地連接至)合適的啟動子和/或其它表達控制序列的控制下。儘管也可將反式激活蛋白置於誘導型啟動子(如金屬硫蛋白啟動子(Brinster等，Nature296:39-42(1982)))或組織特異性啟動子的控制下，但是最好將反式激活蛋白置於組成型活性的啟動子序列的控制下。可根據本發明使用的啟動子序列包括但不限於SV40早期啟動子區域(Benoist和Chambon,Nature290:304-310(1981))、包含在勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavims)的長末端重複序列內的啟動子(Yamamoto等，Cell22:787-797(1980))、皰疹胸苷激酶啟動予(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:144-1445(1981))、人巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子/增強子(Boshart等，Cell41:521-530(1985))。在本發明一個具體實施方式中，嵌合反式激活蛋白是由pcDNA3/HIF/VP16/Afl2編碼的。在另一個具體實施方式中，嵌合反式激活蛋白是由pcDNA3/HIF/VP16/RI編碼的，除了VP16片段插入在HIF-1a編碼區第530密碼子之後外，pcDNA3/HlF/VPl6/RI與pcDNA3/HIF/VP16/Afl2相同。才艮據本發明，編碼雜合/嵌合反式激活蛋白的核酸可用來特異性地調節含低氧反應元件(HRE)基因的表達。這些HRE對應於用作嵌合反式激活蛋白骨架的DNA結合蛋白識別和結合的核酸序列。總的來說，編碼嵌合反式激活蛋白的核酸可用來選擇性地控制目的基因的表達。例如，並不作為限制的方式，例如當需要在細胞培養物或轉基因動物體內產生一定量特定基因產物時，可將嵌合反式激活蛋白置於組成型啟動子的控制下並且可用於組成性增強與低氧反應元件(HRE)連接的目的基因的表達。可選地，可將反式激活蛋白置於組織特異性啟動子的控制下，使目的基因可在特定組織中表達。在本發明可選的具體實施方式中，嵌合反式激活功能是可誘導的，這樣通過低氧反應元件(HRE),目的基因的表達可被選擇性地增強或降低。條件性的和可誘導的轉基因表達的綜述參見Fishman，Circ.Res.，82:837-844(1998)和Fishman，TrendsCardiovasc.Med.,5:211-217(1995)。HIFl-a構建體的其它信息可參見例如美國專利序列第6，432,947號。月幾萎縮性側索石更化症(ALS)是一種進行性神經變性病狀，其涉及腦和脊髓中大運動神經元的喪失。該病的特徵是進行性衰弱、萎縮和痙攣狀態，導致在發病5年內癱瘓和呼吸衰竭。家族性ALS佔所有ALS病例的10%;這些病例中約25%是由於Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(S0D1)的突變造成的[l]。迄今為止，SODl基因中鑑定到109個不同的突變，這些突變覆蓋了所有5個外顯子[2]。除了非常罕見的在重神經絲鏈(NFH)基因、動力蛋白激活蛋白基因、嚢泡結合蛋白1基因和ALSIN基因的突變外，S0D1是已鑑定的唯一的主要ALS易感性基因座。SOD1是一個主要存在於胞質的酶，其催化超氧離子分解成氧和過氧化氫，然後過氧化氫被穀胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶降解形成水。許多證據認為，突變型S0D1蛋白通過獲得的相反的功能具有神經毒性，該功能可引起氧化性病理狀態和蛋白的聚集，伴有穀氨酸代謝、線粒體功能、軸突運輸和鈣平衡的次級紊亂[3]。突變型SOD1蛋白在小鼠中高水平的轉基因表達產生運動神經元疾病的表型，發病的年齡和疾病的持續時間依賴於拷貝數[4]，這一觀察結果有力支持了突變型S0D1具有毒性這一論斷。迄今為止J艮少有治療性幹預措施改變了轉基因ALS小鼠的運動神經元表型。儘管迄今為止已測試了超過100種小分子，但是這些分子甚至是邊際效益都很少具有(如利魯唑[5]、塞內昔布[6]、ari纖Jomol[7])。相比之下，一些形式的蛋白治療是有益的。因此，通過轉基因[8]或經IM注射並隨後逆向軸突運輸到運動神經的AAV2遞送[9]系統施用胰島素樣生長因子1(IGF-1)以顯著改進存活。另外2個作為神經保護劑顯示有治療前景的蛋白是促紅細胞生成素[10]和血管內皮因子(VEGF)[11,12]。後者特別令人感興趣，因為遺傳分析表明VEGF基因的減效變體是ALS的危險因子[13]。此外，缺少低氧反應啟動子元件的小鼠出現緩慢進行性運動神經元疾病[14]。隨後，有文獻表明，通過慢病毒將VEGF遞送到ALS小鼠的脊髓可延緩死亡[15]。2個獨立的研究者報導將VEGF注入ALS小鼠[16]和大鼠[17]的腦脊液也延緩疾病的進程。由於這個原因，本發明的一個具體實施方式是提高神經營養性蛋白VEGF家族和/或EPO水平的方法，該方法包括將編碼HIF-la的神經營養性載體注射到具有ALS或其它運動神經元病症的受治療者的脊髓區域。該方法可增加超過一種這樣的神經營養性蛋白。理論上不受限制，遞送編碼HIF-la的轉基因將增強各種HIF-1靶基因的表達，因此為HIF-la的表達位點的運動神經元提供了好處。理論上不受限制，直接脊髓注射神經營養性載體也為治療性分子(如HIF-la)的遞送提供優勢，因為其在脊髓細胞中直接表達時更有效發揮功能。例如，編碼例如短幹擾RNA(siRNA)分子的神經營養性載體可通過直接注射脊髓遞送到脊髓細胞。以這種方式遞送的siRNA直接在細胞內對轉導的脊髓細胞產生影響。此外，某種遺傳性運動神經元病症(如SMA)可通過將編碼治療性基因的神經營養性載體直接注射脊髓進行治療。這種直接脊髓注射的方法提供了將重組病毒直接遞送到脊髓區域細胞的方法。合適的用於實施本發明的神經營養性病毒載體包括但不限於腺伴隨病毒載體(AAV)、單純皰滲病毒載體(美國專利第5,672,344號)和慢病毒載體。在本發明的方法中，可使用任何血清型或假型AAV。在本發明某些具體實施方式中使用的病毒載體的血清型選自下述AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8(參見如Gao等(2002)PNAS,99:11854-11859和ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(基因治療的病毒載體方法和步驟)，編輯Machida,HumanaPress,2003)。除本文列出的血清型外，也可使用其它血清型。此外，假型AAV載體也可用在本文所述的方法中。假型AAV載體是那些含一種AAV血清型的反向末端重複序列(ITR)和第二種AAV血清型的衣殼的載體；例如，含AAV2衣殼和AAVlITR的AAV載體(即AAVl/2)或含AAV5衣殼和AAV2ITR的AAV載體(即AAV2/5)。AAV載體衍生自對哺乳動物不致病的單鏈(ss)DNA細小病毒(綜述見Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129)。簡單地i兌，基於AAV的載體除去了佔病毒基因組96%的wp和cap病毒基因，保留了2個側翼的145石成基對(bp)的反向末端重複序列(ITR),該反向末端重複序列可用來起始病毒DNA複製、包裝和整合。在缺少輔助病毒時，野生型AAV以優先位點特異性整合到人宿主細胞基因組中染色體19q13.3處，或可以游離地保留。單個AAV顆粒可接納達5kb的ssDNA,因此保留了約4.5kb轉基因和調節元件，這一般是足夠的。然而，如美國專利第6，544，785號所述的反式剪接系統幾乎可以使這個限值加倍。在一個示例性具體實施方式中，AAV是AAV7或AAV8。許多血清型的腺伴隨病毒，特別是AAV2,被廣泛研究並鑑定作為基因治療載體。本領域技術人員熟悉功能性基於AAV的基因治療載體的製備。許多關於AAV產生、純化和製備以施用至人受治療者的各種方法的參考可發現在許多已公開的文南史中(參見如ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(基因治療的病毒載體方法和步驟)，編輯Machida,HumanaPress,2003)。此外，基於AAV的靶向CNS細胞的基因治療描述於美國專利第6,180,613和6,503,888號。其它的示例性AAV載體有編碼人蛋白的重組AAVl、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8血清型載體。其它示例性假型載體可以是AAV載體AAV2/1、AAV2/2、AAV2/6、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8。在本發明某些方法中，載體包括可才喿作連接至啟動子的轉基因。轉基因編碼生物活性分子，該轉基因在CNS中的表達導致至少部分神經病理學的^斧正。HIFl-a基因是為本領域所熟知的。參見如NM—001530和NP—001521。NFickB反式激活序列可替換HIFl-a反式激活序列。參見如畫—003998。真核細胞中轉基因的表達水平主要是由轉基因表達盒內的轉錄啟動子決定的。顯示長期活性和組織特異性甚至細胞特異性的啟動子在某些實施方式中使用。啟動子的非限制性實例包括但不限於巨細胞病毒(CMV)啟動子(Kaplitt等(1994)Nat.Genet.8:148-154)、CMV/人|33-珠蛋白啟動子(Mandel等(1998)J.Neurosci.18:4271-4284)、GFAP啟動子(Xu等.(2001)GeneTher.8:1323-1332)、1.8-kb的神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子(Klein等(1998)Exp.Neurol.150:183-194)、雞(3肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki(1989)Gene79:269-277)、(3-葡糖醛S吏酶(GUSB)啟動子(Shipley等.(1991)Genetics10:1009-1018)和諸如美國專利第6,667,174號所述的分離自人泛素A、人泛素B和人泛素C的泛素啟動子。為延長表達，可額外將其他調節元件可操作連接至轉基因，如土撥鼠肝炎病毒後調控元件(WPRE)(Donello等.(1998)J.Virol.72:5085-5092)或牛生長激素(BGH)多聚腺苦化位點。對於某些CNS基因治療應用，可有必要控制轉錄活性。為達到這個目的，可通過引入例如Haberma等.(1998)GeneTher.5:1604-16011和Ye等(1995)Science283:88-91所述的各種調節元件和藥物反應性啟動子，獲得用病毒載體藥理性地調控基因的表達。30在某些具體實施方式中，組合物中載體的濃度或滴度至少是(a)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(xio12gp/ml);(b)5、6、7、8、9、]0、15、20、25或50(xio9tu/ml);或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(x10'°iu/ml)。一方面，轉基因編碼生物活性分子，該轉基因在CNS中的表達可導致至少部分神經病理學的矯正。在某些實施方式中，治療性轉基因產物是減輕和/或阻止ALS症狀的HIFl-a蛋白。參見Raoul等.(2005)Nat.Med.ll(4):423-428和Ralph等.(2005)Nat.Med.11(4):429-433。另外的或可選的轉基因可用來表達治療量的胰島素生長因子-l(IGF-1)、4丐結合蛋白(calbindin)D28、小清蛋白、HIFl-a、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2和CNTF(睫狀神經營養因子)。本發明提供了調控、矯正或增大罹患運動神經元損傷的受治療者運動功能的方法。只為例證的目的，受治療者可患肌萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髓延髓性肌萎縮、脊髓性肌萎縮(SMA)、脊髓小腦性共濟失調、原發性側索硬化(PLS)或創傷性脊髓損傷中的一種或多種。理論上不受限制，與運動神經元損傷相關的病理學可包括運動神經元退化、神經膠質增生、神經絲異常、皮層脊髓束和脊神經前根中有髓纖維的喪失。可識別兩種類型病症的出現延髓發病，影響腦幹運動神經元(影響面部肌肉、語言和吞咽)；四肢發病，影響脊髓運動神經元，表現為痙攣狀態、普遍的衰弱、肌萎縮、癱瘓和呼吸衰竭。ALS中，受治療者有延髓發病也有四肢發病。在PLS中，受治療者延髓發病。組織和完成複雜的運動作用的能力依賴於來自大腦皮層運動區域(即運動皮層)的信號。皮質運動指令沿兩個神經束下行。皮質延髓纖維控制移動面部肌肉的腦幹中的運動核，而皮質脊髓纖維控制神經支配軀幹和四肢肌肉的脊髓運動神經元。大腦皮層也通過作用於下行腦幹途徑間接影響脊骨逸運動活動。原生運動皮層沿Broadmann，s區的中央前回分布(4)。才更射到脊髓的皮層神經元軸突在皮質脊髓束(含約1百萬軸突的一大束纖維)匯集到一起。這些軸突中約1/3起源自額葉中央前回。另夕卜1/3起源自6區。剩餘部分起源於體感覺皮層的3、2和1區，調節經背角向中樞傳入的傳輸。皮質脊髓纖維與皮質延髓纖維匯集通過內嚢後肢到達中腦的前側部分。它們在腦橋分離成小束纖維，小束纖維在腦橋核間運行。小束纖維在髓質重新組合形成髓質錐體。約3/4的皮質脊髓纖維與位於髓質和脊髓連^^處的錐體交叉的中線相交。相交的纖維在脊髓側柱的背部(背外側柱)下行，形成皮質脊髓側束。不相交的纖維在前柱下行，形成皮質脊髓前束。皮質脊髓的側束和前束的分開終止於大致與腦幹側生和中央系統同樣的脊髓灰質區。皮質脊髓側束主要向前角側生部分的運動核和中間區的中間神經元投射。皮質脊髓前束向兩側投射前內側細胞柱和含神經支配軸向肌肉的運動神經元的中間區連接部。一方面，公開的方法包括施用攜帶編碼治療性產物轉基因的神經營養性病毒載體到受折磨受治療者的CNS,使轉基因在接近施用位點的CNS內表達，表達水平足以使表達的蛋白通過CSF在CNS中運輸時產生治療性效果。此外，載體可包含編碼有效治療CNS病症的生物活性分子的多核普酸。這種生物活性分子可包括肽，包括但不限於天然的、融合的或突變形式的全長蛋白、天然的、融合的或突變形式的蛋白片段、合成的多肽。在一個例證性具體實施方式中，施用是通過直接將高滴度的載體溶液注射到受治療者或患者的脊髓來實現的。在某些具體實施方式中，方法包括施用高滴度的攜帶治療性轉基因的神經營養性載體，以-使轉基因產物在脊髓內第一位點以治療性水平表達。在某些具體實施方式中，組合物的病毒滴度至少是(a)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(xiol2gp/mO;(b)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(x109tu/ml);或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(x1010iu/ml)。在實驗小鼠中，注入AAV溶液的總體積可在諸如1到20(il之間。對其它哺乳動物，包括人，體積和遞送速率是4姿合適比例的。治療可由每個靶位點單次注射組成，也可在一個或多個位點重複注射。也可使用多注射32位點。例如，在某些具體實施方式中，除了第一施用位點，含攜帶轉基因的病毒載體的組合物可施用於另一位點，該位點可在第一施用位點的對側或同側。注射可以是單次或多次、單側或兩側。高滴度AAV的製品可使用本領域已知技術來產生，例如，如美國專利第5,658,776號禾口ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(基因治療的病毒載體:方法和步驟)，編輯Machida,HumanaPress,2003所述。下述實施例提供了本發明例證性的具體實施方式。本領域的普通技術人員可考慮到多種可進行的改進和調整，而不改變本發明的精神或範圍。這種改進和調整包括在本發明的範圍內。實施例不以任何方式限制本發明。實施例實施例1.rA4F4^我'傳遂送脊迄今為止，系統地監測不同血清型rAAV在神經系統的分布模式的研究相對較少。一個最提供信息的研究表明rAAV2/1和rAAV2/5傾向於表現出比rAAV2/2更高的轉導。此外，觀察到rAAVl和rAAV5的反向運輸[20]。因此我們進行了初始實驗來決定許多AAV血清型的相對攝取和遞送，使用兩種遞送途徑將其遞送到脊髓細胞，集中在運動神經元。這些初始實驗比較脊髓灰質內注射編碼GFP(綠色螢光蛋白)的AAV和肌內注射編碼GFP的AAV。評估包括血清型2/1、2/2、2/5、2/6、2/7和2/8的6個不同的#￡型AAV載體。通過吸入異氟烷麻醉小鼠,並4吏用立體定位儀固定。小鼠組用AAVCBA-GFP載體注射，一組用下述血清型之一進行注射AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2〃和AAV2/8。每隻小鼠接受總數為2.5e10的DNA酶抗性顆粒(DRP)。通過灰質內注射一劑到脊髓的下述區域C6區(頸區內)、T8/T9區和T13區(胸區內)和L3/L4區(腰區內)。以1微升/分鐘的速率每個位點注射4微升病毒。i^iM^成組小鼠用AAVCBA-GFP載體注射；一組用下述血清型中的每一種進行注射AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2〃和AAV2/8。每隻小鼠接受4次AAV注射2次注射到四頭肌，2次注射到腓腸肌(gasctrocnemius)。每隻小鼠接受總劑量為2.5e10的DNA酶抗性顆粒(DRP)。解剖全腦、脊髓和肌肉。用QiagenDneasyTM試劑盒提取DNA。用針對AAVCBA-GFP載體上BGH序列的51物和探針對腦、脊髓和肌肉進行BGH(牛生長激素)TaqmanTM試驗分析，來確定每種組織中載體基因組的拷貝數。確定總DNA中BGH的拷貝數。也對解剖的脊髓進行免疫組織化學分析來檢測以下各項1)GFP以確定轉基因的表達，2)膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)以代表(label)神經膠質細胞，和3)SM132和NeuN以代表(label)神經元細胞。圖1顯示了通過脊髓注射或通過肌內注射遞送到脊髓的AAV載體基因組的數目。在用脊髓注射AAV2/7和2/8處理的小鼠脊髓中發現了更多的載體基因組。圖2顯示了脊髓或肌內注射AAV載體後遞送到腦的載體基因組的數目。很少的AAV載體存在於腦。不同處理組間的顯著性差異是不明顯的。數據顯示直接脊髓注射任何AAV血清型後，散布到腦的載體很少。這可能是一種安全優勢，說明脊髓注射後載體保留在脊髓區域。圖3顯示了肌內注射AAV載體後遞送到肌肉的載體基因組的數目。悽t據顯示與肌內注射AAV載體相比，直接脊髓注射AAV載體介導更多的基因轉移到脊髓。脊髓注射與肌肉注射同樣AAV載體的小鼠相比，脊髓中測到更大數目的AAV載體基因組，這證明了上述觀點。此外，數據表明本實驗中介導最高脊髓基因轉移的血清型是AAV2/7和AAV2/8。免疫組織化學結果表明脊髓注射編碼GFP的AAV載體引起顯著的GFP表達。GFP表達與表達神經元標記SM132和NeuN的細胞共定位。沒有觀察到GFP與星形膠質標記GFAP的共定位。所有測試血清型的免疫組織化學結果類似。肌內注射後，在肌內注射後的脊髓中，觀察到沒有GFP或很少GFP陽性細胞(主要為非神經元細胞)。實施例2.V、it嫁1/7的7，估V、iU^^^射爿爿r-77/屍/aiVF;cg:在腦的丘腦區域用編碼HIF1aNFicB的AAV載體注射小鼠。評估2種血清型1)AAV2/1-HIF1cxNFkB和2)AAV2-HIF1cxNFkB。每隻小鼠接受9e9的DNA酶抗性顆粒(DRP)。未處理的小鼠作為對照。注射後4周，處死小鼠，收集它們的腦。對腦切片進行原位雜交以顯現HIF-la的mRNA。也對從腦中提取的cDNA進行RT-PCR,來評估VEGF基因的表達。用GUSB基因的表達對VEGF基因的表達進4亍歸一4匕(normalization)。通過原位雜交在用AAV2/1-HIF1cxNFkB和AAV2-HIF1cxNFkB處理的小鼠腦內觀察HIF-la的mRNA;對照腦中沒有觀察到信息(message)。在用AAV2/1-HIF1cxNFkB處理的小鼠中觀察到更多的HIF-1amRNA信號。RT-PCR的基因表達分析表明，相對於對照動物，用AAV2/l-HIFlaNFKB處理的小鼠中VEGF基因表達增加。在用AAV2-HIF1cxNFkB處理的小鼠中沒有觀察到可測的VEGF基因表達的增加。在第二個實—瞼中，用AAV2/1-HIF1oiNFkB兩側注射'J、鼠到d、鼠腦的d、腦區。每隻小鼠接受2e10的DNA酶抗性顆粒(DRP)。未處理的小鼠作為對照。注射後3周，處死小鼠，收集它們的腦。對腦切片進行原位雜交以顯現HIF-la的mRNA。也對從腦中提取的cDNA進行RT-PCR,以評估VEGF、EPO和IGF-l基因的表達。用GUSB基因的表達對表達水平進行歸一化。通過原位雜交在整個小腦見察到HIF-la的mRNA。表達是強的並遍及各個神經元細胞層。腦幹中沒有觀察到HIF-la的mRNA。對照小鼠的腦中沒有觀察到HIF-la的mRNA。如圖4顯示，用編碼HIF-la的AAV載體轉導後，腦中VEGF、EPO和IGF-1的mRNA水平被上調。對照小鼠中沒有觀察到這些基因的上調。這表明用AAV載體轉導後，HIF-la具有調節腦中靶基因的基因表達水平的能力。^^,裙^^,硬^症W浴^V^^^^T曹。肌萎縮性側索硬化症(amytrophiclateralsclerosis)(ALS)是一種至丈死性的3申經變性疾病，其特徵是皮層、腦幹和脊髓中運動神經元的選擇性喪失。疾病的進展可導致四肢、軸向和呼吸肌肉的萎縮。運動神經元細胞的死亡伴隨著活性神經膠質增生、神經絲異常和皮質脊髓束和脊神經前根內大的有髓纖維的顯著喪失。儘管對ALS的病因學了解較少，越來越多的證據表明散發性(SALS)和家族性(FALS)ALS共有許多相似的病理特徵；因此，提供了一個前景對任何一種形式的研究將導致共同的療法。FALS佔診斷病例約10%,其中20%與Cu/Zn超氧化物歧化酶(S0D1)的顯性遺傳突變相關。表達突變型人SODl蛋白的轉基因小鼠(如SODlG"A小鼠)重現了ALS的許多病理特徵，是研究ALS的適合的動物模型。對SALS來說，大量的病理4幾制一皮牽涉為潛在的起因，包括穀氨酸誘導的興奮性神經毒性、毒素的暴露、蛋白酶體功能障礙、線粒體損傷、神經絲結構破壞和神經營養性支持的喪失。我們將測試如下々i說通過rAAV介導將HIFla遞送到脊髓可促進運動神經元存活和改善SODlG"AALS小鼠疾病進展。用重組AAV載體遞送允許相對長期的轉基因表達(ALS小鼠可能需要轉基因表達許多個月。此外，根據血清型，AAV感染神經元和非神經元細胞，如果如我們猜想，非神經元細胞參與運動神經元的死亡[21]，則是一個潛在的好處。實驗大綱。我們使用脊髓內注射施用AAV2/8-HIFlaNFKB,來確定本策略對運動神經元存活、疾病發病和ALSSODlGWA小鼠存活的影響。r^4F惑染小it的##差。對每個病毒處理組，60天齡或卯天齡的SODlG93A或S0D1WT小鼠(5隻/組)和WT小鼠(5隻/組)注射1ellDRP的AAV2/8-Hifla-NFKB。作為陰性對照，60天齡或90天齡的S0D1小鼠用同樣劑量的空載體注射。(作為一個額外的陽性對照，60天齡或90天齡的SOD1小鼠(5隻/組)可用同樣劑量的AAV2/8-hlGF-l(人IGF-1)載體注射。一個額外的陰性對照也可以是野生型小鼠。)病毒注射到推骨C6、T8/T9、T13、L3/L4的脊髓，每個位點4pl，以1(il/分鐘遞送，總劑量為2.5e10DRP。用TaqMan試驗檢測脊髓中病毒基因組、fflFla信息和VEGF。進行脊髓的原位雜交來顯現HIF-a在AAV2/8-Hif1(x-NFkB處理和陰性對照小鼠脊髓中的表達。,術義小和魏20隻TgSODl冊A小鼠用AAV2/8-HIFla處理以觀察發病和存活。每種類型中可額外有30隻小鼠在110天和最後被處死，用於組織學和生物化學分析。基於先前的研究，我們假設(i)具有SODlG，轉基因的小鼠存活130士13天；(ii)檢測真實組間差異的本研究的統計學功效是90%;(iii)a以0.05雙尾檢驗；和(iv)我們希望在處理小鼠的平均存活上檢測到10%或更大的差異。用這些假設，我們要求每個測試單型至少14隻小鼠。因此，我們決定每組觀察至少20隻動物的病症發病、疾病進展和存活，免得小鼠因與它們運動神經元疾病不相關的原因死亡。在最後的存活分析中，評估20隻用AAV2/8-HIFla處理的小鼠，並評估18隻對照小鼠。每組中可額外有30隻小鼠以預定的時間間隔(每個月5隻，共6個月)被處死，用於組織學和生物化學分析。用Kaplan-Meier曲線和log-rank統計學檢驗來比較疾病發病和存活的時間。用Cox比例風險模型來控制性別的影響。確;tM」r-///^7aj玄"麼多詢。疾病的發病定義為當用尾巴拔—起小鼠時，伸展的腿出現震顫。死亡定義為小鼠不能在30秒內恢復正常的點。一佐MHF7cc^適浙贈龍存;緣謬喊我們將使用脊神經前根分析來監測5隻用rAAV-HIFla處理的TgSODlG93A小鼠在症狀性(110天)和末期時間點的運動神經元數目。茲果。脊髓內施用AAV2/8HiflaNFicB後，觀察到ALS小鼠存活的統計學顯著(pi.033)的增長(對照小鼠存活133天而實驗動物存活139天)。不同同齡組動物對處理的反應不同25%的處理動物表現出18-23天存活的增長，而25%的動物表現出8-13天存活的增長。在AAV2/8HiflaNFkB處理的ALS小鼠脊髓中，對HiflaNFicB的原位雜交分析表明轉導主要見於脊髓的腰區。此外，分析也表明只有25。/。的預定劑量lelldrps供給動物。表l列1的存活歸納表截尾指示變量(CensorVariable):列3分組變量列1.2tableseeoriginaldocumentpage38表2列1的Kaplan-Meier存活統計截尾指示變量列3分組變量列1.2tableseeoriginaldocumentpage38實施例4.可以構建由HIF-la的DNA結合和二聚化結構域和單純皰滲病毒VP16的反式激活結構域組成的雜合轉錄因子(pcDNA3/HIF.VP-16.Afl2),以4吏正常參與對低氧的生理性適應的基因發生強且組成性的激活，如下面概述。通過PCR(AdvantagecDNAPCR試劑盒，Clontech,PaloAlto，Calif.),用4是出的引物(SEQIDNO:4:ggggtaccttctcttctccgcgtgtggagggagccagc;SEQIDNO:5:gctctagagtgagccaccagtgtccaaaaaaaggatg),乂人HeLa糹田月包cDNA文庫(Clontech)中分離全長(aa1-826)HIF-la基因，並將其插入表達載體pcDNA3(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)的Kpnl和Xbal位點之間。在該質粒中，基因表達是由巨細胞病毒(CMV)即時早期增強子/啟動子控制的。HIF-la/VP-16雜合體是通過在aa390(Afl2位點)處截短HIF-lou然後將HSVVP-16的反式激活結構域連接在其下遊構建的。用Vent聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和提出的引物(SEQIDNO:6:cgtacgcttaagccggaattcccggggatctgg;SEQIDNO:7:cgctctagactacccaccgtactcgtcaattc)PCR擴增含Afl2和Xbal末端的VP16片段(aa413-490),並將該片4殳克隆到pcDNA3/HIF-la構建體合適的位點內。將在aa530處截短HIF-la產生相關的構建體(pcDNA3/HIF/VP-16/Rl)用EcoRl進行部分消化。PCR產生的所有序列的完整性通過使用AppliedBiosystems377DNA序列分析儀進行DNA測序來驗證。所有克隆操作按標準步驟進行(Sambrook,J.等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆實-驗手冊)第2版(ColdSpringHarbor，N.Y.,1989))。限制性內切酶和DNA修飾酶從NewEnglandBiolabs或LifeTechnologies,Inc.(Gaithersburg,Md.)獲得，並參照製造廠商的說明書使用。質粒DNA用從Qiagen(Chatsworth,Calif.)獲得的試劑盒純化。除非另外指明，說明書(包括權利要求)中使用的表達成分、細胞培養物、處理條件等的量的所有數字應理解成在所有情況下都由術語"大約"修飾。相應地，除非另外有相反指明，數字參數都是近似值，並且可根據試圖通過本發明獲得的所需特性而改變(very)。除非另外指明，在一系列元素之前的術語"至少"應理解成指系列中的每個元素。本領域技術人員實施方式進行許多等同替代。這些等同替代預期包括在權利要求中。參考文獻391.Rosen,D.R.等,Mw加/o"sCi//Z"swperar/<ieW纖wto化ge恥are物歧化酶基因的突變與家族性肌萎縮性側索硬化症相關)Nature,1993.362:p.59-62.2.Andersen，P.M.等,5Yxteewwove///zeCw/Z"sw/erar/cfeofocoven'ay，<ie/ec&W^Wey.(月幾萎縮性側索硬化症中Cw/Z"超氧化物歧化酶基因的16個新突變10年的發現、不足和爭論)AmyotrophLateralSclerOtherMotorNeuronDisord,2003.4(2):p.62-73.3.Cleveland,D.W.禾口J.D.Rothstein,FrowCAorcofto丄owGe/zn'gvcfe")/ze〃,wg"/ecf/vewotorwewrawfife3/1/7爿丄51.(乂人Charcot到LouGehrig:破角手ALS中選4奪性的運動神經元死亡)NatRevNeurosci,2001.2(11):p.806-19.4.Gurney，M.E.等,Motorwewraw<iegewera/7'oww/cef/wfexpressa/畫a"Cw，Z"sw/emx/cfeW扁wtoe(表達人Cw/Z"超氧化物歧化酶突變的小鼠中運動神經元的退化)Science,1994.264:p.1772-1775.5.Gumey，M.E.等，Bew^/^q/"v"amfw7-/Zwzo/e，ga^/e油'wz'wacomme"^/.(家族性肌萎縮性側索石更化症轉基因模型中維生素E、利魯唑和加巴噴丁的好處)AnnNeurol,1996.39(2):p.147-57.6.Drachman,D.B.等，Qyc/ooxyge"ose2/w/z/6"z'owpratectomotorwewromjwr/0"g5swrv/va/ea〖mew〖鎖'moc/omo/,acozWww0//2eafWocA:prafe/m1，t/e/qys/ragms^/o"/"爿丄6"w/ce.(用熱5敫蛋白的4肅i秀導物arimoclomol治療延緩了ALS小鼠疾病的進展)NatMed,2004.10(4):p.402-5.8.Dobrowolny,G.等，Mwsc/eex/m^/cwq/"a/oca//g/^-/7'S(^/b環/rate戰woZorew7X>ra/"awJ丄Swowsemotfe/.(局部Igf-l亞型在月幾肉的表達保護ALS小鼠模型的運動神經元)JCellBiol，2005.168(2):p.193-9.9.Kaspar,B.K.等，v/ra/cfe//ver_y</GF-7/ra/o"gsswrv/vo/aww^e^LSwocfe/.(IGF-1的反向病毒遞送延長小鼠ALS模型的生存)Science,2003.301(5634):p.839-42.10.Iwasaki，Y.等，Prc^e"/ve^fecfo//w/^/e油'w-3朋Jw/"/7廠opo/Wwcwmofc^"ewrawq/e廠wecwato/a;w/om,(#斤生動物軸索顯《敬夕卜牙牛術後白細胞介素-3和促紅細胞生成素對運動神經元死亡的保護性效應)NeurolRes,2002.24(7):p.643-6.11.Brockington,A.等,P^wc"/(argraw//2_/^c/。r朋d//ewenw"s"tew.(血管內皮生長因子和神經系統)NeuropatholApplNeurobiol,2004.30(5):p.427-46.12.Storkebaum,E.,D.Lambrechts牙口P.Carmeliet，KEGF:regarcfec/(VEGF:曾經認為作為特異性的血管生成因子，現在參與神經保護)Bioessays，2004.26(9):p.943-54.13.Lambrechts,D.等,K五GFz'samoc折er0/(3myo的//7/c/afera/sc/mw/s(VEGF是小鼠和人中肌萎縮性側索硬化症的調節物，保護運動神經元免受在夾血性死亡)NatGenet,2003.34(4):p.383-94.14.Oosthuyse,B.等,Z)e/e"o"0//^ox/a-ms^orae/"//2evflscw/arewiof/2e//a/grovi^/z々ctor/r函她rcawses附ofor"ewra/Jege"eraWo".(血管內皮生長因子啟動子內低氧反應元件的缺失可引起運動神經元的退化)NatGenet,2001.28(2):p.131-8.15.Azzouz,M.等，FEGFde//ver_yw///z/^ragra>加m770rtoi/e"Z/vecto/'/廠o/cwg51sw廠v/va/,"gwowsg^fL51wo<ie/.(通過反向運1俞6勺十曼病毒載體遞送VEGF延長小鼠ALS模型的生存)Nature,2004.429(6闊:p.413-7.16.Zheng,C.等,^scw/are77fifc^/7e//fl//^rctorw。/o"gsrarv/va/aframgem'cwow"wocfe/o/爿LS.(血管內皮生長因子延長轉基因小鼠ALS模型的生存)AnnNeurol,2004.56(4):p.564-7.17.Storkebaum,E.等,7e加wew/<wofowewrowZ少ALS^^莫型中通過腦室內遞送VEGF來治療運動神經元退化)NatNe腦sci,2005.8(1):p.85-92.18.Yamakawa,M.等,外/ox:/a-zWwc/Z)/ey2ctor-7聰血/eyo"z'v加'ow</ac/ora.(低氧誘導因子-l通過誘導多個血管生成因子介導培養的血管內皮細胞的激活)CircRes，2003.93(7):p.664-73.19.Vincent,K.A.等，Jwg/ogewes/s&zWwced,"ara6Z)"wo<ie/o//nW//m6Zramcn^/o"/acto/'.(編碼HIF-la/VP16雜合轉錄因子的棵DNA誘導兔後肢缺血模型的血管發生)Circulation,2000.102(18):p.2255-61.20.Burger,C.等,iec謂W/7G^v/ra/vectorspsewdo妙edwi^zviraZco/w油化ra妙esi，2，a"c/5(i一/a少t/7,re"f/a/^cfg"cya"<ice〃fra//膽q/er^fe/z've/"7to<^,re"reg/o"syce"加/wenww，tem.(重組AAV病毒載體與來自血清型1、2和5的病毒衣殼形成的々i型遞送到中樞神經系統不同區域後表現出不同的效率和細胞向性)MolTher，2004.10(2):p.302-17.21.Clement，A.M.等,JFz7cZ-(y/e7wwwewro"a/ce〃sex/e"Jswrvz'vo/SQD7mwfawfmotorALS1mz'ce.(野生型非神經元糹田月包延長ALS小鼠中SOD1突變型運動神經元的生存)Science,2003.302(5642):p.42113-7.權利要求1.一種治療患有運動神經元病症的哺乳動物的方法，該方法包括下述步驟將編碼HIF1-α的重組表達載體注射入患有運動神經元病症的哺乳動物的脊髓內，從而延長其預期壽命。2.根據權利要求1所述的方法，其中重組載體是腺病毒相關載體。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/7。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/8。5.根據權利要求1所述的方法，其中將所述載體遞送至所述脊髓的多個位點。6.根據權利要求1所述的方法，其中所述載體編碼HIFl-a和HSVVP16的融合蛋白。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述載體編碼HIF1-cx和NFkB的融合蛋白。8.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物患有的病狀選自脊髓延髓性肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調、脊髓性肌萎縮或創傷性脊髓損傷。9.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物患有ALS。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物選自嚙齒類、鼠、人或猿。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人類患者。12.—種治療患有運動神經元病症的人類患者的方法，該方法包括下述步驟將編碼與NFkB融合的HIFl-a的重組AAV假型2/7或2/8載體遞送至患有運動神經元病症的人類患者的脊髓的多個位點，從而延長其預期壽命。13.根據權利要求11或12所述的方法，其中所述人類患者患有的病狀選自脊髓延髓性肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調、脊髓性肌萎縮或創傷性脊髓損傷。14.根據權利要求11或12所述的方法，其中所述人類患者患有肌萎縮性側索硬化症(ALS)。15.—種用於治療患有運動神經元病症的患者的重組基因遞送載體，該載體包括編碼HIFl-a的重組AAV假型2/7或2/8載體。16.根據權利要求15所述的載體，其中所述fflFl-a與NFKfi融合。17.根據權利要求16所述的載體，其中所述HIFl-a與NFkB融合，由SEQIDNO:l所示的核香酸序列編碼。18.根據權利要求7所述的方法，其中所述融合蛋白由SEQIDNO:l所示的核苷S吏序列編碼。全文摘要本發明提供了治療影響受治療者運動功能和控制的病症或損傷的方法和組合物。一方面，通過將含轉基因的重組病毒載體施用至脊髓，將本發明的轉基因產物遞送到受治療者的脊髓。病毒載體遞送表達編碼重組病毒基因產物的轉基因。病毒基因產物包括HIF1-α。本發明也提供了將轉基因產物遞送到受治療者脊髓的組合物。文檔編號C12N15/00GK101528922SQ200780038545公開日2009年9月9日申請日期2007年10月3日優先權日2006年10月3日發明者C·奧賴爾登,S·瓦茲沃斯申請人:建新公司