克隆和/或表達的新載體其製備方法及應用的製作方法

2023-05-30 02:09:21

專利名稱：：克隆和/或表達的新載體其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在革蘭氏陰性細菌之廣泛宿主中克隆和/或表達的新載體。本發明還涉及這些載體的應用，特別是這些載體在生產重組蛋白質或代謝產物中或生物轉化反應中的應用，以及含有這些載體的宿主細胞。分子生物學的最新進展導致可用於遺傳基因方法之具有廣泛宿主之新載體的開發。這些載體與那些具有窄範圍宿主特異性的載體(如ColE1)截然不同，特徵在於這些載體可在分類學上普遍存在的宿主內複製。就可在幾乎所有革蘭氏陰性細菌內複製的某些質粒來說，這一特性是很明顯的。這樣的質粒具有特別適用於大腸桿菌等細菌，以進行必要的構建，然後直接引入所選擇之革蘭氏陰性宿主的特點。這些載體的另一個特點是它們具有由供體細菌向受體細菌接合轉移的遷移或被遷移性質。這種轉移一般可以很高頻率進行(在1-10-2之間)，此大大高於已知的轉化系統。文獻中描述的在革蘭氏細菌中有廣泛宿主的質粒屬於不相容性C、N、P、Q和W組群(incC、incN、incP、incQ和incW)。其中已對不相容性組群P和Q作了充分研究，並已構建了大量的衍生物(Schmidhauseretal.，1988)。這些組群也是幾乎無例外地得到了應用。在這方面，還描述過這些質粒在除黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)、Bradyrhizobiumjaponicum和擬桿菌屬(Bacteroides)外之所有革蘭氏陰性細菌中的複製情況(KüesandStahl，1989)。對不相容性W組群質粒的使用並不太重要，這一方面是因為它們的優點比不相容性P和Q組群質粒少，另外是對它們了解尚不多。不相容性P組群分兩個亞群incPα和incPβ，其中研究最多的是質粒RK2、RP4(事實上它們是同種質粒的兩個不同的分離物)和R751。這些質粒具有自動接合特性，即它們都具有接合功能(tra和mob)。此外，它們都是具有低拷貝數(RK2在大腸桿菌內的拷貝數為4-7)的大質粒(RK2有60Kb的尾部)。Kües和Stahl已詳細研究了這些質粒的複製情況。另外，已經知道複製原點oriV由(ⅰ)8個17pb的片段、(ⅱ)大腸桿菌之DnaA蛋白質固定位點周圍的推斷的啟動子和推斷的大腸桿菌之IHF蛋白質固定位點、(ⅲ)富含AT的9bp序列及相接的DnaA蛋白質固定位點，以及(ⅳ)一個富含GC的區域組成。與trfA基因相關聯的複製原點構成與RK2同樣普遍存在的複製子，其中所說的trf基因轉譯成由相同相編碼的兩種蛋白質A1和A2，且該基因被賦予了不同的密碼子。就這些宿主來說，A2，或者A1與A2兩者對其複製似乎都是必不可少的(Thomas，1986)。這些質粒的複製受到Kil和Kor基因所介入的複合調節系統的控制。Kor基因(Kil-override)拮抗Kil基因(KilA、KilB、KilC和KilD)的致死性作用，並且對trfA的表達起付調節作用。已鑑定出五個Kor基因(KorA、KorB、KorC、KorE和KorF)。鑑於RK2複製子能適應於用來進行複製的宿主，故證實了存在這些基因及trf基因之調節網(KüesandStahl，1989)。Schmidhauser和Helinski(1985)也證明當在某些宿主中有較差的分離穩定性時，可造成其中某些基因的缺失。因此可見，這些基因對於所觀察到的RK2或RP4衍生物的好的穩定性是不可缺少的。已構建了許多RK2的衍生物作為多宿主載體。這便是那些因離開複製原點(oriV)部位而保留了起始載體之四環素抗性基因的質粒。例如質粒PRK290、PRK404、PRK415(Dittaetal.，1980和1985;Keenetal.，1988;Schmidhauseretal.，1988)。其中特別應提到的是質粒pRK290(Dittaetal.，1980)，該質粒在許多革蘭氏陰性菌中顯示出很高的穩定性(SchmidhauserandHelinski，1985)。該質粒可穩定地存在於大腸桿菌、固氮菌(Azotobacter)、臭味假單胞菌(PseudomonasPutita)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、球形紅色假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)中。然而，在其他革蘭氏陰性菌中該質粒仍是不穩定的;如在瘤病土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Acetinobacter、柄桿菌屬(Caulobacter)及銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中(SchmidhauseretHelinski，1985)。PRK290有一個20Kb的尾部，這對於一個克隆載體來說是很大的。由RK2開始，通過一系列連續缺失而得到了該質粒。除轉移功能(tra基因)、卡那黴素抗性基因及轉座子Tnl外，這些缺失除去了KilA和KilC、KilC和KilE功能(SchmidhauseretHelinski，1985)。因此，儘管失去了某些Kil和Kor功能，仍有可能觀察到RK2衍生物的某些穩定性。然而，已觀察到單純丟失KilB功能可表現出其在許多革蘭氏陰性菌中之穩定性的淨減低，並且還觀察到PRK290比所有被試的有更小尾部的RK2衍生物之穩定性都低(SchmidhauseretHelinski，1985)。除了有關在trfA表達調節系統中所涉及的不同RK2決定子之各自重要性的研究工作外，還發現了一個對這些質粒之分離穩定性可能起決定性作用的片段(Saurugeretal.，1986)。這個位於tra2區域和卡那黴素抗性基因之間的片段編碼一個分配系統(par)。而且表明該片段可穩定大腸桿菌中的PBR322和PACYC177(Saurugeretal.，1986)。至於不相容性組群Q的天然質粒，其實例可包括RSF1010、R1162和R300B。這些質粒在適當微生物中的拷貝數可為10至60個。這些質粒的尾部小於不相容性P組群質粒的尾部;事實上它們的尾部在10Kb以下。複製這些質粒需要有一個Cis區域，其包括兩個亞區域(ⅰ)由3，5重複序列、40pb富AT、60pb富GC和推斷的大腸桿菌DnaA蛋白質固定盒所形成的區域;以及(ⅱ)另一個有反向重複序列的區域，該反向重複序列構成了有40-60pb「杆」部分的次級結構。RSF1010複製的起始必需有由下述質粒編碼的三種蛋白質存在由repA、repB和repC基因編碼的RepA、RepB和RepC。RepC(與重複序列相對應)識別複製原點，並正向調節其複製的起始;RepA具有解螺旋酶活性;RepB和RePB＊(它們相應於由相同相編碼的而又賦予各蛋白質以不同密碼子的兩種蛋白質)具有體外RSF1010特異性的引物酶(Primase)活性。RSF1010的複製依賴於DNA聚合酶Ⅲ和宿主的促旋酶。RSF1010可藉助不相容性IncIα、IncM、IncX，特別是IncP組群的質粒的tra功能由一種革蘭氏陰性菌遷移到另一種革蘭氏陰性菌中(DerbyshireetWillets，1987)。迄今尚未描述過有關RSF1010及其衍生物之穩定性的任何研究工作。此外，RSF1010的序列已為人們所熟知(ScholzetScherzinger，1989)，但用功能性分析和分子分析法均不能鑑定出任何質粒穩定性的決定子。有各種理由認為不相容性Q組群質粒，以及不相容性P組群質粒都是不穩定的。雖然作了上述工作，但有廣泛宿主的已知質粒存在著許多與其性能及工業規模上的應用有關的缺點。尤其是對於工業應用，除不依賴於宿主細菌外，載體質粒還應具有某些與開發限制及生物安全性相對應的性質。應用上受到限制實質上與質粒的分離穩定性有關。事實上，非常希望在抗生素工業應用中不選擇那麼易於丟失的質粒。基於這一觀點，要求工業上應用的載體應具有很好的穩定性。這種穩定性應大到能維持25次連續傳代，此即代表了達到200M3工業發酵罐之生產規模時仍能保留重組菌株所必須的傳代數(StanburryetWhitaker，1984)。而且，對於含有可擴增、表達等DNA序列之核苷酸插入段的這些質粒的衍生物來說，也應有相近的穩定性。另外，生物安全限制性規定迫使對重組菌株實行許多生物學限制。1987年5月7日NIH「有關重組DNA分子研究準則」中述及的I級(BL1)生物安全系統提出了相應較少的限制。這一大腸桿菌和臭味假單胞菌中的系統必須以利用非接合和非遷移質粒為條件。事實上，如果重組微生物在天然介質中偶然處於被釋放狀態，則這些質粒一定不能被轉移到其他生物體內(Trevorsetal.，1987)。然而，文獻中描述的寬宿主範圍的質粒中，沒有一種能完全滿足這些條件。首先，這些質粒從未以普遍存在的方式達到一種良好的分離穩定性。事實上，如果其中某些質粒在某些宿主內是很穩定的，卻不能在所有革蘭氏陰性菌中有同樣的穩定性。此外，長時間以來一直沒有研究過在將含有例如可擴增或表達之序列的DNA片段插入這些質粒後的穩定性。這裡特別應提到的是質粒PRK290，以前從未研究過該質粒中插入DNA片段後的穩定性特徵。再者，現有技術中描述的有寬範圍宿主之質粒的其他特性是它們可以遷移或被遷移，以便由供體細菌接合轉移到受體細菌中。具有mob座位的PRK290質粒同樣是這種情況。為此，這些質粒便不適合於對生物安全性的限制，而只能以很高遷移頻率從其他微生物中排除這些帶有特定DNA序列的質粒。另外，這些質粒中的某些質粒因缺乏穩定性而導致只能以低效率產生蛋白質或代謝產物，從而使其在工業發酵過程中的應用受到限制。本發明的一個目的是提供適於在廣泛宿主內克隆和/或表達的載體，其特徵在於該載體可在幾乎所有革蘭氏陰性菌內複製，它具有很高的分離穩定性，而且是不能遷移的。本發明的再一個目的是提供這種載體的所有衍生物。從本發明的意義來說，該載體的許多衍生物都包括了保留上述特徵的載體，儘管可在其相對重要的區域內有某些改變或修飾(缺失、突變、插入等)。本發明的載體衍生出在革蘭氏陰性菌中有廣泛宿主的不相容性P組群的質粒。具體地說，它們具有由屬於不相容性P組群之質粒衍生的複製原點。更有利的是它們可衍生RK2質粒。它們結合了對載體來說從未描述過的特性，即它們在革蘭氏陰性菌中有廣泛宿主、具有高穩定性，以及不存在遷移功能。本發明載體的高穩定性是由於具有穩定性特性之特定核苷酸序列的摻入。特別是可使用得自然RP4質粒的特定片段。Saurugger等人(1986)描述了稱為par片段的已克隆之片段，並述及它們在大腸桿菌內穩定某些質粒的能力。現已發現，插入par片段可大大提高穩定性，而且這種增加與所選擇的宿主生物體、性質(基因、啟動子等)或核苷酸插入段的尾部無關。事實上，本發明的載體及其衍生物的分離穩定性比可用作克隆載體的RK2衍生物的穩定性更高，而且在所有已試驗的革蘭氏陰性菌中都是這樣。遷移功能的丟失是本發明載體的第二個特徵。因此，與如PRK290這樣的質粒相反，本發明的載體不能從一種革蘭氏陰性菌向另一種遷移。這樣它們便與這些細菌形成I類宿主-載體對，使之符合工業生產規則。特別是因缺失含mob座位的區域所得到的本發明載體更具有這種有利的特性。本發明載體的第三個特性是其能夠在大多數革蘭氏陰性菌中複製。這一特性是特別有利的，因為在將載體引入所選擇的革蘭氏陰性宿主之前，這種特性尤其能在完成構建所需的大腸桿菌內發揮作用。同樣還可根據所要求的載體應用(擴增、表達等)或其核苷酸插入段之尾部等性質，以及適當宿主來選擇之。在一特定的實施方式中，本發明的載體具有多個克隆位點及許多獨特的克隆位點，這樣將大大有利於整合期望擴增或表達的核苷酸插入段。在另一實施方式中，本發明的載體含有選擇標誌，如抗生素抗性基因。更可取的是它們含有RK2的四環素抗性基因。該抗性基因能用於選擇存在於幾乎所有革蘭氏陰性菌中的質粒。可將其他抗性基因插入本發明所述的載體及其衍生物上。本發明的一個特定目的是提供在革蘭氏陰性菌中有寬範圍宿主的克隆和/或表達載體，其特徵在於它衍生於RK2質粒、其尾部小於20Kb、含有一個攜帶RP4質粒之par區域的DNA片段、不含mob座位，並可含有多個克隆位點及選擇標誌。本發明的載體可用於擴增或表達給定的DNA序列。因此，本發明的一個目的是涉及前面限定之含重組DNA片段的載體。更具體地說，依賴於遺傳表達之調節序列的重組DNA含有一個或多個編碼一種或多種給定之多肽的結構基因。根據本發明，結構基因總是依賴於它們所特有的調節信號或不同的調節信號。在一優選實施方案中，其遺傳表達的調節序列是由選自啟動子、決定子、信號肽和核蛋白體固定位點的一個或多個元件組成的。編碼多肽的結構基因可選自於編碼酶、激素或生長因子的基因。最好是選自編碼白蛋白、tPA、TIMP、白細胞介素、脫輔基脂蛋白及幹擾素的結構基因。在本發明的一個特定實施方式中，一個或多個結構基因是在代謝產物的生物合成中，在遺傳或生物化學水平上起作用的基因，也就是說它們是為生物合成代謝產物之方法中所涉及的多肽編碼的基因。具體地說，代謝產物可以是維生素、胺基酸、抗生素或其他任何細菌代謝產物。代謝產物最好選自於維生素B12、生物素、核黃素、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、青黴素或四環素。在一更可取的實施方式中，本發明的載體含有位於允許表達的信號，可能還有允許分泌所需蛋白質的信號之前的，編碼給定之蛋白質的結構基因。本發明的另一個目的涉及生產蛋白質或代謝產物的方法，其特徵在於-在革蘭氏陰性菌內引入一個如上文中限定的載體，該載體含有編碼所述蛋白質的結構基因，或在遺傳或生物化學水平上參予生物合成上述代謝產物的一個或多個基因。-在適於表達所說之基因的條件下培養該細菌;以及-回收所產生的蛋白質或代謝產物。可在工業規模上在幾乎所有革蘭氏陰性菌中利用本發明所描述的載體。對於質粒PXL1635來說，可在能複製質粒RK2的幾乎所有革蘭氏陰性菌，即除黃色粘球菌、Bradyrhizobiumjapanium、擬桿菌屬細菌以外的所有革蘭氏陰性菌中使用該質粒(KüesetStahl，1989)。可按下列方式利用這些質粒如可在多克隆位點處克隆攜帶一個或多個將被擴增之基因的一個或多個DNA片段，然後將如此構建的質粒引入期望在工業上使用的細菌中。如可使用電穿孔轉化系統來引入已構建好的質粒(Wirthetal.，1986)。可基於由質粒提供的抗性來選擇重組克隆。然後按照工業上應用的傳統保存技術保存這些克隆(StandburryetWhitaker，1984)。本發明的再一個目的是涉及含有本發明載體的革蘭氏陰性細菌及其應用。這樣的細胞特別適用於生產蛋白質或代謝產物，或直接用於生物轉化反應中。本發明的其他目的及優點可體現於下述實施例中，這些實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。克隆、分子生物學及生物化學的一般技術用於本發明的傳統分子生物學方法，如在氯化銫-溴乙錠梯度下離心質粒DNA、用限制酶消化、凝膠過濾、由瓊脂糖凝膠中電洗脫DNA片段、向大腸桿菌內轉化及核苷酸沉澱等均如文獻所述(Maniatisetal.，1982;Ausubeletal.，1987)。按已提出的程序經鏈終止法測定核苷酸序列(Ausubeletal.，1987)。所用限制酶由New-EnglandBiolabs(Biolabs)公司、BethesdaReseachLaboratories(BRL)公司或Amersham公司(Amersham)提供。為了進行連接，用0.7%瓊脂糖凝膠或8%丙烯醯胺根據其尾部分離DNA片段，經電洗脫純化、用苯酚提取、在乙醇中沉澱，然後在T4噬菌體的DNA連接酶(Biolabs)存在下，於含50mMTris-HCl(PH7.4)、10mMMgCl2、10mMDTT、2mMATP的緩衝液中保溫。必要時可在緩衝液(10mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2，PH10.5)中於37℃下用牛小腸鹼性磷酸酶(ClP，Pharmacia)處理30分鐘，使帶有突出之5′末端的DNA片段脫磷酸化。可用同樣技術使突出的或跨越的3′末端脫磷酸化，但不同的是於37℃處理15分鐘，再於56℃處理15分鐘。於1%SDS和100mMNaCl存在下，65℃下加熱該反應混合物以使酶失活，然後用苯酚提取並用乙醇沉澱。用大腸桿菌之DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)填充突出的5′末端，該反應於室溫下在50mMTris-HCl(PH7.2)、0.4mMdNTPs、10mMMgSO4、0.1mMDTT、50μg/mlBSA緩衝液中進行30分鐘。可按照製造商推薦的方法，在T4噬菌體的DNA聚合酶存在下，填充和/或消化突出的3′末端。用Biosearch8600型自動DNA合成儀，按製造商推薦的程序以氰乙基基團呈β型保護的氨基磷酸酯(phosphoramidites)化學(Simaetal.，1984;Giles，1985)方法合成寡核苷酸。按照Taylor等人(1985)建立的方法，用Amersham公司(France，SA)提供的試劑盒對寡核苷酸進行體外誘變。按照製造商推薦的程序使用Promega公司(Madison，WI，USA)的Erase-BaseTMSystem試劑盒，藉助核酸外切酶Ⅲ和核酸酶S1以Henikoff(1984)的技術造成序列缺失。用已連接的DNA轉化感受態菌株對於質粒為大腸桿菌MC1060〔△(lacIOPZYA)φX74，galU，galK，StrAr，hsdR〕(Casadabanetal.，1983)和HB101〔hsdS20，supE44，recA13，ara-14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，λ-〕(Maniatisetal.，1982)，或對於噬菌體M13之複製形式的衍生物則為大腸桿菌TG1〔△(lacproA，B)，supE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+，B+，lacIq，lacZ△M15〕(Gibson，1984)。所用polA菌株是具有萘啶酮酸抗性(Nalr)的SF800菌株(Stacheletal.，1985)。當大腸桿菌與大腸桿菌接合時，利用C600菌株〔thi-1，thr1，leu-B6，lacY1，tonAL1，supE44，λ-〕(Maniatisetal.，1982)自發利福平抗性克隆(C600Rifr)(50μg/ml)作為受體菌株。按照Birnboim和Doly(1979)的技術純化質粒DNA。按照Klein等人(1980)的方法小量製備質粒DNA。有關細菌部分的實驗使用LB培養基(Maniatisetal.，1982)。在LB培養基中和30℃保溫溫度下培養脫氮假單胞菌SC510Rifr、瘤病土壤桿菌C58C9(Cameronetal.，1989)、臭味假單胞菌KT2440(Bagdasarianetal.，1981)和苜蓿根瘤菌102F34(Leongetal.，1982)。按已述方法(Dittaetal.，1980)進行接合。將參予接合之各細菌的109個細胞經過濾吸附到0.45μm微孔濾膜上。在LB培養基上37℃保溫該濾膜後將細胞懸浮在1ml的10mMMgSO4中。然後再將細胞懸浮液的稀釋液塗布在添加了適當抗生素的LB培養基上。實施例1質粒pXL1635的構建本實施例舉例說明如何構建不能遷移的、具有高度分離穩定性的多宿主載體。實施例1.1得到丟失mob座位之pRK290的衍生物本實施例舉例說明如何使RK2的衍生物上缺失RK2的mob座位。鑑於不清楚在靠近mob座位處有何獨特的限制性位點，因而給缺失該座位帶來困難。在這種情況下，如果使用已描述過的核酸外切酶Bal31，則將有可能進行體外缺失(Maniatisetal.，1982)。為了進行上述缺失，須在RK2的mob座位引入一個獨特的限制性位點。為此，我們按照Taylor等人(1985)的技術，分下述三個步驟在一小片段上進行定位誘變首先將含有轉移原點(oriT)的RK2的片段再克隆到噬菌體M13的噬菌體衍生物中，進行定位誘變以便引入一個獨特的限制性位點;其次將如此突變的片段再克隆到質粒PUC13(VieraetMessing，1982)上，然後將攜帶卡那黴素抗性基因的暗盒克隆到存在於轉移原點內的限制性位點上;第三，經雙重重組將突變的片段與由pRK290攜帶的野生片段交換。所產生的質粒即是在轉移原點水平上具有獨特限制性位點的pRK290衍生物。這樣便有可能通過核酸外切酶，然後是DNA連接酶的作用經誘變完成缺失目的。有關構建細節如下文所述。將足以以cis得以遷移的RK2之760pbHeaⅡ片段(GuineyetYakobson，1982)克隆到M13mp10(VieraetMessing，1982)中。該片段含有RK2的轉移原點(GuineyetYakobson，1983)，並且當其克隆到質粒上時，可由RK2的tra功能提供以trans遷移的轉移原點。由對RK2的HaeⅡ消化開始純化該片段，並用T4噬菌體的DNA聚合酶消化末端。另外，經pstⅠ和SstⅠ消化使可複製形式的噬菌體M13mp10線性化;並用T4噬菌體的DNA聚合酶消化其末端。連接如此製得的複製形式並已純化的片段，然後用以轉化感受態大腸桿菌TG1的細胞。按已述方法(VieraetMessing，1982)檢測這些重組噬菌體。將所得到的複製形式定名為PXL1418(參見圖1)。也已公開了含有RK2轉移原點的112pb之HpaⅡ片段的序列(GuineyetYakobson，1983)。該片段包含於PXL1418之760pbHaeⅡ片段中。已觀察到它存在一個反向重複序列，且各重複序列均可形成有19pb的髮夾結構(參見圖2)。按照Taylor等人(1985)建立的方法，對由這一複製形式開始製得的一小的噬菌體DNA進行定位誘變。所用的寡核苷酸具有下示序列5′-CCCGTTGAGCTCCGCCAGGTGC-3′。圖2中列出了112pb之HpaⅡ片段及寡核苷酸的序列;如該圖所示，寡核苷酸序列與該片段的序列只有一個核苷酸不同;經這一突變而引入了SstⅠ位點。首先證實寡核苷酸與用複製形式之PXL1418感染大腸桿菌TG1所得到的單一小DNA片段完全互補。為此可使用所研究的寡核苷酸作為核苷酸序列的起始部分。已清楚地觀察到所發生的序列反應。已顯示出該核苷酸序列，並且前面的鹼基相當於圖2中上一列的右側端序列。按已述方法進行上述誘變。得到一個在所期望的位置上引入了適當SstⅠ位點的突變克隆。將其中一個複製形式的突變克隆定名為PXL1454(參見圖1)。下述步驟旨在將含有抗生素抗性基因的暗盒引入SstⅠ位點，以使其中存在供選擇的標誌。為此，用SstⅠ處理PXL1461使之線性化，然後與從PUC4KIXX(PharmaciaFrance，SA)純化的SstⅠ片段連接。該1.6Kb片段攜帶來自Tn5轉座子的卡那黴素抗性基因。在添加氨苄青黴素和卡那黴素的LB培養基上轉化之後，選擇重組體克隆。將如此得到的質粒定名為PXL1462(參見圖1)。將質粒PRK290轉化到大腸桿菌polA，SF800菌株(Stacheletal.，1985)中。由RK2衍生的質粒可在該菌株中複製，因為它們的複製並不依賴於大腸桿菌的DNA聚合酶;而PUC13則不能被複製。然後將PXL1462轉化到菌株SF800/PRK290中。轉化後，將細菌鋪敷在添加了四環素、卡那黴素和氨苄青黴素的LB培養基上。因為質粒PXL1462不能在該菌株中複製，所以要使該質粒具有這一抗性，只有在兩質粒之間進行同源重組。事實上，這兩種質粒共同具有攜帶轉移原點的760pbHaeⅡ片段。這樣，在兩質粒的同源區域間進行同源重組，便可導致兩複製子之間的融合。用限制性酶切法分析三種抗生素抗性克隆的質粒DNA。經瓊脂糖凝膠分析表明其只含有單一的質粒。經限制性酶切分析，表明就轉移原點水平來說，PXL1462與質粒PRK290重組很好。由兩複製子融合所得到的質粒具有兩個RK2的轉移原點一個是野生型的，一個則具有經誘變而引入的SstⅠ位點，以用於克隆攜帶卡那黴素抗性基因的暗盒(見圖3)。然後在添加四環素和卡那黴素的LB培養基中，用稀釋的培養物培養含有這類質粒的克隆。因切除攜帶轉移原點之760pb片段之野生拷貝的PUC13會發生簡單重組，從而可在沒有苄苄青黴素情況下選擇之。既然PUC13及其衍生質粒未被複製，已切除的質粒會立即丟失。在可以選擇PRK290和突變之複製原點標誌的液體培養基中，經代表60次傳代的一系列稀釋培養後，將細菌塗布在添加同樣抗生素的LB培養基上。將2000個菌落接種到相同培養基和添加氨苄青黴素的LB培養基上。得到2個對氨苄青黴素敏感的克隆。純化由這些克隆攜帶的質粒，進行限制性酶切分析。分析結果表明，這些質粒完全符合於切除了RK2轉移原點之野生拷貝及PUC13的質粒。該質粒被定名為PXL1561(見圖3)。既然該質粒具有兩個與轉移原點相應的HindⅢ位點，那麼就有可能在經HindⅢ消化後再用核酸外切酶切割以實現缺失(見圖3)。為此，先用HindⅢ消化pXL1561，再用Henikoff(1984)的技術進行一系列缺失;該技術中利用了核酸外切酶和核酸酶S1的連續作用;所得到的缺失是雙向的。然後連接這些缺失，並用連接產物轉化MC1060。用限制性酶切法分析如此得到之轉化體的質粒DNA。結果表明許多克隆經受了與mob座位相應的缺失。我們得到了缺失3.5Kb的質粒。如果核酸外切酶相對於HindⅢ位點以兩個方向相同的動力學消化質粒DNA，則該缺失應有相對於質粒轉移原點為1.75Kb的缺失。將如此得到的質粒定名為PXL1570(見圖3)。PXL1570具有獨特的限制性位點EcoRⅠ和BglⅡ。我們試圖在EcoRⅠ位點處引入克隆的多位點，以便使所得質粒包含多個克隆位點。使用具有以兩個EcoRⅠ位點為邊界之多克隆位點的質粒PFR10(Shapiraetal.，1983)作為多克隆位點的來源。同PXL1570一樣，用EcoRⅠ消化PFR10。連接兩消化產物，並將連接物轉化到大腸桿菌MC1060中。將所得到的已確定了多位點取向的重組克隆定名為PXL1594(參見圖4)。實施例1.2構建具有RK2之par座位的不可遷移的PRK290衍生物本實施例舉例說明如何將具有RP4之par座位的片段克隆到RK2衍生物上，以得到分離穩定的質粒。將含RP4之par座位的PGMA28(Gerlitzetal.，1988)的2.2KbBamHⅠ片段純化後，與用BglⅡ線性化的PXL1594相連接。用該連接物轉化大腸桿菌MC1060。經限制性消化分析24個轉化體的質粒DNA，以及3個攜帶2.2Kb片段的克隆。其中兩個具有相同定向的片段，第3個則相當於相反定向。與前兩個克隆相應的質粒命名為PXL1635，而有另一取向之片段者則定名為PXL1634(圖4)。如此得到的質粒是RK2，更準確地說是PRK290的衍生物，它缺失轉移原點周圍的3.5Kb，整合了RP4的par區域，且還可以具有克隆的多位點。對於對稱性克隆可依次利用下列位點EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、HindⅢ、ClaⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ和SstⅠ;對於非對稱性克隆應排除EcoRⅠ，但可使用其他的酶。實施例2PXL1635的遷移已研究過PXL1635的遷移。這種遷移是基於從大腸桿菌到大腸桿菌的接合轉移而達到的。按照Ditta等人已述及的技術，利用下列菌株進行三對間的轉移-攜帶遷移質粒的菌株HB101(PXL1635)或HB101(PRK290)或HB101(PXL1570)或HB101(PUC9tet)。-含有RK2衍生物遷移所需之「輔助」質粒的菌株。-受體菌株C600Rifr。質粒PUC9tet得自PharmaciaFranceS.A.;其為不能遷移的、PBR322衍生的質粒，並被賦予與PRK290、PXL1635和PXL1570相同的抗性。在添加四環素和利福平的LB培養基上選擇轉移接合體。按常規方法(Dittaetal.，1980)，根據有效地獲得質粒抗性之受體細胞數對受體細胞總數之比計算接合的頻率。用HB101作供體菌株進行接合。這涉及到recA菌株，它可避免了因具有同源序列而在PRK2013與PXL1570、PRK290、PXL1635和PUC9tet之間發生同源重組的可能性。表RK2的衍生物由大腸桿菌HB101向C600Rifr接合的頻率。試驗細節如正文所述。一無供體質粒。實施例3將PXL1635引入大腸桿菌以外的革蘭氏陰性菌中本實施例舉例說明如何將質粒PXL1635(非遷移性的)引入各種革蘭氏陰性菌中。既然質粒PXL1635不具有轉移原點，便不可能由大腸桿菌向其他革蘭氏陰性菌中遷移。為將PXL1635引入各種革蘭氏陰性細菌中，可使用經電穿孔轉化的方法(Wirthetal.，1989)。藉助這一方法用質粒PRK290、PXL1570和PXL1635轉化下列細菌-脫氮假單胞菌SC510Rifr-瘤病土壤桿菌C58C9-臭味假單胞菌KT2440-苜蓿根瘤菌102F34對每種細菌均再次分離重組克隆;純化質粒DNA表明與經過許多限制性消化的起始質粒沒有差異。據此可將質粒PXL1635引入革蘭氏陰性細菌中。實施例4PXL1635的穩定性本實施例舉例說明在革蘭氏陰性菌中為什麼PXL1635比PRK290更穩定。不同的重組體細菌及其親代菌株均培養於添加抗生素的LB培養基中。達到生長穩定期時進行1/1000稀釋。如此培養這些菌株達到平均50代(傳代數估計為50代，包括在40-60代之間)，然後將培養物稀釋液分散到LB瓊脂培養基上。對每份培養物，取200個獨立的克隆轉移到對質粒有選擇性的培養基上。計算失去抗性，因而也就是失去了質粒之克隆的頻率。所得數值列於下表中。表各種革蘭氏陰性細菌中PRK290、PXL1570和PXL1635的丟失頻率這些數值相應於在非選擇性的LB培養基中培養50代後，丟失質粒抗性之克隆的頻率(%)。由此表可以清楚地看出，PXL1635比PRK290和PXL1570穩定得多;這種特性對於所研究的所有細菌都是符合事實的。攜帶後兩種質粒的克隆均以同樣的頻率丟失質粒;從統計學上看所觀察到的差異性並不顯著。可見缺失3.5Kb並不影響PRK290的複製特性和穩定性。相反，克隆PGMA28的2.2Kb片段對於引起穩定性的增加卻是極為重要的。這些結果清楚地表明，從穩定性角度看，質粒PXL1635是一種比PRK290更為有利的質粒。其他的RK2衍生物同樣保留了這些優點。對於工業應用來說，按照已公開的材料，RK2之其他衍生物的優點要比PRK290少。圖1PXL1418、PXL1454、PXL1461和PXL1462的構建。有關構建細節如正文所述。圖2含有RK2之轉移原點的110bpHpaⅡ片段的序列(據GuineyetYakobson，1983)。標出了用於誘變之寡核苷酸的序列及所引入的SstⅠ位點。用箭頭著重標示了兩個應形成髮夾結構的反向重複序列。圖3PXL1561和PXL1570的構建。構建的細節如正文所述。圖4PXL1594、PXL1635和PXL1634的構建。所用術語的定義與縮寫重組DNA技術組合，它們或者在同一微生物中使微生物固有的DNA序列相結合，或者對特定DNA片段進行誘變。ATP腺苜-5′三磷酸BSA牛血清白蛋白CodonStop轉導終止密碼子dNTP2′-脫氧核苜5′-三磷酸DTT二硫蘇糖醇Kb千鹼基pb鹼基對參考文獻RéférencesbibliographiquesAusubelF.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.SeidmanandK.Struhl.1987.Currentprotocolsinmolecularbiology1987-1988.JohnWilleyandSons，NewYork.Bagdasarian，J.Frey，andK.Timmis.1981.Specific-purposeplasmidcloningvectors.Ⅱ.Broadhostrange，highcopynumber，RSF1010-derivedvectors，andahostvectorsystemforgenecloninginPseudomonas.Gene16，237-247.CameronB，K.Briggs，S.Pridmore，G.BrefortandJ.Crouzet，1989.CloningandanalysisofgenesinvolvedincoenzymeB12biosynthesisinPseudomonasdenitrificans.J.Bacteriol，171，547-557.Casadaban，M.J.，A.Martinez-Arias，S.T.ShapiraandJ.Chou.1983.β-galactosidasegenefusionforanalysinggeneexpressioninEscherichiacoliandYeast.MethodsEnzymol.100，293-308.Derbyshire，K.M.andN.S.Willets.1987.MobilizationofthenonconjugativeplasmidRSF1010ageneticanalysisofitsoriginoftransfer.Mol.Gen.Genet.，206，154-160.DittaG.，SchmidhauserT.，YakobsonE.，LuP.，LiangX.-W.，FinlayD.R.，GuineyD.，HelinskiD.R.，1985.PlasmidsrelatedtothebroadhostrangevectorpRK290，usefulforgenecloningandformonitoringgeneexpression.Plasmid，13，149-154.DittaG.，StanfieldS.，CorbinD.，HelinskiD.R.，1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteriaConstructionofagenebankofRhizobiummelitoti.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77，7347-7351.Gerlitz，M.，O.HrabakandH.Schwab.Abstract8thInternationalBiothechnologySymposium，1988，A156，p.129.Giles，J.W.1985.AdancesinautomatedDNAsynthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec.GuidelinesforresearchinvolvingrecombinantDNAmolecules;Notice.NationalInstituteofHealth，FederalRegister，Vol.51，No.88，16958-16965.Guiney，D.G.andE.Yakobson.1983.LocationandnucleotidesequenceofthetransferoriginofthebroadhostrangeplasmidRK2.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，3595-3598.HenikoffS.1984.UnidirectionaldigestionwithexonucleaseⅢcreatestargetedbreakpointsforDNAsequencing.Gene，28，351-359.Keen，N.T.，S.Tamaki，D.KobayashiandD.Trollinger.1988.ImprovedbroadhostrangeplasmidsforDNAcloningingram-negativebacteria.Gene，70，191-197.Kües，U.andU.Stahl.1989.Replicationofplasmidingram-negativebacteria.Mic.Rev.，53，4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