利用氧化還原反應的測定方法

2023-06-08 22:35:51

專利名稱：利用氧化還原反應的測定方法
技術領域：
本發明涉及利用氧化還原反應測定樣品中的測定對象物質的方法。
例如，血液中的糖基化蛋白質，特別是紅細胞中的糖基化血紅蛋白反映了生物體內血糖值的過去的情況，因此被作為糖尿病診斷、治療等的重要指標。這類紅細胞中的糖基化蛋白質可以如下所示利用上述氧化還原反應進行測定。
首先配製紅細胞溶血後的樣品，將該溶血樣品用果糖胺基酸氧化酶(以下稱為「FAOD」)進行處理，使之與糖基化蛋白質的糖基化部分作用而產生過氧化氫。該過氧化氫量對應於上述糖基化蛋白質的量。然後在該樣品中添加過氧化酶(以下稱為「POD」)以及還原劑，將上述POD作為催化劑使上述過氧化氫和上述還原劑發生氧化還原反應。此時，如果上述還原劑使用因氧化而發色的發色性底物，則通過對該發色進行測定，可以測定上述過氧化氫量，結果可得知紅細胞中的糖基化蛋白質的量。
但是，血液中通常存在抗壞血酸(AsA)、膽紅素等各種還原物質，紅細胞中還存在有穀胱甘肽(GSH)等各種還原物質。這些還原物質也會例如還原產生的上述過氧化氫，阻礙上述氧化還原反應，或再度還原因氧化而發色的上述發色性底物而褪色。因此，存在難以準確測定紅細胞中的糖基化蛋白質的量的問題。
另外由於每個樣品中所含的上述還原物質的濃度也不是一定的，因此也存在測定精度差的問題。
為了避免這些問題，提出了將各種氧化劑添加到上述樣品中的方法。例如，特開昭56-151358號公報中公開了用碘酸或高碘酸等滷素氧化物作為氧化劑的方法，特開昭57-13357號公報、特開昭57-161650號公報、特開昭59-193354號公報、特開昭62-169053號公報、特開平3-30697號公報中公開了用鈷、鐵、鈰等金屬絡合物作為氧化劑的方法。
因此，本發明的目的在於提供利用氧化還原反應測定樣品中的測定對象物質的方法，該方法可獲得可信性優異的測定值。
為了達到上述目的，本發明的測定方法利用氧化還原反應測定樣品中的測定對象物質，其特徵在於在上述氧化還原反應之前，在表面活性劑的存在下，向樣品中添加四唑鎓化合物以排除上述樣品中的還原物質的影響，之後通過氧化還原反應測定由上述測定對象物質產生的還原物質或氧化物質的量，由該測定值確定上述測定對象物質的量。上述四唑鎓化合物是指具有四唑環結構的化合物。另外，本發明中的「由測定對象物質產生的還原物質或氧化物質」是指測定對象物質本身或其中的氧化還原物質，或由測定對象物質利用氧化還原酶等產生的氧化還原物質雙方。
本發明者們發現上述傳統的方法雖然排除了上述GSH、AsA這樣的低分子量還原物質的影響，但並未排除蛋白質等高分子量還原物質的影響。而另一方面，如果用上述四唑鎓化合物進行處理，則不僅能排除上述低分子量還原物質，還可以排除上述高分子量還原物質，特別是血紅蛋白和血紅蛋白分解物(以下將兩者一併稱為「血紅蛋白」)作為還原物質的影響。關於上述內容，本申請人正另行申請專利(特開2000-210100號公報)。然而，由於該方法雖然排除了血紅蛋白等高分子量還原物質的影響，但還未能充分提高測定精度，或者希望進一步提高測定精度，本發明者們進行了更深入的研究。結果發現通過上述四唑鎓化合物的處理可以排除例如血紅蛋白等高分子量還原物質的影響，通過將上述兩者混合可以查明反應液中產生了渾濁，並且可以通過表面活性劑來防止該渾濁的發生，從而實現了本發明。根據本發明所述的測定方法，通過四唑鎓化合物排除還原物質的影響，並抑制由於上述四唑鎓化合物的處理而產生的渾濁，因此可以防止因還原物質以及渾濁雙方對測定的妨礙，可以進行更高精度的測定。因而本發明的測定方法適用於如上所述的臨床醫療等中的各種檢查，特別是如果適用於糖基化血紅蛋白的測定，則會提高作為糖尿病診斷等指標的可信性。
本發明的測定方法中，上述樣品是含有血紅蛋白以及血紅蛋白分解物的樣品，優選排除上述樣品中的血紅蛋白以及血紅蛋白分解物作為還原物質的影響。特別是可以排除樣品中的血紅蛋白作為還原物質的影響，並可排除因上述兩者引起的渾濁。因而可以說對後面所述的血液樣品是有用的測定。
本發明的測定方法中，向樣品中添加四唑鎓化合物之後，也可以再向產生了渾濁的混合液中添加表面活性劑，但從可抑制產生渾濁本身來講，優選將上述兩者同時添加，或向事先添加了表面活性劑的樣品中添加四唑鎓化合物。
本發明的測定方法中，根據上述氧化還原反應進行的測定優選對由上述反應產生的發色物質的吸光度進行測定。
進行上述吸光度測定時通常以雙波長測定為主要方式。上述雙波長測定是將表示待測定對象物質(例如發色性底物等發色物質)的最大吸收的波長作為主波長，對上述對象物質進行測定，再將與上述主波長不同的波長作為副波長，測定其電氣幹擾、樣品的濁度、光量的變化等，對上述主波長的測定值進行校正。因而，副波長是例如其他混在的物質不顯示吸收的波長，且優選將其設定為與主波長相差至少約80nm。因此，本發明者們進一步研究的結果發現在不存在表面活性劑的條件下用四唑鎓化合物處理Hb，則在約700-900nm，特別是約760nm-900nm的波長處可見這些反應物的吸收，雖然用該波長測定是困難的，但如果在表面活性劑存在的條件下進行四唑鎓化合物處理，則在上述波長未見吸收。因此，如果將上述發色物質的測定波長(主波長、副波長)設定在該約700nm-900nm的吸收波長處，則不僅可以防止上述渾濁，更可不受Hb的吸收的影響，高精度地進行吸光度的測定。
本發明的測定方法中，測定上述發色物質的吸光度的測定波長優選650-900nm，更優選650-800nm，特別優選690-760nm。另外，以上述波長為主波長時，副波長優選比上述主波長長，例如優選730-900nm，更優選800-900nm，特別優選800-850nm。
本發明的測定方法中，優選上述表面活性劑為選自非離子型表面活性劑、烷基硫酸鹽以及高分子化合物中的至少一種表面活性劑。
上述非離子型表面活性劑有例如聚氧乙烯醚、脫水山梨糖醇脂肪酸酯等，優選聚氧乙烯醚。
上述聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是指聚氧乙烯鏈和烴鏈以醚鍵連接，上述烴鏈有例如烷基、烷基苯基等。優選上述聚氧乙烯鏈的重均聚合度(N)為8-23，另一方的烴鏈中的碳原子數(L)為8-18；更優選上述重均聚合度(N)為8-15，烴鏈中的碳原子數(L)為8-16；特別優選上述重均聚合度(N)為8-10，烴鏈的碳原子數(L)為8-14。另外，上述烴鏈例如可以是直鏈，也可以有支鏈。上述聚氧乙烯醚的具體例子有例如聚氧乙烯-對-叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂基醚、聚乙二醇(9)月桂基醚等。
上述脫水山梨糖醇脂肪酸酯有例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基酯等。
上述烷基硫酸鹽有例如月桂基硫酸鈉、月桂基苯磺酸鈉、2，4-二甲基苯磺酸鈉等。
上述高分子化合物可以使用例如水溶性明膠、支鏈澱粉等生物高分子化合物，以及聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等合成高分子化合物。聚乙二醇的重均聚合度例如為100-30,000，優選600-6000。支鏈澱粉為多糖類，是指麥芽三糖殘基通過α1-6鍵連接的水溶性α-葡聚糖。
本發明的測定方法優選以0.05-5mmol/mL樣品的範圍添加上述表面活性劑，更優選0.1-3mmol/mL樣品的範圍，更加優選0.2-1.5mmol/mL樣品的範圍。另外，優選以0.2-15mol/mol四唑鎓化合物的範圍添加上述表面活性劑，更優選0.5-10mol/mol四唑鎓化合物的範圍，更加優選0.7-5mol/mol四唑鎓化合物的範圍。
優選本發明的測定方法中使用的上述四唑鎓化合物例如在四唑環的至少2個位置具有環結構取代基，更優選在3個位置具有環結構取代基。
如前所述，當上述四唑鎓化合物在上述四唑環的至少2個位置具有環結構取代基時，優選上述取代基位於上述四唑環的2位以及3位。另外，當上述四唑鎓化合物在3個位置具有環結構取代基時，優選上述取代基位於上述四唑環的2位、3位以及5位。
另外，至少2個環結構取代基的環結構優選苯環。另外，苯環以外的環結構取代基有例如環骨架中含有S或O，且為共振結構的取代基，例如噻吩基、噻唑基等。
上述四唑鎓化合物優選四唑環的至少3個位置有環結構取代基，上述環結構取代基中至少2個環結構取代基的環結構是苯環。
優選至少1個環結構取代基具有官能團，更優選上述官能團數目多。
上述官能團優選吸電子性的官能團，例如滷代基、醚基、酯基、羧基、醯基、亞硝基、硝基、羥基、磺基等。除此之外還包括例如氫過氧基、氧基、環氧基、環二氧基、氧代基等含氧的特性基，以及巰基、烷硫基、甲硫基甲基、硫代基、亞磺基、苯磺醯基、苯基磺醯基、對甲苯磺醯基、對甲苯基磺醯基、甲苯磺醯基、氨磺醯基、異硫氰酸酯基等含硫的特性基等。在這些吸電子性的官能團中，優選硝基、磺基、滷代基、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基。另外，除上述吸電子性的官能團之外，還包括例如苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不飽和烴基等。上述官能團也可以通過離解而離子化。
上述四唑鎓化合物在四唑環的2位及3位具有苯環，優選上述苯環中的至少一個具有選自滷代基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基以及乙氧基的至少一個官能團。也可以上述兩個苯環均具有上述官能團。上述苯環中，可以在任何位置(鄰-、間-、對-)具有上述官能團。另外，官能團的數量並無限定，可以具有相同的官能團，也可以具有不同的官能團。
上述四唑鎓化合物作為在上述四唑環的2位、3位以及5位具有苯環結構取代基的化合物，包括例如2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽、3，3′-(1，1′-聯苯-4，4′-基)-雙(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓鹽、3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-聯苯基)-4，4′-基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽]、2，3-二苯基-5-(4-氯代苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(對二苯基)四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-(對二苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(間-甲苯基)四唑鎓鹽以及2，5-二苯基-3-(對-甲苯基)四唑鎓鹽等。
另外，上述四唑鎓化合物並不限於上述化合物，除此之外還可以使用在上述四唑環的2個位置具有苯環結構取代基，以及在1個位置具有其他環結構取代基的化合物，例如2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓鹽、2-苯並噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲醯基)苯基]-2H-四唑鎓鹽、2，2′-二苯並噻唑基-5，5′-雙[4-二(2-磺基乙基)氨基甲醯基苯基]-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)二四唑鎓鹽以及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓鹽等。
另外，也可以使用在上述四唑環的2個位置具有苯環結構取代基，以及在1個位置具有不是環結構的取代基的四唑鎓化合物，包括例如2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓鹽等。
如前所述，上述四唑鎓化合物優選具有3個環結構取代基的化合物；更優選具有3個環結構為苯環的取代基，且含有較多吸電子性官能團的化合物；特別優選2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
這樣的四唑鎓化合物可以是鹽，也可以是離子化狀態等。另外，並不只限於一種，也可以兩種以上並用。
本發明的測定方法中，上述四唑鎓化合物的添加量並無特別限定，例如可以根據樣品的種類或上述樣品中含有的血紅蛋白、其他還原物質的量適當決定。具體地說，例如優選按0.001-100μmol/μL樣品的範圍添加上述四唑鎓化合物，更優選0.005-10μmol/μL樣品的範圍，特別優選0.01-1μmol/μL樣品的範圍。
本發明的測定方法中，上述樣品為全血的情況下，優選按0.001-10μmol/μL全血的範圍添加上述四唑鎓化合物，更優選0.005-5μmol/μL全血的範圍，特別優選0.01-2μmol/μL全血的範圍。全血的血細胞濃度通常可以推定為50％重量。具體地說，當上述四唑鎓化合物為2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽時，優選按0.02-10μmol/1μL全血的範圍添加，更優選0.05-3μmol/1μL全血的範圍，特別優選0.1-2μmol/1μL全血的範圍。
上述表面活性劑的添加量可以根據四唑鎓化合物的添加量調整，例如可以調整為如上所述的摩爾比。
本發明中，由如上所述的氧化還原反應產生的發色物質的吸光度測定，優選例如通過使用氧化還原酶的上述還原物質或氧化物質與發色性底物的氧化還原反應，對發色的上述發色性底物(即發色物質)的吸光度進行測定。
具體地說，優選由上述測定對象物質產生的氧化物質是過氧化氫，使用因氧化而發色的發色性底物作為上述發色性底物，使上述過氧化氫與上述發色性底物通過氧化還原酶進行氧化還原發應。
上述氧化還原酶並無特別限定，優選例如POD；由於上述因氧化而發色的發色性底物能夠高靈敏度檢出，優選例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。
本發明的測定方法中，上述測定樣品並無特別限定，除全血、血漿、血清、血細胞等血液樣品外，也包括例如尿、腦脊液、唾液等生物樣品以及果汁等的飲料、醬油、調味汁等食品類等。另外，測定血細胞內成分時，例如可以將全血溶血後作為樣品，也可以從全血中分離紅細胞，將上述紅細胞溶血後作為樣品。
本發明的測定方法中，上述測定對象物質只要利用上述氧化還原反應即可，並無特別限定，例如全血中成分、紅細胞內成分、血漿中成分、血清中成分等，優選紅細胞內成分。具體地說例如糖基化血紅蛋白或糖基化白蛋白等糖基化蛋白質、糖基化肽、糖基化胺基酸、葡萄糖、尿酸、膽固醇、肌酸酐、肌氨酸、甘油等；更優選糖基化蛋白質；特別優選糖基化血紅蛋白。
本發明的測定方法中，測定對象物質是糖基化蛋白質時，優選將上述糖基化蛋白質的糖基化部分用FAOD進行氧化分解而生成過氧化氫。另外，測定對象物質是上述糖基化肽、糖基化胺基酸時，也同樣優選用FAOD進行作用。根據需要，優選在上述FAOD處理之前用蛋白酶處理上述糖基化蛋白質或糖基化肽。
上述FAOD優選是催化下式(1)所示反應的FAOD。…(1)上式(1)中，R1表示羥基或來源於糖基化反應前的糖的殘基(糖殘基)。當反應前的糖為醛糖時，上述糖殘基(R1)是醛糖殘基；當反應前的糖為酮糖時，上述糖殘基(R1)是酮糖殘基。例如反應前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多利重排使反應後的結構為果糖結構，此時糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)可以用例如-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n為0-6的整數。
上式(1)中，R2並無特別限定，例如是糖基化胺基酸、糖基化肽或糖基化蛋白質時，其中α-氨基被糖基化的情況與α-氨基之外的氨基被糖基化的情況不同。
上式(1)中，當α-氨基被糖基化時，R2是下式(2)所示胺基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4…(2)上式(2)中，R3表示胺基酸側鏈基。另外，R4表示羥基、胺基酸殘基或肽殘基，例如可用下式(3)表示。下式(3)中，n是至少為0的整數，R3與前述相同，表示胺基酸側鏈基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(3)另外，上式(1)中，當α-氨基以外的氨基被糖基化(胺基酸側鏈基被糖基化)時，R2可用下式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7…(4)上式(4)中，R5表示胺基酸側鏈基中被糖基化的氨基以外的部分。例如被糖基化的胺基酸是賴氨酸時，R5是-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如被糖基化的胺基酸是精氨酸時，R5是-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
另外，上式(4)中，R6是氫、胺基酸殘基或肽殘基，例如可用下式(5)表示。下式(5)中，n是至少為0的整數，R3與前述相同，表示胺基酸側鏈基。
-(CO-CHR3-NH)n-H …(5)另外，上式(4)中，R7是羥基、胺基酸殘基或肽殘基，例如可以用下式(6)表示。下式(6)中，n是至少為0的整數，R3與前述相同，表示胺基酸側鏈基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)
圖2表示在本發明測定方法的上述實施例中，在Tween20存在下使溶血樣品與WST-3反應時吸光度隨時間變化的圖。
圖3表示在本發明測定方法的上述實施例中，在聚氧乙烯二醇月桂基醚存在下使溶血樣品與WST-3反應時吸光度隨時間變化的圖。
圖4表示在比較例中，在未添加表面活性劑的條件下使溶血樣品與WST-3反應時吸光度隨時間變化的圖。
首先，使全血溶血，或將用離心分離等常用方法從全血中分離出的血細胞部分溶血，配製溶血樣品。該溶血方法並無特別限定，可以使用例如使用表面活性劑的方法、超聲波法、利用滲透壓差的方法等。其中優選上述使用表面活性劑的方法。
溶血用的表面活性劑並無特別限定，但從操作簡便性考慮，優選使用與後述的通過四唑鎓化合物進行前處理時相同的表面活性劑。上述溶血處理的條件，通常在處理溶液中的血細胞濃度為1-10％體積的情況下添加上述表面活性劑，使上述處理溶液中的濃度為0.01-5％重量，在室溫下攪拌數秒(約5秒)-10分鐘即可。
接下來，在表面活性劑存在的條件下向上述溶血樣品中添加具有上述四唑環結構的四唑鎓化合物，進行上述溶血樣品的前處理。
上述表面活性劑可以使用如前所述的表面活性劑。具體地說，可以使用例如市售的Triton系表面活性劑聚氧乙烯-對-叔辛基苯基醚；市售的Tween系表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯；市售的Brij系表面活性劑聚氧乙烯烷基醚等。除此之外也可以使用例如聚氧乙烯(10)月桂基醚、商品名為Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N為9和光純藥工業社製造)等的聚氧乙烯(9)月桂基醚、商品名為Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N約為10.5ナカライテスク社製造)以及商品名為Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N為20ナカライテスク社製造)的聚氧乙烯辛基苯基醚等。
上述表面活性劑的添加比例如前所述。具體地說，前處理溶液中的血細胞濃度為1-10％體積時，表面活性劑濃度為2-150mmol/L，優選5-100mmol/L，特別優選10-50mmol/L。上述溶血樣品的配製(溶血處理步驟)中，當使用與該前處理相同的表面活性劑時，也可以事先在上述溶血處理步驟添加上述表面活性劑，以達到前處理所需濃度。另外，還可以將四唑鎓化合物以及上述表面活性劑共同添加到溶血處理前的樣品中，使溶血處理與前處理同時進行。
上述四唑鎓化合物可以使用上述的物質，例如前處理溶液中的血細胞濃度為1-10％體積時，優選以達到濃度0.02-2000mmol/L，更優選0.1-1000mmol/L，特別優選0.4-200mmol/L的比例進行添加。具體地說，上述四唑鎓化合物為2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽時，優選以達到濃度0.02-80mmol/L，更優選0.1-20mmol/L，特別優選0.2-15mmol/L的比例進行添加。
上述四唑鎓化合物可以化合物本身的形態使用，但從操作的簡便性及處理效率等角度來看，優選使用溶解在溶劑中的四唑鎓化合物溶液。上述溶液濃度可以根據四唑鎓化合物的種類(例如分子量等)適當決定，例如可以是0.01-120mmol/L，優選0.1-50mmol/L，更優選0.2-20mmol/L。上述溶劑可以使用例如蒸餾水、生理鹽水、緩衝液等，上述緩衝液可以使用例如後面所述的緩衝液等。
該前處理通常在緩衝液中進行。上述緩衝液可以使用例如胺類緩衝液、磷酸緩衝液、硼酸緩衝液以及CHES、CAPS和CAPSO等優質(グツド)緩衝液等，優選胺類緩衝液及CHES緩衝液。上述胺類緩衝液的緩衝劑包括例如甘氨酸、乙胺、二乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三羥基氨基甲烷、三乙醇胺、甘氨醯胺等，優選甘氨酸、甘氨醯胺、三乙醇胺。
上述緩衝液的pH值優選pH7-12，更優選pH8-11，特別優選pH8-10。
該前處理條件並無特別限定，但通常溫度在10℃-37℃，處理時間在10秒-60分鐘。
下面，對該前處理完畢的溶血樣品進行蛋白酶處理。這是為了使後面的處理中使用的FAOD容易作用於測定對象物質的糖基化部分。
上述蛋白酶可以使用例如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶等，具體地說，可以使用金屬蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶、胃蛋白酶等。
在糖基化蛋白質為糖基化血紅蛋白的情況下，優選選擇性地分解上述糖基化Hb的菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源於豬胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源於枯草芽孢桿菌(Bacillus subillis)的蛋白酶等，更優選金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，特別優選金屬蛋白酶。如果這樣使用選擇性分解的蛋白酶，則可以選擇性地配製糖基化Hb分解物，由於其它糖基化蛋白質難於被分解，因而可以進一步提高測定精度。上述來源於枯草芽孢桿菌的蛋白酶包括商品名プロテア一ゼN(例如フルカ社製造)、商品名プロテア一ゼN「アマノ」(天野製藥社製造)等。上述金屬蛋白酶包括來源於芽孢桿菌屬(Bacillus)的金屬蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如東洋紡社製造的商品名トヨチ-ム)等。
蛋白酶處理的條件根據例如所用蛋白酶的種類、作為測定對象物質的糖基化蛋白質的種類及其濃度等適當決定。
具體地說，例如用蛋白酶K作為上述蛋白酶對上述前處理完畢的溶血樣品進行處理時，通常反應液中的蛋白酶濃度為10-30,000mg/L(1KU/L-250MU/L)，反應液中的血細胞濃度為0.05-15％體積，反應溫度為15-37℃，反應時間為1分鐘-24小時，pH值在6-12範圍內。該蛋白酶處理通常在緩衝液中進行。上述緩衝液可以使用例如與上述前處理相同的緩衝液。
另外，例如用金屬蛋白酶作為上述蛋白酶對上述前處理完畢的溶血樣品進行處理時，通常反應液中的蛋白酶濃度為0.02g-6g/L(40KU/L-40MU/L)，反應液中的血細胞濃度為0.05-15％體積，反應溫度為15-37℃，反應時間為1分鐘-24小時，pH值在6-12範圍內。
下面，將由上述蛋白酶處理獲得的分解物用上述FAOD進行處理。通過該FAOD處理來催化上式(1)所示反應。
該FAOD處理優選與上述蛋白酶處理同樣在緩衝液中進行。該處理條件根據所用FAOD的種類、作為測定對象物質的糖基化蛋白質的種類及其濃度等適當決定。
具體地說，反應液中的FAOD濃度為50-50,000U/L，反應液中的血細胞濃度為0.01-1％體積，反應溫度為15-37℃，反應時間為1-60分鐘，pH值在6-9範圍內。上述緩衝液的種類也無特別限定，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩衝液。
下面，使用氧化還原酶以及上述因氧化而發色的發色性底物通過氧化還原反應測定由上述FAOD處理生成的過氧化氫。
上述氧化還原酶可以使用例如POD等。
上述發色性底物包括例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)聯苯胺鈉、鄰對苯二胺(OPD)、トリンダ一試劑和4-氨基安替比林組合而成的底物等。上述トリンダ一試劑包括例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯並噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯並噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在這些發色底物中，如前所述，特別優選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。
上述氧化還原反應通常在緩衝液中進行，其條件根據上述生成的過氧化氫的濃度等適當決定。通常，反應液中的氧化還原酶濃度為10-100,000IU/L，發色性底物濃度為0.005-30mmol/l，反應溫度為15-37℃，反應時間為6秒-30分鐘，pH值為5-9。另外，上述緩衝液並無特別限定，可以使用例如與上述蛋白酶處理及FAOD處理等相同的緩衝液等。
上述氧化還原反應中，例如使用上述發色性底物時，可以通過用分光光度計測定上述反應液的發色程度(吸光度)來測定過氧化氫的量。然後可以用該過氧化氫濃度與校準曲線等求出樣品中的糖基化蛋白質的量。
另外，除上述使用POD等的酶法外，也可以通過例如電氣方法測定上述過氧化氫量。
該測定方法中，如前所述，由上述四唑鎓化合物進行的前處理步驟只要在實際發生氧化還原反應之前，則並無特別限定，但由於上述FAOD處理後產生過氧化氫，優選在上述FAOD處理前進行。另外，各處理步驟可如前所述分別進行，也可按如下所示的組合同時進行。
1溶血處理+前處理2溶血處理+前處理+蛋白酶處理3蛋白酶處理+FAOD處理4FAOD處理+發色反應5蛋白酶處理+FAOD處理+發色反應另外，四唑鎓化合物與表面活性劑的添加順序、上述FAOD、氧化還原酶以及發色性底物的添加順序也無特別限定。
採用這樣的方法，通過使四唑鎓化合物與上述樣品接觸，不僅GSH、AsA、二硫蘇糖醇、半胱氨酸、N-乙醯半胱氨酸等低分子量還原物質，特別是還可以充分排除血紅蛋白以及血紅蛋白分解物作為還原物質的影響。同時可以防止因四唑鎓化合物和血紅蛋白混在而產生的渾濁。因此可以不對上述吸光度測定產生任何影響，高精度地進行測定。
另外，在採用上述四唑鎓化合物進行的前處理步驟中，還可以與例如上述四唑鎓化合物以外的氧化劑並用。上述氧化劑可以使用例如碘乙酸鈉、碘酸、高碘酸等滷素氧化物、EDTA-Fe、抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等。這些氧化劑的添加量為0.001-0.1mg/μL樣品。
本發明的測定方法中，測定對象物質只要利用氧化還原反應即可，並無特別限定，除上述糖基化蛋白質之外，如前所述，還包括糖基化肽、糖基化胺基酸、葡萄糖、膽固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸、甘油等。
通過產生過氧化氫對上述各測定對象物質的量進行測定時，可以分別將葡糖氧化酶作用於上述葡萄糖、將膽固醇氧化酶作用於上述膽固醇、將尿酸酶作用於上述尿酸、將肌氨酸氧化酶作用於上述肌酸酐、將肌氨酸氧化酶作用於上述肌氨酸、將甘油氧化酶作用於上述甘油，產生過氧化氫。該過氧化氫量的測定方法可以與上述同樣進行。另外，糖基化肽、糖基化胺基酸也可與上述糖基化蛋白質的測定同樣進行測定。
另外，用上述四唑鎓化合物對樣品中的血紅蛋白以及血紅蛋白分解物處理後，由測定對象物質產生還原物質，通過氧化還原反應對該還原物質的量進行測定，由該測定值確定上述測定對象物質的量時，可以如下所示進行測定。
例如，上述測定對象物質為葡萄糖時，在例如NAD+或NADP+等存在下，用葡糖脫氫酶產生NADH或NADPH等還原物質。然後使用例如心肌黃酶和因還原而發色的底物，通過氧化還原反應測定由上述測定對象物質產生的還原物質NADH或NADPH。然後，如前所述，可以用由該測定對象物質產生的還原物質的濃度和校準曲線等求出樣品中測定對象物質的量。另外，例如測定對象物質為膽固醇時，可以使用膽固醇脫氫酶；為肌氨酸時，可以使用肌氨酸脫氫酶。
上述因還原而發色的底物並無特別限定，也可使用例如為了排除上述樣品中的血紅蛋白以及血紅蛋白分解物的影響而添加的發色性四唑鎓化合物。另外，根據各測定波長，也可以使用與上述樣品的前處理中所用四唑鎓化合物種類不同的發色性四唑鎓化合物。除上述發色性四唑鎓化合物之外，也可以使用例如2，6-二氯苯酚靛酚等。為了獲得可信性更為優異的測定值，優選例如在對由上述測定對象物質產生的還原物質進行測定之前事先測定吸光度。
(實施例)下面，結合比較例對實施例進行說明。
(實施例1)該實施例是在各種表面活性劑存在下，將血細胞樣品用四唑鎓化合物進行前處理，檢查有無渾濁。以下表示使用的樣品、試劑以及方法。
(樣品的配製)採集健康者的全血，通過離心分離(1500G(3000rpm)、3分鐘)回收血細胞，向該血細胞中添加31倍體積的精製水，進行稀釋及溶血，將該物質作為測定樣品。
(表面活性劑溶液)將下表1中所示各種表面活性劑溶解於精製水，分別配製2.4％重量的表面活性劑溶液。
下表1中所示表面活性劑中，商品名TritonX-100、商品名Brij35、商品名Nikkol BL-9EX以及2，4-二甲基苯磺酸鈉為和光純藥工業社製造，商品名TritonX-114、商品名TritonN-101、商品名Tween20、商品名Tergitol NPX、商品名Tergitol NP-40、聚乙二醇月桂醚、月桂基苯磺酸鈉、商品名PEG1000以及商品名PEG6000為ナカライテスク社製造，商品名Brij58、商品名Brij98以及商品名Arlasolve 200為SIGMA社製造，商品名プルランPI-20為林原研究所社製造。
(緩衝液)CHES緩衝液(pH9.0)0.2mol/L(WST-3溶液以下相同)將下述化學式(7)表示的2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓單鈉鹽(商品名WST-3、同仁化學研究所社製造)溶解於精製水中，配製濃度為1.66mmol/L的溶液。 (渾濁的確認方法)將345μL測定樣品、150μL表面活性劑溶液、300μL緩衝液以及900μL WST-3溶液混合，在37℃下保溫5分鐘後目視確認該混合溶液的渾濁，按照下述評價標準進行評價。另外，除添加精製水代替表面活性劑之外，將按相同方法配製的混合溶液作為比較例同樣進行評價。結果表示在下表1。
(渾濁的評價)○未產生渾濁×產生了渾濁
(表1)表面活性劑 渾濁評價(比較例1)未添加表面活性劑 ×(實施例1)TritonX-100○TritonX-114○TritonN-101○Tween 20 ○Brij 35○Brij 58○Brij 98○Tergitol NPX ○Tergitol NP-40 ○Arlasolve 200 ○聚乙二醇月桂醚 ○脫氧膽酸 ○Nikkol BL-9EX ○月桂基硫酸鈉 ○月桂基苯磺酸鈉 ○2，4-二甲基苯磺酸鈉○プルランPI-20 ○PEG 1000 ○PEG 6000 ○如上表1所示，在表面活性劑存在下用WST-3處理，可以防止渾濁的發生。
(實施例2、比較例2)該實施例改變表面活性劑的添加量，進行四唑鎓化合物處理。以下表示使用的樣品、試劑以及方法等。
(測定樣品的配製)與上述實施例1相同，向回收的血細胞(血紅蛋白濃度約為300g/L)中添加22倍體積的精製水，進行稀釋及溶血，配製測定樣品(血紅蛋白濃度約為13.6g/L)。
(表面活性劑溶液)與實施例1相同，將表面活性劑分別溶解於0.2mol/L CHES緩衝液(pH9.0)，配製規定濃度(1.0％重量和2.4％重量)的表面活性劑溶液。
將上述測定樣品用精製水稀釋2倍後的稀釋液25μL、15μL表面活性劑溶液以及45μL WST-3溶液混合，在37℃下保溫3分鐘。混合液中表面活性劑的最終濃度是0.176％重量和0.424％重量。保溫後，在波長884nm下測定上述混合液的吸光度，並與上述實施例1同樣進行渾濁的評價。另外，作為比較例2，在未添加表面活性劑的條件下，與上述同樣進行吸光度測定以及渾濁評價。該結果表示在下表2中。
(表2)最終濃度0.176％重量 0.424％重量表面活性劑 (吸光度)(吸光度) 渾濁評價(比較例2)未添加表面活性劑 0.075×(實施例2)TritonX-100 0.007 0.007 ○TritonN-101 0.018 0.013 ○Tween 20 0.035 0.032 ○Brij 35 0.017 0.012 ○Brij 58 0.009 0.011 ○Brij 98 0.009 0.011 ○Tergitol NPX 0.008 0.007 ○Tergitol NP-40 0.007 0.007 ○Arlasolve 2000.008 0.008 ○聚乙二醇月桂醚 0.007 0.007 ○Nikkol BL-9EX0.015 0.011 ○月桂基硫酸鈉 0.011 0.017 ○月桂基苯磺酸鈉 0.011 0.017 ○2，4-二甲基苯磺酸鈉 0.012 0.012 ○プルラPI-20 0.007 0.008 ○PEG 1000 0.008 0.009 ○PEG 6000 0.007 0.008 ○另外，對於分別使用了TritonX-100、Tween20以及聚氧乙烯二醇月桂醚的實施例，在

圖1-圖3表示測定其在884nm、845nm以及805nm下的吸光度隨時間變化的情況。圖1表示TritonX-100隨時間變化的情況，圖2表示Tween20隨時間變化的情況，圖3表示聚氧乙烯二醇月桂醚隨時間變化的情況。未添加表面活性劑條件下隨時間變化的情況作為比較例在圖4表示。
如上表2所示，如果在表面活性劑存在下進行WST-3處理，則不會產生渾濁，另外與未添加表面活性劑的情況相比吸光度保持較低。另外還可以看出由圖4比較例隨時間變化的圖可見吸光度顯著增加，而添加了表面活性劑的圖1-圖3實施例隨時間變化的圖中吸光度充分減少，排除了渾濁的影響。
(實施例3、比較例3)該實施例是在表面活性劑存在下，將添加了糖基化胺基酸的溶血樣品進行WST-3處理，對上述糖基化胺基酸進行測定。
(氧化還原試劑)POD(東洋紡社製造) 132KU/LFAOD(旭化成社製造) 44KU/L商品名DA-64(和光純藥工業社製造)0.088mmol/L磷酸鉀緩衝液(pH8.0)0.2mol/L(糖基化纈氨酸溶液的配製)根據以往已知的方法配製糖基化纈氨酸(以下稱「FV」)，將其溶解於精製水中，配製成糖基化纈氨酸溶液。
(表面活性劑溶液)將商品名TritonX-100、商品名Nikkol BL-9EX以及商品名Tween20分別溶解於0.2mol/L CHES緩衝液(pH9.0)中，配製規定濃度(1.0％重量和2.4％重量)的表面活性劑溶液。
(樣品的配製)與實施例1同樣，向回收的血細胞中添加上述FV溶液使溶液體積達到22倍，進行稀釋及溶血，以此作為樣品。配製Hb濃度及FV濃度不同的下述4種(a-d)樣品。
FV濃度(μmol/L) Hb濃度(g/L)樣品a9 6.8樣品b9 13.6樣品c36 6.8樣品d36 13.6(測定方法)在12.5μL上述樣品中加入12.5μL精製水，再添加15μL表面活性劑溶液，之後添加45μL上述WST-3溶液，在37℃下保溫3分鐘。向該混合液中添加25μL上述氧化還原反應試劑，反應1分鐘，測定反應後的吸光度(主波長751nm和884nm)。該反應液中表面活性劑的最終濃度是0.114％重量和0.273％重量。另外作為比較例3，用上述CHES緩衝液代替表面活性劑，同樣進行吸光度測定。結果表示在下表3中。
在下表3中，表面活性劑的濃度單位表示為％重量。另外，表中括號內的數值(％)表示樣品b及d(Hb濃度13.6g/L)的吸光度分別除以樣品a及c(Hb濃度6.8g/L)的吸光度的值(b/a、d/c)的百分率(％)，得到接近100％的優異的測定精度。即，由於樣品中的FV量是一定的，即使Hb的量為二倍，依賴於FV的吸光度(發色量)仍是同樣程度，如果接近100％，則可以說充分防止了渾濁的產生，可以高精度地測定FV。
(表3)實施例3比較例3樣品 FV HbTritonX-100 NikkolBL-9EXμmol/L μmol/L 0.114％ 0.273％0.114％ 0.273％波長751nma9 6.8 0.066 0.063 0.0620.0580.069b9 13.6 0.057 0.058 0.0550.0510.074c366.8 0.202 0.184 0.2010.2010.192d3613.6 0.189 0.182 0.1850.1850.179波長884nma9 6.8 0.004 0.004 0.0040.0040.019b9 13.6 0.008 0.006 0.0070.0070.040c366.8 0.006 0.006 0.0060.0060.020d3613.6 0.009 0.008 0.0080.0080.044波長751-884nma9 6.8 0.062 0.058 0.0580.0540.050b9 13.6 0.049 0.052 0.0480.0450.034(79％) (89％) (82％) (83％) (68％)c366.8 0.197 0.179 0.1950.1950.172d3613.6 0.180 0.174 0.1760.1770.135(92％) (97％) (90％) (91％) (78％)如上表3所示，在表面活性劑存在下進行了WST-3處理的實施例3中防止了渾濁的發生，特別是在884nm下Hb的吸收降低。由此可知與表面活性劑不存在的比較例3相比，括號內的值(％)高，可以高精度進行測定。
產業上的可利用性如上所述，本發明的測定方法在表面活性劑的存在下，通過將上述四唑鎓化合物添加到樣品中，可以排除樣品中還原物質的影響，並且可以防止因四唑鎓化合物與血紅蛋白等還原物質的混在而產生的渾濁，因此可以進行可信性優異的測定。從而，本發明的測定方法可以適用於例如臨床醫療中的各種分析，特別是適用於糖尿病診斷中重要的紅細胞中糖基化血紅蛋白等糖基化蛋白質的測定。
權利要求
1.一種利用氧化還原反應測定樣品中的測定對象物質的測定方法，該方法是在所述氧化還原反應之前，在表面活性劑的存在下，將四唑鎓化合物添加到樣品中，以排除所述樣品中的還原物質的影響，然後通過氧化還原反應測定由所述測定對象物質產生的還原物質或氧化物質的量，由該測定值確定所述測定對象物質的量。
2.權利要求1的測定方法，其中所述樣品含有血紅蛋白以及血紅蛋白分解物，排除了所述樣品中的血紅蛋白以及血紅蛋白分解物作為還原物質的影響。
3.權利要求1的測定方法，其中所述通過氧化還原反應進行的測定是對所述反應產生的發色物質的吸光度進行測定。
4.權利要求3的測定方法，其中所述發色物質是通過使用氧化還原酶，使還原物質或氧化物質與發色性底物發生氧化還原反應而發色的發色性底物。
5.權利要求3的測定方法，其中所述吸光度測定中的測定波長在650-900nm範圍內。
6.權利要求3的測定方法，其中所述吸光度測定中的主波長在650-800nm範圍內，副波長比所述主波長長且在730-900nm範圍內。
7.權利要求1的測定方法，其中所述表面活性劑為選自非離子型表面活性劑、烷基硫酸鹽以及高分子化合物的至少一種表面活性劑。
8.權利要求7的測定方法，其中所述非離子型表面活性劑是聚氧乙烯鏈和烴鏈以醚鍵連接的聚氧乙烯醚。
9.權利要求8的測定方法，其中所述聚氧乙烯鏈的重均聚合度為8-23，烴鏈中碳原子數為8-18。
10.權利要求8的測定方法，其中所述烴鏈包括烷基以及烷基苯基的至少一方。
11.權利要求8的測定方法，其中所述烴鏈具有支鏈。
12.權利要求7的測定方法，其中所述高分子化合物是選自水溶性明膠、支鏈澱粉、聚乙二醇以及聚乙烯基吡咯烷酮的至少一種化合物。
13.權利要求1的測定方法，其中所述表面活性劑以0.05-5mol/mL樣品的範圍添加。
14.權利要求1的測定方法，其中所述表面活性劑以0.2-15mol/mol四唑鎓化合物的範圍添加。
15.權利要求1的測定方法，其中所述四唑鎓化合物在四唑環的2位及3位帶有苯環，所述苯環中至少一方具有選自滷代基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基以及乙氧基的至少一個官能團。
16.權利要求1的測定方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
17.權利要求3的測定方法，其中所述由測定對象物質產生的氧化物質是過氧化氫，使用因氧化而發色的發色性底物，使所述過氧化氫與所述發色性底物通過氧化還原酶發生氧化還原反應。
18.權利要求1的測定方法，其中所述測定樣品含有血細胞。
19.權利要求1的測定方法，其中所述測定對象物質是糖基化蛋白質。
20.權利要求1的測定方法，其中所述測定對象物質是糖基化血紅蛋白。
全文摘要
本發明提供利用氧化還原反應測定樣品中的測定對象物質的方法，該方法可得到可信性優異的測定值。在所述氧化還原反應之前，在表面活性劑存在下，向樣品中添加四唑鎓化合物，以排除所述樣品中含有的血紅蛋白以及血紅蛋白分解物作為還原物質的影響，然後由所述測定對象物質產生還原物質或氧化物質，通過氧化還原反應測定該量，由該測定值確定所述測定對象物質的量。本方法可以防止因表面活性劑與血紅蛋白混在而產生的渾濁，因此如圖1所示，可以抑制因渾濁而導致的吸光度上升。所述表面活性劑可以使用聚氧乙烯醚等。
文檔編號G01N33/53GK1466683SQ01816377
公開日2004年1月7日 申請日期2001年9月27日 優先權日2000年9月28日
發明者平井香, 小林胤樹, 樹 申請人:愛科來株式會社