具有協同提高的賴氨酸含量的玉米種子的製作方法

2023-06-09 03:02:06

專利名稱：：具有協同提高的賴氨酸含量的玉米種子的製作方法
技術領域：
：這裡所公開的是具有提高的胺基酸水平，特別是賴氨酸水平的轉基因玉米的種子，用於基因抑制的重組DNA構建體，製備和使用這種構建體的方法，以及表達這種構建體的轉基因生物體，包括植物。
背景技術：
：玉米(Zea顧")，通常稱作玉米(maize)或玉米(corn),是作為人類食物和作為動物祠料都很重要的穀物。由於其蛋白質組成，玉米種子或穀粒天然地賴氨酸含量低。大多數玉米種子蛋白質是玉米醇溶蛋白或谷醇溶蛋白，發現其位於胚乳中並且佔總的種子蛋白質的一半以上。玉米醇溶蛋白或谷醇溶蛋白富含脯氨酸、甘氨酸和穀氨醯胺，但是幾乎完全缺乏必需胺基酸，賴氨酸和色氨酸。由於玉米醇溶蛋白相對豐富，因此淡化了其它種子蛋白質的賴氨酸和色氨酸的貢獻。常常向動物飼料中添加外源性賴氨酸作為必需補充物。因而增加玉米種子中的賴氨酸水平很重要。可通過多種遺傳技術操縱轉基因植物中的胺基酸水平，包括，但不限於，轉基因植物中的內源基因表達的修飾和/或外源重組DNA表達。美國專利申請公開2004/0126845中公開了使用轉基因構建體調整減少和增加一個以上基因的基因表達。美國專利申請No.11/057,062中公開了可用於產生在轉基因生物體中用於基因抑制的反義方向RNA的方法和重組DNA構建體。美國臨時專利申請No.60/638,256公開了用於抑制真核生物細胞中至少一個基因的DNA盒，這種DNA盒包括有效連於可轉錄DNA的啟動子，其中可轉錄DNA包含至少一個內含子、多聚腺苦酸化信號和多聚腺苷酸化位點，其中在內含子中包含異源DNA,其來源於至少一個定向抑制的基因並且其可轉錄成能抑制至少一個基因的RNA。所有這些所引用的專利申請和出版物在此以其整體引入作為參考。發明概述本發明公開了一種轉基因玉米植物，其中在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA，由此轉基因DNA的表達導致協同增加轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。在本方面的一個方面，用於減少玉未醇溶蛋白的序列包括用於至少一個玉米醇溶蛋白合成基因的基因抑制的序列。在本發明的另一個方面，用於賴氨酸生物合成的序列包括外源性賴氨酸合成基因。在本發明的另一個方面，用於賴氨酸生物合成的序列包括用於轉基因玉米植物內源性賴氨酸分解代謝酶的基因抑制的序列。本發明公開並要求初級轉化的轉基因植物和它們的轉基因後代。本發明也提供用於提供具有協同增加的賴氨酸含量的玉米種子的方法，包括(a)提供一種轉基因玉米植物，其中在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA，(b)在轉基因玉米植物的種子中表達轉基因DNA,該表達導致協同增加種子的賴氨酸含量，和(c)收穫具有協同增加的賴氨酸含量的種子。本發明方法的實施方案包括提供通過轉化獲得的轉基因玉米植物，以及提供通過遺傳雜交技術獲得的轉基因玉米植物。在下列詳細描述中公開了本發明的其它具體實施方案。附圖簡述圖la描述了第一親本轉基因玉米植物PQO15/PQ15.0001和PQ071/PQ71.0014的種子的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜分析，序列，並i其與具有與第一轉^因玉米植物基本上"相似的基:型，但是缺乏用於減少玉米醇溶蛋白的序列的野生型玉米品種90DJD28/91INH2.0002相比，顯示19kDoc-玉米醇溶蛋白減少。見實施例1。X軸表示m/z(質量與電荷)比。Y軸表示強度百分率。質譜通過標準蛋白質峰，[CA十H廣(碳酸酐酶)進行標準化，接近29,000附厶。認為[CA+Hf+和15kDP-玉米醇溶蛋白之間的15,615Da峰是碳酸肝酶的汙染物。圖lb描述了與野生型玉米品種90DJD28/91INH2和90DJD28/91INH2.0002相比，第一親本轉基因玉米植物PQ015/PQ15.0001和PQ071/PQ71週4的總賴氨酸含量。PQ015/PQ15、PQ071/PQ71和90DJD28/91INH2的總賴氨酸含量上的誤差^^奉代表置信區間(oc=0.05,"=20)。圖2a-d描述了在其基因組中具有包括用於賴氨酸生物合成的序列(coWa/^)的轉基因DNA的第二親本轉基因玉米植物(M27908+)的代表，M27908+.0028的種子，以及具有與M27卯S+基本上相似的基因型但缺乏用於賴氨酸生物合成的序列的野生型玉米品種M27908-的代表，M27908-.0006的種子的特徵測定的結果。見實施例1。圖2a描述游離賴氨酸分析的結果。誤差棒是同胞谷穗的標準差。圖2b描述單個成熟穀粒的cordapAWestern分析的結果。觀察到CordapA的胚特異性表達，證實谷穗，M27908+.0028的純合性。圖2c描述CordapAELISA結果，其進一步證實CordapA的胚特異性累積。誤差棒是重複實驗的標準差。圖2d描述賴氨酸不敏感的DHDPS活性測定的結果。在DHDPS活性測定中所使用的賴氨酸濃度是1毫摩爾。圖3描述Fl後代轉基因玉米植物PQ15/CordapA和PQ71/CordapA的種子的典型的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜分析，顯示與各自親本轉基因玉米植物PQ015/PQ15扁1("PQ15")和PQ071/PQ71.0014("PQ"")相似的玉米醇溶蛋白譜，其在它們的基因組中具有用於減少玉米醇溶蛋白的序列。見實施例1。CordapA和對照種子的質譜與90DJD28/91INH2.0002類似。X軸表示m/z(質量與電荷)比。Y軸表示強度百分率。圖4描述Fl後代轉基因玉米植物PQ15/CordapA和PQ71/CordapA的所切開的種子的CordapAELISA結果，進一步證實用於賴氨酸生物合成的序列，cora^W的胚特異性表達。見實施例l。在PQ15/CordapA和PQ71/CordapA中，CordapA的表達高於對照Fl,CordapA,其缺乏用於減少玉米醇溶蛋白的序列。誤差棒代表置信區間(oc=0.05，">20)。N.D.,表示沒有檢測到。圖5a-e描述Fl後代轉基因玉米植物，PQ15/CordapA和PQ71/CordapA,以及親本轉基因植物CordapA中游離賴氨酸和賴氨酸生物合成途徑的其它成分之間的Pearson相關性。見實施例1,表3。圖5a顯示游離賴氨酸和游離天冬氨酸之間的相關性。圖5b顯示游離賴氨酸和游離天冬醯胺之間的相關。圖5c顯示游離賴氨酸和游離穀氨酸之間的相關。圖5d顯示游離賴氨酸和游離酵母氨酸之間的相關。圖5e顯示游離賴氨酸和CordapA表達之間的相關。每個數據點代表從三個Fl中的每一個所用的一塊和兩塊土地中所收穫的大量碾磨的谷穗。每個圖表內的數字對應於線性回歸的r2值和隨後的顯著水平(屍)。發明詳述除非另有定義，這裡所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的同一意思。一般地，這裡所使用的命名法和下面所描述的生產步驟或實驗步驟是本領域公知的和通常所使用的。使用常規方法用於這些步驟，如本領域和多種一般參考文獻中所提供的那些。如果術語是單數，那麼發明人也預期由該術語的複數所描述的本發明的方面。這裡所使用的命名法和下面所描述的實驗步驟是本領域公知的並通常所使用的那些。如果在術語和？1入作為參考的參考文獻中所用的定義之間存在差異，那麼本申請中所使用的術語將具有這普通意思，如在多種技術詞典中的意思。發明人不打算限制機理或作用方式。另外，提供參考文獻僅用於說明性目的。轉基因植物本發明提供一種轉基因玉米植物，其中在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA,由此轉基因DNA的表達導致協同增加轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。可通過任何一種或多種適當的方法將轉基因DNA引入到玉米植物的基因組內，包括，但不限於，DNA的直接遞送如通過PEG介導的原生質體的轉化、電穿孔、用碳化矽纖維的激發(agitation)、土壤桿菌(爿grok/"ehw附)介導的轉化、DNA包^皮的顆粒的加速，以及本領域已知的其它相似方法。可通過這種方法穩定轉化玉米細胞，以及實際上任何其它植物物種的那些細胞，並且將這些細胞發育成本發明的轉基因植物。植物轉化的優選方法包括，但不限於，例如，在美國專利Nos.5,015,580、5,550,318、5,538,歐6,160,208、6,399,861和6，403，865中所述的微粒轟擊，以及例如，在美國專利Nos.5,635，055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301中所述的土壤桿菌介導的轉化，所有這些在此以其整體引入作為參考。轉基因DNA包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列，其中序列相互之間不同並可通過一個或多個核酸構建體的方法引入到轉基因植物的基因組內(換句話說，在一個構建體中同時引入，或者使用一個以上的構建體分別地或平行地單獨地引入)。優選地，主要在轉基因植物的種子中表達用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列，例如，通過在構建體中使用種子特異性啟動子，如種子基因的啟動子如，但不限於，油菜籽蛋白(美國專利No.5,420,034)、玉米L3油質蛋白(美國專利No.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27和谷蛋白1(Russell等(1997)7V謹g綴'cto.,6:157-166)、球蛋白1(Belanger等(1991)129:863-872)以及過氧化物氧還蛋白抗氧化劑(Perl)(Stacy等(19%)Mo/說o/,31:1205-1216)，所有這些在此引入作為參考。轉基因DNA的表達導致協同增加轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。協同增加的賴氨酸含量是指賴氨酸含量的增加高於由於用於減少玉米醇溶蛋白的序列的單獨效應所致的賴氨酸增加和用於賴氨酸生物合成的序列的單獨效應所致的賴氨酸增加的總和。用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的表達優選地不導致不期望的性狀(例如，更低的產量，增加對害蟲、基本或環境脅迫的敏感性，以及降低種子加工或儲藏質量)。用於減少玉米醇溶蛋白的序列可包括導致玉米種子中一個或多個玉米醇溶蛋白減少或降低的任何序列；如用於至少一個玉米醇溶蛋白合成基因的基因抑制的序列。在一個非限制性的實施方案中，用於減少玉米醇溶蛋白的序列包括用於減少(例如，通過基因抑制)a-玉米醇溶蛋白，如19kDcc-玉米醇溶蛋白或22kDa-玉米醇溶蛋白的種子水平的序列。在其它實施方案中，用於減少玉米醇溶蛋白的序列可包括用於減少目的玉米醇溶蛋白中任何一種或多種，如oc-、P-、y-和5玉米醇、溶蛋白的種子水平的序列。可通過任何適當的機制減少玉米醇溶蛋白種子水平，包括，但不限於，一個或多個玉米醇溶蛋白合成基因的基因抑制，或者一個或多個內源性玉米醇溶蛋白合成基因的缺失或者突變，或者用非內源性玉米醇溶蛋白合成基因或導致基本上降低玉米醇溶蛋白種子水平的基因同系物替換一個或多個內源性玉米醇溶蛋白合成基因，或者玉米醇溶蛋白合成基因表達的轉錄抑制。基因抑制包括，但不限於，用於抑制RNA轉錄或者抑制產生從RNA轉錄物翻譯的蛋白質的公知方法中的任何一種，包括轉錄後的基因抑制和轉錄抑制(見，例如，Matzke等(2001)Cwr.(9/i".Z)e仏，11:221-227(2001),和Meister&Tuschl(2004)^Va0^e,431:343-349)。影響基因抑制的非限制性的方法包括通過插入具有反義方向DNA的重組DNA構建體介導的基因抑制(見，例如，美國專利Nos.5,107,065和5,759,829);通過土壤桿菌介導的轉化將由幾個拷貝的轉移DNA的共插入所致的，排列成反向重複序列的DNA整合到植物中的基因抑制(見，例如，Redenbaugh等在"SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFlavrSavrTMTomato,CRCPress,Inc.(1992),Stam等(1997)屍/朋f丄，12:63-82,以及Sanders和Hiatt(2005)Ato^"S,o&c/mo/,23:287-289);通過插入具有有義方向DNA的重組DNA構建體的基因抑制(見，例如，美國專利Nos.5,283，184和5,231,020),通過使用兩個獨立的轉錄單位從有義和反義方向DNA中轉錄RNA的基因抑制(見，例如，美國專利No.5,107,065);通過提供能產生可形成雙鏈RNA及至少其長度的一部分的轉化構建體的基因抑制(見，例如，公開的歐洲專利申請EP0426195Al、Sijen等(1996)J7ze屍toC"/，8:2277-2294、國際專利/>開Nos.WO98/53083、WO99/53050、WO99/49029,以及美國專利申請/>開Nos.2003/0175965、2003/0036197、2003/0018993和2002/0048814);以及通過轉錄抑制的基因抑制，如啟動子反式抑制(見，例如，Mette等(1999)五Affi(9丄，18:241-148，和Mette等(2000)EA^(9開的cre-lox系統和在美國專利No.5,527,695中所/>開的FLP-FRT系統，兩者都在此引入作為參考。優選地在培養基上的組織培養物中和在可控環境中進4亍才直物細月包的轉化以產生在本發明的方法中有用的轉基因植物。在美國專利Nos.6,194,636和6,232,526中公開了用於製備在本發明方法中有用的轉基因植物的實際轉化方法和材料，例如，多種培養基和受體靶細胞，未成熟胚的轉化，以及隨後能育的轉基因植物的再生，這些在此引入作為參考。轉基因DNA遞送到受體植物細胞後，通常對所轉化的細胞進行鑑定，用於進一步的培養和植物再生。為了提高鑑定轉化體的能力，可使用選擇標記基因或篩選標記基因，其中可將潛在轉化的細胞群通過將細胞暴露於選擇劑進行測定或者對期望的標記基因性狀進行篩選。篩選標記的非限制性的實例包括表達有色或者螢光蛋白如螢光素酶或綠色螢光蛋白(GFP)的基因，或者表達P-葡糖醛酸酶的基因或者已知有多種顯色底物的w^4基因(GUS)。選擇性標記的非限制性的實例包括賦予對抗生素如卡那黴素和巴龍黴素(，W)、潮黴素B(a;/2/PO和慶大黴素(,c3和aacC4)抗性，或者賦予對除草劑如glufosinate(或/7aO和草甘膦(woA或EPSPS)抗性的那些；在美國專利Nos.5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中舉例說明了這種選擇標記的特別有用的實例，所有這些在此引入作為參考。白的序列的轉基因^NA的第、"^親本轉基因玉米植物其基因^中具有包含用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA的第二親本轉基因玉米植物的遺傳雜交提供轉基因玉米植物，其中遺傳雜交導致在其基因組中具有用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的後代轉基因玉米植物。轉基因DNA的表達優選地基本上位於轉基因玉米植物的種子中，例如，基本上位於胚、胚乳，或者既在胚中也在胚乳中，使用，例如，上述在標題"轉基因植物"下所描述的啟動子。這種表達導致協同增加種子的賴氨酸含量，最優選地在轉基因玉米植物的種子的收穫季節協同增加種子的賴氨酸含量。可收穫種子並用於任何重要目的，包括，例如，用於種植目的，或者用於加工成人類食品、動物飼料產品、油、澱粉、藥品，以及多種工業產品。例如，可在美國專利Nos.6,194,636、6,207,879、6,232,526、6,426,446、6,429,357、6,433,252、6,437,217和途的示範性的討論，其中的每一個都在此以其整體引入作為參考。'"實施例實施例1本非限制性的實施例舉例說明本發明的用於提供具有協同增加的賴氨酸含量的玉米種子的方法，以及進一步舉例說明在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA的本發明的轉基因玉米植物，其中轉基因DNA的表達導致協同增加轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。更具體地，本實施例描述第一親本轉基因玉米植物(玉米醇溶蛋白減少的品種PQ15和PQ71,其在基因組中具有用於減少玉米醇溶蛋白的序列並且顯示玉米醇溶蛋白累積減少)和第二親本轉基因玉米植物(高賴氨酸品種M27908+，其在基因組中具有用於賴氨酸生物合成的序列並且顯示由於外源性confo/^基因的表達所導致的提高的游離賴氨酸)的遺傳雜交。這些遺傳雜交證明可在本發明的示範性的轉基因玉米植物的玉米種子中獲得協同增加的賴氨酸含量。轉基因植物玉米醇溶蛋白減少的品種構建設計的用於減少玉米醇溶蛋白的載體並根據Huang等(2004)/.爿gr,c.FooJC/^m.,52:1958-1964所詳細描述的方法用於轉化，其在此以其整體引入作為參考。簡要地，通過PCR分離含有玉米l9kDa-玉米醇溶蛋白基因，"(GenBank登錄號No.V01472)的核苷酸965-868的DNA片段(以反義方向)。將該玉米醇溶蛋白基因編碼區片段以反義方向插入到表達盒內，其中表達盒也含有Y-玉米醇溶蛋白A啟動子(對應於GenBank登錄號No.S78780序列的核苷酸19-1118)以驅動mRNA大量合成，以及才艮癌土i裡桿菌(爿gnZ^"enwmfi/me/ac/era)月因月旨鹼合酶基因的3'非翻譯區，以提供聚腺苷酸化序列。通過微粒轟擊將這些表達盒引入到未成熟的玉米胚中。用野生型花粉對所再生的RO轉基因植物進行授粉以產生Fl種子，從中篩選不透明的表型並通過SDS-PAGE凝膠進行分析以評價玉米醇溶蛋白譜。在發現顯示19KDoc-玉米醇溶蛋白減少表型的RO品種中，使用兩個RO品種，"PQ15"和"PQ71"(分別含有轉基因的3個拷貝和6個拷貝)用於遺傳雜交研究。所選的用於該研究的谷穗，PQ015/PQ15.0001和PQ071/PQ71.0014,顯示PQ15和PQ71的典型MALDI-TOF(基質輔助雷射解吸電離飛行時間)質譜(見圖la)。PQ15的19KDoc-玉米醇溶蛋白的減少最顯著並且22KDoc-玉米醇溶蛋白輕微增加，而PQ71的19KDcx-玉米醇溶蛋白略有減少，22KDa-玉米醇溶蛋白大量增加。所選的兩個谷穗的總賴氨酸含量也都比野生型谷穗高(見圖lb)。高賴氨酸品種i殳"H"只又元質衝立以表達,穀氨S^才奉4幹菌(Cor_y"e6開的全長917鹼基對序列，或者由Bonnassie等(1990)M/c/e,c爿c油M,18:6421所公開的棒桿菌屬dapA基因序列，兩者在此引入作為參考，或者這些基因的賴氨酸不敏感的同系物，其中同系物可通過本領域已知的序列比較工具進行鑑定，例如，BLAST算法。通過該方法所產生的無標記cora^W轉基因品種之一是M27908。來源於該事件的種子與含有平均值為71ppm游離賴氨酸的野生型分離子的種子相比，具有平均值為2505ppm的游離賴氨酸含量。在雜交實驗中轉基因品種M27908+.0028和M27908-.0006用作cwY/a/W和野生型對照，其分別含有2706和64ppm的游離賴氨酸水平(圖2a)。通過Western印跡和ELISA測定證實cwY/a/M的胚特異性表達(圖2b和圖2c)。轉基因M27908+.0028胚也顯示提高的DHDPS活性，甚至在賴氨酸存在時(圖2d)。玉米醇溶蛋白減少和高賴氨酸玉米品種的遺傳雜交用第一親本轉基因玉米植物(玉米醇溶蛋白減少的品種PQ15和PQ71,其在基因組中具有用於減少玉米醇溶蛋白的序列)和第二親本轉基因玉米植物(高賴氨酸品種M27908+,其在基因組中具有用於賴氨酸生物合成的序列)進行遺傳雜交。在田間，使用玉米醇溶蛋白減少的品種，PQ15、PQ71和它們的野生型對照，90DJD28/91INH2作為雌性，並用高賴氨酸品種，M27908+,和其野生型對照，M27908-進行授粉。表l列出所得的6個不同的Fl基因型、它們的名稱，以及所收穫並分析的谷穗的數量。由於同源轉基因親本的雜交所得的所有轉基因穀粒都是半合子。從每個雜交的兩個不同的土地中收穫20個以上F1谷穗並進行分析；僅選擇每個谷穗具有約150-約400個穀粒的谷穗用於分析。表icomplextableseeoriginaldocumentpage17分析切開穀粒為了便於切開穀粒，將成熟乾燥的穀粒浸沒在水中並在4。C過夜貯藏。每個谷穗切開50個穀粒並進行凍幹以除去水分。記錄所分離的胚和胚乳的乾重後，將樣品碾磨成粉末。沒有發現水吸漲作用顯著影響隨後的胺基酸和近似分析。Co油一提承和浮歸/;t將千燥的胚和胚乳粉末在50-55匸按照組織與己烷1:3的比例抽提幾次，持續3-IO分鐘。己烷抽提後，將粉末凍幹並貯藏在4-6°C。用20毫摩爾Tris-HCl,pH8.0、100毫摩爾KCl和lO毫摩爾丙酮酸鈉提取CordapA和天然的DHDPS。使用組織與CordapA提取緩衝液1:5的比例，在4。C振蕩1小時。將提取液以14,000xg微型離心5分鐘。為了測定(採用Frisch等(1991)屍/"W屍/zjwo/.,96:444-452的方法，其引入作為參考)，將提取液上清用提取緩衝液進一步稀釋6倍。向微量培養板的孔中加入20微升稀釋的提取液。為了開始反義，加入180微升反應緩衝液，其含有200毫摩爾Tris-HCl,pH8.0，16毫摩爾丙酮酸鈉，1毫摩爾ASA(L-天冬氨酸-(3-半醛水合物三氟乙酸)以及加減1毫摩爾賴氨酸一氫氯化物。ASA購自GatewayChemicalTechnology,StLouis並溶於4NHC1中以生產140毫摩爾貯存液。使用前，通過將100微升140毫摩爾ASA貯存液加到100微升1摩爾Tris-HCl,pH8.0和800微升INNaOH中，將140毫摩爾ASA貯存液稀釋成14毫摩爾。允許反應在37。C進行1小時，然後通過添加IOO微升終點顯色劑終止。通過將20毫克鄰-氨基苯曱醛溶於0.3毫升乙醇中製備該試劑，然後將其加到11.7毫升0.22摩爾檸檬酸-0.55摩爾磷酸緩衝液pH5.5中。允許在室溫下顯色10分鐘並用SpectraMaxPlus微量培養板讀數器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)在520納米處讀取吸光度。Cor6fo一伊遂將20毫克碾磨的胚乳或胚在200微升SDS-硼酸緩沖液(60毫摩爾Na2B4O7M0H2OpH10,4%SDS，1.5毫克/毫升二石充蘇糖醇)中65。C孵育1.5小時。將樣品以14000rpm離心5分鐘並將6(M鼓升上清液轉移到含有30微升3XSDS-PAGE加樣緩沖液(Bio-Rad,Hercules,CA)的96孑LPCR平板中。將樣品平板在98r加熱10分鐘，然後冷卻並貯藏在4。C直到上樣。將每個樣品13微升，連同作為參照的純化的重組Cord叩A和預染的MW標準(Bio-Rad)加載到20孔預製的SDS-PAGE(4-20。/。)凝膠(Bio-Rad)中。將凝膠在恆定電壓(卯伏)下電泳，直到染料前部到達凝膠的底部；然後將凝膠轉移到PVDF膜(Bio-Rad)上。通過使山羊對大腸桿菌所表達的重組CordapA產生免疫，製備山羊抗CordapA抗體。根據生產商的方案，使用含有兔抗山羊IgG鹼性磷酸酶綴合物的Immun-Blot測定試劑盒(Bio-Rad)用於4全測。分析100毫克乾燥切開的胚或胚乳粉末。添加2.5毫升冷提取緩衝液(50毫摩爾Na2B4O7'10H20，0.75摩爾KC1，0.2%v/vTween20，36毫摩爾NaOH和10毫摩爾L-抗壞血酸)後，將樣品在4。C劇烈渦旋30分鐘。將提取液過濾，並將樣品的等分試樣貯藏在-20°C。製備一系列稀釋液(1/10、1/100、1/1000、1/5000)並用於分析。向NuncImmuno平板(VWR,WestChester,PA)的每個孔中添加IOO微升稀釋的一抗(2.4微克/微升)並在4。C孵育。將平板用PBST(137毫摩爾NaCl,8.1毫摩爾Na2HP04'7H20，1.5毫摩爾KH2P04，2.7毫摩爾KC1和0.05%v/vTween20)洗滌3次並在37。C與具有0.1%奶粉的100微升TBA(100毫摩爾Tris，100毫摩爾Na2B407'10H2OpH7.8，5MMgCl2，0.05%v/vTween20和0.20/0(Wv)L-抗壞血酸)孵育1小時以封閉非特異性蛋白質吸附，然後用PBST再洗滌3次。製備溶於TBA的CordapA蛋白的系列稀釋液(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05納克/毫升)作為標準。將每個標準和樣品稀釋液的100微升溶液一式三份加載到平板上並在37。C孵育1小時。用PBST洗滌3次後，向每個孔中加入IOO微升溶於TBA的生物素偶聯的山羊抗CordapA—抗的1:10000稀釋液，並將平才反在37°C孵育1小時。用PBST洗滌3次後，添加Neutravidin-HRP偶聯的小鼠抗山羊IgG(KPLInc.,Gaithersburg,MD)的1:10000稀釋液進行第二次孵育。用PBST洗滌3次後，隨後與100微升TMB底物/H2O2(l:l)(VWR)孵育IO分鐘，通過添加100微升6摩爾H3P04終止反應。使用SpectraMaxPlus微量培養板讀數器(MolecularDevices)在450納米處讀取吸光度。基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜學將單個穀粒碾成粉末，並按40毫克穀粒粉末比1毫升緩衝液的比例用乙醇緩沖液(70%乙醇，25毫升氫氧化銨，和10毫摩爾二疏蘇糖醇)抽提。將樣品在60。C水浴中孵育1小時，周期性振蕩並以1000rpm離心15分鐘。然後4吏用AppliedBiosystems(Framingham,MA)SymBiotTMI自動裝置，將每個樣品l微升溶液與8微升基質(溶於具有0.3%三氟乙酸的70%乙腈中的10.4毫克/毫升2-(4'-羥基偶氮苯)-苯曱酸(HABA))混合。將0.6微升該混合物置於384-位MALDI靶平板(AppliedBiosystems)上。基質混合物中包括碳酸酐酶(Sigma,St.Louis,MO)(1毫摩爾)作為內對照以使光譜標準化。使用具有337納米氮雷射的AppliedBiosystemsVoyager-DETMPROBiospectrometry工作站進行基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜學(MALDI-TOFMS)分析。Adams等(2004)丄Foot/C/zem.,52:1842-1849已經/>開了用於分析玉米醇溶蛋白的MALDI-TOFMS法的詳細描述，其在此引入作為參考。瘋差凝為Vf在4。C將整個穀粒或切開的胚和胚乳池中的碾磨的粗粉樣品(50毫克)用5。/。TCA過夜抽提。將提取液過濾，如果必要的話進行稀釋，以及通過OPA法進行游離胺基酸分析，在注射到C18，反相HPLC柱(ZorbaxEclipse-AAA,XDBC-18,4.6毫米x75毫米，3.5孩t米，AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)上前，該方法使用鄰苯二醛以使樣品衍生，隨後使用保護柱(ZorbaxEclipse-AAA,4.6毫米x12.5毫米，5微米，AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)。我們使用裝備了螢光檢測器的AgilentHPLC(模型1100)。對於總胺基酸分析，在OPA衍生前進行蛋白質水解。將樣品(60毫克)在ll(TC在氬下用10毫升6NHC1和10微升苯酚水解24小時。將等分試樣乾燥並重新溶於0.1NHC1中用於OPA衍生以及隨後的HPLC分析。通過LC-MS/MS重複賴氨酸測量。也測量賴氨酸代謝產物，oc-氨基己二酸5-半醛("AAA")和酵母氨酸("Sac")。組合物分析使用Infratec1221穀粒分析器(Foss,EdenPrairie,MN)，通過近紅外線透射(NIT)分析(如Der和Feng(1997)69:16-25所述，將其引入作為參考)測定表2中每個谷穗的大量穀粒的近似含量。用FP-528蛋白質/氮測定儀(LECO，St.Joseph,MI),接著用AOCS(美國油化學協會)法定測定法Ba4f-00測定表2中顯示的所切開的胚和胚乳的總蛋白含量。丄《B/SD//提承和承^^/定該才是取製備方法採用Goncalves-Butruile等(1996)屍/"W屍/^wo/.,110:765-771，Gaziola等(1999)J.如c.FoodC/z緩,47:1268-1275和Kemper等(1998)E,,/.S/oc/zem.,253:720-729的方法，並進行修改，所有這些在此引入作為參考。將目的種質的新鮮冷凍碾磨的穀粒(300-600毫克)置於具有預先與150微升(幹體積)聚乙烯吡咯烷酮混合的裂解基質E(Q-Biogen,Irvine,CA)的2毫升試管中。625微升體積的提取緩衝液(50毫摩爾KH2P04:K2HP04pH7.4,125毫摩爾NaCl，2.0毫摩爾MgCl2，l.O毫摩爾EDTA,250微摩爾CaCl2，10%甘油，CHAPS0.1%，8毫摩爾NaF，4毫摩爾DTT，以及一個完整的蛋白酶片劑(Roche,Indianapolis,IN))加到碾磨的穀粒和基質的頂部。將樣品用FastPrep機器(Q-Biogen)勻漿。在以14,000xg離心15分鐘前，將勻漿置於冰上，不定期混合/攪動15-20分鐘。將上清液(550-625微升)從壓緊的碎屑中移去並置於單獨的試管中。將該樣品通過在7.5和15%的PEG沉澱(溶於水的PEG800050%w/v)進行分餾。將15%沉澱(其含有LKR和SDH活性)在新鮮提取緩沖液(150-300微升)中重懸並且分析LKR和SDH活性。所有這些方法都在4。C或在冰上進行(除勻漿在室溫下進行外)。通過在340納米和30°C，分別觀察TecanSafire2(TecanUS,ResearchTrianglePark,NC)中NADPH氧化的速度或者NAD+還原的速度，持續IO-20分鐘，用螢光分光光度法分析LKR和SDH活性(見，例如，由Goncalves-Butmile等(1996)所述的方案)。對於兩個測定，反應樣品的體積都是200微升。LKR測定含有25毫摩爾賴氨酸、13.3毫摩爾oc-酮戊二酸、325微摩爾NADPH，以及溶於100毫摩爾KH2P04:K2HP04pH7.0、1毫摩爾EDTA和10毫摩爾MgCl2的10-30微升提取液。陰性對照含有除oc-酮戊二酸外的所有成分。SDH測定含有2.15毫摩爾L-酵母氨酸、2.5毫摩爾NAD+以及溶於100毫摩爾KH2P04:K2HP04pH8.4、20毫摩爾TAPS和1毫摩爾EDTA的10-30微升提取液。陰性對照含有除L-酵母氨酸外的所有成分。以每分鐘每毫克蛋白質中所氧化的NADPH或所還原的NAD+的納摩爾值的形式報告比活性。通過使用Bio-Rad的Bradford試劑測定蛋白質濃度。結果玉米醇溶蛋白的質譜分析由於F1雜交的親本都是它們各自轉基因的純合子，因此F1穀粒一律都是兩個轉基因基因座的半合子。為了確保轉基因基因座在Fl代的表達，通過MALDI-TOF質譜分析檢查單個穀粒的玉米醇溶蛋白的組成。發現每個雜交的Fl穀粒的典型譜與它們所來源的玉米醇溶蛋白減少的品種相似(圖3)。另外，所有含有CoW"/v4的Fl保持Confo/^的胚特異性表達(圖4)。儘管C0Wa7M轉基因的存在不改變這些Fl中的玉米醇溶蛋白譜，但是其表達顯著高於玉米醇溶蛋白減少的Fl。整個谷在的近似為Vf表2給出近紅外線透射(NIT)近似分析的結果和大量由轉基因的谷穗和野生型谷穗所產生的穀粒的大小。所顯示的數據是均值加減置信區間(a=0.05)。大小是通過測量100個穀粒的重量，以克表示。將總蛋白重量表示為100個穀粒的總蛋白重量，以克表示，其通過將蛋白質含量乘以100個穀粒的大小進行計算。在PQ15/CoW。f^4和PQ15,PQ71/Cora^/^和PQ71,以及CoWa/W和對照之間觀察到有相對較小的差異，表明Co/Yto/M無助於穀粒最近組成的任何顯著改變。另一方面，可檢測到穀粒最近組成中玉米醇溶蛋白減少的影響。PQ15/Co^fa/^和PQ15材料似乎玉米醇溶蛋白減少最顯箸，也似乎具有更低的蛋白質含量，更低的種子密度和更小的種子大小。當計算每ioo個穀粒的蛋白質重量時，PQ15/Corab/W和PQ15比它們的非玉米醇溶蛋白減少的對應物，Co^fap^和對照平均減少25%。PQ71/Co^/"p」和PQ71材料的略微更高的蛋白含量抵消了它們略微更小的大小，它們的每100個穀粒的蛋白質重量難以與Corafa/M和對照區別。PQ15/0^cfe^4和PQ15種子的油含量顯著高於其它(與前代的觀察一致)，儘管不清楚是否這是由於玉米醇溶蛋白減少所致，因為其它玉米醇溶蛋白減少品種，PQ71,具有正常的油含量。表2tableseeoriginaldocumentpage22遊溥扇差^和謝肩謝/v》為vf在表3中給出了整個穀粒游離胺基酸分析結果，數據以百萬分率(ppm)表示，並且表示為兩個土地的平均值加減標準差。也給出了通過LC-MS/MS所測量的賴氨酸及其代謝產物、cx氨基己二酸-5-半醛(AAA)和酵母氨酸(Sac)的水平。表3tableseeoriginaldocumentpage23'通過LC-MS/MS測定所有含有轉基因的Fl材料的整個穀粒游離賴氨酸含量非常高，並且伴有賴氨酸代謝產物、oc氨基己二酸-5-半醛和酵母氨酸的增加。出乎意料地，玉米醇溶蛋白減少似乎協同增加由Co^fo/W的表達所導致的游離賴氨酸的累積(PQ15/Cwy/";7v4和PQ71/Corafa/^4中2908和2498ppm對Q^^/v4中1838ppm)。在所檢查的胺基酸中，非賴氨酸，天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸和穀氨醯胺在PQ15和PQ71品種中顯著增加。然而，當與CoMa;^4組合時，如在PQ15/CoW";^4和PQ71/Cor^/"中，這些胺基酸的水平類似於對照材料。整個各在^我差^》浙表4中給出整個穀粒的總胺基酸分析的結果，數據以百萬分率(ppm)表示，並且表示為兩個土地的平均數加減標準差。將天冬醯胺和天冬氨酸合併("Asx");將穀氨醯胺和穀氨酸合併("Glx")。表4tableseeoriginaldocumentpage24如在表4中所示，在所分析的整個Fl穀粒中，在所定量的胺基酸中觀察到賴氨酸含量的差別最顯著。當與對照相比，發現PQ15和PQ71的總賴氨酸水平提高。另外，減去它們的游離賴氨酸含量後，PQ15/a^/"/M、PQ71/Corafap4和的總賴氨酸含量分別與PQ15、PQ71和對照相似(見表3)。所切開的胚和胚乳一游離胺基酸和賴氨酸代謝產物分析表5中給出了所切開的胚和胚乳的游離胺基酸分析結果，數據以百萬分率(ppm)表示，並且表示為兩個土地的平均值加減標準差。通過取從土地中所收穫的每個谷穗的等量碾磨的粉末，將樣品匯集在一起。也給出通過LC-MS/MS測量的賴氨酸及其代謝產物、ot氨基己二酸-5-半醛(AAA)和酵母氨酸(Sac)的水平。表5tableseeoriginaldocumentpage25如在表5中所示，所切開的胚和胚乳組織的結果類似整個穀粒的分析數據。含有CorJapJ的Fl材料的賴氨酸和賴氨酸代謝產物增加，玉米醇溶蛋白減少的Fl具有更高的天冬醯胺、天冬氨酸和穀氨酸。通常，游離胺基酸更集中(以ppm計)在胚中，其導致當檢查整個完整穀粒時，不具有統計學意義的某些較小差別的擴大。例如，CwYfopJ的表達也減少胚組織中大約50%的甘氨酸和絲氨酸(將PQ51/CoWo/W、PQ71/CoWa;^和CoWa;^與PQ15,PQ71和對照比較)。另一方面，發現在玉米醇溶蛋白減少的品種中天冬醯胺、天冬氨酸和穀氨酸增加的大部分是在胚乳中(將PQ15和PQ71與對照比較)。所切開的胚和胚乳-總胺基酸分析在表6中給出了整個穀粒的總胺基酸分析結果，數據以百萬分率(ppm)表示，並且表示為兩個土地的平均值加減標準差。將天冬醯胺和天冬氨酸合併("Asx");將穀氨醯胺和穀氨酸合併("Glx")。表6tableseeoriginaldocumentpage27將PQ15/Corab/^與PQ15,PQ71/CoW"屍v4與PQ71以及將Co^fapJ與對照比較，Corafa;^4的表達輕微減少胚乳中的總胺基酸累積。在胚中，組氨酸和賴氨酸是僅有的顯示在含有CoMa/W的Fl中一致增加的胺基酸。關於玉米醇溶蛋白減少對多種總胺基酸水平的影響，與對照相比，PQ71,而不是PQ15具有更高的總胺基酸含量。然而，僅在胚乳中發生的總賴氨酸的增加，在兩個事件中都一致。所切開的胚和胚乳-蛋白質含量和乾重表7中給出所切開的胚和胚乳的蛋白質含量和乾重分析結果，表示為均值加減置信區間(cc=0.05)。乾重表示成50個所切開的胚或胚乳總量的均值，以克表示。表7tableseeoriginaldocumentpage29在所有三個成對比較，PQ15/CWt/a^4對PQ15，PQ71/CoWa/M對PQ71和GW"/^4對對照中，胚乳的蛋白質含量相對於胚，似乎輕微增加，不影響與乾重成比例。這與表6中所示的數據與一致，其中總胺基酸在含有Cwy^/W轉基因的材料的胚組織中更高，在胚乳組織中更寸氐。關於玉米醇溶蛋白減少的影響，與對照相比，PQ15在胚和胚乳中具有相似的蛋白質含量，但重量顯著減少，而PQ17在胚和胚乳中具有更高的蛋白質含量並且重量僅輕度減少。由Fl發育的穀粒的LKR/SDH活性在表7中顯示在Fl發育的穀粒中所測量的LKR和SDH比活性。悽t據顯示為均值加減標準差(n=3)。在授粉後(DAP)25天發育的谷穗的穀粒中製備每個樣品，並且一式三份進行測定。每個Fl使用三個發育的谷穗。以每分鐘每毫克蛋白質中所氧化的NADPH或所還原的NAD+的納摩爾數的形式報導LKR和SDH的比活性。表7tableseeoriginaldocumentpage30質中氧化14.15-29.88納摩爾NADPH和每分鐘每毫克蛋白質中還原3.78-6.01NAD+。LKR比活性比以前報導的正在發育的玉米胚乳的比活性高5-10倍。見，例如，Azevedo等(2004)丄爿g"'c.Foot/C/zew.,52:4865-4871,Gaziola等(1999)J.爿gnc.C/zew.,47:1268-1275以及Kemper等(1999)屍/Ce〃，11:1981-1993，所有這些在此引入作為參考。與不透明的突變體不同，通過轉基因的方法減少玉米醇溶蛋白不降低這些Fl中的LKR和SDH的比活性。所有玉米醇溶蛋白減少的Fl(PQ15/Cwy/，j,PQ15、PQ71/CoWa/W和PQ71)的發育的穀粒具有與正常玉米醇溶蛋白水平、CoWa;^和對照相似的或者更高的LKR和SDH比活性。所提高的賴氨酸濃度似乎不增加LKR和SDH比活性(將PQ1Jap4與PQ15、PQ71/aWa/^4與PQ71，以及Con/a/7y4與對照比較)。LKR/SDH比的範圍為3.46-5.72,並且也比以前所報導的高几倍，與在高賴氨酸F1中所發現的酵母氨酸的累積一致。討論Fl種子顯示與純合親本相似的表型。含有CoW"/W轉基因的Fl後代具有更高的游離賴氨酸(表3)，來源於PQ15和PQ71的F1種子顯示玉米醇溶蛋白減少(圖3)和總賴氨酸含量提高(表4)。將玉米醇溶蛋白減少和表達結合，如在PQ15/0nia^4和PQ71/Corab/^4雜交中，導致在對照材料中觀察到總賴氨酸含量的大幅度增加(大約加倍)(表4)。觀察到對游離賴氨酸累積的意想不到的CoW";^4依賴的協同效應。Corafo;^Fl後代累積1838ppm游離賴氨酸，比對照的43ppm增加40倍以上(表3)。玉米醇溶蛋白減少協同增加源於Cortfe/W表達的游離賴氨酸水平，如在PQ15/CoW，」和PQ71/CorA^4的組合中所見，其甚至具有更高度游離賴氨酸含量，分別為2%8和2498ppm。單獨具有玉米醇溶蛋白減少的Fl(PQ15和PQ71)具有對照水平的游離賴氨酸，這表明玉米醇溶蛋白減少在存在Cora^/W時以協同方式提高賴氨酸的生物合成。然而，所提高的游離賴氨酸無助於由玉米醇溶蛋白減少所導致的蛋白質結合的賴氨酸的增加。發現幾乎總賴氨酸的所有增加都在胚乳中，因為在轉基因種子的胚乳中減少了大量賴氨酸貧乏的玉米醇溶蛋白(表6)。已提出不透明2號突變體(Mertz等(1964)S"e"ce,145:279-280)的高賴氨酸含量是由於賴氨酸貧乏的玉米醇溶蛋白的減少和富含賴氨酸的非玉米醇溶蛋白質的多效增力。所致。見，例如，Damerval和Devienne(1993)//w^/,(y,70:38-51，Habben等(1993)油/.23:825-838和Lopez-Valenzuela等(2004),屍/朋f屍/z"/。/.,135:1784-1797，所有這些在此引入作為參考。從表3中計算PQ15/CwY/a/^4和PQ71/CoWap4中由玉米醇溶蛋白減少和OW，J表達所致的游離賴氨酸的增加，產生經計算的游離賴氨酸值，分別為PQ15/CoW"/^4中2865(2908-43)ppm和PQ71/CoW，J中2454(2498-43)ppm。通過將游離賴氨酸的增加加到表4中所示的PQ15和PQ71的總賴氨酸中，估計PQ15/CorJ"/^和PQ71/Corafep4的所預計的總賴氨酸含量將是5975和5784ppm。這些評估與6160±"4和54乃±3乃ppm的實際測量值(表4)沒有顯著差異。因此，與以前的假說形成對照，在轉基因玉米醇溶蛋白減少的品種中更高的游離賴氨酸不刺激富含賴氨酸的非玉米醇溶蛋白的合成。儘管PQ15具有類似對照的蛋白質含量，但是其更小的穀粒(以及因此更小的胚乳)導致基於每個穀粒其含有更少的總蛋白質(表2和表7)，表明PQ15中玉米醇溶蛋白的減少對富含賴氨酸的非玉米醇溶蛋白的合成幾乎沒有影響。另一方面，PQ71具有略微更小的穀粒，但是具有更高的蛋白質含量並且因此總蛋白質的量與對照類似(表2和表7)。所有這些綜合在一起，在PQ15中所觀察到的更高的總賴氨酸含量僅反映玉米醇溶蛋白減少，而PQ71中總賴氨酸含量的增加可能是由於富含賴氨酸的非玉米醇溶蛋白的合成所致。發現玉米醇溶蛋白的減少出乎意料地增加用於a^/a/^4提高的賴氨酸生物合成的前體胺基酸的供給，導致賴氨酸的協同增加。在玉米醇溶蛋白減少的F1(PQ15和PQ71)中，三種游離胺基酸，天冬醯胺、天冬氨酸和穀氨酸在所測量的所有游離胺基酸中增加最顯著(表3)。將Cor^;^引入到玉米醇溶蛋白減少的品種中協同提高賴氨酸生物合成並且伴隨減少天冬醯胺、天冬氨酸和穀氨酸(表2中的PQ15/Corato^4、PQ71/CoWa/^)。在植物中，認為賴氨酸將通過Asp家族途徑的賴氨酸分支從天冬氨酸合成；反過來，可從穀氨酸或天冬醯胺合成天冬氨酸。見，j列^口，Galili(2002)^ww.屍/aW屍/zjw》/.屍/aW^fo/.Bzo/.,53:27-43，在此將其引入作為參考。在玉米醇溶蛋白減少的Fl和玉米醇溶蛋白減少/CorJapJFl中所檢測到的天冬醯胺、天冬氨酸和穀氨酸的意想不到的改變進一步表明這些胺基酸在提高賴氨酸生物合成中的重要性。實施例2本非限制性的實施例描述在將用於減少玉米醇溶蛋白的序列引入到本發明的轉基因植物中有用的重組DNA構建體，通常在美國專利申請No.11/057,062中描述了該構建體的用途，在此以其整體引入作為參考。更具體地，該實施例描述反義方向RNA的閉環用於抑制至少一種玉米醇溶蛋白基因(例如，oc-、|3-、y-和5-玉米醇溶蛋白的基因中的任何一個或多個)的用途。用於抑制至少一種玉米醇溶蛋白基因的重組DNA構建體在5'-3'順序上，可包括有效連於至少一種玉米醇溶基因的向的DNA元件比反義方向的DNA元件短，由有義方向DNA元件所轉錄的有義方向的RNA與由反義方向的DNA元件所轉錄的反義方向的RNA的5，最末端互補，其中所轉錄的RNA形成用於抑制至少一種玉米醇溶蛋白基因的反義方向的RNA的環。在另一個實施方案中，可通過在轉基因植物的細胞中提供重組DNA構建體，將用於減少玉米醇溶蛋白的序列引入到本發明的轉基因植物，其中該構建體被轉錄成RNA，其形成用於抑制至少一種玉米醇溶蛋白基因的反義方向的RNA的環。實施例3本實施例描述可用於獲得本發明的轉基因玉米植物的非限制性的構建體。在美國臨時專利申請No.60/638,256中詳細描述了在內含子中含有用於基因抑制的異源DNA的表達盒，在此以其整體引入作為參考。在本發明的實踐中有用的類似的表達盒對於精通本領域的人員是顯而易見的。例如，可用於獲得本發明的轉基因植物的適當的載體包括含有有效連於玉米熱休克蛋白內含子的種子特異性啟動子和前導序列，其中玉米熱休克蛋白內含子包含用於抑制至少一種玉米醇溶蛋白合成基因的序列(如反向DNA序列)，和任選地用於抑制至少一種內源性賴氨酸分解代謝酶(例如，玉米LKR)的序列，隨後是引導肽和編碼賴氨酸合成基因(例如，大腸桿菌AKIII或棒狀桿菌DHDPS)的序列，以及最後是具有多聚腺苷酸化信號和位點的DNA的表達盒。該載體可另外地含有選擇標記或篩選標記，例如，編碼草甘膦除草劑抗性的基因。可在不需要進行過度實驗的情況下根據上述公開內容的教導，製備和使用在此所公開的和要求的所有材料和方法。儘管已經才艮據優選的實施方案和舉例說明的實施例描述了本發明的材料和方法，但是對於本領域技術人員來說，可在不偏離本發明的概念、精神和範圍的情況下對這裡所描述的材料和方法進行改變是顯而易見的。認為對本領域技術人員顯而易見的所有這種相似的替代和修改是在如所附權利要求所定義的本發明的精神、範圍和概念內。權利要求1、一種轉基因玉米植物，其中在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA，由此所述轉基因DNA的表達導致協同增加所述轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。2、權利要求1的轉基因玉米植物，其中所述用於減少玉米醇溶蛋白的序列包括用於至少一種玉米醇溶蛋白合成基因的基因抑制的序列。3、權利要求1的轉基因玉米植物，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括外源性賴氨酸合成基因。4、權利要求3的轉基因玉米植物，其中所述外源性賴氨酸合成基因包括編碼基本上反饋不敏感的賴氨酸合成酶的基因。5、權利要求1的轉基因玉米植物，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括用於所述轉基因玉米植物的內源性賴氨酸分解代謝酶的基因抑制的序列。6、權利要求1的轉基因玉米植物，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括外源性賴氨酸合成基因和用於所述轉基因玉米植物的內源性賴氨酸分解代謝酶的基因抑制的序列。7、權利要求6的轉基因玉米植物，其中所述外源性賴氨酸合成基因包括編碼基本上反饋不敏感的賴氨酸合成酶的基因。8、權利要求1的轉基因玉米植物，其中所述轉基因植物包括在其基因組中具有包含用於減少玉米醇溶蛋白的序列的轉基因DNA的第一親本轉基因玉米植物，和在其基因組中具有包含用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA的第二親本轉基因玉米植物的遺傳雜交的後代轉基因玉米植物，其中所述遺傳雜交的後代轉基因玉米植物在其基因組中具有所述用於減少玉米醇溶蛋白的序列和所述用於賴氨酸生物合成的序列。9、一種提供具有協同增加的賴氨酸含量的玉米種子的方法，包括(a)提供一種轉基因玉米植物，在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA，(b)在所述轉基因玉米植物的種子中表達所述轉基因DNA，所述表達導致協同增加所述種子的賴氨酸含量，和(C)收穫具有協同增加的賴氨酸含量的所述種子。10、權利要求9的方法，其中所述用於減少玉米醇溶蛋白的序列包括用於至少一種玉米醇溶蛋白合成基因的基因抑制的序列。11、權利要求9的方法，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括外源性賴氨酸合成基因。12、權利要求11的方法，其中所述外源性賴氨酸合成基因包括編碼基本上反饋不敏感賴氨酸合成酶的基因。13、權利要求9的方法，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括用於所述轉基因玉米植物的內源性賴氨酸分解代謝酶的基因抑制的序列。14、權利要求9的方法，其中所述用於賴氨酸生物合成的序列包括外源性賴氨酸合成基因和用於所述轉基因玉米植物的內源性賴氨酸分解代謝酶的基因抑制的序列。15、權利要求14的方法，其中所述外源性賴氨酸合成基因包括編碼基本上反饋不敏感的賴氨酸合成酶的基因。16、權利要求9的方法，其中所述提供包括在其基因組中具有包含用於減少玉米醇溶蛋白的序列的轉基因DNA的第一親本轉基因玉米植物，和在其基因組中具有包含用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA的第二親本轉基因玉米植物的遺傳雜交，所述遺傳雜交導致後代轉基因玉米植物在其基因組中具有所述用於減少玉米醇溶蛋白的序列和所述用於賴氨酸生物合成的序列。全文摘要本發明提供一種轉基因玉米植物，其中在其基因組中具有包括用於減少玉米醇溶蛋白的序列和用於賴氨酸生物合成的序列的轉基因DNA，由此轉基因DNA的表達導致協同增加轉基因玉米植物種子的賴氨酸含量。本發明進一步提供用於提供具有協同增加的賴氨酸含量的玉米種子的方法。文檔編號C12N15/82GK101175857SQ200680016272公開日2008年5月7日申請日期2006年3月10日優先權日2005年3月10日發明者A·L·克裡日,M·H·呂蒂,S·黃申請人:孟山都技術有限公司