用bis-tris緩衝液的蛋白純化的製作方法

2023-06-09 06:36:31 2

用bis-tris緩衝液的蛋白純化的製作方法
【專利摘要】本發明提供用於小規模和大規模蛋白質純化特別是單克隆抗體的兩步色譜法，其僅使用由一種母液製得的四種緩衝溶液。
【專利說明】用BIS-TRIS緩衝液的蛋白純化
【技術領域】
[0001]本發明涉及使用四種緩衝溶液的用於小規模和大規模蛋白質純化，尤其是單克隆抗體的兩步色譜過程。
[0002]發明背景
抗體純化可能是生物生產最為昂貴的方面之一。單克隆抗體(mAbs)通常採用在各步驟使用特定緩衝體系的三步驟三樹脂色譜方法來純化。這種常規純化方法包括捕獲步驟，接著是離子交換步驟，並且結束於拋光步驟，並通常花費3至5個工作日(包括儲存和開放階段(open phase))。隨著提高的細胞培養物效價和更大的細胞培養物體積用於生產，下遊加工被視為行業瓶頸。這特別與單克隆抗體生產相關，在單克隆抗體生產中，關注點由批量體積轉向下遊加工能力。此外，早期的臨床前期和臨床階段研究要求可以更快速製造的更大量抗體。因此，在行業中有需求減少用於抗體純化的步驟數，並減少獲得批量產品所花費的時間。
[0003]發明概述
發明人已經發現了用於純化抗體的新方法，所述方法包括有限數量的步驟，同時仍能夠以優異的純度獲得純化抗體的高產率。純化的蛋白質由此適於醫療應用。因此，該方法可用於純化用於臨床試驗的蛋白質和/或用於包含該蛋白質的藥物組合物的營銷。
[0004]簡而言之，這種方法僅包括兩個色譜步驟:一個親和色譜，和一個多峰樹脂色譜(multimodal resin chromatography)。此外，已經發現,在這兩個色譜步驟過程中使用的緩衝液可以由相同的母液起始製備。在其它方面，所有緩衝液可以由相同的化學物質組成，儘管各緩衝液中所述化學物質的濃度可以彼此不等。這些緩衝液有利地包含Bis Tris，例如與NaCl、乙酸和水組合。由於不需要任何緩衝液交換，該方法容易進行，並且高度適於自動化和/或用於以連續模式運行。此外，所有緩衝液可以由相同化學物質組成的事實能夠極大減少製備色譜柱的時間，並減少了對人工幹預的需要。本發明的方法進一步允許減少或取消開放階段(即其中純化系統開放以進行手工操作的步驟，如準備用於新緩衝液的色譜柱、稀釋樣品或調節其PH)，由此減少汙染的風險。因此，本發明的方法能夠快速生產批量產品並減少純化系統的佔用時間。由此適於放大試驗和以工業規模純化重組蛋白質。
[0005]已經建立了兩種特定方案並對三種不同的抗體實施。在第一種方案中，在第一色譜步驟結束時使用Bis Tris溶液(參見實施例3、4和5)調節獲得的粗蛋白質洗脫液的pH值。已經表明，該方案是通用的，只要其提供優異和可再現的結果，不考慮被純化的特定抗體(參見實施例6)。在第二種方案中，在第一色譜步驟結束時獲得的粗蛋白質洗脫液直接通過第二色譜柱，即沒有經受任何處理如PH調節、緩衝液交換或稀釋(參見實施例7)。在該方案中，兩個色譜步驟後可接著流過膜吸附器。第二種方案具有極為快速(對100升原材料為大約7或8小時)的優點。此外，其可以完全自動化，以連續方式運行，並且不包含任何開放階段。
[0006]本發明由此提供一種從溶液中純化蛋白質的方法，該方法包括第一色譜步驟和第二色譜步驟，所述第一色譜步驟包括使平衡緩衝液流經第一色譜柱，使溶液流經第一色譜柱，使平衡緩衝液流經第一色譜柱，使清洗和衛生緩衝液流經第一色譜柱，使平衡緩衝液流經第一色譜柱，使用第一洗脫緩衝液從第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液，和任選使用BisTris溶液調節該粗蛋白質洗脫液的pH值；所述第二色譜步驟包括使平衡緩衝液流經第二色譜柱，使粗蛋白質洗脫液流經第二色譜柱，使平衡緩衝液流經第二色譜柱，和使用第二洗脫緩衝液從第二色譜柱中回收純化的蛋白質。
[0007]本發明還提供一種從溶液中純化蛋白質的方法，該方法包括第一色譜步驟和第二色譜步驟，所述第一色譜步驟包括使平衡緩衝液流經第一色譜柱，使溶液流經第一色譜柱，使平衡緩衝液流經第一色譜柱，使用第一洗脫緩衝液從第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液，和任選使用Bis Tris溶液調節該粗蛋白質洗脫液的pH值；所述第二色譜步驟包括使平衡緩衝液流經第二色譜柱，使該粗蛋白質洗脫液流經第二色譜柱，使平衡緩衝液流經第二色譜柱，使清洗和衛生緩衝液流經第二色譜柱，使平衡緩衝液流經第二色譜柱，和使用第二洗脫緩衝液從第二色譜柱中回收純化蛋白質。
[0008]在本發明的一個實施方案中，該Bis Tris溶液是IM的Bis Tris溶液。在其它實施方案中，各緩衝液包含Bis Tris和/或各緩衝液包含不同濃度的相同化學物質。在另一個實施方案中，各緩衝液包含Bis Tris、乙酸、NaCl和水。
[0009]在本發明的一個實施方案中，該第一色譜柱是蛋白質A柱，該第二色譜柱是多峰樹脂色譜柱。在本發明的另一實施方案中，該第一色譜柱是多峰樹脂色譜柱，該第二色譜柱是蛋白質A柱。在本發明的其它實施方案中，用於從溶液中純化蛋白質的方法不包括任何包括使該溶液流經陰離子交換色譜(AEX)柱的色譜步驟。
[0010]在本發明的一個實施方案中，被純化的蛋白質是抗體。在另一個實施方案中，該抗體是單克隆抗體。
[0011]在本發明的一個實施方案中，該方法進一步包括在步驟(b)之後使該粗蛋白質洗脫液流經膜吸附器。在其它實施方案中，該方法進一步包括在步驟(b)之後的納濾步驟和/或在該納濾步驟後的超濾和滲濾步驟。
[0012]在本發明的某些實施方案中，該第一洗脫緩衝液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸調節至pH 3.5 ;該第二洗脫緩衝液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸調節至pH4.5 ;該平衡緩衝液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl,用乙酸調節至pH 7.4 ;並且該清洗和衛生緩衝液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸調節至pH 7.4。在本發明的其它實施方案中，該第一洗脫緩衝液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸調節至pH 4.5 ;該第二洗脫緩衝液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸調節至pH 3.5 ;該平衡緩衝液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸調節至pH 7.4 ;並且該清洗和衛生緩衝液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸調節至pH 7.4。
[0013]本發明提供包含一種試劑盒，其包含多峰樹脂色譜柱和/或蛋白質A柱；和至少一種包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的緩衝液。在某些實施方案中，該試劑盒用於使用本發明的方法從溶液中純化蛋白質。
[0014]本發明還提供一種試劑盒，其包含多峰樹脂色譜柱和/或蛋白質A柱；以及用於製備至少一種包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的緩衝液的說明書。在某些實施方案中，該試劑盒用於使用本發明的方法從溶液中純化蛋白質。
[0015]本發明進一步提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的緩衝液用於通過至少一個色譜步驟從溶液中純化蛋白質的用途。在某些實施方案中，該色譜步驟是多峰樹脂色譜步驟和/或蛋白質A色譜步驟。還提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的緩衝液用於通過本發明的方法從溶液中純化蛋白質的用途。
[0016]本發明進一步提供了用於製備平衡緩衝液的方法，包括生成具有20mM Bis Tris和20mM NaCl的最終濃度的100升溶液；用乙酸將該溶液的pH調節至7.4 ;和收集50升該溶液。本發明還提供了用於製備清洗和衛生緩衝液的方法，包括用乙酸將來自製備平衡緩衝液剩餘的50升溶液的pH調節至4.5 ;和收集25升該溶液。本發明進一步提供了用於製備洗脫緩衝液的方法，包括用乙酸將來自清洗和衛生緩衝液製備的剩餘25升溶液的pH調節至3.5。本發明進一步提供了用於製備洗脫緩衝液的方法，包括向來自洗脫緩衝液製備的剩餘25升溶液中添加當量IM的NaCl。通過本文中公開的方法製備的緩衝液可用於使用本發明的方法從溶液中純化蛋白質。
[0017]將由下列詳述及所附權利要求更充分地理解公開的純化方法的這些和其它特徵與優點。要注意的是，權利要求的範圍由其中的敘述限定，而並非由該描述中所提出的特徵與優點的具體討論來限定。
[0018]附圖概述
當與下列附圖結合閱讀時能夠最好地理解公開的純化法的實施方案的下列詳述。
[0019]圖1顯示了用於配製實施例3至6中公開的純化法的緩衝液的方案的示意圖。
[0020]圖2顯示了兩步純化法的示意圖。
[0021]圖3顯示了兩步 純化法用於大規模純化柱的示意圖。
[0022]圖4顯示了 「一天一批」大規模純化的示意圖。
[0023]圖5顯示了 「一天一批」大規模純化的結果。
[0024]圖6顯示了用於配製實施例7中公開的純化法的緩衝液的方案的示意圖。
[0025]各方面與實施方案的詳細描述
基於混合模式樹脂(亦稱多峰樹脂)的可用性，本發明人已經開發了一種僅使用兩個色譜步驟的新的純化方法。換句話說，該方法僅包含兩個涉及流經色譜柱的步驟。
[0026]本發明涉及用於從溶液中純化蛋白質的方法，包括或由以下步驟組成:
(a)第一色譜步驟，包括:
-使所述溶液流經第一色譜柱；
-使用第一洗脫緩衝液從第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液；和
(b)第二色譜步驟，包括:
-使在步驟(a)結束時獲得的粗蛋白質洗脫液流經第二色譜柱；
-使用第二洗脫緩衝液從第二色譜柱中回收純化的蛋白質，
其中各緩衝液包含Bis Tris。
[0027]更具體而言，兩個上述色譜步驟各自可以包含或由以下步驟組成:
-使平衡緩衝液流經該色譜柱；
-使溶液或粗蛋白質洗脫液流經色譜柱(如上所述);
-使平衡緩衝液流經該色譜柱；
-任選地使清洗和衛生緩衝液流經該色譜柱；
-任選使平衡緩衝液流經該色譜柱；-使用洗脫緩衝液從該色譜柱中洗脫該粗蛋白質洗脫液或回收純化的蛋白質(如上所
述)，
其中各緩衝液包含Bis Tris。
[0028]如上所述，上述本發明的方法僅包含兩個色譜步驟。更具體而言，該方法可以避免使該溶液流經陰離子交換色譜(AEX)柱的色譜步驟和/或用於拋光的色譜步驟。即使本發明的方法僅包含兩個色譜步驟，該方法也能夠獲得適於藥物用途並特別適於施用於人類的純化蛋白質。
[0029]除了將純化法中的步驟數量由三個減少到兩個(並因此縮短了完成該純化過程所需的總時間)，公開的方法將用於純化的緩衝液數量由七種減少到四種。此外，該緩衝液包含相同的組分(即Bis Tris、NaCl、乙酸和水)，這極大地便利了緩衝液的製備。除了允許純化多種mAb外，公開的純化方法還簡化了 mAb純化，提高了總產率，並減少了原材料、商品成本和加工時間。
[0030]與常規蛋白質純化方法不同，如上所述，本文中公開的方法使用四種緩衝液:平衡緩衝液、清洗緩衝液和兩種洗脫緩衝液。公開的方法中使用的緩衝液用相同的化合物基質由母液製得，這極大地便利了緩衝液的製備。
[0031]本文中所用的「本發明的緩衝液」指的是包含Bis Tris的緩衝液。Bis Tris是本領域技術人員公知的化合物，其IUPAC名稱是2-[雙(2-羥乙基)氨基]-2-(羥甲基)丙-1，3- 二醇，其CAS編號為6976-37-0。本發明的此類緩衝液可以對應於平衡緩衝液、對應於清洗和衛生緩衝液和/或對應於洗脫緩衝液。
[0032]更具體而言，本發明的此類緩衝液可以包含或由不同濃度的相同化學物質組成(其中之一是Bis Tris)。在一個具體實施方案中，該緩衝液包含或由Bis Tris、乙酸和水組成。在一個更具體的實施方案中，該緩衝液包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成。換句話說，此類緩衝液包含或由不同濃度的Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成。
[0033]該洗脫緩衝液可以例如包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和15至25 mM(例如20 mM) NaCl組成，用乙酸調節至包括3至4 (例如3.5)的pH。此類洗脫緩衝液尤其適用於親和色譜柱如蛋白質A柱。
[0034]該洗脫緩衝液還可以包含或由15至25 mM (例如20 mM) Bis Tris和15至25 mM(例如20 mM) NaCl組成，用乙酸調節至包括4至5 (例如4.5)的pH。此類洗脫緩衝液尤其適用於多峰樹脂色譜柱如Capto Adhere。
[0035]該洗脫緩衝液還可以包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和150至250 mM(例如200 mM)NaCl組成，用乙酸調節至包括8至9的pH。此類洗脫緩衝液尤其適於與多峰樹脂色譜柱如Capto MMC 一起使用。
[0036]該平衡緩衝液可以包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和15至25 mM (例如20 mM) NaCl組成，用乙酸調節至包括7至8 (例如7.4)的pH。
[0037]該清洗和衛生緩衝液可以包含或由15至25 mM (例如20 mM) Bis Tris和0.9 to
1.1 mM (例如I M) NaCl組成，用乙酸調節至包括7至8 (例如7.4)的pH。
[0038]更具體地，用於公開的方法的一種平衡緩衝液含有20 mM Bis Tris和20 mM NaCl，用2 mM乙酸調節至pH 7.4。用於公開的方法的一種清洗緩衝液含有20 mM Bis Tris和I MNaCl，用2 mM乙酸調節至pH 7.4。用於公開的方法的第一洗脫緩衝液含有20 mM Bis Tris和20 mM NaCl，用275 mM乙酸調節至pH 3.5。用於公開的方法的第二洗脫緩衝液含有20 mMBis Tris 和 20mMNaCl，用 35 mM 乙酸調節至 pH 4.5。
[0039]上述緩衝液製劑的優點包括相對於傳統純化方法能夠以更大的相容性使mAb產物通過公開的方法中使用的兩個色譜柱，同時最小化不需要的相互作用，限制pH和電導率降低，並有助於提高產率。除了使用減少數量的緩衝液之外，公開的方法的另一方面是使用Bis-Tris緩衝液。
[0040]本文中所用的術語「多肽」或「蛋白質」指的是具有天然蛋白質(即由天然存在和具體地非重組細胞產生的，或基因工程改造或重組細胞所產生的蛋白質)的序列的分子，並包含具有天然蛋白質的胺基酸序列的分子，或缺失、添加和/或取代天然序列的一個或多個胺基酸的分子。在某些方面，待純化蛋白質是抗體。
[0041]本文中所用的術語「抗體」指的是完整抗體，或其與完整抗體競爭特定結合的結合片段。結合片段包括但不限於？(&13)、？(&13』)、？(&13』)2、？￥和單鏈抗體。術語「重鏈」包括具有足夠的可變區序列以賦予對抗原的特異性的任何免疫球蛋白多肽。
[0042]本文中所用的術語「重鏈」涵蓋全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH和三個恆定區結構域CH1、CH2和CH3。該VH結構域位於多肽的氨基末端，CH3結構域位於羧基末端。
[0043]本文中所用的術語「輕鏈」涵蓋全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL和恆定區結構域CL。類似重 鏈，輕鏈的可變區結構域在多肽的氨基末端。本文中所用的術語「輕鏈」包括具有足夠的可變區序列以賦予對抗原的特異性的任何免疫球蛋白多肽。
[0044]天然存在的抗體結構單元通常包含四聚體。此類四聚體各自通常由兩個相同的多肽鏈對組成，各對具有一個全長輕鏈(通常具有大約25 kDa的分子量)和一個全長重鏈(通常具有大約50-70 kDa的分子量)。各輕鏈和重鏈的氨基末端部分通常包括大約100至110個或更多胺基酸的可變區，該可變區通常負責抗原識別。各鏈的羧基末端部分通常限定了負責效應子功能的恆定區。人輕鏈通常分類為K和λ輕鏈。重鏈通常分類為μ、δ、gamma、α或ε，並且分別將抗體的同種型限定為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個子分類，包括但不限於IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限於IgMl和IgM2的子分類。IgA類似地細分為包括但不限於IgAl和IgA2的子分類。在全長輕鏈和重鏈中，可變區和恆定區通常通過大約12或更多個胺基酸的「 J」區接合，重鏈還包括大約10個或更多個胺基酸的「D」區。
[0045]各個輕/重鏈對的可變區通常構成抗原結合位點。可變區通常表現出通過三個高變區(也稱為互補決定區或⑶R)連接的相對保守的框架區(FR)的相同的一般結構。來自各個對的兩個鏈的CDR通常通過可能使得能夠結合至特定表位的框架區對準。由N端至C端，輕鏈和重鏈可變區二者通常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根據 Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，U.S.Department of Health and Human Services, NIH 出版號 91-3242 的定義將胺基酸分配到各結構域。雙特異性或雙功能抗體通常是具有兩種不同的重鏈/輕鏈對和兩種不同的結合位點的人工雜交抗體。
[0046]F(ab)片段包含一個重鏈的CHl與可變區和一個輕鏈。F(ab)分子的重鏈不能與另一重鏈分子構成雙硫鍵。F(ab』)片段含有一個輕鏈和在CHl與CH2結構域之間含有更多恆定區的一個重鏈，以使得能夠在兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab』 )2分子。Fv區包含來自重鏈和輕鏈的可變區，但是缺少恆定區。單鏈抗體是其中重鏈和輕鏈可變區已經通過柔性聯結子連接以形成單一多肽鏈(其構成抗原結合區)的Fv分子。在某些實施方案中，除了「多特異性」或「多功能」抗體之外的二價抗體應理解為包含具有相同抗原特異性的結合位點。
[0047]可以通過公開方法純化的單克隆抗體(mAbs)可以通過多種技術製得，包括常規單克隆抗體方法，例如，本領域公知的標準體細胞雜交技術。儘管原則上體細胞雜交程序是優選的，可以使用製造單克隆抗體的其它技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌性轉化。該單克隆抗體例如可以對應於鼠類、嵌合、人源化或全人抗體。
[0048]在一個具體實施方案中，通過本發明的方法純化的抗體是選自以下的單克隆抗體:特異性結合到人β_澱粉樣蛋白質的初原纖維形式上的抗體(例如人源化抗體)、特異性結合到細菌表面多糖聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)上的抗體(例如全人抗體)、和特異性結合到CD38跨膜糖蛋白上的抗體(例如人源化抗體)。
[0049]本文中所用的術語「回收蛋白質」指的是在使用公開的純化方法後收集蛋白質。公開的純化方法可以使用多種標準蛋白質色譜技術實現，所述色譜技術例如但不限於親和色譜、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、凝膠過濾色譜和多峰樹脂色譜。
[0050]在公開方法的某些實施方案中，第一或第二色譜柱是蛋白質A柱。該蛋白質A柱經由樹脂配體與蛋白質之間的親和力起作用，實現雜質的高效去除。在公開的方法中使用蛋白質A柱的另一優點在於mAbs對蛋白質A具有通用的親和力。在公開的方法的一個實施方案中，該蛋白質A柱是MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare)。
[0051]在公開方法的其 它實施方案中，第一或第二色譜柱是多峰(混合模式)樹脂色譜柱。該多峰樹脂與所述目標蛋白質經由幾種機制相互作用，所述機制具有mAb:離子相互作用、疏水性相互作用和氫鍵相互作用。更具體地，在多峰樹脂色譜柱中，該mAb:離子相互作用是mAb:陽離子相互作用，與發生在傳統陰離子交換色譜(AEX)柱中的mAb:陰離子相互作用相反。
[0052]在公開的方法的一個特定實施方案中，該多峰樹脂是Capto Adhere樹脂(GEHealthcare)ο Capto adhere是具有基於高度交聯的瓊脂糖的基質的多峰陰離子交換劑。下面總結了 Capto adhere 的特性(參見 GE Healthcare Life Sciences,數據文件 28-9078-88AC)。
【權利要求】
1.用於從溶液中純化蛋白質的方法，其包括: (a)第一色譜步驟，包括: -使所述溶液流經第一色譜柱； -使用第一洗脫緩衝液從所述第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液；和 (b)第二色譜步驟，包括: -使在步驟(a)結束時獲得的所述粗蛋白質洗脫液流經第二色譜柱； -使用第二洗脫緩衝液從所述第二色譜柱中回收純化的蛋白質， 其中各所述緩衝液包含Bis Tris。
2.權利要求1所述的方法，其中兩個色譜步驟的各個包括: -使平衡緩衝液流經所述色譜柱； -使所述溶液或所述粗蛋白質洗脫液流經所述色譜柱； -使平衡緩衝液流經所述色譜柱； -任選地使清洗和衛生緩衝液流經所述色譜柱； -任選地使平衡緩衝液流經所述色譜柱； -使用洗脫緩衝液從所述色譜柱中洗脫所述粗蛋白質洗脫液或回收純化的蛋白質， 其中各所述緩衝液包含Bis Tris。
3.權利要求1或2所述的方法，其中各所述緩衝液由不同濃度的相同化學品組成。
4.權利要求1至3中任一項所述的方法，其中各所述緩衝液由BisTris、乙酸、NaCl和水組成。
5.權利要求1至4中任一項所述的方法，其中用於從溶液中純化蛋白質的所述方法僅包括兩個色譜步驟。
6.權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述色譜柱之一是親和色譜柱。
7.權利要求6所述的方法，其中所述親和色譜柱是蛋白質A柱。
8.權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述色譜柱之一是多峰樹脂色譜柱。
9.權利要求1至8中任一項所述的方法,其中步驟(a)進一步包括使用BisTris溶液調節所述粗蛋白質洗脫液的pH。
10.權利要求9所述的方法，其中將所述pH調節至包括6至7的值。
11.權利要求1至8中任一項所述的方法，其中使在步驟(a)結束時獲得的所述粗蛋白質洗脫液直接流經第二色譜柱，而不經受任何處理，如PH調節、緩衝液交換或稀釋。
12.權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述方法包括以下步驟: (a)第一色譜步驟，包括: (i)使平衡緩衝液流經第一色譜柱； (?)使所述溶液流經所述第一色譜柱； (iii)使平衡緩衝液流經所述第一色譜柱； (iv)使清洗和衛生緩衝液流經所述第一色譜柱； (v)使平衡緩衝液流經所述第一色譜柱； (vi)使用第一洗脫緩衝液從所述第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液；和 (vii)任選地使用BisTris溶液調節所述粗蛋白質洗脫液的pH ； 和(b)第二色譜步驟，包括: (i)使平衡緩衝液流經第二色譜柱； (?)使來自步驟(a)的所述粗蛋白質洗脫液流經所述第二色譜柱； (iii)使平衡緩衝液流經所述第二色譜柱；和 (iv)使用第二洗脫緩衝液從所述第二色譜柱中回收純化的蛋白質。
13.權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述第一色譜柱是親和色譜柱。
14.權利要求13所述的方法，其中所述親和色譜柱是蛋白質A柱。
15.權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述第二色譜柱是多峰樹脂色譜柱。
16.權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述方法包括以下步驟: (a)第一色譜步驟，包括: (i)使平衡緩衝液流經第一色譜柱； (?)使所述溶液流經所述第一色譜柱； (iii)使平衡緩衝液流經所述第一色譜柱； (iv)使用第一洗脫緩衝液從所述第一色譜柱中洗脫粗蛋白質洗脫液；和 (V)任選地使用Bis Tris溶液調節所述粗蛋白質洗脫液的pH ； 和 (b)第二色譜步驟，包括: (i)使平衡緩衝液流經第二色譜柱； (?)使來自步驟(a)的所述粗蛋白質洗脫液流經所述第二色譜柱； (iii)使平衡緩衝液流經所述第二色譜柱； (iv)使清洗和衛生緩衝液流經所述第二色譜柱； (v)使平衡緩衝液流經所述第二色譜柱；和 (vi)使用第二洗脫緩衝液從所述第二色譜柱中回收純化的蛋白質。
17.權利要求1至11和16中任一項所述的方法，其中所述第一色譜柱是多峰樹脂色譜柱。
18.權利要求1至11、16和17中任一項所述的方法，其中所述第二色譜柱是親和色譜柱。
19.權利要求18所述的方法，其中所述親和色譜柱是蛋白質A柱。
20.權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述蛋白質是抗體。
21.權利要求20所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
22.權利要求20或21所述的方法，其中所述單克隆抗體選自特異性結合到人β-澱粉樣蛋白質的初原纖維形式上的抗體、特異性結合到細菌表面多糖聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)上的抗體、和特異性結合到⑶38跨膜糖蛋白上的抗體。
23.權利要求1至22中任一項所述的方法，其在步驟(b)之後進一步包括使所述粗蛋白質洗脫液流經膜吸附器的步驟(c )。
24.權利要求23所述的方法，其中所述膜吸附器是耐鹽性相互作用的色譜法膜吸附器。
25.權利要求1至24中任一項所述的方法，其在步驟(b)或(c)之後進一步包括納濾步驟。
26.權利要求25所述的方法，其在所述納濾步驟之後進一步包括超濾和滲濾步驟。
27.權利要求1至15和20至26中任一項所述的方法，其中所述第一洗脫緩衝液包含15至25 mM Bis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸調節至包括3至4的pH。
28.權利要求1至15和20至27中任一項所述的方法，其中所述第二洗脫緩衝液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸調節至包括4至5的pH。
29.權利要求1至15和20至27中任一項所述的方法，其中所述第二洗脫緩衝液包含15至25 mMBis Tris和150至250 mM NaCl，用乙酸調節至包括8至9的pH。
30.權利要求1至11和16至26中任一項所述的方法，其中所述第一洗脫緩衝液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸調節至包括4至5的pH。
31.權利要求1至11和16至26中任一項所述的方法，其中所述第一洗脫緩衝液包含15至25 mMBis Tris和150至250 mM NaCl，用乙酸調節至包括8至9的pH。
32.權利要求1至11、16至26、30和31中任一項所述的方法，其中所述第二洗脫緩衝液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸調節至包括3至4的pH。
33.權利要求2至32中任一項所述的方法，其中平衡緩衝液包含15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸調節至包括7至8的pH。
34.權利要求2至33任一項所述的方法，其中所述清洗和衛生緩衝液包含15至25mMBis Tris和0.9至1.1 mM NaCl,用乙酸調節至包括7至8的pH。
35.權利要求1至34中任一項所述的方法，其中以至少85%的產率回收所述純化的蛋白質。
36.權利要求1至35中任一項所述的方法，其中所述回收的純化的蛋白質表現出至少95%的純度。
37.權利要求1至36中任一項所述的方法，其進一步包括將所述回收的純化的蛋白質配製成藥物組合物的步驟。
38.製備適用於權利要求1至37中任一項所述的方法的緩衝液的方法，其包括以下步驟: i)製得具有15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl的最終濃度的溶液； ii)用乙酸將所述溶液的pH調節至包括7至8的值； iii)收集所述溶液的一半，由此獲得平衡緩衝液； iv)用乙酸將來自步驟(iii)的剩餘一半的溶液的pH調節至包括4至5的值； V)收集步驟(iv)獲得的所述溶液的一半，由此獲得洗脫緩衝液； vi)用乙酸將來自步驟(V)的剩餘一半的溶液的pH調節至包括3至4的值，由此獲得進一步的洗脫緩衝液； vii)收集步驟(iii)獲得的所述平衡緩衝液溶液的一半並加入NaCl以獲得0.9至1.1mM的最終NaCl濃度，由此獲得清洗和衛生緩衝液。
39.製備適用於權利要求1至37中任一項所述的方法的緩衝液的方法，其包括以下步驟: i)製得具有15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl的最終濃度的溶液； ii)用乙酸將所述溶液的pH調節至包括8至9的值； iii)收集所述溶液的四分之一，由此獲得洗脫緩衝液；iv)用乙酸將來自步驟(iii)的剩餘溶液的pH調節至包括7至8的值； V)收集步驟(iv)獲得的所述溶液的三分之二，由此獲得平衡緩衝液； vi)用乙酸將來自步驟(V)的剩餘溶液的pH調節至包括3至4的值，由此獲得進一步的洗脫緩衝液； vii)收集步驟(V)獲得的所述平衡緩衝液的一半並加入NaCl以獲得0.9至1.1 mM (例如I M)的最終NaCl濃度，由此獲得清洗和衛生緩衝液。
40.試劑盒，其包含: Ca)多峰樹脂色譜柱和/或親和色譜柱，例如蛋白質A柱； 和 (b)包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的至少一種緩衝液。
41.試劑盒，其包含: Ca)多峰樹脂色譜柱和/或親和色譜柱，例如蛋白質A柱； 和(b)用於製備包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水組成的至少一種緩衝液的說明書。
42.包含或由BisTris、乙酸、NaCl和水組成的緩衝液用於通過至少一個色譜步驟從溶液中純化蛋白質的用途。
43.權利要求42所述的用途，其中所述色譜步驟是多峰樹脂色譜步驟和/或親和色譜柱，例如蛋白質A柱。
【文檔編號】C07K1/22GK104039808SQ201280067326
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年5月23日 優先權日:2011年11月23日
【發明者】D.迪瑟, L.朗德裡-比爾丹, B.莫特斯 申請人:賽諾菲