源自蜂王漿的降壓肽的製作方法

2023-06-08 19:52:56 2

專利名稱：源自蜂王漿的降壓肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自蜂王漿的蛋白分解物及其製造方法，以及含有該蛋白分解物的食品、經口攝取用製劑。本發明的蛋白分解物具有血管緊張素轉化酶抑制作用、血管舒緩激肽誘發腸管收縮反應增強作用，對高血壓的預防或治療有效。
背景技術：
高血壓症是一種沒有自覺症狀，如果置之不理的話則二次引發心臟病、腦血管病等重大疾病的疾病。高血壓的治療和預防是一個重大的課題。已知血管緊張素轉化酶(以下稱為ACE)與高血壓症關係密切，通過抑制ACE可以預防或治療高血壓。
另一方面，高血壓的預防或治療需要長時間攝取，因此，具有極低的副作用也是一個重要的因素，要求開發預防高血壓的食品。據說蜂王漿是蜜蜂為了養育女王峰而從頭部的下咽頭腺和大顎腺分泌出的一種乳白色的膠狀(ゼリ一狀)物質，作為人的食品攝取的歷史很久，具有滋養、強壯、改善體質等各種作用。對該蛋白質的酶分解物進行了研究，也已經知道了具有ACE抑制活性的源自蜂王漿的肽(特許第3068656號；特開2002-145899；特許文獻3特開2002-338594；Journalof Nutritional Biochemistry 13(2002)，80-86頁；診斷と新薬，第39卷，第2號，2002年，85-90頁；日本食品科學工業會誌，第50卷，第10號457-462頁(2003)；日本食品科學工業會誌，第50卷，第6號286-288頁(2003)；日本食品科學工業會誌，第50卷，第7號310-315頁(2003)；日本食品科學工業會誌，第51卷，第1號34-37頁(2004))。
但是，從通過蜂王漿原材料的水解得到的量和ACE抑制活性的強度、速效性(即効性)、副作用、作用的持續時間、攝取的形狀、保存穩定性的平衡的觀點考慮，這些肽在工業化方面還有改善的餘地。

發明內容
本發明的目的在於提供沒有副作用、具有高血壓預防作用的蛋白分解物、其製造方法、含有該蛋白分解物的食品以及經口攝取用製劑。
本發明的另一個目的在於提供一種具有速效性、效果持續性及保存穩定性的ACE抑制物質、含有該抑制物質的高血壓預防或治療劑。
本發明者對上述問題進行了反覆地研究，結果發現，將生蜂王漿、乾燥蜂王漿進行乙醇沉澱，利用蛋白分解酶、例如胰蛋白酶將得到的變性蛋白質等的蜂王漿材料水解，由此得到可以預防高血壓的蛋白分解物。
另外，本發明的蛋白分解物具有強的ACE抑制作用，具有比從ACE抑制作用預測的更強的高血壓預防或治療作用，推測該作用的一部分是基於具有降壓作用的血管舒緩激肽的分解抑制作用。
該蛋白分解物過敏症等副作用小，是一種源自蜂王漿的安全食品，對正常高值血壓或輕度高血壓等的血壓高的人，具有特別有用的降壓作用或高血壓預防作用，特別適合用作特定保健用食品等的食品。
對正常高值高血壓和輕度高血壓的人給用本發明的蛋白分解物，表明具有顯著的血壓降低作用，並且攝取結束後，血壓緩慢上升，沒有超過攝取前值的反彈，脈搏、體重BMI、血液檢查、尿檢查無異常，沒有乾咳、皮膚症狀、消化器官症狀等可能與蜂王漿分解物具有因果關係的副作用，是一種安全性高的食品。
本發明提供以下發明。
1.一種具有血管緊張素轉化酶抑制作用的蛋白分解物，利用胰蛋白酶處理蜂王漿材料而得到。
2.如上述1所述的蛋白分解物，其中蜂王漿材料是蜂王漿的醇變性蛋白質。
3.一種蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，其中，用下式100×(相對於Gly(1摩爾)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相對於Gly(1摩爾)的蜂王漿材料的Lys(mol))表示的以Gly為基準時Lys的酶分解後的殘存率(摩爾比)為蜂王漿材料的70％以下。
4.一種蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，其中，用下式(相對於Lys(1摩爾)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相對於Lys(1摩爾)的蜂王漿材料的Leu(mol))表示的以Lys為基準時Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的1.3倍以上。
5.如上述3或4所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上(実質的に)不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離胺基酸、鹼性游離胺基酸、具有醇羥基的游離胺基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中選擇的至少一種。
6.如上述5所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)游離酸性胺基酸、及游離鹼性胺基酸。
7.如上述6所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離胺基酸(Asp，Glu)、鹼性游離胺基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羥基的游離胺基酸(Thr，Ser)、游離Ala和游離Gly。
8.如上述3～5任何一項中所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量為35重量％以下，在40℃、2個月的加速試驗條件下其實質上(実質的に)不變色。
9.如上述3～6任何一項中所述的蛋白分解物，其中，利用凝膠透過柱分析實質上(実質的に)未發現分子量10000以上的成分，分子量為約200～約1500的範圍內具有最大的峰，具有分子量為約200～約300的尖峰。
10.如上述3～6任何一項中所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在約700～約6000的範圍內。
11.如上述1～10任何一項中所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下式表示的相關成分(関與成分)含量(％)為35％以上，優選40％以上。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布；30μm細孔徑；250官能團；沒有適用pH範圍全區域。
·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸(デセン酸)的保留時間A1從在T1的洗脫位置(溶出位置)檢測的峰之後到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
12.如上述11所述的蛋白分解物，其中，前述相關成分含量為58±5％。
13.如上述1～12任何一項所述的蛋白分解物，其中，含有以下9種肽中的至少一種Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu；Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；
Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu；14.如上述1～11任何一項所述的蛋白分解物，其中，在使前述蛋白分解物通過具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，用水(級分1，2)、20％甲醇(級分3)、40％甲醇(級分4)、60％甲醇(級分5)、80％乙醇(級分6)、100％乙醇(級分7)洗脫時的級分中，含有級分3～6。
15.如上述14所述的蛋白分解物，其中，在級分3中含有Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu和Thr-Phe組成的組中的至少一種肽，在級分4中含有Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu組成的組中的至少一種肽。
16.一種高血壓的預防或治療劑，其以上述1～15任何一項中所述的蛋白分解物為有效成分。
17.一種食品，其含有上述1～15任何一項中所述的蛋白分解物。
18.如上述17所述的食品，其為高血壓預防用食品。
19.一種經口攝取用製劑，其含有上述1～15任何一項中所述的蛋白分解物。
20.一種高血壓的預防或治療劑，其中，含有從下述7種肽中選擇的至少一種肽作為有效成分Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu；
Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu。
21.一種食品，其含有上述20所述的蛋白分解物。
22.如上述21所述的食品，其為高血壓預防用食品。
23.一種經口攝取用製劑，其含有上述20中所述的至少一種肽。
24.如上述19所述的製劑，其為明確的食品和/或含有輔助物(サプリメント)的食品形態。
25.一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其以上述1～15中的任何一項所述的蛋白分解物為有效成分。
26.如上述1～15中任何一項中所述的蛋白分解物的製造方法，其特徵在於，用胰蛋白酶處理蜂王漿材料。
27.如上述26所述的方法，其特徵在於，用合成吸附劑處理用胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物，除去(1)無機鹽類、和(2)酸性游離胺基酸、鹼性游離胺基酸、具有醇羥基的游離胺基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中選擇的至少一種。
28.如上述26所述的方法，其特徵在於，將用胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去無機鹽和水溶性胺基酸，然後用含水醇洗脫。
29.如上述28所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性粒度分布＞250μm(含有90％以上的粒徑大於250μm的粒子)細孔徑；400官能團；沒有適用pH範圍全區域。
30.一種新型肽，含有以下5種肽中的任何一種
His-Pro-Ala-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。
本發明的源自蜂王漿材料的蛋白分解物通過經口攝取顯示強的ACE抑制作用，對高血壓的預防或治療有效。另外，使用胰蛋白酶作為酶，與使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶時相比可以提高每單位重量的ACE抑制活性及蛋白分解物的收率，可以有效地利用蜂王漿材料。
本發明的蛋白分解物，其中可以作為抗原的分子量2萬以上的蛋白質含量降低，優選的蛋白分解物中幾乎不含有或者完全不含有可以作為抗原的分子量1萬以上的蛋白質。因此，本發明的蛋白分解物可以強力地抑制過敏反應，幾乎沒有發現過敏反應。
而且，本發明和蛋白分解物是一種安全的物質，服用後在進行脈搏、體重、BMI、血液檢查、尿檢查時沒有異常，沒有乾咳、皮膚症狀、消化器官症狀等副作用。
進行了脫鹽操作的本發明的蛋白分解物中，可以作為升壓物質的鹽類，特別是氯化鈉的含量非常低。另外通過脫鹽操作，使游離胺基酸呀糖分等其它的成分的含量降低，使吸溼性或美拉德反應(メイラ一ド反応)等的化學反應得到抑制，可以得到穩定性更高的蛋白分解物。
通過長期攝取本發明的蛋白分解物，可以使血壓緩慢而且持續地降低，對於正常血壓的試驗者可以預防高血壓、及高血壓引起的各種疾病。
本發明的蛋白分解物因為作用持續時間長(8～12小時)，血壓緩慢地降低，因此在服用了該蛋白分解物時，一天的血壓變動小，容易控制血壓。例如如果早晨服用，在活動時間中使血壓降低，睡覺時不使血壓降低，因此，具有血壓高的人服用時的理想的作用方式。另外，服用中止後血壓緩慢地上升，沒有觀察到超過服用前的血壓的反彈。
本發明的蛋白分解物對誘變性(変異原性)試驗及抗原性試驗得到陰性的結果，血壓變動少，或者幾乎不影響脈搏數、體重，是一種安全性好的材料。
本發明的蛋白分解物適合具有高血壓症的危險因子(遺傳性、環境因素等)的正常高值血壓或輕度高血壓的人或高血壓患者攝取。


圖1顯示實施例1的ACE抑制活性的測定結果。
圖2顯示將Gly設為1摩爾時的相對胺基酸組成。
圖3顯示將Lys設為1摩爾時的相對胺基酸組成。
圖4顯示GFC分析結果。
圖5顯示被試驗物質的一次投餵時的收縮壓的變化。
圖6顯示被試驗物質投餵8周時、停藥2周藥時的收縮壓的變化。
圖7顯示按照路線1進行分級的級分號1～7的圖。
圖8顯示與相關成分含量相關的色譜圖的實例。圖8中「比較液」含有色氨酸、甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸及10羥基-δ-2-癸烯酸標準品。另外，檢液是含有級分1～7的本發明的蛋白分解物。
圖9顯示實施例5的收縮壓(全部被測者)的結果。
圖10為顯示分離和製備試樣的流程圖。
具體實施例方式
本發明中，蜂王漿材料是指含有蜂王漿的蛋白質的材料，只要滿足上述條件就可以，沒有限制，例如有生蜂王漿、乾燥蜂王漿、對蜂王漿進行乙醇沉澱、硫酸銨處理、加熱處理等的蛋白改性處理得到的蛋白沉澱物(包括乙醇沉澱物)、或者含有通過提取、過濾、離心分離、色譜等各種方法對蜂王漿進行分級後的蛋白質的材料。
蜂王漿可以是任何一種，可以廣泛使用用於養育女王蜂的蜜蜂分泌的那些蜂王漿。具體地說，蜂王漿是將蜜蜂中的工蜂從下咽頭腺及大顎腺分泌的分泌物混合而成的乳白色的膠狀物質。
源自蜂王漿的蛋白質級分(分畫)可以適合使用將蜂王漿進行醇沉澱而得到的蛋白級分。特別優選使用在製造蜂王漿飲料時作為水不溶性蛋白質副產物而產生的蜂王漿的乙醇變性蛋白質。乙醇變性蛋白質可以是使用約50～約100體積％的乙醇，從蜂王漿中提取癸烯酸等的飲料用生理活性物質後的殘渣的水溶解度小的蛋白質。
本發明的蜂王漿材料的酶分解物可以利用胰蛋白酶進行水解得到。胰蛋白酶有通過胰蛋白酶原的限定水解生成的活性α-胰蛋白酶和β胰蛋白酶，可以使用其中的任何一種。另外，也可以將凝血酶、血纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、尿激酶等基質特異性和催化劑結構相似的胰蛋白酶親緣酶(類縁酵素)作為胰蛋白酶使用。而且，可以使用通過將胰蛋白酶(包含胰蛋白酶親緣酶)的一種以上的胺基酸進行取代、附加、缺失、插入等改性的變異型酶。該變異型胰蛋白酶和胰蛋白酶親緣酶也包含在本發明的蜂王漿材料的酶分解中使用的胰蛋白酶中。胰蛋白酶的來源例如有牛、豬、羊、人等哺乳動物。蜂王漿材料的水解中也可以使用從牛、豬等哺乳動物的胰臟提取的胰蛋白酶，也可以使用通過基因重組而得到胰蛋白酶。
用胰蛋白酶處理蜂王漿材料的條件例如優選可以通過在水性溶劑中在約15℃到約60℃，優選約20℃到約50℃，特別是37℃左右的溫度下進行約1～約72小時，優選約3～約48小時來實施。胰蛋白酶的使用量例如相對於每100g蛋白質為約0.01～約3g，優選約0.05～約1g。胰蛋白酶可以使用游離的酶，也可以使用固定在載體上的酶。胰蛋白酶具體優選可以使用Roche Diagnotics制的來自牛的胰蛋白酶、Novozyme制的來自豬的胰蛋白酶。
酶反應液的pH為約6～約10，優選約7～約9。用胰蛋白酶水解蜂王漿材料時，因為pH慢慢地降低，因此優選使用鹼金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)、鹼金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉、碳酸鉀)、鹼金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀)等的鹼，將pH保持在一定的範圍。
反應液適合使用水，也可以在含有少量的乙醇等水混溶性有機溶劑的含水醇等水性溶劑中進行。
通過對酶分解物的反應液進行加熱處理、以及根據需要進一步進行離心分離、過濾、提取、脫鹽、凍幹或噴霧乾燥等後處理，可以得到本發明的蛋白分解物。例如，使用生蜂王漿或乾燥蜂王漿作為蜂王漿材料的情況下，也可以除去源自蜂王漿的糖分(糖質)等成分。本發明的優選實施方式之一中，本發明的蜂王漿材料的蛋白分解物利用凝膠透過柱測定的分子量為約200～約7000，特別是約250～約6000，具有分子量約200～約300的尖峰，和在分子量約200～1500約範圍內具有最大峰。從凝膠透過柱的測定結果推定的蛋白分解物的推定分子量為約700～約6000，優選約800～約5000。
本發明的另外優選的實施方式之一中，本發明的蜂王漿材料的蛋白分解物實質上(実質的に)不含有糖類、鹽類、和酸性游離胺基酸、鹼性游離胺基酸、具有醇羥基的游離胺基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中選擇的至少一種。如前所述，胰蛋白酶處理蜂王漿材料時，隨著蛋白水解的進行，反應液的pH降低，因此優選添加氫氧化鈉等的鹼，使反應液的pH維持在適合胰蛋白酶的pH為約6～約10，特別是約7～約9。這樣添加的鹼(例如氫氧化鈉)，在酶反應後向反應液中添加酸(例如鹽酸)，將pH調整為約3.5～約7，優選約4～約5.5時，將鹼(例如氫氧化鈉)變成對應的鹽(例如氯化鈉)。這時生成的大量的鹽特別是氯化鈉等的含有鈉的鹽時，鈉是升壓物質，因而優選除去。該脫鹽可以通過例如使用脫鹽柱進行，具體地，使用含有苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的疏水性的合成吸附劑(例如ダイヤイオンHP-20(三菱化學制)、セパビ一ズSP-70(三菱化學制)吸附蛋白分解物，用水清洗除去氯化鈉等的鹽，然後使用甲醇、乙醇、乙腈等適當的有機溶劑進行洗脫，由此可以得到脫鹽的、實質上不含有無機鹽類的蛋白分解物。當在脫鹽中使用合成吸附劑時，例如難以吸附在疏水性的合成吸附劑上的Asp、Glu、Lys、Arg等的酸性或鹼性游離胺基酸等和無機鹽類一起除去，另一方面，Phe、Leu、Ile、Trp、Val等的容易吸附在疏水性的合成吸附劑上的游離胺基酸即使通過脫鹽操作也難以除去。另外，Ser、Thr等的具有醇羥基的游離胺基酸、以及游離Ala，游離Gly等也難以吸附在疏水性的合成吸附劑上，因而和酸性或鹼性的游離胺基酸同樣地容易與無機鹽類一起被除去。
本發明的第一實施方式中，在蜂王漿的蛋白分解物中產生比較多的游離Lys，但通過使用合成吸附劑柱進行脫鹽處理其大部分被水洗除去，因而在用乙醇等洗脫而回收的分級的蛋白分解物中實質上不含有游離Lys。
本發明的另一實施方式中，在蜂王漿的蛋白分解物中也存在大量游離Ala，對於游離Ala，通過使用合成吸附劑柱進行脫鹽處理將其大部分水洗除去，因而在用乙醇等洗脫回收的分級的蛋白分解物中實質上不含有游離Ala。
這裡，所述的「實質上不含有游離胺基酸」是指該游離胺基酸的含量為約0.01μmol/10mg以下，優選為約0.001μmol/10mg以下，更優選為0.0001μmol/10mg以下。
在本說明書中，「酸性胺基酸」是指Glu和Asp，鹼性胺基酸是指Lys、His、Arg，具有醇羥基的胺基酸是指Thr、Ser。
優選的實施方式之一中，本發明的蛋白分解物中的鹽類(特別是氯化鈉)的含量為1重量％以下，更優選0.2重量％以下，進一步優選0.1重量％以下，特別是檢測限以下。
如上所述，通過脫鹽處理使鹼性游離胺基酸、酸性游離胺基酸、醇性游離胺基酸、游離Ala和游離Gly等的濃度降低，但是ACE抑制活性幾乎或完全沒有降低。一般認為這是因為鹼性游離胺基酸、酸性游離胺基酸、醇性游離胺基酸、游離Ala和游離Gly等對ACE抑制活性的貢獻率低。
本發明的優選的另外的一個實施方式中，本發明的蛋白分解物其中在以Gly為基準時Lys的殘存率(以摩爾數比較)為蜂王漿材料的25～70％，30～60％，35～55％，40～50％以下，42～48％，或者44～46％。例如對於本發明的實施例得到的蛋白分解物，酶分解前的蜂王漿材料(乙醇沉澱物)相對於Gly(1摩爾)，Lys為(1.09摩爾)酶分解物(用填充有合成吸附劑的柱脫鹽後，回收的樣品)相對於Gly(1摩爾)，Lys為(0.49摩爾)濃度降低，根據數學式1計算Lys的殘存率，結果為100×(0.49/1.09)＝44.95％。
儘管根據蜂王漿材料、分解條件的不同多少有變動，但是在通過利用合成吸附劑吸附蛋白分解物進行脫鹽時，很明顯游離Lys的含有濃度和原來的(相もと )分解物相比降低了。
本發明的優選的其它的一個實施方式中，本發明的蛋白分解物其中在以Lys為基準時Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的約1.3～約3.5倍，例如為約1.5～約3倍，約1.7～約2.7倍或約2～約2.5倍。例如對於本發明的實施例得到的蛋白分解物，酶分解前的蜂王漿材料(乙醇沉澱物)相對於Lys(1摩爾)，Leu為(1.08摩爾)酶分解物(用填充有合成吸附劑的柱脫鹽後，回收的樣品)相對於Lys(1摩爾)，Leu為(2.49摩爾)因此，當根據數學式1計算Lys的殘存率(摩爾基準)時，結果為2.49/1.08＝約2.3倍在本發明的蛋白分解物中，比未分解的分子量高的蛋白質、胰蛋白酶等殘留時，根據需要可以利用超濾等除去。
本發明的優選的其它的一個實施方式中，優選本發明的蛋白分解物中源自蜂王漿的糖分含量低。糖分含量只要不影響蛋白分解物的品質就可以，沒有特別限定。通常為35重量％以下，優選30重量％以下，更優選25重量％以下。糖分例如有葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖等單糖或二糖。這些糖分在保存時和蛋白分解物緩慢反應(例如メイラ一ド反応 )，從而使蛋白分解物變成褐色，或導致吸溼性升高，因此希望儘可能地除去。
本發明的蛋白分解物可以通過在酶處理後優選進行脫鹽處理來製造，進一步通過柱等處理收集ACE抑制活性更強的級分也可以。並且，根據需要通過反覆進行同樣的提純，可以分離具有ACE抑制作用的肽，分離或濃縮該生理活性肽，用作具有ACE抑制作用的蛋白分解物。
對於ACE抑制肽而言，例如，將本發明的蛋白分解物施加至合成吸附劑或凝膠過濾劑、分子篩、反相色譜等中，利用水、甲醇、乙醇、或其混合液這樣的適當洗脫液進行洗脫，分離成各種級分，對ACE抑制活性強的級分利用通常的製備型HPLC等方法分離肽，通過結構鑑定，由此可以分離ACE抑制活性強的肽。
本發明的優選的一個實施方式中，將蜂王漿材料進行胰蛋白酶處理，使處理後的蛋白分解物吸附在作為合成吸附劑之一的HP-20柱上，根據下述路線1，可以分級成7個級分。
另外，本說明書中，有時將級分簡寫為Fr或P。例如級分4可以寫作Fr4或P4。
路線1蜂王漿蛋白水解液855ml(相當於凍乾物50g)↓加載到ダイヤイオンHP20(柱尺寸φ11cm×20cm、容量約1.9L)上↓洗滌液使用水3260mL↓洗脫液20％、40％、60％、80％、100％MeOH↓·20％甲醇使用2460mL↓·40％甲醇使用2340mL↓·60％甲醇使用2720mL↓·80％甲醇使用2300mL↓·100％甲醇使用3200mL洗滌液及各洗脫液↓使用蒸發器(40℃)濃縮各濃縮液↓凍幹水洗滌級分級分1和220％甲醇洗脫級分級分340％甲醇洗脫級分級分460％甲醇洗脫級分級分580％甲醇洗脫級分級分6100％甲醇洗脫級分級分7
將根據上述路線1分級的級分No.1～7的收率和ACE抑制率表示在以下表1中，將級分1～7的圖示於圖7。
表1

*各級分的試樣溶液的反應液濃度為0.5mg/mL。抑制率的測定根據後述的實施例1所述的方法進行。
優選含有上述的級分中的級分3～6的製品。也可以含有級分7，但因為級分7的收率少，所以含有級分3～6的蛋白分解物具有充分的降壓作用。另外，級分1，2儘管可以顯示ACE抑制作用，但是因為含有胺基酸和無機鹽類(例如NaCl)，所以不需要包含在本發明的蛋白分解物中。
本發明的蛋白分解物，當通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(商品名三菱化學公司制MCI-GEL，CHP55Y)的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下述式表示的相關成分含量(％)為35％以上，優選40％以上，更優選50％以上，進一步優選50～70％，特別優選58±5％、最優選58±3％。
·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間A1從在T1的洗脫位置檢測的峰之後到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布；30μm細孔徑；250官能團；沒有適用pH範圍全區域柱(4.6mmφ×150mm)在上述A1中，主要含有級分4和級分5。
蜂王漿蛋白水解物(檢測樣)的相關成分含量的測定例如可以在以下的條件(試驗方法)下進行。
試驗方法稱量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)溶解，做成50mL。用薄膜過濾器(0.45μL)過濾該溶液，將濾液作為檢液(検液)。
或者，稱量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10ml及磷酸緩衝液(pH8.0)1)10mL進行溶解，再添加水15ml和稀醋酸2)5mL充分地振蕩，添加水做成50mL。用薄膜過濾器(0.45μL)過濾該溶液，將濾液作為檢液。
另外，稱量1mg色氨酸3)及甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸4)5mg，添加醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH4.0)5)5mL進行溶解，再添加水，做成10mL，作為A液。
稱量10-羥基-δ-癸烯酸標準品6)5mg，添加水/甲醇混合液(1∶1)0.5ml進行溶解。在該溶液中添加A液0.5ml，充分混合，作為比較液。
對於試液和比較液分別取50μL，在下述操作條件下進行液相色譜測定。將比較液的色氨酸及10-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間設為T1及T2，測定從在試液的T1的洗脫位置檢測的峰之後到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和A1及全部的峰面積的總和AT，利用下式求得相關成分含量。
相關成分含量(％)＝A1/AT×100操作條件檢測器紫外吸光光度計(測定波長275nm)柱內徑4.6mm，長度150mm的不鏽鋼管中填充了30μm的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物7)。
柱溫50℃附近的恆定溫度流動相A水/甲醇混合液(199∶1)B甲醇/水混合液(19∶1)流速*1ml/min梯度條件0分→10分B.CONC 8％ 保持10分 →12分B.CONC 8％→50％ 直線12分 →22分B.CONC 50％保持22分 →30分B.CONC 50％→90％ 直線30分 →45分B.CONC 90％保持45.01分→55分B.CONC 8％ 保持面積測定範圍10-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間的約1.5倍的範圍*對於流速和梯度條件，進行適當地調整，以滿足下述系統適合性。
系統適合性系統的性能對於比較液50μL，在上述的操作條件下進行液相色譜測定，按照色氨酸、甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸、10-羥基-δ-2-癸烯酸的順序洗脫，色氨酸和甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸的分離度為3以上，甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸和10-羥基-δ-2-癸烯酸的分離度為5以上。
注1)磷酸緩衝液(pH8.0)按照日本食品添加物標準(食品添加物公定書)進行配製。
2)稀醋酸按照日本食品添加物標準進行配製。
3)L-色氨酸使用C11H12N2O2，和光純藥工業株式會社公司制的試劑特級或同等品質的產品。
4)甘氨醯-L-亮氨醯-L-酪氨酸使用C17H25N3O5，フルカ(リ一デル？デ？ハ一ン)公司制的含量98％以上或同等品質的產品。
5)醋酸-醋酸鈉緩衝液(pH4.0)將醋酸鈉三水合物5.44g溶解在水900ml中，滴加醋酸(100)，將pH調整為4.0之後，添加水稀釋到1000ml。
6)10-羥基-δ-2-癸烯酸標準品使用(E)-10-羥基-δ-2-癸烯酸標準品(C10H18O3)，和光純藥工業株式會社公司制的或同等品質的產品。
(7)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物使用三菱化學公司制的MCI-GEL CHP55Y或同等品質的產品。
與相關成分含量有關的色譜圖如圖8所示。
下面，對級分3～6的相關成分(肽)的分離和其鑑定按如下進行。
(a)大口徑柱進行的分級HPLC條件柱TSK-gel ODS 120T 55mmφ×300mm東ソ一柱TSK-gel ODS 120T 45mmφ×300mm東ソ一流動相水/乙腈混合液/0.05％TFA流量42mL/min柱溫室溫檢測波長220nm*乙腈濃度7～25％、50％(洗出)(b)中口徑柱進行的分級HLPC條件柱COSMOSIL-5C18-AR II 20mmφ×250mmナカライテスク和/或COSMOSIL-5C18-AR II 10mmφ×250mmナカライテスク流動相水/甲醇混合液/0.05％TFA流量8mL/min或2mL/min柱溫40℃檢測波長220nm*甲醇濃度等度(イソクラテイツク)方式2～35％、50％(洗出)梯度方式 A液0％(0.05％TFA)、B液50％(c)各製備液(分取液)的純度的確認HLPC條件
檢測器紫外分光光度計(測定波長220nm)柱COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ×250mmナカライテスク流動相水/甲醇混合液/0.05％TFA流量0.4mL/min柱溫40℃*甲醇濃度2～40％
(d)分離製備的試樣(級分數)參見圖10。
(e)ACE抑制率的測定對於純度85％以上的級分的295個檢測樣測定ACE抑制率。
另外，純度為85％以下的樣品也測定一部分。
ACE抑制率的測定方法試料溶液(反應液中濃度0.1mg/mL) 25μL↓ACE溶液(來自兔肺的血管緊張素I轉化酶25mU/mL)50μL預溫育(プレインキユベ一ト)37℃-5min↓底物溶液(馬尿醯-L-組氨醯-L-亮氨酸12.5mM)50μL溫育(インキユベ一ト)37℃-60min↓鹽酸(9→200)125μL↓內標液(m-馬尿酸0.625mM)100μL↓乙酸乙酯750μL↓渦流混合機10秒×2離心分離(2000rpm，5min)↓有機層500μL↓在60℃、氮氣氣流下乾燥↓流動相500μL↓用渦流混合機溶解將20μL注入HPLCHLPC條件
檢測器紫外分光光度計(測定波長228nm)柱L-column ODS 4.6mmφ×150m，化學物質評價研究機構流動相0.01M磷酸緩衝液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)流量1.0mL/min柱溫40℃注射量20μL
(f)構成胺基酸的測定對於分離量為2mg以上或ACE抑制率為20％以上的級分166檢測樣，在酸水解之後測定胺基酸濃度，求得構成胺基酸。
構成胺基酸的測定方法酸水解法-1不含色氨酸的分離肽
試料溶液(1mg/ml 50％甲醇溶液)50μL↓使用Pico-Tag(Waters)在減壓條件下乾燥(室溫)殘留物↓+6mol/L鹽酸溶液(含有1％苯酚)0.2mL(放入小反應瓶中)↓使用Pico-Tag法水解(110℃、22小時)↓冷卻後↓使用Pico-Tag(Waters)在減壓條件下乾燥(室溫)殘留物↓+0.02mol/L鹽酸試液0.25mL(稀釋5倍)20μL/胺基酸分析酸水解法-2不含色氨酸的分離肽
試料溶液(1mg/ml 50％甲醇溶液)50μL↓使用Pico-Tag(Waters)在減壓條件下乾燥固化(室溫)殘留物↓+4mol/L甲磺酸溶液(含有0.2％的色胺)20μL↓+水0.2mol/L(放入小反應瓶中)↓利用Pico-Tag法水解(110℃、22小時)↓冷卻後↓+4mol/L氫氧化鉀溶液22μL↓使用Pico-Tag在減壓條件下乾燥固化(室溫)殘留物↓+0.05mol/L鹽酸試液0.25mL(稀釋5倍)20μL/胺基酸分析
胺基酸分析條件
(利用茚三酮反應的合成後標記(ポストラベル)法)裝置L-8500形日立高速胺基酸分析計柱4.6mmID×80mm日立カスタムイオン交換樹脂(#2622SC，Lot No.K99272)(Na型、高分離分析、梯度法)緩衝液日立高速胺基酸分析計用緩衝液L-8500PH-KIT(三菱化學或和光純藥公司制)V1PH-1(PH-1500mL中添加乙醇(99.5)65mL和水，做成1000mL)V2PH-2V3PH-3(未使用)V4PH-4V5PH-RG反應液茚三酮試液-L8500組(セツト)(光純藥公司制)流量緩衝液0.26mL/min反應液0.30mL/min注射量20μL測定波長570nm(Pro440nm)(g)胺基酸序列的測定基於ACE抑制率和構成胺基酸的測定結果，對ACE抑制率比較高、胺基酸的構成比較明確、構成胺基酸數為2～6個的分離物18個檢測樣利用LC-MS/MS法進行胺基酸序列的解析。
利用LC-MS/MS法進行構造解析的操作條件試料溶液的配製法分別在超純乙腈(1∶1)400μL中溶解，用0.01％甲酸溶液/乙腈(1∶1)稀釋至約100μg/mL及約25μg/mL的濃度。
HPLC條件使用儀器1100Series(Agilent Technologies)柱Cadenza CD-C18，3μm，2mmφ×50mm
流動相A液0.01％甲酸溶液B液0.01％甲酸溶液/乙腈(10∶90)0.01M磷酸緩衝液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)洗脫條件0～8minB液8％8～12min B液90％12～13min B液8％流量0.1mL/min柱溫40℃注射量5μLMS和MS/MS的操作條件使用儀器API4000(Applied Biosystems/MDS Sciex)柱Turbo ion spray(正，positive)噴霧器氣體18psi氣簾氣體(カ一テンガス)10psi離子噴霧電壓5500V噴嘴電壓適當設定測定質量範圍適當測定碰撞氣體Level 4(氮氣)碰撞氣體能量適當設定產品離子測定範圍適當設定測定結果在上述(d)顯示的1548個檢測樣中，以簡易測定的HPLC純度為基準，對295個檢測樣測定ACE抑制活性，以該結果為基準，對166個檢測樣進行胺基酸分析，測定其組成。另外，對於胺基酸序列而言，測定18個檢測樣，可以鑑定RJ蛋白水解物中含有的9種肽的結構。
表2

具體地，對ACE抑制活性率比較高、胺基酸構成比較明確、構成胺基酸數為2～6的18個檢測樣，利用LC/MS/MS進行胺基酸序列的解析。
結果，可以鑑定結構的是9個檢測樣(I～IX)，從HP-20的粗級分的Fr3部分可以鑑定3種肽，從Fr4部分可以鑑定6種肽。
將它們的結構式及從ACE抑制率的測定結果求得的ACE抑制活性IC50值示於下述的表3中。
表3

本發明的蛋白分解物(含有作為有效成分或相關成分的鑑定的前述7種肽。以下相同)可以調整到等電點的pH後，作為游離(自由)的蛋白質分解物使用，或者從等電點調整至酸性或鹼性的pH之後，通過凍幹、噴霧乾燥等除去溶劑，或者添加乙醇等的溶劑使其沉澱等方法，由此可以得到酸加成鹽(鹽酸鹽等無機酸鹽或富馬酸鹽等有機酸鹽)或鹼鹽(例如Na，K等的鹼金屬鹽)的形式。鹼鹽優選儘可能抑制作為升壓物質的鈉的含量的那些。這樣的蛋白分解物可以在溶液形態下使用，通常優選以固體物質，例如結晶、非晶形或粉末的形態分離，使用。
本發明的蛋白分解物本身可以作為食品使用，或單獨使用，或和適當的無毒經口攝取用載體、稀釋劑或成形劑一起做成片劑(未包衣片、糖衣片、泡騰片、薄膜包衣片、咀嚼片等)、膠囊劑、錠劑、粉末劑、細粒劑、顆粒劑、液劑、懸濁液、乳濁液、糊劑、霜液、注射劑(包括添加到胺基酸輸液、電解質輸液等的輸液中的情況)、或者可以做成腸溶性的片劑、膠囊劑、顆粒劑等緩釋型製劑等的食品用或醫藥用製劑。前述製劑中的蛋白分解物的含量可以適當的選擇，一般是0.01～100重量％範圍。
另外，通過添加配合本發明的蛋白分解物(蜂王漿酶分解物)可以配製的食品的具體形態例如有飲料類(清涼飲料(咖啡、可可飲料、果汁、礦物質飲料、茶飲料、綠茶、紅茶、烏龍茶等)、乳飲料、乳酸菌飲料、酸乳飲料、碳酸飲料、酒類(日本米酒、洋酒、果酒、蜂蜜酒等)等)、塗在麵包上的軟質食品(スプレツド)(乳蛋糕乳脂、加糖奶油漿、花生漿、巧克力漿、塗抹乾酪等)、糊狀物(果泥、蔬菜泥、芝麻糊、海藻糊等)、洋點心(巧克力、油炸圈餅、餡餅、奶油麵包、手指形小蛋糕、鬆餅、華夫餅乾、口香糖、膠姆糖、果凍、糖果、曲奇餅、克力架、餅乾、方便點心、蛋糕、布丁等)、日式點心(飴糖、日本脆餅乾、油炸糖點心、米雪、米粉團、牡丹餅、年糕餅、豆餅、餅、餡、饅頭、蛋糕、豆沙水果涼粉、羊羹等)、冰果(冰激淋、冰棍、果子露冰激淋、刨冰等)、殺菌罐頭食品(咖喱、牛肉飯、中華飯、雜飯、稀粥、調料、湯、肉沙司、半冰沙司、肉球、漢堡、雜燴類、紅小豆米飯、烤雞肉串、蒸雞蛋羹等)、速食食品(方便麵、速食烏龍麵、速食蕎麥麵、速食炒麵、速食義大利實心面、速食混沌面、速食年糕小豆湯、調料精、粉末湯精、果汁粉混料、混合熱糕點(ホツトケ一キミツクス)等)、瓶裝食品及罐裝食品、膠狀食品(果凍、瓊脂、陶罐裝食品(テリ一ヌ)、膠狀飲料等)、調料(食鹽、天然鹽、醬油、日本甜料酒、醋、砂糖、蜂蜜、味精、調料品、增香調料(旨味調味料)、複合調料、沙司、蛋黃醬、調味番茄醬(ケチヤツプ)、往振動添加的粉末食品(ふりかけ)、天麩羅料汁(天つゆ)、面汁(麵つゆ)、即食肉湯、中華清湯料、中華湯料(麻婆豆腐料、青椒肉絲料)、肉湯、烤肉佐料、冷火鍋佐料、咖喱油糊(カレ一ル一)、燉菜用油糊(シチユ一のル一)等)、蜂產品(蜂蜜、蜂王漿、蜂膠、花粉糰子(花粉だんご)、幼蜂等)、乳製品(牛奶、乳酪、酸奶、生奶油等)、經加工果實(果醬、橘皮果醬、糖水水果(シロツプ漬)、乾果等)、經加工蔬菜(蔬菜醬等)、穀物類加工食品(面、義大利麵條、麵包、米粉等)、醃菜(鹹菜、柰良泡菜、朝鮮泡菜、福神泡菜、醃蔥、醃白菜、芥末醃菜、醃結縷草、少鹽醃菜、醃漬品等)、醃菜料(即食醃菜原料、醃白菜原料等)、魚肉製品(魚糕、圓筒狀魚糕、魚肉山芋餅等)、畜肉製品(火腿、紅腸、臘腸、臘肉等)、好吃的食品(槍烏賊(さきするめ)、鱈魚(さきタラ)、醃海膽(ウニの塩辛)、醃墨斗魚、醃章魚、冠鱗單棘純的味醂幹(カワハギみりんぼし)、河豚的啉醂幹、燻墨斗魚、醃海參腸等)、乾物(帶味海苔等)、日常食品類(拌菜、油炸食品、炒菜、燒菜、煮菜、醋拌食品等)、冷凍食品(炸蝦、炸肉餅、春卷、炸豬排、燒麥、餃子、漢堡、章魚糰子、含豆醬的日本鬆餅(回転焼き)、肉包子、有餡饅頭等)、油脂食品(色拉油、人造黃油、黃油)等。通過添加配合本發明的蜂王漿蛋白分解物可以配製的食品也可以作為保健食品、功能性食品、營養輔助補品、輔助品、特定保健用食品、病人用食品·病人用組合食品(厚生勞動省、特別用途食品的一種)或高齡者用食品(厚生勞動省、特別用途食品的一種)，這種情況下，也可以做成未包衣片、薄膜包衣片、糖衣片、顆粒、粉末、藥片、膠囊(硬膠囊和軟膠囊中的任何一種)、咀嚼類、糖漿類、藥水類等。添加配合有本發明的蜂王漿酶分解物的食品的配製可以使用公知的方法。
含有本發明的蛋白分解物的特定保健用食品等對血壓正常高值血壓(收縮壓為130～139mmHg，舒張壓為85～89mmHg)以及輕度高血壓(收縮壓為140～159mmHg或者舒張壓為90～99mmHg)的兩類人均具有預防高血壓的效果。
本發明的蛋白質分解物具有理想的特性對輕度高血壓及正常高值血壓的被測者具有特別明顯的降壓效果，但是，對正常或低血壓的被測者的血壓幾乎沒有影響，或者只有輕微的作用。
本發明的蛋白質分解物經口攝取可以直接被口腔黏膜或胃腸管吸收，或者，在胃腸管中水解而被吸收之後，顯示強的持續的ACE抑制作用，為了預防高血壓症、緩和高血壓傾向或調節血壓，可以繼續攝取，可以用作預防高血壓的功能性食品、特別是保健用食品等。為了該目的使用本發明的蛋白分解物或製劑時，一般來說體重60kg的成人一天經口攝取10mg～10g、優選0.1～5g、更優選0.5～3g、特別優選0.5～1g。
另外也可以將本發明的蛋白質分解物與蜂王漿、蜂膠、蜂蜜、花粉、幼蜂等並用，或混合使用。
本發明的蛋白質分解物幾乎或完全沒有過敏反應等副作用，作用持續時間長、一天攝取一次(給藥)可以顯示充分的降壓作用。而且，雖然具有速效性，但是沒有血壓快速降低、或大量飲用時血壓大副度降低的問題，具有安全性高的降壓作用。另外對人具有優良的降壓作用。
具體實施例方式
下面，使用實施例進一步詳細地說明本發明。
實施例1(1)蜂王漿原材料的蛋白分解物的配製將1g乾燥蜂王漿(蛋白質含量0.4g)溶解在10ml的蒸餾水中，調節pH為8後，相對蜂王漿原材料添加0.25重量％的胰蛋白酶(源自牛胰臟、Roche公司制)，溫育24小時。對開始溫育3小時、6小時、及24小時後的樣品測定ACE抑制率。反應液的pH通過添加氫氧化鈉使其維持在pH8左右。
使用胰凝乳蛋白酶(pH7)或胃蛋白酶(pH2)代替胰蛋白酶，同樣溫育24小時，對開始溫育3小時、6小時、及24小時後的樣品，按照下述(2)測定ACE抑制率。
(2)ACE抑制活性的測定將如上所述得到的蛋白分解物4mg/mL(反應液濃度0.8mg/mL)25μl放入試管中，向其中添加源自兔肺的25mU/mL ACE溶液*1·硼酸緩衝液(pH8.3)100μl，在37℃溫育5分鐘。添加12.5mM的馬尿醯-L-組氨醯-L-亮氨酸(Hippuryl-L-histidyl-L-Leucine)(HHL、ペプチド研究公司制)*2·硼酸緩衝液(pH8.3)50μl作為底物，在37℃溫育60分鐘。然後，添加0.5M鹽酸溶液125μl使反應停止，添加0.625mM的m-甲基馬尿酸乙腈溶液*3100μl作為內標液，為了提取反應生成物的馬尿酸添加乙酸乙酯750μl，之後，利用渦流混合機攪拌，離心分離(2000rpm，5min)。取其有機層0.5mL，在60℃氮氣流下蒸發乾燥固化，將殘留物溶解在HPLC用流動相0.5mL中，做成試樣溶液。
另外將硼酸緩衝液(pH8.3)*425μl放置在試管中，向其中添加源自兔肺的25mU/mL ACE溶液*1·硼酸緩衝液(pH8.3)*450μl，在37℃溫育5分鐘後，以下和試樣溶液進行同樣的操作，做成標準溶液。另外，將硼酸緩衝液(pH 8.3)75μl放置在試管中，在37℃溫育5分鐘。然後，以下和試樣溶液進行同樣的操作，作為空白試驗。對於試樣溶液、標準溶液和空白試驗液20μl在下述條件下利用HPLC方法進行測定。求得各自的馬尿酸對m-甲基馬尿酸的峰面積比。
HPLC條件
檢測器UV(測定波長228nm)柱L-column ODS 4.6mm×150mm(財團法人化學物質評價研究機構制)柱溫40℃流動相10mK KH2PO4(pH3.0)/乙腈＝17/3流量1.0mL/min注射量20μL根據HPLC法得到的各自的馬尿酸的峰面積對m-甲基馬尿酸的峰面積的比，按照以下所示的式子計算抑制率(IC(％))。
抑制率(IC(％))＝{(Rs-Rt)/(Rt-Rb)}×100Rs；試樣溶液的馬尿酸的峰面積對m-甲基馬尿酸的峰面積的比Rt；標準溶液的馬尿酸的峰面積對m-甲基馬尿酸的峰面積的比Rb；空白試驗液的馬尿酸的峰面積對m-甲基馬尿酸的峰面積的比*125mU/mL ACE溶液在源自兔肺的血管緊張素I轉化酶(シグマ公司制)0.25U或1U/小瓶(vial)中添加pH8.3硼酸緩衝液1mL、溶解(0.25U或1U/mL、冷凍保存)。
將該液用pH8.3硼酸緩衝液進行適當地稀釋，配製25mU/mL溶液(用時配製)。
*212.5mM的Hip-His-Leu(底物溶液)在馬尿醯-L-組氨醯-L-亮氨酸(HHL·H2O、分子量447.8、ペプチド研究所制)中添加pH8.3硼酸緩衝液，在沸騰水浴中加熱3分鐘，溶解，配製12.5mM溶液。
{HHL·H2O 5.5935g+pH8.3硼酸緩衝液1mL12.5mM(用時配製)}*3內標液(3→25000)在m-甲基馬尿酸(分子量193.20)12mg中加入水/乙腈混合液(91)，溶解，作成100mL，作為內標液(冷藏保存)。
*4pH8.3硼酸緩衝液A液0.2M硼酸溶液(含有0.3M氯化鈉)硼酸12.4g+氯化鈉17.5g+水→1000mLB液0.05M四硼酸鈉溶液(含有0.3M氯化鈉)在A液中添加B液，將pH調整為8.3(冷藏保存)。
結果示於表4及圖1。
表4ACE抑制率(反應液中濃度0.8mg/ml)

從上述結果可知，利用胰蛋白酶的水解物其ACE抑制活性最強。
另外，在溫育24小時後的酶分解物中，通過SDS-PAGE分子量20000以上的蛋白質在本發明的蛋白分解物中幾乎沒有發現，但是胃蛋白酶分解物及胰凝乳蛋白酶分解物中作為譜帶得到確認。
而且，使用COSMOSIL-5C18-AR-300(4.6×150mm)蛋白質分離用ワイドポアカラム作為柱通過HPLC法進行色譜分析時，發現蛋白分解物的生成肽量以胰蛋白酶為最多。
由上述結果確認了胰蛋白酶最優選。
實施例2使用通過在生蜂王漿中添加乙醇而沉澱的蜂王漿的乙醇變性蛋白質代替1g乾燥蜂王漿(蛋白質含量0.4g)，和實施例1同樣進行24小時處理。求得該胰蛋白酶處理物的ACE抑制率，得到和實施例1的蜂王漿幾乎同等的ACE抑制率。
將利用胰蛋白酶處理24小時的反應液調整為pH4.5，加載到合成吸附劑(セパビ一ズSP-70(三菱化學制))上，水洗，除去氯化鈉和酸性或鹼性的游離胺基酸以及糖類等之後，用乙醇洗脫，得到脫鹽的本發明的蛋白分解物。
對於實施例1使用的乾燥蜂王漿(乾燥RJ)、實施例1得到的該脫鹽前的胰蛋白酶分解物(脫鹽前；乾燥RJ-酶)、實施例2使用的蜂王漿的乙醇變性蛋白質(RJ變性)、該蛋白分解物(脫鹽前(RJ-變性-酶)；及脫鹽後，柱吸附後的洗淨級分(1W)、柱吸附物的乙醇洗脫級分(1E)的胺基酸組成比，對於各樣品的胺基酸組成而言，將甲磺酸分解後的分解物、或游離胺基酸進行薄膜過濾器過濾(孔徑；0.45μm)過的濾液分別進行胺基酸濃度測定(日立L-8500型高速胺基酸分析計)，進行比較研究。結果示於表5，表6，表7，圖2和圖3。另外，表5和圖2是將Gly設為1摩爾時的相對值，表6和圖3是將Lys設為1摩爾時的相對值，表7分別顯示游離胺基酸的測定值。從結果確認利用柱處理，酸性或鹼性的游離胺基酸、游離Ala、游離Gly被水洗除去，在柱吸附級分中較多地分布著游離的芳香族及脂肪族的胺基酸。
表5酸水解後的胺基酸 (摩爾比、對照；Gly)

表6酸水解後的胺基酸 (摩爾比、對照；Lys)

表7游離胺基酸(測定值；μmol/10mg)

另外，取進行24小時處理後的胰蛋白酶分解物25mg，添加流動相20mL，進行超聲波處理，使之溶解，做成25mL，對於其10mL，進行下述的凝膠透過色譜(GFC)分析，測定分子量分布。
GFC分析
柱TSKgel G2000SWXL7.8mmI.D.×30cm流動相0.1％TFA/乙腈流速1.0mL/min柱溫25℃檢測UV(220nm)將GFC分析結果示於表4。
實施例3蜂王漿(RJ)蛋白水解物的相關成分的結構分析取蜂王漿的乙醇變性蛋白100g，根據實施例1所述的方法，在pH8.0的條件下，利用胰蛋白酶在37℃下進行24小時酶分解。將反應液在沸騰水浴中加熱30分鐘，使酶失去活性之後，用鹽酸調整至pH4.5，離心分離(10000rpm、20分鐘)，將得到的上清液用薄膜過濾器過濾，得到RJ蛋白水解物1160mL。
將得到的RJ蛋白水解液按照上述路線使用ダイヤイオンHP20，用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇及甲醇(100％)洗脫，得到級分1(Fr1)～級分7(Fr7)。
然後，將由級分3～6鑑定的9個相關成分(肽)的分離和鑑定的詳細情況列在下面蜂王漿蛋白水解物的相關成分的分離、鑑定1.分離鑑定肽HP20 Fr3級分單離肽IGlu-Trp-Lys(P30615-1)單離肽IIHis-Pro-Ala-Leu(P30615-3-7-3)
單離肽IIIThr-Phe(P30618-3-3)HP20 Fr4級分單離肽IVSer-Pro-Leu(P40408-3-2)單離肽VAsn-Leu-Tyr(P41219-2-1)單離肽VILeu-Ser-Tyr(P41210-4-1-2)單離肽VIIThr-Pro-Phe(P41211-3)單離肽VIIISer-His-Ser-Gly-Leu-Tyr(P40323-3-4)單離肽IXTyr-Ser-Pro-Leu(P40528-3-2)2.相關成分鑑定用檢測樣的配製(1)蜂王漿蛋白水解物的配製在蜂王漿乙醇變性蛋白100g中添加1200mL水，邊在37℃的水浴中攪拌邊添加20％的氫氧化鈉溶液，調節到pH8.0，添加胰蛋白酶250mg，用1mol/L氫氧化鈉試液使其保持pH8.0，同時在37℃下酶分解24小時之後，在沸騰水浴中加熱30分鐘。在其中加入稀釋的鹽酸(1→2)調節到pH4.5，進行離心分離(10000rpm，20分鐘)之後，將得到的上清液用薄膜過濾器過濾，得到蜂王漿蛋白水解液1160mL。(2)利用ダイヤイオンHP20進行粗分級將蜂王漿蛋白水解液855mL裝載在填充有作為合成吸附劑的ダイヤイオンHP20的玻璃柱(11cmφ×20cm，容量約1.9L)中，按照水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇及100％甲醇的順序洗脫，將水洗脫級分設定為級分(以下稱Fr)1，2，將20％、40％、60％、80％及100％甲醇洗脫級分分別設定為Fr3，4，5，6及7。用蒸發器使各分級液濃縮後，凍幹，將得到的Fr3級分(5.38g)，Fr4級分(8.34g)，Fr5級分(11.58g)及Fr6級分(4.84g)作為相關成分鑑定用的檢測樣。
3.蜂王漿蛋白水解物的相關肽(関與ペプチド)的分離、鑑定(1)來自Fr3級分的相關肽的分離、鑑定單離肽IGlu-Trp-Lys(P30615-1)
對於利用HP20進行粗分級的Fr3級分，通過利用高效液相色譜法使用大口徑的製備用ODS柱[柱TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流動相7％，15％，25％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量42mL/mL，柱溫室溫，檢測波長UV220nm。以下，稱為HPLC]進行再分級。
對於Fr3級分約4g，分階段地變換流動相[7％乙腈(含有0.05％TFA)0～94分，15％乙腈(含有0.05％TFA)94～121分，25％乙腈(含有0.05％TFA)121～135分，50％乙腈(含有0.05％TFA)135～]進行再分級，向保留時間為(以下稱為Rt)為61.5～83.4分及98.0～112.4分得到的分級液中添加乙醇並濃縮，反覆進行該操作至TFA臭味消失為止，之後用少量的水溶解殘留物，凍幹，得到P3(6)(級分3的第6峰)(0.471g)，及P3(8)(級分3的第8峰)(0.107G，供肽III的分離用)。
對於P3(6)(0.471g)，使用中口徑的半製備用ODS柱[COSMOSIL5C18AR-II 20mmφ×250mm]，在流量8mL/mL，柱溫40℃，檢測波長UV220nm的條件下，通過在流動相A中使用0.05％TFA，流動相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的濃度梯度法(0分Bconc 0％→360分Bconc75％)，製備分離Rt為57.6～77.1分及84.2～100.9分的峰部分，將得到的製備液分別進行濃縮、凍幹，得到製備提純物P30615-1(35.7mg)及P30615-3(107.0mg，供給肽II的分離)。
對得到的P30615-1，利用HPLC進行純度分析，以及酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P30615-1的結構確定為Glu-Trp-Lys。
分離肽IIHis-Pro-Ala-Leu(P30615-3-7-3)對純度低的先前的P30615-3(107.0mg)，再次使用中口徑的半製備用ODS柱，將流動相從8％甲醇(含有0.05％TFA)變換為50％甲醇(含有0.05％TFA)(61.3分)，製備分離(分取)Rt為68.9分～70.2分的峰部分，進行濃縮、凍幹，得到P30615-3-7(9.2mg)。
對於P30615-3-7(9.2mg)，再在使用口徑小並且分離能力高的ODS柱的條件下[柱COSMOSIL 5C18AR-II 10mmφ×250mm，流動相8％甲醇(含有0.05％TFA)，流量2mL/mL，柱溫40℃，檢測波長UV220nm]，對Rt為57.1～59.8分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到製備的提純物P30615-3-7-3(0.7mg)。
對得到的P30615-3-7-3利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P30615-3-7-3的結構確定為His-Pro-Ala-Leu。
分離肽IIIThr-Phe(P30618-3-3)對於通過大口徑的ODS柱進行再分級得到的P3(8)(0.107g)，使用中口徑半製備用ODS柱，在與分離肽I相同的條件下通過濃度梯度法，對Rt為82.6分～92.0分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P30618-3(12.2mg)。
對P30618-3(12.2mg)，再使用口徑小的ODS柱(內徑10mm)，使用10％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為39.7份～45.2份的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P30618-3-3(3.7mg)。
對得到的P30618-3-3，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P30618-3-3的結構確定為Thr-Phe。
(2)來自Fr4級分的相關肽的分離、鑑定分離肽IVSer-Pro-Leu(P40408-3-2)對於利用HP20進行粗分級的Fr4級分(8.34g)約5g，通過使用大口徑的製備用ODS柱的高效液相色譜法[柱TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流動相10％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量42mL/mL，柱溫室溫，檢測波長UV220nm]進行再分級。
對於流動相為10％乙腈(含有0.05％TFA)，將Rt為52.1～83.5分以及118.9～179.0分的分級液進行濃縮、凍幹，得到P4(2)(級分4的第2峰)(0.536g)和P4(4)(級分4的第2峰)(不進行凍幹，濃縮乾燥固化後，供給肽V～VIII的分離)。另外，在179分後將流動相變換為50％乙腈(含有0.05％TFA)，將Rt為179.0～205.0的分級液進行濃縮、凍幹，得到P4(5)(2.162g，供給肽IX的分離)。
對於P4(2)(0.536g)，再次使用大口徑的製備用ODS柱，將8％乙腈(含有0.05％TFA)作為流動相，將Rt為76.2～90.2分的分級液進行濃縮、凍幹，得到P40121-13(91.4mg)。
對得到的P40121-13(91.4mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為42.6～51.6分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P40408-3(12.1mg)。
對得到的P40408-3(12.1mg)，再次使用中口徑的半製備用ODS柱，通過在流動相A中使用0.05％TFA、在流動相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的濃度梯度法(0分Bconc 0％→360分Bconc100％)，對Rt為95.1～99.1分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到製備分離的提純物P40408-3-2(1.2mg)。
對得到的P40408-3-2，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P40408-3-2的結構確定為Ser-Pro-Leu。
分離肽VAsn-Leu-Tyr(P41219-2-1)對於使用大口徑的製備用ODS柱進行再分級而得到的P4(4)，再次使用大口徑的製備用ODS柱，使用10％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相進行再分級，對從Rt為63.0～82.7分、82.7～108.0分、108.0～126.5分、以及141.0～163.4分得到的各分級液進行濃縮、凍幹，分別得到P41206-3(133.1mg，供給肽VIII的分離)、P41206-4(177.8mg)、P41206-5(74.2mg，供給肽VI的分離)、和P41206-7(41.7mg，供給肽VII的分離)。
對得到的P41206-4(177.8mg)100mg，使用中口徑的製備用ODS柱，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為121.9～153.5分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P41219-2(23.38mg)。
對得到的P41219-2-2(23.38mg)，再次在相同條件下進行製備分離、提純操作，從Rt為118.3～142.9分的峰部分，得到P41219-2-1(12.3mg)。
對得到的P41219-2-1，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P41219-2-1的結構確定為Asn-Leu-Tyr。
分離肽VILeu-Ser-Tyr(P41210-4-1-2)對通過大口徑製備用ODS柱進行二次再分級操作得到的P41206-5(74.2mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，使用17％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，製備分離Rt為65.5分～80.7分的峰部分，並進行濃縮乾燥固化，得到P41210-4(未進行凍幹)。對得到的P41210-4再次在同一條件下進行製備分離、提純操作，從Rt為63.5～85.3分的峰部分得到P41210-4-1(12.7mg)。
另外，對得到的P41210-4-1(12.7mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，使用15％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為92.0分～102.7分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到製備分離的提純物P41210-4-1-2(5.18mg)。
對得到的P41210-4-1-2，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P41210-4-1-2的結構確定為Leu-Ser-Tyr。
分離肽VIIThr-Pro-Phe(P41211-3)對通過大口徑製備用ODS柱進行二次再分級操作得到的P41206-7(41.7mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，使用15％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為70.4分～88.6分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P41211-3(5.8mg)。
對得到的P41211-3，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P41211-3的結構確定為Thr-Pro-Phe。
分離肽VIIISer-His-Ser-Gly-Leu-Tyr(P40323-3-4)對通過大口徑製備用ODS柱進行二次再分級操作得到的P41206-3(133.1mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，使用13％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為73.1分～84.8分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P40323-3(10.5mg)。
另外，對得到的P40323-3(10.5mg)，使用ODS柱(內徑10mm)，使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)作為流動相，對Rt為73.9分～77.1分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到製備分離的提純物P40323-3-4(1.0mg)。
對得到的P40323-3-4，利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P40323-3-4的結構確定為Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。
分離肽IXThr-Ser-Pro-Leu(P40528-3-2)對通過大口徑製備用ODS柱進行再分級操作得到的P4(5)(2.162g)，再次使用大口徑的製備用ODS柱，使用15％乙腈(含有0.05％TFA)作為流動相，進行再分級，對Rt為60.0分～70.0分的分級液進行濃縮、凍幹，得到P40413-5(75.8mg)。
對得到的P40413-5(75.8mg)，使用中口徑的半製備用ODS柱，通過在流動相A中使用0.05％TFA，流動相B中使用50％甲醇(含有0.05％TFA)的濃度梯度法(0分Bconc30％→360分Bconc 100％)，對Rt為75.4～86.0分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到P40528-3(5.9mg)。
另外，對得到的P40528-3(5.9mg)，在流動相中使用22.5％甲醇(含有0.05％TFA)的單一溶劑，再次利用中口徑的半製備用ODS柱，對Rt為43.4～46.4分的峰部分進行製備分離、提純操作，得到製備分離的提純物P40528-3-2(1.6mg)。
對得到的P40528-3-2利用HPLC進行純度分析，並在酸水解後進行胺基酸分析，基於得到的構成胺基酸的比率利用LC/MS/MS進行結構分析，將P40528-3-2的結構確定為Tyr-Ser-Pro-Leu。
實施例4蛋白質分解物的活體內試驗(大鼠)I.一次經口給用時的血壓降低作用1)被測物質使用蜂王漿(RJ)的乙醇變性蛋白質為原料，與實施例2相同，配製用胰蛋白酶處理RJ乙醇變性蛋白後脫鹽的分解物，供以下的試驗用。
2)使用的動物採購CrjSHR(雄性、八周齡、日本チヤ一ルスリバ一)，檢疫馴化飼養後，在九周齡(體重235-260g)時用於試驗。大鼠在金屬絲網5個串聯籠(5連ケ一ジ)的1個隔間(1區畫)中分別飼養，在調節為溫度23±2℃、溼度30～70％、換氣次數12次以上/小時、照明時間12小時(照明期6:30～18:30)的環境的動物飼養室內飼養，使其自由地攝取固體飼料(CRF-1、オリエンタル酵母工業(株))及自來水。
3)試驗方法在試驗時使用了一組六隻SHR。RJ變性蛋白質水解物用注射用蒸餾水溶解，一次以10mL/kg的用量進行經口投喂。向對照組同樣投餵注射用蒸餾水。將大鼠放入設定為40℃的保溫箱內，進行十分鐘的加溫後，使用血壓計(TK-370C、ニュ一ロサイエンス)，利用tail cuff法在清醒的狀態下測定血壓(收縮壓、平均血壓及舒張壓)及心率數。血壓的測定在投餵RJ變性蛋白水解物前和投餵4、8、12、16、20及24小時後進行。
4)統計處理數據利用平均值±標準偏差表示。與對照組的顯著性差異(有意差)的檢定，利用一元配置進行分散分析，在確認顯著性差異的情況下，在RJ變性蛋白水解物和對照組之間進行Dunnett型多重比較檢定。另外，顯著性水平(有意水準)設為5％(解析軟體StatView，SAS InstituteInc.制)。
5)結果1、收縮壓圖5中表示了投餵RJ變性蛋白水解物前和投餵4、8、12、16、20及24小時後測定的收縮壓的變化。對照組及RJ變性蛋白水解物3g/kg組的投餵前的收縮壓分別為226±6及225±7mmHg。對照組的收縮壓到投餵24小時後顯示大致恆定的值，並在217～229mmHg的範圍內變化。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的收縮壓在投餵4～16小時後，在比對照組低10～20mmHg的值範圍內變化，投餵8、12及16小時後的收縮壓與對照組相比，明顯地降低。
2、平均血壓測定投餵RJ變性蛋白水解物前和投餵4、8、12、16、20及24小時後測定的平均血壓的變化。對照組及RJ變性蛋白水解物3g/kg組投餵前的平均血壓分別為173±4及166±4mmHg。對照組的平均血壓到投餵24小時後顯示大致恆定的值，並在164～176mmHg的範圍內變化。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的平均血壓在投餵8～20小時後，在比對照組低10～17mmHg的值的範圍內變化，投餵16小時後的平均血壓與對照組相比，明顯地降低。
3、舒張壓測定投餵RJ變性蛋白水解物前和投餵4、8、12、16、20及24小時後測定的舒張壓的變化。對照組及RJ變性蛋白水解物3g/kg組投餵前的舒張壓分別為150±4及139±4mmHg。對照組的舒張壓到投餵24小時後顯示大致恆定的值，並在140～151mmHg的範圍內變化。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的舒張壓在投餵8及12小時後，在比對照組低10～13mmHg的值的範圍內變化，投餵8小時後的舒張壓與對照組相比，明顯地降低。
4、心率數測定投餵RJ變性蛋白水解物前和投餵4、8、12、16、20及24小時後測定的心率數的變化。對照組及RJ變性蛋白水解物3g/kg組投餵前的心率數分別為468±15及445±6次/分。對照組及RJ變性蛋白水解物3g/kg組對心率數沒有明顯的影響。
II.連續經口投餵八周時的血壓降低作用1)被檢物質使用蜂王漿(RJ)乙醇變性蛋白質為原料，與實施例2相同，配製用胰蛋白酶處理RJ乙醇變性蛋白後脫鹽的分解物，供以下的實驗用。
2)使用的動物採購CrjSHR(雄性、八周齡、日本チヤ一ルスリバ一)檢疫馴養後，在九周齡(體重235-260g)時進行試驗。大鼠在金屬絲網5個串聯籠的1個隔間中分別飼養，在調節為溫度23±2℃、溼度30～70％、換氣次數12次以上/小時、照明時間12小時(照明期6:30～18:30)的環境的動物飼養室內飼養，使其自由地攝取固體飼料(CRF-1、オリエンタル酵母工業(株))及自來水。
3)試驗方法在實驗時使用了一組11隻SHR。被檢物質用注射用蒸餾水溶解，以一日一次20ml/kg的用量進行八周經口投喂。向對照組同樣投餵注射用蒸餾水。將大鼠放入設定為40℃的保溫箱內，進行十分鐘的加溫後，使用血壓計(TK-370C、ニュ一ロサイエンス)，利用tail cuff法在清醒的狀態下測定血壓(收縮壓、平均血壓及舒張壓)及心率數。在開始投餵被檢物質前和開始投餵後每周測定一次、投餵八小時後進行測定。另外，在投餵期間結束1及2周後同樣測定血壓及心率數。每周測定一次體重。
實驗組1、對照組(投餵蒸餾水)2、RJ乙醇變性蛋白水解物(3g/kg)3、RJ乙醇變性蛋白(3g/kg)4)統計處理結果利用平均值±標準偏差表示。組間比較使用Dunnett型多重比較檢定進行解析。以風險率(危険率)小於5％判定為顯著。
5)結果
1.收縮壓圖6中表示出了投餵被測物質八小時後每周進行一次測定的收縮壓的變化。投餵蒸餾水的對照組的收縮壓隨試驗期間的經過而上升，從投餵前到投餵4周後血壓以約10mmHg/周的比例上升，以後直至試驗期間結束，血壓以約2～5mmHg/周的比例上升。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的收縮壓在投餵三周後為止以與對照組大致相同的變化顯示血壓上升，但在投餵四周後以後的期間，與對照組相比，顯示抑制血壓上升的圖形。投餵5周後的收縮壓為207±3mmHg，然後，直至投餵期間結束(投餵八周後)，在比對照組的收縮壓低約10mmHg的值的範圍內變化。在投餵7周後及八周後的收縮壓分別為214±3mmHg、210±3mmHg，與對照組相比，明顯的降低。投餵結束後，在停藥一周後為217±3mmHg，停藥二周後為221±2mmHg，漸漸恢復至與對照組相同水平的收縮壓。
另外，RJ變性蛋白3g/kg組的收縮壓以和投餵期間中對照組同樣的變化發生變動。停藥期間的收縮壓也顯示和對照組相同水平的血壓。
2、平均血壓在投餵被測物八小時後每周一次測定平均血壓的變化。對照組的平均血壓隨試驗期間的經過而上升，在到投餵三周後為止，以約10mmHg/周的比例上升。投餵4周後的平均血壓為158±4mmHg，以後直至投餵期間結束，血壓以163～170mmHg的值變化。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的平均血壓在投餵2周後為止，顯示與對照組相同的血壓上升，但投餵3周後，與對照組相比，顯示抑制血壓上升的圖形。投餵3周後的平均血壓為153±2mmHg，其後，直至投餵期間結束，在比對照組的平均血壓低約10mmHg的值的範圍內變化。投餵7周後及八周後的平均血壓分別為161±2mmHg及158±1mmHg，與對照組相比，明顯降低。在投餵結束後的停藥期間，停藥一周後為165±2mmHg，停藥二周後為164±3mmHg，漸漸恢復至與對照組相同水平的平均血壓。RJ變性蛋白3g/kg組的平均血壓為167±2mmHg，與對照組的平均血壓的程度相同。停藥期間的平均血壓也顯示與對照組同樣的水平。
3、舒張壓在投餵被測物八小時後每周一次測定舒張壓的變化。對照組的舒張壓隨試驗時間的經過而上升，在到投餵三周後為止，血壓以約10mmHg/周的比例上升。在到投餵3周後為止的舒張壓為137±5mmHg，以後直至試驗期間結束，以140～144mmHg的值變化。RJ變性蛋白水解物3g/kg組的舒張壓在投餵3周後為止，顯示與對照組相同的血壓上升，但在投餵3周後以後的期間，與對照組相比，顯示抑制血壓上升的圖形。投餵3周後的舒張壓為132±3mmHg，以後直至投餵期間結束，在比對照組的舒張壓低約10mmHg的值的範圍內變化。投餵8周後的舒張壓與對照組相比，明顯地降低。在投餵結束後的停藥期間，停藥一周後為140±3mmHg，停藥二周後為135±3mmHg，漸漸恢復至與對照組相同水平的舒張壓。RJ變性蛋白3g/kg組的平均血壓顯示和對照組基本同樣的血壓變動圖形。投餵結束後也和對照組具有相同水平的血壓。
4、心率數、體重在投餵被測物八小時後每周一次測定心率數和體重。在整個實驗期間，各組的心率數和體重增加沒有大的變動，RJ變性蛋白水解物和RJ變性蛋白對心率數和體重增加沒有明顯的影響。
實施例5蛋白質分解物的活體內試驗(人)1)被測物質和實施例2同樣，得到RJ乙醇變性蛋白的胰蛋白酶分解物，按照上述路線1使其吸附在ダイヤイオンHP20後，水洗除去級分1和2，然後用80％乙醇洗脫，製備含有級分3～6的本發明的蛋白分解物，供以下實驗用。
2)被驗者對相當於從正常高值血壓到輕度高血壓(血壓值收縮壓130～159mmHg、舒張壓85～99mmHg)的人67名，按照收縮壓、舒張壓、年齡、性別均勻地分成四組。在各組間，其年齡、血壓、脈搏數、身高、體重、肥胖指數(BMI)方面，沒有發現明顯差別。
3)試驗食物及攝取方法使用在每一片中配合了含有級分3～6的上述蜂王漿蛋白分解物166.7mg設計的片劑(以下，稱為試驗食物)，和不配合蜂王漿蛋白分解物的片劑(以下稱為空白對照劑(プラセボ))。
表8中顯示各試驗食物的營養成分表。
表8試驗食物的營養成分(每1片)

攝取進行4周，在攝取2周前和1周前、攝取開始日、攝取1周後、2周後、3周後和4周後、以及攝取結束1周後總共檢查8次。
試驗食物如表9所示與空白對照劑組合，蜂王漿蛋白分解物攝取量設定為0mg/天、500mg/天、1000mg/天及5000mg/天，在早晚飯後分別食用15片試驗食物，總共1天攝取30片。
表9試驗食物的攝取方法

4)檢查方法和統計處理對所有的被測者一起測定血壓、脈搏數、體重和身高，進行血液檢查、尿檢查、醫學檢查及問診。數據用平均值數據±標準偏差表示。對於血壓、脈搏數、體重、BMI的比較而言，進行Bonferroni多重比較檢定。對收縮壓的測定結果示於圖9。
5)結果和考察1、收縮壓4組間並行進行4周連續攝取試驗，結果表明在1000mg/天的攝取組中，和攝取日比較，在攝取1周後和4周後收縮壓明顯降低，在5000mg/天攝取組中也發現攝取3周後和4周後收縮壓明顯降低。
從上述結果可知，本發明的蛋白分解物的降壓作用與用量相關。
另外，在任何一組中，在攝取結束後試驗食物組的收縮壓緩慢地恢復，都沒有發現過度超過攝取前值的反彈現象。
2、其它的檢查項目在尿檢中，Na和K一天的預測排洩量沒有發現變化，說明了本發明蛋白分解物的降壓作用不受食鹽攝取量的影響，而是與蛋白分解物有關。
有關各種血液檢查、其它的尿檢查(蛋白、潛血、尿膽素原)、體重和BMI的各檢查項目，沒有醫學意義上的變動。
特別是被認為有害的現象(副作用)在任何攝取量都沒有發現。由此表明本發明的蛋白分解物安全性高。
實施例6蛋白質分解物對舒緩激肽收縮的影響(豚鼠(モルモツト)取出的迴腸)1)被測物質和實施例2同樣，得到RJ乙醇變性蛋白的胰蛋白酶分解物，按照上述路線1使其吸附在ダイヤイオンHP20後，水洗除去級分1和2，然後用80％乙醇洗脫，配製含有級分3～6的本發明的蛋白分解物，供以下實驗用。
對照試劑的エナラプリル(ACE抑制劑)從SIGMA公司購買。級分3，4，5和エナラプリル溶液在注射用蒸餾水(大塚製藥(株))溶解。由級分3～6構成的蜂王漿蛋白分解物(RJ-H)和級分6不溶於蒸餾水，因而溶解在硼酸緩衝液(pH8.3)中後使用。對於各被測物質，配製30mg/ml溶液作為原液，用注射用蒸餾水稀釋，對預定濃度的溶液(最終濃度3，10，30，100，300μg/ml)進行試驗。
2)試驗材料採購Harley系豚鼠(雄性、六周齡、日本エスエルシ一)，在屏障系統的環境下在調節為溫度(23±2℃)、溼度(55±15％)、換氣(次數15次/小時以上)及照明(12時間照明從上午7點到下午7點)的環境的動物飼養室內，通過自由攝取食物及水進行預飼養(馴化)，馴化結束後，豚鼠用乙醚麻醉，擊打頭部將其放血致死，取出腸管(迴腸)，利用通常的方法製成長度約2cm的筒型標本。標本馬上放置在加溫至27℃的臺羅德氏溶液(タイロ一ド液)中。另外，用作營養液的臺羅德氏溶液的組成如下所述。
137mM NaCl，2.7mM KCl，1.8mM CaCl2，1.1mM MgCl2，0.4mMNaH2PO4，11.9mM NaHCO3，5.5mM葡萄糖，3)試驗方法在裝滿臺羅德氏溶液(15ml)的馬克納斯管中懸垂標本，加載靜止張力約1g，利用等滲性張力轉換器(MODEL ME-4013，株式會社エム·イ一·コマ一シヤル，東京)，在記錄器(MULTICORDER MC6625，GRAPHTEC，橫濱)上記錄腸管的運動。使用舒緩激肽(5ng/ml)作為收縮藥，用單一濃度反覆添加收縮藥，使標本收縮，收縮反應近於穩定之後添加被檢物質，2分鐘後，添加收縮藥測定張力。在27℃下進行試驗，設定1組4個標本。相對於臺羅德氏溶液15ml，被檢物質及收縮藥分別添加0.15ml(稀釋100倍)。關於收縮高的計算，分別在記錄紙上測定收縮藥單獨產生的收縮高和由添加被檢物質時的收縮藥產生的收縮高，用後者相對於前者(對照)的比率(增強率％的對照)算出。
4)統計處理測定結果利用平均值±標準偏差表示。使用從各被檢物質的用量作用曲線(EXSAS一次回歸直線)看到直線性的4用量(10～300μg/ml或0.3～10μM)，求出使舒緩激肽收縮增強30％的濃度(AC30；30％增強)。結果示於表10。從下述結果可知，本發明的蛋白分解物具有舒緩激肽增強作用。
表10

以下說明含有本發明的蛋白質分解物的處方例。
處方例1(粒)利用通常的方法，將下述原料混合，用打片儀器成型，製造了8mm直徑的未包衣片。利用通常的方法使該未包衣片在食品上進行薄膜包衣，完成了粒狀的健康食品。
(每1粒的組成)表11

處方2(飲用藥水)將下述材料放於水中充分攪拌之後，使總量為100ml。
(1瓶的組成)表12

處方3(膠囊劑)將下述材料均勻混合，通過60目的篩之後，將該全部粉末填充在2號明膠膠囊中。
(1個膠囊劑的組成)
表13

處方4(顆粒)利用通常的方法，將下述材料製成顆粒狀，做成棒狀的鋁分包(アルミ分包)包裝。
(1個顆粒的組成)表14

處方5(沙司)將下述材料充分混合，使用時充分攪拌，在沙拉或油炸食品中使用。
(1人量的組成)表15

權利要求
1.一種具有血管緊張素轉化酶抑制作用的蛋白分解物，通過用胰蛋白酶處理蜂王漿材料而得到。
2.如權利要求1所述的蛋白分解物，其中蜂王漿材料是蜂王漿的醇變性蛋白質。
3.一種蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，其中，用下式100×(相對於Gly(1摩爾)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相對於Gly(1摩爾)的蜂王漿材料的Lys(mol))表示的以Gly為基準時的Lys的酶分解後的殘存率(摩爾比)為蜂王漿材料的70％以下。
4.一種蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，其中，用下式(相對於Lys(1摩爾)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相對於Lys(1摩爾)的蜂王漿材料的Leu(mol))表示的以Lys為基準時的Leu的含有比例(摩爾比)為蜂王漿材料的1.3倍以上。
5.如權利要求3或4所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離胺基酸、鹼性游離胺基酸、具有醇羥基的游離胺基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中選擇的至少一種。
6.如權利要求5所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)游離酸性胺基酸、及游離鹼性胺基酸。
7.如權利要求6所述的蛋白分解物，其源自蜂王漿材料，實質上不含有(1)無機鹽類，和(2)酸性游離胺基酸(Asp，Glu)、鹼性游離胺基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羥基的游離胺基酸(Thr，Ser)、游離Ala和游離Gly。
8.如權利要求3～5任何一項中所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量為35重量％以下，在40℃、2個月的加速試驗條件下其實質上不變色。
9.如權利要求3～6任何一項中所述的蛋白分解物，其中，利用凝膠透過柱分析實質上未發現分子量10000以上的成分，分子量為約200～約1500的範圍內具有最大的峰，具有分子量為約200～約300的尖峰。
10.如權利要求3～6任何一項中所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在約700～約6000的範圍內。
11.如權利要求1～10任何一項中所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通過具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)時，由下式表示的相關成分含量(％)為40％以上，·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性粒度分布；30μm細孔徑；250官能團；沒有適用pH範圍全區域，·相關成分含量(％)＝A1/AT×100T1色氨酸的保留時間T210-羥基-δ-2-癸烯酸的保留時間A1從在T1的洗脫位置檢測的峰之後到在T2的洗脫位置檢測的峰之前的峰面積的總和AT所有的峰面積的總和。
12.如權利要求11所述的蛋白分解物，其中，前述相關成分含量為58±5％。
13.如權利要求1～12任何一項所述的蛋白分解物，其中，含有以下9種肽中的至少一種Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu；Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu 。
14.如權利要求1～11任何一項所述的蛋白分解物，其中，在使前述蛋白分解物通過具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，用水(級分1，2)、20％甲醇(級分3)、40％甲醇(級分4)、60％甲醇(級分5)、80％乙醇(級分6)、100％乙醇(級分7)洗脫時的級分中，含有級分3～6粒度分布＞250μm(含有90％以上粒徑大於250μm的粒子)細孔徑；400官能團；沒有適用pH範圍全區域。
15.如權利要求14所述的蛋白分解物，其中，在級分3中含有Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu和Thr-Phe組成的組中選擇的至少一種肽，在級分4中含有Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu組成的組中選擇的至少一種肽。
16.一種高血壓的預防或治療劑，其以權利要求1～15任何一項中所述的蛋白分解物為有效成分。
17.一種食品，其含有權利要求1～15任何一項中所述的蛋白分解物。
18.如權利要求17所述的食品，其為高血壓預防用食品。
19.一種經口攝取用製劑，其含有權利要求1～15任何一項中所述的蛋白分解物。
20.一種高血壓的預防或治療劑，其中，含有從下述9種肽中選擇的至少一種肽作為有效成分Glu-Trp-Lys；His-Pro-Ala-Leu；Thr-Phe；Ser-Pro-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Thr-Pro-Phe；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu。
21.一種食品，其含有權利要求20所述的蛋白分解物。
22.如權利要求21所述的食品，其為高血壓預防用食品。
23.一種經口攝取用製劑，其含有權利要求20中所述的至少一種肽。
24.如權利要求19所述的製劑，其為明確的食品和/或含有輔助物的食品形態。
25.一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其以權利要求1～15中的任何一項所述的蛋白分解物為有效成分。
26.如權利要求1～15中任何一項中所述的蛋白分解物的製造方法，其特徵在於，用胰蛋白酶處理蜂王漿材料。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，用合成吸附劑處理用胰蛋白酶處理而得到的蛋白分解物，除去(1)無機鹽類、和(2)酸性游離胺基酸、鹼性游離胺基酸、具有醇羥基的游離胺基酸、游離Ala和游離Gly組成的組中選擇的至少一種。
28.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，將用胰蛋白酶處理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去無機鹽和水溶性胺基酸，然後用含水醇洗脫。
29.如權利要求28所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性粒度分布＞250μm(含有90％以上粒徑大於250μm的粒子)細孔徑；400官能團；沒有適用pH範圍全區域。
30.一種新型肽，含有以下5種肽中的任何一種His-Pro-Ala-Leu；Asn-Leu-Tyr；Leu-Ser-Tyr；Tyr-Ser-Pro-Leu；Ser-His-Ser-Gly-Leu-Tyr。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白分解物，其具有血管緊張素轉化酶抑制作用，通過用胰蛋白酶處理蜂王漿原材料而得到。
文檔編號C12P21/02GK1690219SQ20051000944
公開日2005年11月2日 申請日期2005年2月16日 優先權日2004年2月12日
發明者柳田正 申請人:株式會社山田養蜂場