蝦青素合成酶的製作方法

2023-06-02 15:21:56

專利名稱：蝦青素合成酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組生產類胡蘿蔔素和其中有用的生物物質。
Phaffia rhodozyma(P.rhodozyma)是生產蝦青素的生成胡蘿蔔素的酵母菌株。蝦青素分布於各種種類的生物體中，如動物(鳥如火烈鳥和scarletibis，和魚如虹鱒和鮭魚)，藻類和微生物。同樣認識到蝦青素具有強烈的抵抗氧自由基的抗氧化特性，氧自由基可期望用於藥物用途以保護活細胞抵抗一些疾病、如癌症。另外，蝦青素作為色劑的工業需要增加了，特別是在養殖魚(如鮭)的工業中，因為蝦青素給予動物明顯的桔紅色，並且能夠滿足市場上消費者的要求。
已知P.rhodozyma是作為生產蝦青素的生成胡蘿蔔素的(carotenogenic)酵母菌株。不同於其它生成胡蘿蔔素的酵母、紅酵母屬的種，P.rhodozyma可以發酵一些糖如D-葡萄糖。這是來自工業應用的觀點的重要特徵。在最近的分類學研究中，發現了P.rhodozyma的有性循環，並且以Xanthophyllomyces dendrorhous的名稱命名了它的遠距離刺激變形態(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。已經進行了從P.rhodozyma獲得蝦青素的超級生產者的一些菌株的改良研究，但在這十年中，已經限制這樣的努力為利用常規誘變和原生質體融合的方法。最近，Wery等人利用P.rhodozyma開發了宿主載體系統，其中利用非複製質粒以多拷貝整合進入P.rhodozyma的核糖體DNA的基因組(Wery等人，基因，184，89-97，1997)。Verdoes等人報導了更加改良的載體以便獲得P.rhodozyma的轉化體以及它的編碼催化從香葉焦磷酸到β-胡蘿蔔素的反應的酶的三個胡蘿蔔素生成基因(WO97/23633)。
胡蘿蔔素生成的特異的生物合成途徑在重要的中間產物，法尼焦磷酸(FPP)的點從一般的類異戊二烯途徑中分支(


圖1)。通過P.rhodozyma中由crtE編碼的香葉焦磷酸(GGPP)合酶縮合FPP和IPP以便生成GGPP。然後，通過起到八氫番茄紅素合酶和由crtBY編碼的番茄紅素環化酶和crtI由編碼的八氫番茄紅素去飽和酶的雙倍作用的酶的連續反應將GGPP轉化成β-胡蘿蔔素。
在細菌中，已經分離了參與葉黃素形成的酶和基因並且詳細地鑑定了特徵。由crtZ編碼的β-胡蘿蔔素羥化酶參與了β-胡蘿蔔素的β紫羅酮環的兩個末端的兩個羥化步驟。從各種生物體如噬夏孢歐文氏菌，(Misawa等人，細菌學雜誌，172，6704-6712，1990)，黃桿菌的種(L.Pasamontes等人，185(1)，35-41，1997)和Agrobacterium aurantiacum(Misawa等人，細菌學雜誌，177(22)，6575-6584，1995)中克隆了crtZ基因。由crtW編碼的β-胡蘿蔔素酮酶催化了將氧代基團導入β-胡蘿蔔素的β-紫羅酮環的兩個末端的兩個步驟。Kajiwara等人從Haematococcus bluvialis克隆和測定了對應於真細菌中crtW的bkt基因的序列(Kajiwara等人，P.Mol.Biol.，29，343-352，1995)。Harker等人也從聚球藍細菌PCC7942克隆和測定了對應於真細菌中的crtW的crtO基因的序列(Harker等人，FEBS通訊，404，129-134，1997)。羥化酶和酮酶這兩種酶具有廣泛的底物特異性，並且這保證了在兩種酶依據反應條件在同時反應的情況中，形成各種葉黃素(
圖1)。
如上所述，分離參與從FPP形成β-胡蘿蔔素的所有基因，但在P.rhodozyma中在蛋白質和DNA的水平上還沒有鑑定出參與從β-胡蘿蔔素形成葉黃素的最後步驟的酶和基因。雖然Johnson等人(Crit.Rev.Biotechnol，11(4)，297-326，191)通過假設由它們分離的一些葉黃素化合物是蝦青素生物合成的中間產物而提出存在兩條獨立的生成蝦青素的途徑，但不能證明這兩條獨立的途徑，因為不能分離出參與這樣的途徑的酶和基因。另外，不能排除的是，這些葉黃素化合物可能已經產生於這些化合物的分離步驟中的實驗的人為現象。不能從P.rhodozyma分離出在由β-胡蘿蔔素到蝦青素的生物合成途徑中積累中間產物的突變體使得難于澄清從β-胡蘿蔔素到蝦青素的生物合成途徑。
本發明涉及參與由β-胡蘿蔔素到蝦青素的蝦青素生物合成的最後步驟的基因和酶。
本發明提供了分離的DNA，特別是cDNA，所述DNA含有編碼參與在P.rhodozyma中由β-胡蘿蔔素到蝦青素的反應的蝦青素合酶的核苷酸序列，類似於AST基因。
在一個優選的實施方案中，可以鑑定克隆的DNA片段的特徵在於(a)所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO1中所述的胺基酸序列的所說的酶，或
(b)所說的核苷酸序列編碼選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個胺基酸的添加、插入、缺失和/或取代並具有所述的酶活性的酶的所說酶的變體。
在另一個優選的實施方案中，分離的cDNA片段可以來源於Phaffiarhodozyma的基因，並且選自(i)SEQ ID NO2表示的cDNA序列；(ii)SEQ ID NO2表示的cDNA序列的同類編碼或等位基因變體；和(iii)具有一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失和/或取代並且編碼具有所說酶活性的多肽的SEQ ID NO2表示的cDNA序列的衍生物。
在本發明的另一個優選的實施方案中涉及了如上所述的分離的cDNA，其特徵在於所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO2表示的核苷酸序列；(ii)由於遺傳密碼的簡併性，編碼具有與由核苷酸序列(i)編碼的相同的胺基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標準雜交條件下與來自i)或ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
仍然在另一個優選的實施方案中，分離的基因組DNA片段可以起源於Phaffia rhodozyma的基因，並且選自(i)SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列；(ii)SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列的同類編碼或等位基因變體；和(iii)具有一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失和/或取代並且編碼具有所述酶活性的多肽的SEQ ID NO3表示的基因組DNA序列的衍生物。
在本發明的另一個優選的實施方案中涉及了如上所述的分離的基因組DNA，其特徵在於所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO3表示的核苷酸序列；(ii)由於遺傳密碼的簡併性，編碼具有與由核苷酸序列(i)編碼的相同的胺基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標準雜交條件下與來自i)或ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
本發明的另一方面提供了通過如上所述的克隆的DNA片段表達可得的具有參與P.rhodozyma中β-胡蘿蔔素到蝦青素的反應的蝦青素合成酶活性的重組多肽。
本發明的重組多肽的一個優選的實施方案的特徵在於(a)所說的多肽具有如SEQ ID NO1所述的胺基酸序列，或(b)所說的多肽是(a)中定義的肽的變體，所述多肽選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個胺基酸的添加、插入、缺失和/或取代並且具有所述的酶活性的酶。
所以，本發明也涉及本案件中的多肽的變體。這樣的變體是在本發明的胺基酸序列的基礎上通過添加，插入，缺失和/或取代一個或多個所述序列的胺基酸殘基來定義的，其中這樣的衍生物仍然具有與本發明相應的多肽相同的酶活性類型，或它們是公知的等位基因變異現象的結果。通過本領域已知的任何測試或本文的具體敘述可以測量這樣的活性。通過本領域已知的化學肽合成，或通過現有技術中已知的方法如Sambrook等人(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)公開的，採用在如本文公開的DNA序列的基礎上的重組手段可以生產這樣的變體。通常不改變所述分子活性的蛋白質和肽中胺基酸的交換是本領域已知的並且例如H.Neurath和R.L.Hill在「蛋白質」(學術出版社，紐約，1979，特別參見圖6，14頁)中敘述的。最常發生的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Thy/Phe，Ala/Pro，Lys/Art.Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及相反的交換。
另外，本發明不僅涉及如在序列表中公開的DNA序列及其互補鏈，而且涉及包括這些序列的那些序列，所述的這些序列為在標準條件下與所述序列或其片段雜交的DNA序列和由於遺傳密碼的簡併性，在標準條件下與所述序列不雜交但卻編碼確實具有相同的胺基酸序列的多肽的DNA序列。
在這篇文章中雜交的「標準條件」是指本領域的技術人員通常用於檢測特異性雜交信號並且如Sambrook等人(s.a.)所述的條件，或優選的所謂的嚴格雜交和非嚴格洗滌條件，或更優選本領域技術人員熟悉的所謂的嚴格雜交和嚴格洗滌條件，以及如Sambrook等人(s.a.)所述的條件，或更優選所謂的中等嚴格條件，例如遵照製造商給出的方案使用DIG(洋地黃毒苷)標記試劑盒和Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的發光檢測試劑盒並且用雜交溶液
甲醯胺(WAKO，大阪，日本)50％(V/V)5×SSC封閉試劑(Boehringer)2％(W/V)N-月桂醯肌氨酸0.1％(W/V)SDS0.3％(W/V)在42℃的溫度下過夜，隨後如製造商指示的那樣進行洗滌和檢測。
即如PCR反應所示，或通過定點誘變(參見，例如Smith，Ann.Rev.Genet.19，423(1985))或如EP747 483所述的合成法，或如Sambrook等人(s.a.)所述的常用分子克隆方法可以製備起源於本發明DNA序列的DNA序列，因為它們與所述DNA序列(參見上面)雜交或可以利用根據所述DNA序列設計的引物通過聚合酶鏈式反應來構建。
本發明也涉及含有如上所述的DNA的載體或質粒，和由如上所述的DNA或如上所述的載體或質粒轉化或轉染的宿主細胞。
本發明也提供了通過利用攜帶如上所述的DNA的重組DNA轉化宿主可得的重組生物體。
本發明也涉及用於生產能夠催化從β-胡蘿蔔素到蝦青素的反應的多肽的方法，其中包括在指導生產所述的多肽的條件下培養如上所述的重組生物體。
在本發明的其它方面提供了用於生產蝦青素的方法，該方法包括在適當的宿主生物體中導入一個或多個如上所述的DNA，並且在指導生產蝦青素的條件下培養該轉化的生物體。
本發明的多肽也可用於生產蝦青素的方法，該方法包括將β-胡蘿蔔素與具有如上所述的參與從β-胡蘿蔔素到蝦青素的反應的蝦青素合成酶活性的重組肽在含有合適重建膜的合適反應混合物中存在合適電子供體的情況下接觸。在這一方法中，所說的重組多肽可以以從生物膜如微粒體或線粒體膜製備的再構成膜的形式存在。重組多肽也可以以再構成人工膜、如脂質體的形式存在。電子供體、如細胞色素P450還原酶是可以還原本發明的酶反應中心的適當的電子供體。
為了進一步說明本發明，包括了下面的附圖以及下面給出的詳細描述。
圖1顯示了在P.rhodozyma中從乙醯-CoA到蝦青素的生物合成途徑。
圖2顯示了含有部分基因組的AST基因的質粒pR16的限制圖。
圖3顯示了在除去跨膜結構域時，在氨基末端加入6×His的AST基因的表達研究。將來自0.1毫升肉湯的細胞進行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。泳道1，分子量標記(105千道爾頓，82.0千道爾頓，49.0千道爾頓和33.3千道爾頓，從上到下，Bio-RAD，Richmond，美國)；泳道2，大腸桿菌(BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)沒有IPTG)；泳道3，大腸桿菌(BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)含有1.5毫摩爾/升IPTG)；泳道4，分子量標記)。
通常，存在大量克隆編碼生物合成酶的基因的方法。例如，可以利用簡併PCR。簡併PCR是一種克隆其所編碼的胺基酸序列與具有相同或相似功能的來自其它物種的一種已知酶具有高度同源性的感興趣的基因的方法。通過逆翻譯胺基酸序列成對應的核苷酸(「簡併」)來設計在簡併PCR中用作引物系列的簡併引物。在這樣的簡併引物中，通常使用由任意的A，C，G或T組成的混合引物或在不明確的密碼中含有肌苷的引物。在克隆感興趣基因的部分片段後，通過使用克隆的和標記的部分DNA片段作為探針可以篩選含有整個基因的遺傳片段。
在克隆編碼其活性可以通過酶測定測量的酶的基因的情況中，通過檢測酶活性純化這樣的酶和測定酶的胺基酸序列是好的方法。這樣獲得的胺基酸序列容易反向翻譯成對應的核苷酸序列。在體外利用DNA合成儀可以合成具有對應的核苷酸序列的DNA片段並且進行標記以直接用作雜交探針。獲得雜交探針的另一可替代的方法是利用胺基酸序列信息的簡併PCR方法。
為了克隆其功能不能通過酶法鑑定的基因，已經採用了稱為鳥槍(shot-gun)篩選的方法作為常規的克隆方法。這一方法包括分離缺乏編碼任何感興趣的生物合成酶的特異性基因的突變菌株，和通過從具有對應於如此突變的基因的完整基因的生物體製備的DNA轉化該突變菌株。為了分離這樣的突變體，經常採用常規的誘變。通過檢測其輔源營養等可以進行同親代菌株一樣的獲得性表現型的證明。在供體DNA含有對應於突變菌株中的突變基因的基因的情況下，這樣的基因的轉化體獲得了與親代菌株相同的表現型作為遺傳互補的結果。
作為載體，不管在克隆宿主中是否能夠複製的任何形式的載體都可以用於鳥槍克隆。為了使用複製載體，互補的能力是必不可少的，並且這樣的載體不必含有與受體基因組同源的序列。在使用非複製載體的情況中，這樣的載體必須含有與宿主基因組同源的序列以便使供體與受體DNA之間進行重組。
為了克隆本發明的DNA，可以採用稱為「顏色互補」的方法。由於通過可以從胡蘿蔔素生成生物體如噬夏孢歐文氏菌，草生歐文氏菌等克隆的胡蘿蔔素生成基因轉化的結果，非胡蘿蔔素生成生物體如大腸桿菌可以獲得胡蘿蔔素生成的能力。含有crtE，crtB，crtI和crtY的大腸桿菌可以生產β胡蘿蔔素並使細胞成黃色。開發這樣的特徵時，已經從各種生成胡蘿蔔素的生物體如細菌和植物中克隆許多胡蘿蔔素生成基因。例如，為了克隆編碼番茄紅素環化酶的crtY基因，製備在相對於pUC載體的親和載體上含有crtE，crtB和crtI的大腸桿菌作為轉化宿主。這樣的宿主變成紅色，這表明積累了番茄紅素。其次，利用pUC載體可以構建來自胡蘿蔔素生成生物體的cDNA或基因組文庫。如果對應於供體胡蘿蔔素生成生物體中的crtY的基因存在於轉化的質粒中的話，將發生遺傳互補，並且大腸桿菌將變成黃色，這表明獲得了生產β胡蘿蔔素的能力。事實上，通過這一方法從P.rhodozyma克隆了crtE，crtBY和crtI基因(Verdoes等人，WO97/23633)。
關於參與從β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的基因的克隆，Kajiwara等人在含有來自噬夏孢歐文氏菌的crtE，crtB，crtI和crtY基因的宿主大腸桿菌中構建了來自P.rhodozyma的cDNA表達文庫(Kajiwara等人，WO96/28545，1996)。在這樣的克隆系統中，通過判斷表明角黃素或蝦青素積累的紅色素形成，從P.rhodozyma理論上可以克隆出參與β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的基因。但是，迄今還沒有報導這樣的基因。許多研究者推測了膜結合的胡蘿蔔素生成酶將會形成酶複合物的可能性。在這樣的模型中，在胡蘿蔔素生成酶之間的親和力將是有效地生成胡蘿蔔素所必須的。根據這樣的假設，這一顏色互補方法不適於克隆參與蝦青素生物合成的最後步驟，即從β胡蘿蔔素到蝦青素這一步驟的酶，因為外源酶在生成胡蘿蔔素的連續反應中可能與Phaffia的胡蘿蔔素生成酶不具有親和力。
在本發明中，將已於1999年2月18日以登記號74486作為布達佩斯條約保藏物再保藏在美國模式培養物保藏所(ATCC)的並且針對從β胡蘿蔔素到蝦青素的反應進行了阻斷的P.rhodozymaATCC96815用作轉化宿主(Schroeder，W.A.和Johnson，E.A.，J.Ind.Mocrobiol.14，502-507，1995)。將從已經在1998年4月8日在美國模式培養物保藏所(ATCC)以登記號74438作為布達佩斯條約保藏物再保藏的P.rhodozymaATCC96594的野生型菌株的染色體製備的基因組文庫轉化這一突變體用於分離生產蝦青素的克隆。在本發明中，分離出補充P.rhodozym中從β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的這樣的遺傳片段，並且測定它的核苷酸序列。
通過利用基因擴增或啟動子修飾的基因劑量效應而不是阻斷的突變的補充可以將本發明的這樣的基因/DNA用於超量生產蝦青素。
通常，基因由具有不同功能的幾個部分組成。在真核生物中，將編碼對應的蛋白質的基因轉錄成早熟的信使RNA(pre-mRNA)，這區別於核糖體RNA(rRNA)，核小RNA(snRNA)和轉移RNA(tRNA)的基因。雖然在這一轉錄事件中RNA聚合酶II(PolII)起中心作用，但沒有覆蓋含有啟動子的上遊區和上遊激活序列(UAS)的順式元件和反式作用的蛋白質因子，PolII不能單獨起始轉錄。首先，由幾個基本蛋白質成分組成的轉錄起始複合物識別待表達的基因的5』鄰接區中的啟動子序列。在這一事件中，在一些特異的調節下如熱激反應、或適應營養飢餓等等時表達的基因的情況中，需要一些其它的參與者。在這樣的情況中，需要UAS存在於啟動子序列周圍的5』未翻譯上遊區中，並且一些陽性或陰性調節蛋白識別和結合UAS。轉錄起始複合物與啟動子序列的結合長度受到啟動子周圍的反式作用因子的結合的影響，並且這能夠調節轉錄活性。
在由磷酸化激活轉錄起始複合物後，轉錄起始複合物從轉錄起始位點啟動轉錄。從基因的3』方向的啟動子區分離出轉錄起始複合物的一些部分作為延長複合物(這一步驟稱為啟動子清除事件)，並且延長複合物繼續轉錄直到它到達位於基因的3』鄰接下遊區中的終止序列。在核中通過在時對應於轉錄起始位點的帽位點處加入帽結構，和通過在位於3』鄰接下遊區的polyA信號處加入polyA序列來修飾這樣產生的Pre-mRNA。其次，從編碼區除去內含子結構，並結合外顯子部分以產生其序列對應於相應蛋白質的初級胺基酸序列的開放讀碼框架。對穩定的基因表達而言，其中產生成熟mRNA的這一修飾是必須的。在一般意義上，cDNA對應於從這種成熟mRNA序列逆轉錄的DNA序列。利用成熟mRNA作為模板通過來源於病毒種類的逆轉錄酶可以用實驗方法合成它。
在本發明中，確定了使P.rhodozyma野生型菌株生產β-胡蘿蔔素的P.rhodozymaATCC96815菌株的突變點。從測序的結果，表明在AST基因的第8內含子的剪接序列中鹼基的變化引起這樣的表現型，如通過mRNA的不恰當的剪接特異性地積累β胡蘿蔔素。RT-PCR分析檢測出AST基因的不恰當的剪接產物，並強烈地支持了突變點的鑑定。
本發明也提供了可以在不同的宿主生物體、如大腸桿菌中表達的重組AST基因。在本發明中，在大腸桿菌中表達這樣的重組AST基因，並證實AST基因編碼其大小對應於推測的分子量的蛋白質產物。通過利用新的AST基因和這樣的重組DNA技術可以實現蝦青素的生物生產。
根據本發明，從P.rhodozyma的cDNA文庫中克隆了編碼參與蝦青素生物合成的最後步驟的酶的基因，並且確定了它們的核苷酸序列。另外，克隆包括啟動子和終止子的基因組DNA的部分並且可用於克隆包括啟動子和終止子區的它的整個基因。
通過採用標記的cDNA片段作為篩選探針篩選已經在適當宿主中的噬菌體或質粒載體中構建的基因組文庫可以克隆出含有它的編碼區，它的內含子以及它的調節區、如啟動子和終止子的完整基因。通常，用於構建基因組文庫的一種最常用的宿主菌株是大腸桿菌。作為載體，可以使用噬菌體載體、如λ噬菌體載體，或質粒載體如pUC載體。通過使用含有感興趣的基因部分的標記的DNA片段作為探針可以篩選以這種方式、例如從P.rhodozymaDNA構建的基因組文庫。然後，可以挑選雜交的噬菌斑或菌落，並且用於亞克隆和/或測定其核苷酸序列。
通過利用其DNA序列存在幾種增強感興趣的蛋白質的所期望的酶活性的方案。
一個方案是利用呈其天然形式的基因本身。最簡單的途徑是擴增包括它的調節序列、如啟動子和終止子的基因組序列。通過將編碼感興趣的酶的基因組片段克隆到含有在P.rhodozyma中起作用的選擇標記的適當載體中可以進行這一方案。將編碼使宿主在存在有毒的抗生素時能存活的酶的藥物抗性基因經常用作選擇標記。含於pGB-Ph9中的G418抗性基因(Wery等人，基因，184，89-97，1997)是這樣的載體結構的例子。作為載體，通常可以使用兩種類型的載體。這些類型中的一種是不具有自主複製序列的整合載體。質粒pGB-Ph9是這一類型的載體的例子。因為這樣的載體不具有自我複製序列，所以上述載體本身不能複製，並且作為使用載體與染色體之間的同源序列的單交重組的結果，上述載體只以宿主染色體上的整合形式存在。通過在選擇培養基中增加對應的藥物的濃度，只有其中在染色體上擴增整合基因的菌株能夠生存。載體的另一種類型是具有自我複製序列的可複製載體。這樣的載體可以多拷貝的狀態存在。在這一類型的載體中，在具有適當的輔源營養標記的宿主中也可以使用營養互補標記。生長需要胞苷的P.rhodozyma ATCC24221菌株是這種營養缺陷體的一個例子。通過使用CTP合成酶作為ATCC24221的供體DNA，可以確立利用營養互補的宿主載體系統。
超量表達感興趣的酶的另一個方案是將感興趣的基因布置於強啟動子下。在這樣的方案中，感興趣的基因不必是多拷貝狀態。另外，也可以使用在適當的生長期和適當的培養時期誘導其啟動子活性的啟動子。在生長的後期、如次級代謝物的生產期，蝦青素的生產加速。例如，通過在植物啟動子的控制下布置胡蘿蔔素生成基因，在指數生長期可以誘導這些基因的基因表達，並且蝦青素的生產可以變得與生產菌株的生長有關。
在本發明中，作為這樣的組成型啟動子和終止子的一個例子，從P.rhodozyma中克隆丙糖磷酸異構酶(TPI)基因的啟動子和終止子片段。另外，在轉化體中證實了蝦青素生產的恢復，其中在該轉化體中，在生產β胡蘿蔔素的P.rhodozyma ATCC96815的染色體上的不同基因座(位於澱粉酶基因上的AMY基因座)上由來源於TPI基因的組成型啟動子和終止子驅動表達AST基因。
超量表達感興趣的酶的再一個方案是在其調節元件中突變。針對這一目的，將一種報導基因(如β半乳糖苷酶基因，螢光素酶基因，編碼綠色螢光蛋白質的基因等)插入到需要的基因的啟動子和終止子序列之間，以致包括啟動子、終止子和報導基因的所有部分融合在一起並且一起發揮作用。在體內可以對其中在染色體上或在載體上導入所說報導基因的轉化的P.rhodozyma進行誘變處理，以便在需要的基因的啟動子區內誘導突變。通過檢測由報導基因編碼的活性的變化可以監測突變。如果在基因的順式元件中發生突變，那麼通過拯救誘變的基因並且測序將確定出突變點。然後，通過在天然的和突變的啟動子序列之間重組，可以向染色體上的啟動子區導入這一突變。以同樣的方式，可以產生編碼反式作用因子的基因中的突變。
通過啟動子區中的順式元件的體外誘變也可以誘導突變。在這一途徑中，誘變處理含有報導基因的基因盒，其中將所述報導基因融合到來源於感興趣基因的5』-端的啟動子區和來自感興趣基因3』-端的終止子區，然後將其導入P.rhodozyma中。通過檢測報導基因的活性的差異，將篩選有效的突變。通過同樣於體內突變途徑情況的方法，在染色體上的天然啟動子區的序列中可以導入這樣的突變。
作為供體DNA，可以導入編碼催化從β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的酶的基因。可以使用與它的天然序列相同的編碼序列及其等位基因變體、即有一個或多個胺基酸的添加、缺失和/或取代、但其對應的酶具有相同類型的酶活性的序列。然後，通過轉化可以向P.rhodozyma中導入這樣的載體，並且通過在適當的選擇培養基(如在pGB-Ph9的情況中含有遺傳黴素的YPD瓊脂培養基，或在使用營養缺陷型ATCC24221作為受體的情況中不含胞苷的基本瓊脂培養基)上塗布轉化的細胞可以選擇轉化體。
在適當的培養基中可以培養這樣的基因工程化的P.rhodozyma並且評價它的蝦青素的生產率。鑑於它的生產率和通過所述的遺傳工程方法導入的基因或蛋白質表達的水平之間的關係，將證實這樣選擇的蝦青素的超級生產者。
實施例在如下所述的具體的實施例中採用了下列材料和方法菌株P.rhodozymaATCC96594(在1998年4月8日以登記號74438作為布達佩斯條約保藏物已經再保藏了這一菌株)。
P.rhodozyma ATCC96815(在1999年2月18日以登記號74486作為布達佩斯條約保藏物已經再保藏了這一菌株)E.coli DH5alpha F，phi80d，lacZdeltaM15，delta(lacZYA-argF)U169，hsd(rK-，mK+)，recA1，endA1，deoR，thi-1，supE44，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，Japan)E.coli XL1-Blue MRF』delta(mcrA)183，delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F』proAB，lacIqZdeltaM15，Tn10(tetr)](Stratagene，La Jolla，USA)E.coli SOLRe14(mcrA)，delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuCTn5(kanr)，uvrC，lac，gyrA96，relA1，thi-1，endA1，lambdaR，[F』proAB，lacIqZdeltaM15]Su(nonsuppressing)(Stratagene)E.coli TOP10F，mcrA，delta(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，delta(lacZM15)，delta(lacX74)，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Str)，endA1，nupG(Invitrogen，NV Leek，Netherlands)E.coli BL21(DE3)(pLysS)dcm，ompTrBmB，lon lambda(DE3)，pLysS(Stratagene)載體pUC19(Takara Shuzo，Otsu，Japan)lambdaZAPII(Stratagene)pCR2.1-TOPO(Invitrogen)pET11c(Stratagene)
培養基在YPD培養基(DIFCO，底特律，美國)中常規維持P.rhodozyma的菌株。在LB培養基(10克細菌用胰蛋白腖，5克酵母提取物(DIFCO)和5克NaCl/升)中維持大腸桿菌菌株。當製備瓊脂培養基時，補充的1.5％瓊脂(WAKO，Osaka，日本)。
方法根據《分子克隆實驗室手冊》第2版(冷泉港實驗室出版社，1989)中敘述的方法進行常用的分子生物學方法。從TakaraShuzo購買了限制酶和T4DNA連接酶。
根據製造商提供的方案，通過使用QIAGEN基因組試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)從P.rhodozyma中進行染色體DNA的分離。利用自動DNA分離系統(PI-50，Kurabo有限公司，Osaka，日本)進行來自轉化的大腸桿菌的質粒DNA的小量製備。通過使用QIAGEN柱(QIAGEN)進行來自大腸桿菌轉化體的質粒DNA的中量製備(midi-prep)。通過使用QIAquick或QIAEXII(QIAGEN)從瓊脂糖分離和純化DNA片段。
從Pharmacia購買用於DNA測序的螢光DNA引物。利用自動螢光DNA測序儀(ALFred，Pharmacia，Uppsala，瑞士)進行DNA測序。
從Toyobo購買DH5α的感受態細胞。
從Nippon Bio-Rad實驗室(東京，日本)購買用於biolistic轉化P.rhodozyma的儀器和試劑。
實施例1從P.rhodozyma分離基因組DNA為了從P.rhodozyma ATCC96594分離出基因組DNA，根據製造商詳細說明的方法使用QIAGEN基因組試劑盒。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從100毫升的YPD培養基中的過夜培養物中收穫P.rhodozymaATCC96594的細胞，並且用TE緩中液(含有1毫摩爾/升EDTA的10毫摩爾/升Tris/HCl(pH8.0))洗滌一次。在QIAGEN基因組試劑盒的8毫升Y1緩衝液中懸浮後，以2毫克/毫升的濃度加入溶細胞酶(SIGMA，聖路易斯，美國)以便通過酶降解使細胞破裂，並且在30℃下溫育反應混合物90分鐘，然後進行接下來的提取步驟。最後，獲得20微克基因組DNA。
實施例2從P.rhodozymaATCC96594構建基因組文庫如「本發明的詳細描述」部分中所述，通過在甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)的基因的啟動子和終止子區之間插入G418抗性結構基因並且將該盒連接到KpnI和HindIII消化的pUC19上來構建含有藥物抗性標記盒的質粒。將這一質粒命名為pUC-G418並且進一步使用。然後，將ClaI接頭連接到pUC-G418載體特有的EcoRI位點，並且獲得質粒pUC-G418Cl512，並且在Phaffia基因組文庫的構建中用作載體主鏈。
然後，在37℃下利用1.6單位的HpaII部分消化如以上實施例1中所述的由P.rhodozyma ATCC96594製備的10微克染色體DNA45分鐘，並且進行瓊脂糖凝膠電泳。在用溴化乙錠染色後，通過使用透析膜的電洗脫回收4到10kb的部分消化的DNA物質。在乙醇沉澱出回收的HpaII片段後，獲得1.215微克DNA。
接下來，在37℃下用10個單位的ClaI消化3微克的pG418Cl512共1小時，並且用乙醇沉澱。然後使用小牛小腸鹼性磷酸酶使ClaI消化的pG418Cl512去磷酸化。然後，使ClaI消化的並脫磷酸的pG418Cl512載體進行瓊脂糖凝膠電泳，並且根據製造商的說明採用QIAquick方案回收DNA片段。最後獲得2.62微克ClaI消化的並脫磷酸的pG418Cl512。
將2.62微克ClaI消化的並脫磷酸的pG418Cl512在16℃過夜連接到1.22微克HpaII部分消化的Phaffia基因組DNA上，並且將得到的連接溶液用作用於轉化大腸桿菌DH5α菌株的供體DNA。將總的連接混合物(270微升)轉移到1毫升感受態DH52細胞(Toyobo)中。在42℃下熱激處理45秒、接著在冰上維持30分鐘後，將轉化的細胞放置於冰上2分鐘，然後在37℃下在加入5毫升SOC培養基的情況下溫育1小時。
SOC培養基0.5％酵母提取物(DIFCO)2％胰化蛋白腖(DIFCO)10毫摩爾/升NaCl2.5毫摩爾/升Kcl10毫摩爾/升MgCl220毫摩爾/升MgSO4
20毫摩爾/升葡萄糖將這樣溫育的細胞轉移到100毫升含有100微克/毫升氨苄青黴素的LB培養基中。在37℃繼續過液培養，然後收穫細胞用於質粒的中量製備。
根據製造商提供的方法，使用QIAGEN中量製備柱從收穫的細胞製備質粒文庫。最後，在5毫升的總體積中獲得0.3毫克/毫升的Phaffia基因組文庫，並且在進一步的研究中用作基因組文庫。
實施例3採用biolistic方法轉化P.rhodozymaATCC96815根據《分子生物學中的方法》中所述的方法進行轉化(Johnston等人，53147-153，1996)。作為宿主菌株，在YPD培養基中培養P.rhodozymaATCC96815到穩定期。在離心肉湯後，用無菌水濃縮細胞10倍，在含有100微克/毫升遺傳黴素及0.75摩爾/升甘露糖醇和山梨醇的YPD培養基上塗布200微升細胞懸浮液。將如實施例2中所述製備的5微克基因組文庫包衣在1.5毫克0.9微米的金顆粒上，並用作biolistic轉化的供體DNA。在20℃溫育1星期後，產生約2萬個遺傳黴素抗性克隆(300到500個菌落/平板)。儘管大多數轉化體顯示了黃色(如宿主菌株ATCC96815一樣)，但有三個菌落變成紅色，並且進一步加以使利用。
實施例4從變成紅色的轉化體獲得的類胡蘿蔔素的分析在試管中，在20℃下，在10毫升YPD培養基中培養從P.rhodozymaATCC96815獲得的變成紅色的轉化體。然後，從0.5毫升肉湯中收穫細胞，並用於從細胞中提取類胡蘿蔔素。在通過利用所述的玻璃珠破碎來從P.rhodozyma的細胞中提取類胡蘿蔔素後，通過HPLC測量P.rhodozyma的類胡蘿蔔素含量。在提取後，然後通過離心收集破碎的細胞，並採用HPLC分析得到的上清液的類胡蘿蔔素含量。
HPLC柱；Chrompack Lichrosorb si-60(4.6毫米，250毫米)溫度；室溫洗脫液丙酮/己烷(18/82)，並向洗脫液中加入1毫升/升的水注射體積10微升流速2.0毫升/分鐘檢測紫外，在450納米處從SIGMA購買β-胡蘿蔔素的樣品，從Hoffman La-Roche(Basel，瑞士)獲得蝦青素。
作為HPLC分析的結果，證實儘管宿主菌株ATCC96815隻生產β-胡蘿蔔素，但所有的三個紅色轉化體都特異性地生產蝦青素。
實施例5從生產蝦青素的紅色轉化體的染色體進行的質粒拯救從所有生產蝦青素的轉化體製備染色體DNA。為了這一目的，根據製造商詳細說明的方法，如實施例1所述使用QIAGEN基因組試劑盒。通過HindIII消化這樣製備的5微克的染色體DNA，然後根據QIAquick方案純化。通過連接DNA溶液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然後滌布在含有100微克/毫升氨苄青黴素的LB瓊脂培養基上。從質粒的序列分析判斷，所有轉化體在它們的質粒中都具有相同的插入片段。這表明通過在基因組文庫的供體DNA和染色體DNA之間的相同類型的重組事件產生了起源於P.rhodozymaATCC96815的三種獨立的紅色轉化體。將一種這樣拯救的質粒命名為pR2-4並且進一步加以使用。
實施例6通過使用pR2-4作為雜交探針篩選原始的基因組文庫因為根據產生P.rhodozyma的紅色轉化體的重組事件的取方，在pR2-4中拯救的片段可能有突變，所以通過使用pR2-4作為雜交探針進行原始基因組文庫的篩選。
為了這一目的，將如實施例2中所述的原始基因組文庫的2萬個大腸桿菌轉化體轉移到尼龍膜過濾器(Hybond-N+，Amersham，Buckinghamshire，英國)上並且進行菌落雜交。分離出在其插入片段中含有與pR2-4相同的核苷酸序列的三個轉化體。將從這些轉化體分離的質粒命名為pR3，pR5.1和pR16。
接下來，通過pR3，pR5.1和pR16轉化P.rhodozymaATCC96815。所有轉化體都變成紅色。這一結果表明分離的質粒可能含有編碼參與P.rhodozyma中的β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的酶的基因。我們命名這一基因為AST基因。在這些質粒中，進一步使用pR16。
實施例7從P.rhodozyma分離出mRNA用於cDNA分析為了分析來自P.rhodozyma的轉錄物的模式，通過苯酚提取並結合用玻璃珠進行細胞破碎從P.rhodozymaATCC96594和ATCC96815分離出總RNA，並且使用mRNA分離試劑盒(Clontech，Palo Alto，美國)純化mRNA。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從10毫升YPD培養基中的兩天培養物中收穫ATCC96594和ATCC96815菌株的細胞，並用提取緩衝液含有0.1摩爾/升LiCl和0.1毫摩爾/升EDTA的100毫摩爾/升Tris/HCl(pH7.5))洗滌一次。在50毫升一次性離心管(IWAKI Glass，Tokyo，日本)中用同樣的提取緩衝液填充到5.0毫升的細胞懸浮液後，加入1.5毫升isogen-LS(Nippon基因，Toyama，日本)和10克玻璃珠。用水平臺式搖床振蕩含有isogen-LS和玻璃珠的細胞懸浮液的離心管1小時。在這一步驟中，回收300微克的總RNA。
然後，通過使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化mRNA。獲得8.0微克來自P.rhodozyma ATCC96594和ATCC96815菌株的mRNA。
為了合成cDNA，根據製造商詳細描述的方法，我們使用了SMARTcDNA構建試劑盒(Clontech)。我們應用2微克純化的mRNA用於第一條鏈的合成，接著進行PCR擴增，並且獲得1毫克cDNA。
實施例8pR16的亞克隆及其插入片段的功能分析在圖2中描繪了pR16的限制圖。將長度為0.7和2.7kb的每個EcoRI片段亞克隆到pUC-G418中並且分別命名為pRS913和pRLR913。
然後，用pRS913轉化生產蝦青素的P.rhodozyma ATCC96594菌株。作為這一轉化研究的結果，產生了黃色轉化體。這表明0.7kb的EcoRI片段可能含有截短的AST基因，並且通過0.7kb的EcoRI片段與其在P.rhodozyma染色體上的同源序列之間的單交重組的轉化將導致P.rhodozyma染色體上的AST基因的基因破壞。
接下來，用pRLR913轉化生產β胡蘿蔔素的ATCC96815菌株，並且產生了紅色轉化體。這表明導致生產蝦青素的野生型菌株生產β胡蘿蔔素的菌株ATCC96815的突變點位於最初鄰接pR16中的0.7kbEcoRI片段的2.7kb的EcoRI片段中。
將實施例7中製備的200微克cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以用於有效的Northern分析。在從ATCC96594和96815製備的cDNA的情況中，通過使用pRLR913的2.7kb的EcoRI片段作為雜交探針，在這兩種情況下都與3.2和2.0kb的兩個帶雜交。這表明ATCC96815的ast突變將是不影響mRNA的長度變化的點突變如錯義突變。
在使用pRS913的0.7kb EcoRI片段作為雜交探針的情況中，雜交了2.0kb的帶。從這一研究可見似乎AST基因可能在P.rhodozyma中提供2.0kb的轉錄物。
實施例9克隆AST基因的cDNA為了克隆來自P.rhodozyma的AST基因的cDNA，我們從P.rhodozymaATCC96594構建了cDNA文庫。通過如實施例7所述的苯酚提取並結合用玻璃珠進行的細胞破碎來分離總RNA。
首先，通過離心(1500×g，10分鐘)從50毫升YPD培養基中的2天培養物中收穫ATCC96594菌株的細胞，並用提取緩衝液(含有0.1摩爾/升LiCl和0.1毫摩爾/升EDTA的100毫摩爾/升Tris/HCl(pH7.5))洗滌一次。在50毫升一次性離心管(IWAKI Glass)中用同樣的提取緩衝液填充到5.0毫升的細胞懸浮液後，加入1.5毫升isogen-LS(Nippon基因)和10克玻璃珠。用水平臺式搖床振蕩含有isogen-LS和玻璃珠的細胞懸浮液的離心管1小時。在這一步驟中，回收1.8毫克的總RNA。
然後，根據製造商詳細說明的方法，通過使用PolyATractmRNA分離系統(Promega公司，麥迪生，美國)純化mRNA。最後，我們從P.rhodozymaATCC96594菌株獲得了8.0微克mRNA。
為了構建cDNA文庫，採用製造商詳細說明的方案，在COPY試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，美國)中使用8.0微克純化的mRNA。在連接EcoRI銜接頭(Stratagene)後，將合成的cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳。在切下覆蓋了1.9到2.3kb的cDNA長度的瓊脂糖凝膠片後，通過QIAEX II(QIAGEN)純化收集的cDNA物質。將這種按大小進行了分級分離的cDNA與EcoRI消化的並脫磷酸的λZAP II(Stratagene)連接。用GigapackIII金提取物(Stratagene)體外包裝過夜連接的混合物並且用於感染大腸桿菌XL1-BlueMRF』菌株。
使用如實施例8所述的2.7和0.7kb的EcoRI片段作為雜交探針對6000個噬菌斑進行常規的噬菌斑篩選。根據製造商詳細說明的方法，一個噬菌斑與這些探針強烈地雜交，用無菌牙籤挑出該噬菌斑，並將洗脫的噬菌體顆粒用於體內切除。最後，分離出顯示了抗氨苄青黴素抗性的感染的大腸桿菌SOLR細胞的轉化體。在測定了從這些轉化體獲得的分離的質粒的序列後，原來是這些質粒含有與實施例6中所述的pR16序列的一部分相同的片段。
測定了AST基因的cDNA序列的完整，並且表示為SEQ ID NO2，它的推導的胺基酸序列為SEQ ID NO1。
實施例10在大腸桿菌中AST基因的表達為了證實AST基因的ORF真正編碼了蛋白質，在大腸桿菌表達系統中進行了AST基因的表達研究。首先，為了使下面的純化步驟容易，在AST產物的羧基末端加入6×組氨酸(His)標記。合成了在表1中列出其序列的PCR引物。
表1用於克隆問其中加入6×His標記的AST基因的3』部分的PCR引物ast13；GTTCAAAGTTCATTTATGGA(有意義引物)(SEQ ID NO4)ast14；GGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGACCGGCTTGACCTGCA(反義引物)(SEQ ID NO5)接下來，將pAST1207的1.5kb的NdeIEcoRI片段和pAST114的0.3kb的EcoRIBamHI片段連接到用NdeI和BamHI消化的pET11c上，並且將連接的DNA轉化到大腸桿菌JM109菌株中。通過限制酶切分析檢測6個獨立的氨苄青黴素抗性克隆，並且發現6個克隆中的5個具有包含AST基因的重組表達質粒的正確結構。選擇其中的一個進行進一步的研究(pAST120)，然後將其轉化到大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)菌株中。表明由限制酶切分析檢測的所有氨苄青黴素抗性克隆適當地具有pAST120。接下來，當在600納米處的光密度(OD)達到0.8時，通過向大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)(pAST120)生長培養物中加入1毫摩爾/升IPTG來進行表達研究。在37℃連續培養4小時後，通過離心收穫細胞，並通過在SDS樣品緩衝液(125毫摩爾/升Tris-HCl，pH6.8，20％甘油，4％SDS，0.005％溴酚蘭，5％巰基乙醇)中煮沸來溶解。然後，使該溶胞產物進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。在由考馬斯亮蘭染色(快速染色CBB試劑盒，nacalai tesque，Kyoto，日本)後，沒有觀察到表達的蛋白質(數據未顯示)。
通常，據報導需要在P450蛋白質的氨基末端區中的胺基酸序列進行一些修飾，以便在大腸桿菌表達系統中表達P450蛋白質。事實上，在大腸桿菌中沒有表達具有完整序列的AST基因(數據未顯示)，並且發現在AST基因以及其它P450酶的情況中氨基末端序列的一些修飾是必須的。作為重組AST基因表達的下一步方案，進行了構建，其中在位於AST基因氨基末端的疏水的錨序列缺失的基礎上，將6×His標記序列加入AST蛋白質的氨基末端上。
為了在氨基末端缺失的錨序列的基礎上，在AST蛋白質的氨基末端加入6×His標記序列，合成了下面的PCR引物並且用於PCR克隆。
表2用於克隆在加入6×His標記的5』部分缺乏錨序列的AST基因的PCR引物ast32；CATATGCACCACCACCACCACCACCTGTATAACCTTCAGGGGCCC(用於克隆AST基因5』端的有意義引物)(SEQ ID NO6)ast2；GTAACAACACCATCTCCGGT(用於克隆AST基因5』端的反義引物)(SEQ ID NO7)ast13；GTTCAAAGTTCATTTATGGA(用於克隆AST基因3』端的有意義引物)(SEQ ID NO4)ast3 3；GGATCCTCAACTCATTCGACCGGCTT(用於克隆AST基因3』端的反義引物)(SEQ ID NO8)PCR的條件如下在94℃下25次循環共15秒，在55℃下循環30秒，在72℃下循環30秒。使用質粒pAST1207作為PCR模板。將具有所需長度的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，並測定具有預期插入片段的6個獨立的克隆的插入序列。結果，所述克隆中的兩個克隆分別具有準確的插入序列，選擇一個克隆，並用於進一步的研究(針對AST基因的3』末端為pAST228，而針對AST基因的5』末端為pAST302#3202)。將來自pAST302#3202的0.2kb的NdeISphI片段、來自pAST1207的1.5kb的SphIEcoRI片段和來自pAST228的0.05kb的KpnIBamHI片段連接到由NdeI和BamHI消化的pET11c中，並將連接的混合物轉化到大腸桿菌DH5α中。作為對6個獨立的克隆進行限制分析的結果，發現所有的克隆都具有針對其表達的含有AST基因的正確結構。選擇一個克隆，並用於進一步的研究(pAST315)。接下來，將pAST315轉移到表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)中。作為限制分析的結果，證實了所有6個轉化體都準確地具有pAST315。
接下來，當在600納米處的光密度(OD)達到0.93時，通過向大腸桿菌BL21(DE3)(pLysS)(pAST315)生長培養物中加入1.5毫摩爾/升的IPTG進行表達研究。在37℃連續培養4小時後，通過離心收穫細胞，通過在SDS樣品緩衝液中煮沸來溶解細胞。然後，將溶胞產物進行PAGE。在考馬斯亮蘭染色後，觀察到分子量恰好對應於其推定的胺基酸序列(約60千道爾頓)的表達的蛋白質(圖3)。從這一結果，證實了AST基因編碼由它的推定的開放讀碼框架預期的蛋白質。
實施例11AST基因產物的體外特性記述對於AST基因產物的酶的特性記述，可以使用用於描述P450酶的特性的標準測定。為了這一目的，需要反應混合物含有再構成膜。作為再構成膜，經常使用天然的分離物(如線粒體膜或微粒體)和人工膜。在任何情況中必須在電子受體和供體之間發生電子轉移。作為電子供體，向反應混合物中經常加入細胞色素P450還原酶。作為電子受體，加入氧分子。在存在電子來源(如還原的NADPH+)的情況下，可以將作為蝦青素合成酶底物的，β胡蘿蔔素轉化成蝦青素。用HPLC分析可以定性和定量地測定產生的蝦青素。
實施例12含有AST基因的基因組片段的克隆為了測定含有AST基因的基因組序列，通過使用引物步查行方法進行測序實驗。pRS913的測序分析顯示pRS913不含AST基因的3』末端。為了獲得靠近AST基因的3』鄰接基因組片段，進行了基因組步查實驗。為此，根據製造商詳細說明的方法採用了通用的基因組行走試劑盒(Clontech)。作為PCR的模板，使用了在實施例1中製備的染色體DNA。合成了如表3中所列序列的基因特異性引物ast15，並且用作PCR引物；表3用於AST基因的基因組行走的引物的序列ast15；TAGAGAGAAGGAGGGGTACCAGATGC(SEQ ID NO9)從EcoRV和StuI文庫獲得了具有適當長度(小於1kb)的PCR片段，將其純化並且克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。作為測序的結果，發現這兩個片段都含有包含AST基因的基因組片段。根據位於AST基因中離開polyA位點200bp的序列，設計出如表4所列的PCR引物。
表4
用於克隆靠近AST基因的3』鄰接片段的引物的序列ast18；CCCCGGATTGTGGAGAAACT(SEQ ID NO10)通過使用ast15和ast18引物作為PCR引物和實施例1中製備的染色體DNA作為PCR模板，進行PCR。校正聚合酶(HF聚合酶，Clontech)保證了具有準確序列的PCR片段的擴增。PCR條件如下；在94℃下25次循環其15秒，55℃下循環30秒，72℃下循環30秒。具有400bp插入片段的6個獨立的克隆顯示出相同的序列。
通過結合pRS913和pRL913的序列，測定了含有包含474bp的啟動子區和269bp的終止子區的AST基因的3.9kb的序列(SEQ ID NO3)。結果，AST基因顯示出了富含內含子的結構(17個內含子)。
實施例13確定β胡蘿蔔素生產菌株P.rhodozymaATCC96815中的突變點為了證實由AST基因內的突變引起了P.rhodozymaATCC96815菌株產生β胡蘿蔔素的事實，測定了含有從ATCC96815及其親代菌株P.rhodozymaATCC24230獲得的AST基因的基因組序列。為此，合成了如表5中所列序列的PCR引物，並且用於PCR克隆；表5用於克隆整個基因組AST基因的PCR引物；ast21；ATGTTCATCTTGGTCTTGCT(有意義引物)(SEQ ID NO11)ast4；ACGTAGAAGTCATAGCGCCT(反義引物)(SEQ ID NO12)通過使用HF聚合酶(Clontech)作為PCR聚合酶和使用通過與實施例1同樣的方法從菌株ATCC96815和ATCC24230製備的染色體DNA作為PCR模板，在如下的條件下進行PCR94℃下循環25次共15秒，55℃下循環30秒，和72℃下循環4分鐘。將所得的長度約為3.5kb的PCR片段克隆列pCR2.1-TOPO中，並且通過引物行走方法測定它們的整個序列。在P.rhodozymaATCC96594菌株和ATCC24230菌株的序列之間發現了7個鹼基的變化。在它的外顯子序列中發現了4個鹼基的變化，但那些變化沒有造成任何胺基酸的變化。在它的內含子結構中發現了3個鹼基的變化。在β胡蘿蔔素生產菌株ATCC96815和它的親代菌株ATCC24230之間的比較，發現位於第8個內含子中的5』剪接序列上的一個鹼基的變化(GTAAGT＞GTAAAT)。這可能表明賦予生產蝦青素的P.rhodozyma積累β胡蘿蔔素的表現型的突變是由AST基因的mRNA的不恰當剪接引起的。
為了證實這一假設，通過使用從P.rhodozymaATCC96815製備的cDNA作為PCR模板進行RT-PCR。通過與實施例9相同的方案，從P.rhodozymaATCC96815分離出mRNA，並且用於cDNA的合成。為了通過PCR方法從由ATCC96815製備的這種mRNA獲得cDNA，根據供應商詳細說明的方法，使用SMART PCR cDNA文庫構建試劑盒(Clontech)。合成了如表6中所列序列的，並且覆蓋了第8個內含子的下列引物，並且用作PCR引物。
表6用於檢測AST基因的不恰當剪接產物的RT-PCR的PCR引物ast7；TTTGACTCAAGGATTAGCAG(有意義引物)(SEQ ID NO13)ast26；TGTCTTCTGAGAGTCGGTGA(反義引物)(SEQ ID NO14)RT-PCR條件如下；94℃下25次循環共15秒，55℃下循環30秒，72℃下循環30秒。作為PCR的結果，擴增了300bp的PCR產物，並且克隆到pCR2.1-TOPO中。測定了具有300bp插入片段的兩個獨立的克隆的序列。結果，證實在P.rhodozymaATCC96815菌株中合成了AST基因的不恰當的剪接產物。AST基因的第8個內含子的不恰當的剪接可能造成比正確剪接的AST蛋白質更短的截短的AST蛋白質的產生，因為終止密碼子位於第8個內含子中。這一結果表明突變點位於不能正確剪接的AST基因內。
實施例14在生產β胡蘿蔔素的Phaffia rhodozyma中AST基因的表達為了證實AST基因編碼參與從β胡蘿蔔素到蝦青素的轉化的酶的事實，將AST基因克隆到β胡蘿蔔素生產菌株中。為了排除在染色體上的AST基因的天然基因座上重組的可能性，構建在Phaffia rhodozyma染色體的AMY基因座上的AST基因的表達質粒。為此，需要從Phaffia rhodozyma克隆一些遺傳元件。
1)從Phaffia rhodozyma克隆組成型啟動子和終止子為了從Phaffia rhodozyma克隆組成型啟動子和終止子，採用了簡併PCR方法。在經常在酵母遺傳學中用作組成型啟動子和終止子的基因之中，嘗試克隆編碼丙糖磷酸異構酶的TPI基因。在Blocks資料庫(http//www.blocks.fhcrc.org/)中登記的保守的胺基酸序列之中，選擇兩個基元序列(Arg-Thr-Phe-Phe-Val-Gly-Gly-Asn和Asp-Val-Asp-Gly-Phe-Leu-Val-Gly-Gly-Ala)並且如下合成了它們的簡併引物。
表7用於從P.rhodozyma克隆TPI基因的簡併PCR引物tp1；MGNACNTTYTTYGTNGGNGGNAAY(有意義引物)(SEQ IDNO15)tp6；GCNCCNCCNACNARRAANCCRTCNACRTC(反義引物)(SEQ IDNO16)(M＝A或C；N＝A，C，G或T；Y＝C或T；R＝A或G)PCR條件如下94℃下25次循環共15秒，46℃下循環30秒，72℃下循環15秒。將ExTaq聚合酶(TakaraShuzo)用作PCR聚合酶。作為PCR模板，通過使用SMART PCR cDNA文庫構建試劑盒(Clontech)從由P.rhodozymaATCC96594分離出的mRNA製備cDNA庫。純化0.7kb的PCR片段，並將其克隆到pCR2.1-TOPO中。從限制分析判斷，6個獨立的克隆具有所需長度的插入片段。測定其中兩個的序列，並且證實它們都具有與來自不同生物體的已知的TPI基因具有顯著的同源性的插入序列。選擇其中一個用於進一步的研究(pTPI923)。
接下來，根據pTPI923的插入序列，合成了表8中所列序列的幾個PCR引物用於基因組行走，以便克隆TPI基因的啟動子和終止子。對於這一實驗，根據製造商詳細說明的方法使用了通用的基因組行走試劑盒(Clontech)。
表8用於基因組行走以克隆TPI啟動子和終止子的PCR引物tp9；GCTTACCTCGCTTCCAACGTTTCCCAG(終止子克隆，初級)(SEQID NO17)tp10；GGATCTGTCTCTGCCTCCAACTGCAAG(終止子克隆，嵌套)(SEQID NO18)tp11；GGGTCAATGTCGGCAGCGAGAAGCCCA(啟動子克隆，初級)(SEQ ID NO19)tp12；ATGTACTCGGTAGCACTGATCAAGTAG(啟動子克隆，嵌套)(SEQID NO20)PCR條件如下；在94℃下循環7次共4秒，74℃下循環3分鐘，接著在94℃下循環32次共4秒，69℃下循環3分鐘並且在69℃連續延伸4分鐘。將KOD聚合酶(TOYOBO)用作PCR聚合酶。將從P.rhodozymaATCC96594製備的染色體DNA用作PCR模板。結果，從EcoRV和StuI文庫獲得了終止子區的候選物。對這些候選物的測序分析表明兩個克隆都具有含有TPI結構基因的推定了3』末端和終止子區的TPI基因的下遊序列。在克隆啟動子區的情況中，從EcoRV文庫獲得的候選物含有TPI結構基因的推定的5』末端和啟動子區。
然後，為了構建來源於TPI基因的啟動子盒與終止子盒，合成了表9中所列序列的PCR引物。
表9構建TPI啟動子和TPI終止子盒子的PCR引物tp13；GCGGCCGCATCCGTCTCGCCATCAGTCT(啟動子盒子的有義引物)(SEQ ID NO21)tp14；CCTGCAGGTCTAGAGATGAATAAATATAAAGAGT(啟動子盒子的反義引物)(SEQ ID NO22)tp15；CCTGCAGGTAAATATATCCAGGGATTAACCCCTA(終止子盒子的有義引物)(SEQ ID NO23)tp16；GGTACCCGTGCGCAGTCGACCGAGACAT(終止子盒子的反義引物)(SEQ ID NO24)PCR條件如下；在94℃下循環25次共15秒，55℃下循環30秒和72℃下循環30秒。將HF聚合酶(Clontech)用作PCR聚合酶，並將產生的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結果，發現獲得了具有相同序列的克隆。各選擇一個克隆用於進一步的研究(啟動子盒子選擇pTPIP1104，而終止子盒子選擇pTPIT1104)。
2)從Phaffia rhodozyma克隆部分的澱粉酶基因為了在P.rhodozyma的染色體上定位和表達外源基因，從P.rhodozyma克隆澱粉酶基因。在基本將會克隆外源基因的表達載體可能含有與P.rhodozyma的染色體序列(如澱粉酶基因)同源的遺傳片段的情況中，在單交重組後，在P.rhodozyma的染色體的同源區上可以整合表達載體。
從Entrez資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)選擇來自不同生物體的澱粉酶的11個胺基酸序列，並且通過Clustal W用於胺基酸的對比(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.，核酸研究，224673-4680，1994)。表10中列出了在該資料庫登記了其澱粉酶序列的11種生物體。
表10用於Clustal W分析的在資料庫登記的各種澱粉酶基因黑色麴黴泡盛變種amyA基因(登記號X52755)黑色麴黴泡盛變種amyB基因(登記號X52756)川地麴黴酸穩定性α澱粉酶基因(登記號AB008370)米麴黴amyl基因(登記號X12725)Aspergillus shirousamiiα-澱粉酶基因(登記號P30292)隱球酵母屬的種的α澱粉酶基因(登記號D83541)Lipomyces kononenkoae subsp.spencermartinsiae α-澱粉酶基因(登記號U30376)Debaryomyces occidentalis amyl基因(登記號X16040)肋狀復膜孢糖酵母ALP1基因(登記號X05791)粟酒裂殖糖酵母α-澱粉酶基因(登記號Z64354)選擇澱粉酶的兩個保守的胺基酸序列(Asp-Tyr-Ile-Gln-Gly-Met-Gly-Phe-Asp/Thr-Ala-Ile-Trp和Asp-Gly-Ile-Pro-Ile-Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln)，以便通過簡併PCR方法從P.rhodozyma克隆澱粉酶基因。然後，合成在表11中所列序列的PCR引物用於從P.rhodozyma克隆AMY基因。
表11用於從P.rhodozyma克隆澱粉酶(AMY)基因的簡併PCR引物amy1；GAYTAYATHCARGGNATGGGNTTYRMNGCNATHTG(有意義引物)(SEQ ID NO25)amy2；TGYTCNGTNCCRTARTADATDATNGGDATNCCRTC(反義引物)(SEQ ID NO26)(Y＝C或T；H＝A，C或T；R＝A或G；N＝A，C，G或T；M＝A或C；D＝A，G或T)PCR條件如下；在94℃下循環25次共15秒，50℃下循環30秒和72℃下循環2分鐘。使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)作為PCR聚合酶。作為PCR模板，使用了實施例1中製備的染色體DNA和通過使用SMART PCRcDNA文庫構建試劑盒(Clontech)從由P.rhodozymaATCC96594分離出的mRNA製備的cDNA庫。當使用染色體和cDNA作為PCR模板時，分別產生了1.7kb和0.9kb的PCR片段。純化這兩個片段並且克隆到pCR2.1-TOPO中。從限制分析判斷，6個獨立的克隆具有所需長度的插入片段。測定其中兩個的序列，並證實它們都具有與來自不同生物體的已知的澱粉酶基因具有顯著的同源性的插入序列。選擇其中含有染色體AMY片段的一個克隆用於進一步的研究(pAMY216)。為了構建部分澱粉酶盒，根據pAMY216的插入片段的內部序列，合成了表12中所列序列的兩個PCR引物。
表12構建部分AMY盒子的PCR引物amy101；CCGCGGCATTGATACCTCTACCCCGT(AMY盒子的有義引物)(SEQ ID NO27)amy102；GCGGCCGCCTGCAATCCTGGATCCACCG(AMY盒子的反義引物)(SEQ ID NO28)PCR條件如下；在94℃下循環25次共15秒，55℃下循環30秒，及72℃下循環2分鐘。將HF聚合酶(Clontech)和染色體DNA分別用作PCR聚合酶和PCR模板。將產生的PCR片段克隆進pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結果，發現獲得了具有正確序列的克隆。選擇一個克隆用於進一步的研究(pAMY1113)。
3)構建在Phaffia rhodozyma中起作用的AST基因的表達載體通過限制酶切消化和連接每個遺傳成分來構建AST基因的表達質粒。首先，將來自pTPIT1104的0.3kb的KpnIPstI片段和來自pG418Sa512的1.7kb的SacIKpnI片段連接到由用SacI和PstI消化的pGEM-T質粒中。發現作為限制酶切消化的結果，12個轉化體中有9個克隆具有正確的結構，選擇其中一個用於進一步的研究(pTPITG1120)。
接下來，進行AST基因的PCR克隆，以便在兩個末端加入適當的限制位點。合成了在表13中所列序列的PCR引物。
表13克隆整個AST基因盒的PCR引物ast11；TCTAGAATGTTCATCTTGGTCTTGCTCA(有義引物)(SEQ IDNO29)ast12；CCTGCAGGTCATTCGACCGGCTTGACCT(反義引物)(SEQ IDNO30)
PCR條件如下；在94℃下循環25次共15秒，55℃下循環30秒，及在72℃下循環2分鐘。將HF聚合酶(Clontech)和pAST1207分別用作PCR聚合酶和PCR模板。將產生的PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO中。作為限制酶切和測序分析的結果，發現獲得了具有正確序列的一個克隆。選擇這個克隆用於進一步的研究(pAST113)。
最後，來自pAMY1113的將1.6kb的SacIINotI片段、來自pTPIP1104的0.3kb的NotIXbaI片段和來自pAST113的1.5kb的XbaISse8387I片段連接進入利用SacII和Sse8387I消化的pTPITG1120。作為限制分析的結果，證實了所有5個測試的轉化體都具有正確的結構，並且選擇其中一個用於進一步的研究(pAATG123)。
4)在生產β胡蘿蔔素的Phaffia rhodozyma中恢復蝦青素的生產將AST基因的表達質粒(pAATG123)轉化進入生產β胡蘿蔔素的PhaffiarhodozymaATCC96815中。如實施例3所述進行biolistic轉化。挑選出變成紅色的兩個遺傳黴素抗性菌落，進行選擇用於進一步的研究。為了證實在P.rhodozyma染色體上AMY基因座上的整合，合成了其序列列於表14的PCR引物。
表14證實在P.rhodozyma染色體上的AMY基因座上整合表達質粒的PCR引物amy5；CTCTCCTGTTCACAAAAACA(有義引物)(SEQ ID NO31)從這些轉化體製備染色體，並將其用作PCR模板。PCR條件如下；94℃下循環25次共15秒，55℃下循環30秒，及72℃下循環2分鐘。將ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)用作PCR聚合酶。在將從變成紅色的轉化體獲得的染色體用作模板DNA的PCR反應中產生了陽性2.0kb的PCR帶。在將起源於宿主菌株P.rhodozyma ATCC96815的染色體用作PCR模板的PCR反應混合物中沒有觀察到PCR帶。
5)通過在生產β胡蘿蔔素的P.rhodozyma的染色體上整合了重組AST基因的重組體的燒瓶發酵在燒瓶發酵中評價蝦青素的生產率。燒瓶發酵的培養基配方如下。
表15用於燒瓶發酵的種子培養基配方葡萄糖 30.0克/升NH4Cl 4.83克/升KH2PO41.0克/升MgSO4-7H2O 0.88克/升NaCl 0.06克/升CaCl2-2H2O 0.2克/升鄰苯二甲酸氫鉀KH phthalate 20.0克/升FeSO4-7H2O 28毫克/升檸檬酸-1H2O 15.0毫克/升ZnSO4-7H2O 40.0毫克/升CuSO4-5H2O 0.75毫克/升MnSO4-4，5H2O0.6毫克/升H3BO30.6毫克/升Na2MoO4-2H2O0.6毫克/升KI 0.15毫克/升肌醇 60.0毫克/升煙酸 3.0毫克/升D-泛酸鈣 3.0毫克/升維生素B1(鹽酸硫胺素) 3.0毫克/升對氨基苯甲酸 1.8毫克/升維生素B6(鹽酸吡哆醇) 0.3毫克/升生物素 0.048毫克/升7毫升/試管(直徑21毫米)表16用於燒瓶發酵的培養基配方MgSO4-7H2O 2.1克/升CaCl2-2H2O 0.865克/升(NH4)2SO43.7克/升FeSO4-7H2O 0.28克/升葡萄糖(單獨滅菌) 22克/升
KH2PO4(單獨滅菌) 14.25克/升檸檬酸-1H2O 0.21克/升ZnSO4-7H2O 70.14毫克/升CuSO4-5H2O 10.5毫克/升MnSO4-4，5H2O8.4毫克/升H3BO38.4毫克/升Na2MoO4-2H2O8.4毫克/升KI 2.1毫克/升肌醇 0.374克/升煙酸 18.7毫克/升D-泛酸鈣 28.05毫克/升維生素B1(鹽酸硫胺素) 18.7毫克/升對氨基苯甲酸 11.22毫克/升維生素B6(鹽酸吡哆醇) 1.87毫克/升生物素 1.122毫克/升CaCO310克/升向每個燒瓶中加入1滴Actcol(Takeda化學工業有限公司，Osaka，日本)。
在發酵7天後從發酵肉湯中收穫含有緩衝(buffles)細胞的50毫升(含有5％接種物的最後體積)/500毫升燒瓶，並且通過如實施例4所述的HPLC分析其蝦青素和β胡蘿蔔素的積累。結果概括在表17中。
表17通過其中整合了AST基因的重組體導致蝦青素生產的恢復(將數據表示為相對於由P.rhodozymaATCC96815積累的β胡蘿蔔素的效價的蝦青素和β胡蘿蔔素的相對效價)相對效價(％)菌株蝦青素 β胡蘿蔔素ATCC96815pR1634.0％18.6％ATCC96815pAATG12316.3％56.3％ATCC968150％ 100％由ATCC96815pAATG123生產蝦青素的部分恢復表明TPI啟動子的啟動子強度對於蝦青素生產的完全恢復是不夠強的。
序列表110F.HOFFMANN-LAROCHE.AG120蝦青素生產的改進和其中利用的生物物質130P450ast14014116032170PatentIn Ver2.02101211557212PRT213Phaffia rhodozyma220221TRANSIT222(1)..(26)4001Met Phe Ile Leu Val Leu Leu Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe30 1 5 10 15Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg2025 3035 Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr35 40 45Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala50 55 6040Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala65 70 75 80Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val45 85 90 95Met Lys Glu Ala Tyr Asp Tyr Pro Lys Pro Gly Met Ala Ala Arg Val
100 105 110Leu Arg Ile Ala Thr Gly Asp Gly Val Val Thr Ala Glu Gly Glu Ala115 120 125His Lys Arg His Arg Arg Ile Met Ile Pro Ser Leu Ser Ala Gln Ala130 135 140Val Lys Ser Met Val Pro Ile Phe Leu Glu Lys Gly Met Glu Leu Val145 150155 160Asp Lys Met Met Glu Asp Ala Ala Glu Lys Asp Met Ala Val Gly Glu165 170 175Ser Ala Gly Glu Lys Lys Ala Thr Arg Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp180 185 190Val Lys Asp Trp Val Gly Arg Ala Thr Leu Asp Val Met Ala Leu Ala195 200 205Gly Phe Asp Tyr Lys Ser Asp Ser Leu Gln Asn Lys Thr Asn Glu Leu210 215 220Tyr Val Ala Phe Val Gly Leu Thr Asp Gly Phe Ala Pro Thr Leu Asp225 230 235 240Ser Phe Lys Ala Ile Met Trp Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Thr Met245 250 255Lys Arg Arg His Glu Ile Pro Leu Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Arg260 265 270Arg Val Gly Ile Glu Leu Met Glu Gln Lys Lys Gln Ala Val Leu Gly275 280 285Ser Ala Ser Asp Gln Ala Val Asp Lys Lys Asp Val Gln Gly Arg Asp290 295 300Ile Leu Ser Leu Leu Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Asn Leu Pro Glu305 310 315 320Ser Gln Lys Leu Ser Asp Glu Glu Val Leu Ala Gln Ile Ser Asn Leu325 330 335Leu Phe Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Ser Thr Val Leu Thr Trp Met Phe340 345 350His Arg Leu Ser Glu Asp Lys Ala Val Gln Asp Lys Leu Arg Glu Glu
355 360 365Ile Cys Gln Ile Asp Thr Asp Met Pro Thr Leu Asp Glu Leu Asn Ala370 375 380Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu Arg Leu Asp Pro385 390 395 400Pro Ser Pro Tyr Ala Asn Arg Glu Cys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile405 410 415Pro Leu Ala Glu Pro Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Val Ile Asn Glu420 425 430Val Arg Ile Thr Lys Gly Thr Met Val Met Leu Pro Leu Phe Asn Ile435 440 445Asn Arg Ser Lys Phe Ile Tyr Gly Glu Asp Ala Glu Glu Phe Arg Pro450 455 460Glu Arg Trp Leu Glu Asp Val Thr Asp Ser Leu Asn Ser Ile Glu Ala465 470 475 480Pro Tyr Gly His Gln Ala Ser Phe Ile Ser Gly Pro Arg Ala Cys Phe485 490 495Gly Trp Arg Phe Ala Val Ala Glu Met Lys Ala Phe Leu Phe Val Thr500 505 510Leu Arg Arg Val Gln Phe Glu Pro Ile Ile Ser His Pro Glu Tyr Glu515 520 525His Ile Thr Leu Ile Ile Ser Arg Pro Arg Ile Val Gly Arg Glu Lys530 535540Glu Gly Tyr Gln Met Arg Leu Gln Val Lys Pro Val Glu545 550 55521022111932212DNA213Phaffia rhodozyma220221CDS222(33)..(1706)220221polyA-位點222(1871)220221mRNA222(14)..(1891)400210 gaattcggca cgaggccacc tactttctcc at atg ttc atc ttg gtc ttg ctc 53Met Phe Ile Leu Val Leu Leu1 5aca ggt gct tta ggc ctg gct gct ttc tca tgg gca tcc ata gcg ttc 10115 Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe10 15 20ttc agt ctt tac ctc gct ccg agg cga tct tca ctg tat aac ctt cag 149Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln20 25 30 35ggc ccg aat cat acc aac tac ttt aca ggc aat ttt tta gac atc ctc 197Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu40 45 50 5525tca gct cgt aca ggt gaa gag cat gcg aag tac aga gaa aaa tac gga 245Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly60 65 7030 agc acc ctc cgg ttt gct ggg atc gct gga gca ccc gtc ttg aac tcg 293Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser75 80 85acc gat ccg aaa gtc ttc aac cat gtg atg aaa gaa gcc tac gac tat 34135 Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val Met 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223人工序列的描述用於在大腸桿菌中表達AST基因的有意義引物4004gttcaaagtt catttatgga 20210521147212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在大腸桿菌中表達AST基因的反義引物4005ggatcctcag tggtggtggt ggtggtgttc gaccggcttg acctgca47210621145212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的5』有意義引物4006catatgcacc accaccacca ccacctgtat aaccttcagg ggccc 45210721120212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的5』反義引物4007gtaacaacac catctccggt 20210821126212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在大腸桿菌中表達修飾的AST基因的3』反義引物4008ggatcctcaa ctcattcgac cggctt26210921126212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於克隆AST基因的基因組行走引物4009tagagagaag gaggggtacc agatgc262101021120212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於克隆AST基因的終止子區的反義引物40010ccccggattg tggagaaact 202101121120212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆基因組AST基因的有意義引物40011atgttcatct tggtcttgct202101221120212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆基因組AST基因的反義引物40012acgtagaagt catagcgcct202101321120212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於AST基因的RT-PCR的有意義引物40013tttgactcaa ggattagcag202101421120212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於AST基因的RT-PCR的反義引物40014tgtcttctga gagtcggtga 202101521124212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI基因的簡併有意義引物40015mgnacnttyt tygtnggngg naay 242101621129212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI基因的簡併反義引物40016gcnccnccna cnarraancc rtcnacrtc292101721127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI終止子的初級行走引物40017gcttacctcg cttccaacgt ttcccag 272101821127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI終止子的嵌套行走引物40018ggatctgtct ctgcctccaa ctgcaag272101921127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI啟動子的初級行走引物40019gggtcaatgt cggcagcgag aagccca272102021127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆TPI啟動子的嵌套行走引物40020atgtactcgg tagcactgat caagtag272102121128212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建TPI啟動子盒子的有意義引物40021gcggccgcat ccgtctcgcc atcagtct 282102221134212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建TPI啟動子盒子的反義引物40022cctgcaggtc tagagatgaa taaatataaa gagt342102321134212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建TPI終止子盒的有意義引物40023cctgcaggta aatatatcca gggattaacc ccta342102421128212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建TPI終止子盒子的反義引物40024ggtacccgtg cgcagtcgac cgagacat 282102521135212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆AMY基因的簡併有意義引物40025gaytayathc arggnatggg nttyrmngcn athtg 352102621135212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於克隆AMY基因的簡併反義引物40026tgytcngtnc crtartadat datnggdatn ccrtc352102721126212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建部分AMY盒子的有意義引物40027ccgcggcatt gatacctcta ccccgt 262102821128212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建部分AMY盒子的反義引物40028gcggccgcct gcaatcctgg atccaccg282102921128212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建AST盒子的有意義引物40029tctagaatgt tcatcttggt cttgctca282103021128
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223人工序列的描述通過PCR分析證實在AMY基因座上的整合的有意義引物40031ctctcctgtt cacaaaaaca 20
權利要求
1.一種分離的DNA，所述DNA含有編碼一種酶的核苷酸序列，所述的酶具有優選在P.rhodozyma中催化β胡蘿蔔素到蝦青素的反應的蝦青素合成酶的活性。
2.根據權利要求1的分離的DNA，它的特徵是(a)所說的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的所說的酶，或(b)所說的核苷酸序列編碼選自(i)等位基因變體或(ii)具有一個或多個胺基酸的添加、插入、缺失和/或取代但仍然具有相同類型的酶活性的酶的所說酶的變體。
3.根據權利要求1的分離的DNA，其特徵在於所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO2中表示的核苷酸序列；(ii)由於遺傳密碼的簡併性，編碼具有與所述核苷酸序列(i)編碼的相同的胺基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標準雜交條件下，與來自(i)或(ii)的所述核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求1的分離的DNA，其特徵在於所說的核苷酸序列是(i)SEQ ID NO3中表示的核苷酸序列；(ii)由於遺傳密碼的簡併性，編碼具有與所述核苷酸序列(i)編碼的相同的胺基酸序列的蝦青素合成酶的核苷酸序列；和(iii)在標準雜交條件下，與來自(i)或(ii)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列。
5.一種載體或質粒，所述的載體或質粒含有如權利要求1到4的任何一個所要求保護的分離的DNA。
6.一種宿主細胞，所述的宿主細胞是由如權利要求1到4的任何一個所要求保護的分離的DNA或如權利要求5要求保護的載體或質粒轉化或轉染的。
7.一種多肽，所述多肽是由如權利要求1到4的任何一個要求保護的分離的DNA編碼的。
8.一種用於生產具有蝦青素合成酶活性的多肽的方法，該方法包括在指導所說的酶的生產的條件下，培養如權利要求5中要求保護的轉化的宿主細胞。
9.一種用於生物生產蝦青素的方法，該方法包括向合適的宿主生物體中導入一個或多個如權利要求1到4的任何一個要求保護的分離的DNA，在指導生產蝦青素的條件下培養所獲得的生物體，並且從培養物中回收蝦青素。
10.一種用於生產蝦青素的方法，該方法包括在含有合適的再構成膜的合適的反應混合物中，在有合適的電子供體存在下，將β胡蘿蔔素與具有蝦青素合成酶活性的多肽接觸。
11.根據權利要求10的方法，其中所述的多肽以再構成膜的形式存在，而所述再構成膜是從生物膜、如微粒體或線粒體膜製備的。
12.根據權利要求10的方法，其中所述的多肽的再構成的人工膜、如脂質體的形式存在。
13.根據權利要求10的方法，其中所說的電子供體是可以還原其反應中心的合適的電子供體、如細胞色素P450還原酶。
全文摘要
本發明涉及對從β胡蘿蔔素製備蝦青素有用的遺傳物質,比如具有蝦青素合酶活性的多肽、編碼蝦青素合酶的DNA片段,重組生物體等。這些新的遺傳物質可以來源於Phaffia rhodozyma。本發明還提供了一種用於生產蝦青素的方法。
文檔編號C12N5/10GK1266101SQ0010375
公開日2000年9月13日 申請日期2000年3月8日 優先權日1999年3月9日
發明者端野立夫, 小島一之, 世戶口豐 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司